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The polyspecific organic cation transporters (OCT) are involved in the elimination and distribution of drugs, environmental toxins, and endogenous organic cations including monoamine neurotransmitters. Steroid hormones inhibit organic cation transport by the three OCT subtypes with different affinities showing distinct species difference; for example, the IC50 values for corticosterone inhibition of cation uptake by transporters rOCT1 and rOCT2 are ~150μM and ~4 μM, respectively. By introducing domains and amino acids from rOCT2 into rOCT1, we identified three amino acids in the presumed 10th TMD of rOCT2 which are responsible for the higher affinity of corticosterone in comparison to rOCT1. This is the first study which revealed the components of the binding site for corticosterone in OCTs. The evidence is presented that these amino acids (alanine 443, leucine 447, and glutamine 448 in rOCT1 and isoleucine 443, tyrosine 447, and glutamate 448 in rOCT2) are probably located within the substrate binding region of OCTs since the affinity of transported cations was increased together with the affinity of corticosterone. In the double mutant rOCT1(L447Y/Q448E) the IC50 value for the inhibition of [3H]MPP (0.1 μM) uptake by corticosterone (24 ± 4 μM) was significantly higher compared to the IC50 value for inhibition of [14C]TEA (10 μM) uptake (5.3 ± 1.7 μM), indicating an allosteric interaction between transported substrate and corticosterone. The data suggest that more than one compound can bind simultaneously to the substrate binding region. These results confirm previous suggestion that binding of substrates and inhibitors to OCTs involves interaction with a comparatively large surface that may include multiple binding domains rather than with a structurally restricted single binding site.
Die Cyclodextrin-modifizierte Kapillarelektrophorese (CE) ist eine wichtige chirale analytische Technik geworden, die zur HPLC und zur Gaschromatographie komplementär ist und sich deshalb für die Analyse der Abbauprodukte von Aspartam gut eignet. Ausgehend von diesen Abbauprodukten wurden im Arbeitskreis Scriba an der Universität Jena systematische Studien über die Trennung von Enantiomeren verschiedener Dipeptide mit einer Vielzahl von nativen und derivatisierten Cyclodextrinen bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Bei der Trennung der Enantiomere von z. B. Ala-Phe oder Ala-Tyr mit beta-Cyclodextrin wurde eine Umkehr der Migrationsreihenfolge bei Erhöhung des Puffer-pH-Werts von 2,5 auf 3,5 festgestellt. Mit Heptakis-(6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HS-beta-CD), Heptakis-(2,3-O-diacetyl)-beta-cyclodextrin (Diac-beta-CD) und Heptakis-(2,3-diacetyl-6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HDAS-beta-CD) wurde diese Umkehr der Migrationsreihenfolge nicht beobachtet. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Mechanismus der Wechselwirkungen zwischen Cyclodextrinen und Aminosäuren bzw. Dipeptiden gründlich und umfassend zu untersuchen. Dabei ging es v. a. um die Untersuchung der Mechanismen der chiralen Erkennung durch Cyclodextrine, die mit Hilfe von verschiedensten Analysenmethoden, vor allem potentiometrische Titrationen und spektroskopische Methoden, wie der NMR-, UV- und CD-Spektroskopie durchgeführt werden sollten. Damit sollte auch die beobachtete Umkehr der Migrationsreihenfolge bei Erhöhung des pH-Wertes des Laufpuffers in der CE erklärt werden. Die potentiometrische Titrationsmethode lieferte sinnvolle Bindungskonstanten für Cyclodextrin-Einschlusskomplexe mit Aminosäuren. Eine Analyse der Struktur-Aktivitätsbeziehungen für Aminosäuren und Cyclodextrine ergab, dass ein gewisses Volumen der Aminosäure-Seitenkette und damit ein gutes Ausfüllen der Cyclodextrin-Kavität nötig ist, um den vollen Nutzen aus den hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der Aminosäure-Seitenkette und der Cyclodextrin-Kavität zu ziehen. Eine Verlängerung des hydrophilen Restes, der aus der Kavität herausragt, wie bei den untersuchten Dipeptiden Ala-Phe und Ala-Tyr der Fall, führt zu der Möglichkeit der Ausbildung von Wasserstoff-Brücken mit den Hydroxylgruppen am breiteren Rand der Cyclodextrin-Kavität und damit zu einer stärkeren Bindung an das Cyclodextrin. Um den chiralen Erkennungsprozess von beta-CD und einigen seiner Derivate, nämlich HS-beta-CD, Diac-beta-CD und HDAS-beta-CD, zu