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Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwieweit quantitative Genexpressionsstudien an postmortalen humanen Proben mit erhöhtem Postmortalintervall und somit möglicherweise verminderter RNA-Integrität realisierbar sind und in Zukunft als zusätzliches diagnostisches Werkzeug zur Determinierung der Todesursache im forensischen Kontext herangezogen werden können. Dafür wurden in mehreren Teilstudien Faktoren untersucht, die die Verlässlichkeit quantitativer Genexpressionsdaten beeinflussen können. Es konnte zunächst für postmortales Skelettmuskelgewebe festgestellt werden, dass Verstorbene mit erhöhtem BMI statistisch signifikant niedrigere RIN-Werte aufweisen als normalgewichtige Personen. Zudem wurde eine Korrelation zwischen dem Gewebetyp und der Integrität der daraus extrahierten RNA gefunden. Unter Anwendung der in dieser Arbeit gewählten Extraktionsmethode scheint postmortales Skelettmuskelgewebe für Genexpressionsstudien an Autopsiematerial besonders geeignet. Dagegen wurde im vorliegenden Probengut kein Zusammenhang zwischen verminderter RNA-Integrität und Parametern wie Geschlecht, PMI, Sterbealter, Dauer der Agonie und Todesursache gefunden. In einer weiteren Teilstudie wurde anhand von postmortalem Herzmuskel-, Skelettmuskel- und Gehirngewebe aus einer Auswahl von zehn funktionell verschiedenen endogenen Kontrollgenen HMBS, UBC, SDHA und TBP als die Gene mit der größten postmortalen Transkriptstabilität identifiztiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von vier stabilen endogenen Kontrollen am untersuchten Probenmaterial eine verlässliche Datennormalisierung erlaubt. Die validierten Kontrollgene können auch zukünftig für quantitative Genexpressionsstudien eingesetzt werden, solange die untersuchte Probenzusammensetzung der hier vorgestellten ähnelt. Für die Todesursache sowie für den Body Mass Index des Probenspenders wurde in der vorliegenden Arbeit ein statistisch signifikanter Einfluss auf das Expressionslevel instabiler Gene festgestellt. Diese Parameter sind daher geeignet, die gefundenen Instabilitäten möglicher Kontrollgene zu erklären. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen des Weiteren darauf schließen, dass das Erstellen von Degradierungslinien aus kommerziell erhältlicher RNA für jedes verwendete qPCR-Assay ein wichtiges Instrument der Qualitätsprüfung ist. Mit der Degradierungslinie kann die Detektionsgrenze des verwendeten qPCR-Assays validiert werden kann. Nur so ist die Festlegung des Bereichs möglich, in dem ein verändertes Expressionslevel tatsächlich mit dem Einfluss eines spezifischen Parameters in Verbindung gebracht werden kann und klar von einer nur scheinbaren Genexpressionsänderung unterscheidbar ist, die durch eine Degradierung der Probe vorgetäuscht wird. Zudem scheint es praktikabel, in zukünftigen Studien nur Proben mit ähnlichen Integritäten miteinander zu vergleichen. Pathologische Prozesse im menschlichen Körper, auch solche, die die Funktion von Organen sowie die Morphologie betreffen, sind hoch komplex und können interindividuell variieren, weshalb die Genexpression im forensischen Kontext ergänzende Hinweise auf die Diagnose liefern könnte. Als erstes anwendungsbezogenes Beispiel wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von Hypoxie auf das Transkriptlevel von HIF-1α, VEGF und SLC2A1 untersucht. Bei Normalisierung der Daten gegen vier stabile Kontrollgene ergaben sich anhand der untersuchten Gewebeproben Hinweise auf eine todesursachenbezogene Hochregulierung der drei Zielgene. Die Studie unterstrich die besondere Bedeutung der gewählten Normalisierungsstrategie. Wurden die Daten nur gegen GAPDH als einzelnes, nicht validiertes Kontrollgen normalisiert, deuteten die Ergebnisse eine überraschende Herunterregulierung der Zielgene an. Als mögliche Ursache für diese scheinbare Diskrepanz kommt die im weiteren Verlauf dieser Studie nachgewiesene Instabilität infolge einer Co-Regulation von GAPDH unter hypoxischen Bedingungen in Betracht. Mit dem Fernziel postmortale Genexpressionsstudien als zusätzliches Instrument in der forensischen Todesursachenbestimmung einzusetzen, schafft die vorliegende Arbeit durch die Einführung von validierten Kontrollgenen sowie durch die Analyse weiterer Einfluss nehmender Faktoren eine Basis für die verlässliche Durchführung künftiger Genexpressionsstudien an humanem Autopsiegewebe.
