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Background: Mesenchymal stem cells (MSCs) and their chondrogenic differentiation have been extensively investigated in vitro as MSCs provide an attractive source besides chondrocytes for cartilage repair therapies. Here we established prototype foamyviral vectors (FVV) that are derived from apathogenic parent viruses and are characterized by a broad host range and a favorable integration pattern into the cellular genome. As the inflammatory cytokine interleukin 1 beta (IL1β) is frequently present in diseased joints, the protective effects of FVV expressing the human interleukin 1 receptor antagonist protein (IL1RA) were studied in an established in vitro model (aggregate culture system) of chondrogenesis in the presence of IL1β.
Materials and Methods: We generated different recombinant FVVs encoding enhanced green fluorescent protein (EGFP) or IL1RA and examined their transduction efficiencies and transgene expression profiles using different cell lines and human primary MSCs derived from bone marrow-aspirates. Transgene expression was evaluated by fluorescence microscopy (EGFP), flow cytometry (EGFP), and ELISA (IL1RA). For evaluation of the functionality of the IL1RA transgene to block the inhibitory effects of IL1β on chondrogenesis of primary MSCs and an immortalized MSC cell line (TERT4 cells), the cells were maintained following transduction as aggregate cultures in standard chondrogenic media in the presence or absence of IL1β. After 3 weeks of culture, pellets were harvested and analyzed by histology and immunohistochemistry for chondrogenic phenotypes.
Results: The different FVV efficiently transduced cell lines as well as primary MSCs, thereby reaching high transgene expression levels in 6-well plates with levels of around 100 ng/ml IL1RA. MSC aggregate cultures which were maintained in chondrogenic media without IL1β supplementation revealed a chondrogenic phenotype by means of strong positive staining for collagen type II and matrix proteoglycan (Alcian blue). Addition of IL1β was inhibitory to chondrogenesis in untreated control pellets. In contrast, foamyviral mediated IL1RA expression rescued the chondrogenesis in pellets cultured in the presence of IL1β. Transduced MSC pellets reached thereby very high IL1RA transgene expression levels with a peak of 1087 ng/ml after day 7, followed by a decrease to 194 ng/ml after day 21, while IL1RA concentrations of controls were permanently below 200 pg/ml.
Conclusion: Our results indicate that FVV are capable of efficient gene transfer to MSCs, while reaching IL1RA transgene expression levels, that were able to efficiently block the impacts of IL1β in vitro. FVV merit further investigation as a means to study the potential as a gene transfer tool for MSC based therapies for cartilage repair.
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, progressive und systemische Autoimmunerkrankung, in deren Zentrum das dauerhaft entzündete Synovialgewebe der Gelenke steht. Aufgrund vielfältiger Knochen- und Knorpel-destruierender Prozesse kommt es zu irreversiblen Funktionalitätsverlusten der betroffenen Gelenke. Eine tragende Rolle bei der Ausprägung der klinischen Manifestationen wird dabei der exzessiven Synthese des proinflammatorischen Cytokins IL-1 zugesprochen. Dessen Aktivität kann durch kompetitive Blockade des IL-1 Rezeptors Typ I mit dem natürlich vorkommenden, antiinflammatorischen IL-1 Rezeptorantagonisten (IL-1Ra) inhibiert werden. Der Cytokin-blockierende Therapieansatz mit Anakinra, einem rekombinant hergestellten IL-1Ra, konnte die pharmakologischen Behandlungsmöglichkeiten der RA seit 2001 wesentlich erweitern. Gleichwohl erfordern die geringen Halbwertszeiten von IL-1Ra regelmäßige subkutane Injektionen, um hinreichende therapeutische Wirkstoffspiegel im Patienten aufrecht zu erhalten. Vor diesem Hintergrund bieten somatische Gentherapiekonzepte eine vielversprechende Alternative zu den konventionellen Behandlungsstrategien bei der RA-Therapie. Ein IL-1Ra-Gentransfer ins Gelenk soll die persistierende, lokale, endogene Synthese des therapeutischen IL-1Ra-Proteins ermöglichen und lässt in dieser Hinsicht eine nachhaltige Verbesserung der klinischen Symptomatik erwarten. In dieser Arbeit wurden dafür gentherapeutische Foamyvirus-Adenovirus-Hybridvektoren (FAD) zur Expression des IL-1Ra entwickelt und die Funktionalität der Konstrukte evaluiert. Die Vektoren sollten die effizienten adenoviralen Transduktionsmechanismen mit dem Potential der foamyviralen somatischen Integration für einen direkten in vivo Gentransfer kombinieren. Das System besteht aus einem adenoviralen Hochkapazitätsvektor vom Serotyp 5, der eine selbstinaktivierende PFV-Vektorkassette unter Kontrolle des Reversen Tetracyclin Transaktivator Systems (Tet-On) enthält. In FAD-transduzierten Zellen wurde die funktionelle Induzierbarkeit der PFV-Vektorexpression nachgewiesen und die Kinetik der PFV-Partikelfreisetzung charakterisiert. Nach Induktion der PFV-Vektorkassette konnte in FAD-transduzierten Zellen ein langfristig-stabiler IL-1Ra-Gentransfer gezeigt werden. Ferner konnten protektive Effekte eines FAD-vermittelten IL-1Ra-Gentransfers im Zellkulturmodell nachgewiesen werden. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten eine erfolgreiche Transduktion von Synovialzellen nach intraartikulärer Applikation von FAD-Vektoren. Das Tetracyclin-regulierbare Hybridvektorsystem zur Expression des IL-1Ra, das in der vorliegenden Arbeit geschaffen wurde, könnte zukünftig die Basis für ein effektives Werkzeug zum intraartikulären Gentransfer in der klinischen Praxis bieten.