verstehen, wurden NMR-Experimente durchgeführt, und zwar wurden „durch Komplexbildung induzierte Verschiebungen der chemischen Verschiebungen” (complexation induced chemical shifts, CICS) gemessen und mittels ROESY-Experimenten die Komplexgeometrie untersucht. Betrachtet man die CICS, die für die Paare Diac-beta-CD/Ala-Phe, HDAS-beta-CD/Ala-Phe, Diac-beta-CD/Ala-Tyr und HDAS-beta-CD/Ala-Tyr auftreten, dann zeigt sich, dass sie relativ klein sind und demnach auf eine eher schwache Wechselwirkung des jeweiligen Gastmoleküls mit dem Wirt hindeuten. Die CICS für beta-CD- und HS-beta-CD-Dipeptid-Komplexe bestätigten einen Einschluss des aromatischen Restes in die Cyclodextrin-Kavität. Es konnte gezeigt werden, dass bei pH 2.5 das DD-Enantiomer von Ala-Tyr tiefer in die Kavität von beta-CD eintaucht als das LL-Enantiomer. Außerdem ist bei pH 3.5 die Eintauchtiefe in die Kavität geringer als bei pH 2.5, was durch die Ergebnisse der ROESY-Experimente bestätigt werden konnte. Um einen besseren Einblick in die Bindungsmodi der Enantiomere von Ala-Phe und Ala-Tyr mit beta-CD bei unterschiedlichen pH-Werten zu erhalten, wurden Moleküldynamik-(MD-)-Simulationen durchgeführt. Die Simulationen wurden mit jedem Enantiomer von Ala-Phe und Ala-Tyr in jedem möglichen Protonierungszustand durchgeführt, d. h. Kation, Zwitterion und Anion. Zum ersten Mal wurden MD-Simulationen für eine größere Serie von unterschiedlichen Komplexen von Enantiomeren in verschiedenen Protonierungszuständen systematisch über den langen Zeitraum von 1 ns (=1000 ps) ausgeführt. Die Eintauchtiefe der untersuchten Dipeptide wurde mit Hilfe einer in die Cyclodextrin-Kavität eingepassten Ebene berechnet. Auf diese Weise konnten Informationen über das unterschiedliche Einschlussverhalten der untersuchten Dipeptide erhalten werden. Die angewendete Methode lässt sich leicht auf andere Wirt-Gast-Komplexe übertragen und erleichtert die Datenerfassung auch in anderen Fällen. Es konnte gezeigt werden, dass bei pH 2.5 das DD-Enantiomer von Ala-Phe tiefer in die Kavität von beta-Cyclodextrin eintaucht als das LL-Enantiomer, wohingegen bei pH 3.5 der umgekehrte Fall vorliegt. Betrachtet man das Dipeptid Ala-Tyr, dann dringt bei pH 2.5 das DD-Enantiomer tiefer ein, wohingegen keine klare Aussage über das Eindringverhalten der Enantiomere bei pH 3.5 gemacht werden kann. Die CICS und die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese weisen jedoch auf ein tieferes Eindringen des LL-Enantiomers hin.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Beiträge zur C/Si-Bioisosterie und zur asymmetrischen Synthese neuer siliciumhaltiger alpha-Aminosäuren geleistet. Im Vordergrund der Untersuchungen stand die Entwicklung neuer präparativer Methoden zur Darstellung siliciumhaltiger Wirkstoffe und die Untersuchung ihrer pharmakologischen Wirksamkeit sowie die Synthese racemischer und enantiomerenreiner siliciumhaltiger alpha-Aminosäuren des beta-(Trimethylsilyl)alanin-Typs.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchungen von Verunreinigungsprofilen von Aminosäuren aus biotechnologischer Herstellung. Dazu sollten die Aminosäuren Arg, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Ser und Trp von verschiedenen Herstellern und aus unterschiedlichen Batches genauer unter die Lupe genommen werden. Mit der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen dünnschichtchromatographischen Methode (DC-Methode) für „mit Ninhydrin nachweisbare Substanzen“ können ausschließlich Fremdaminosäuren nachgewiesen werden und dies nur, wenn der jeweilige Gehalt relativ hoch ist. Andere Stoffgruppen, die aus der biotechnologischen Herstellung stammen, werden aufgrund der Trennbedingungen sowie der Detektionsart der DC-Methode nicht erfasst. Deshalb mussten neue Methoden entwickelt werden. Laut Vorschriften der International Conference of Harmonisation (ICH) müssen unbekannte Verunreinigungen in Wirkstoffen für orale Therapeutika auf 0,1 % w/w begrenzt werden können. In die Untersuchungen wurden neben den Fremdaminosäuren auch Peptide, Aminozucker und Nucleinsäuren als potentielle Verunreinigungen, die aus der Herstellung bzw. aus dem Reinigungsprozess kommen, einbezogen. Diese zusätzlichen Stoffgruppen können aus den „Nebenaktivitäten“ der Mikroorganismen entstehen. Aminosäuren, Peptide und Aminozucker wurden versucht, kapillarelektrophoretisch zu quantifizieren. Für die Bestimmung von Nucleinsäuren wurde zusätzlich die UV-Spektroskopie eingesetzt.