In der inkompatiblen Interaktion von Lycopersicon esculentum und Cuscuta reflexa wird die Ausbildung von Haustorien, spezieller Organe, die der Nahrungsaufnahme durch den Parasiten dienen,bereits in einem sehr frühen Stadium der Infektion gehemmt. Um einen Einblick in die Regulationsmechanismen der Tomatenreaktion zu gewinnen, wurde eine Subtraktive Hybridisierung durchgeführt und es konnten 20 Gene identifiziert werden, deren Transkripte nach Cuscuta-Befall im Wirtsgewebe akkumulieren. Entsprechend ihrer möglichen Proteinfunktion lassen sich die mRNAs verschiedenen Bereichen der Tomatenreaktion im Infektionsprozess zuordnen: (a) Abwehr-assoziierte Proteine, (b) Signaltransduktionsassoziierte Proteine, (c) Zellstreckungsassoziierte Proteine und (d) Proteine mit bislang vollständig unbekannter Funktion. Einige der identifizierten mRNAs wurden durch Northern Analysen näher charakterisiert. Da eine der mRNAs eine mögliche Xyloglucanendotransglycosylase (XET) kodiert, wurde die XET-Aktivität im Tomatengewebe nach Infektion bestimmt. Außerdem wurde der Einfluß des Phytohormons Auxin auf die Akkumulation der Xyloglucanendotransglycosylase LeEXT1 sowie des Aquaporins LeAqp2 untersucht. Trotz auxinregulierter Transkription nach Cuscuta-Befall zeigte die auxininsensitive Tomatenmutante diageotropica im Vergleich zum Wildtyp keine veränderte Kompatibilität.
Die Laser Mikrodissektion konnte in der vorliegenden Arbeit als geeignetes Tool für Expressionsanalysen pflanzlicher Gewebe weiterentwickelt werden. Nach einer umfangreichen Optimierung der Technik und Anpassung an die jeweiligen Gegebenheiten der zu analysierenden pflanzlichen Gewebe konnten unterschiedliche physiologische Fragestellungen an verschiedenen Pflanzen bearbeitet werden. Methodische Fortschritte Bei den Arbeiten an infiltrierten Arabidopsis-Pflanzen zeigten sich die methodischen Verbesserungen besonders deutlich: i. Die Zeit der Probengenerierung konnte um 60 80 % reduziert werden, wobei gleichzeitig die Qualität und Quantität der isolierten RNA erheblich verbessert wurden. ii. Dadurch konnte auf die in Deeken et al. (2008) beschriebene Voramplifikation, die stets zum Verlust niedrig exprimierter Gene führt, verzichtet und eine deutlich größere Zahl an im Phloem exprimierten Genen identifiziert werden. iii. Dass dabei 95 % der bei Deeken et al. beschriebenen Phloem-Gene wiedergefunden wurden, zeigt die hohe Reproduzierbarkeit der LMPC-Technik, die durch die Optimierung erreicht werden konnte. Pathogenantwort im Arabidopsis-Phloem iv. Die Laser Mikrodissektion konnte entsprechend i iii eingesetzt werden, um Phloem-Proben von Arabidopsis-Blütenstielen nach Pathogenbefall zu sammeln. v. Bei der Suche nach entsprechenden Phloem-mobilen Signalen, die in systemischen Geweben zur Auslösung der SAR führen, zeigte sich, dass im Phloem der Arabidopsis-Blütenstiele v. a. der Jasmonsäureweg angeschaltet wird. SAR-Marker fanden sich kaum induziert. vi. Im Vergleich der Mikroarray- und qPCR-Ergebnisse wird deutlich, dass mittels LMPC die Vorgänge im Phloem deutlich besser aufgelöst werden können, da die Untersuchungen an kompletten Blütenstielen deutliche Abweichungen gegenüber den Phloem-Arrays aufwiesen. Die Analysen der Mikroarrays sowie die zugehörigen Zeitreihenexperimente sind noch nicht abgeschlossen. Pappel-Holzstrahlen als Schaltstelle der saisonalen Umsteuerung vii. Die Laser Mikrodissektion kann alternativ auch in einem inversen Ansatz angewendet werden. viii. Über auf diese Weise angereicherte Holzstrahlen der Pappel war es möglich, tiefgreifende Einblicke in die Saisonalität der Pappel zu erlangen. ix. Zusammen mit Metabolit- und qPCR-Analysen lieferten diese Ergebnisse einen zeitlichen Ablaufplan der zugrundeliegenden physiologischen Prozesse, insbesondere bei der Umsteuerung von der Dormanz zur Wiederaufnahme des aktiven Wachstums im Frühjahr.
Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekundärmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikuläre Wachsbestandteile im primären Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzflächeneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenphänotypen in Erscheinung: Der Glossy-Phänotyp ist frei von epikutikulären Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Phänotyps von fadenförmigen epikutikulären Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Phänotyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikulärem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikulären Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Phänotyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit höhere Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der frühen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Phänotyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgeführt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer frühen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer täglichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenförmigen Wachskristalle in der frühen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die für die Biosynthese des kutikulären Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Phänotyp beschränkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der frühen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Phänotyps überein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die für die Bildung kutikulärer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikulären Triterpenen über die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenzähnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach β-Amyrin und bestätigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans für die katalytische Funktionalität dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt für ein tieferes Verständnis der Biosynthese kutikulärer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als β-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit α-, β- und δ-Amyrin gleich drei Triterpene in größeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tatsächlichen Relevanz der klonierten OSCs für die Biosynthese dieser kutikulären Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden.