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Der Wirkung von Östrogenen fällt bei vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen im menschlichen Körper eine entscheidende Rolle zu. Daraus wiederum ergibt sich ein Ansatzpunkt für Therapien von Erkrankungen. Für viele Wirkungen der Östrogene sind die Östrogenrezeptoren verantwortlich, welche diese vermitteln. Damit in bestimmten Geweben die Östrogene eine bestimmte Wirkung hervorrufen können, muss die Expression von Östrogenrezeptoren unterschiedlich reguliert werden. Mit der Entdeckung der untranslatierten Exons wurde ein möglicher Regulationsmechanismus für die Expression von Östrogenrezeptoren gefunden. Über die gewebespezifische Verwendung von untranslatierten Exons ist bisher nur wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verwendung von untranslatierten Exons in humanen fetalen Osteoblasten (hFOB), Neuroblastomzellen (SK-N-SH), mesenchymalen Stammzellen (MSC) und Chondrozyten (T/C28a2) untersucht. Des Weiteren wurde die quantitative Expression von Östrogenrezeptor β während der Differenzierung von MSC zu Osteoblasten und Adipozyten untersucht. Zu diesem Zweck wurde aus Zellkulturen gewonnenen Zellen RNA isoliert, mit deren Hilfe eine cDNA synthetisiert wurde. Diese wurde mittels PCR amplifiziert und die gewonnenen Produkte durch Gelelektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht. Zur Identifikation der PCR Produkte wurde sie einer Sequenzanalyse unterzogen. Die Versuche konnten belegen, dass in den einzelnen Zelllinien untranslatierte Exons verwendet werden. Erstmalig konnten untranslatierte Exons in fetalen Osteoblasten und mesenchymalen Stammzellen nachgewiesen werden. Tabelle 8 zeigt eine Übersicht über die bei den einzelnen Zelllinien gefundenen Exons. Zudem konnte eine Splicevariante des Exons 1 bei fetalen Osteoblasten nachgewiesen werden. Der Nachweis eines zusätzlichen untranslatierten Exons bei Osteoblasten im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen zeigt, dass während Differenzierungsvorgängen zusätzliche Promotorregionen zur Expression des Östrogenrezeptor β genutzt werden. Die Untersuchung der Expression des Östrogenrezeptor β während der Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen konnte keine quantitativen Unterschiede aufzeigen. Die Verwendung von sensitiveren Analysemethoden könnte hier genauere Aussagen ermöglichen.
Der freie an der Arteria radialis gestielte fasziokutane Unterarmlappen hat sich als Standardmethode für die Rekonstruktion nach Resektion ausgedehnter Tumoren im Kopf-Hals-Bereich etabliert. Hierzu trug nicht nur die überschaubare und komplikationsarme Operationstechnik bei, sondern auch die Möglichkeit der Wiederherstellung von durch den Tumor und dessen Resektion in Mitleidenschaft gezogenen Funktionen und somit die frühzeitige Rehabilitation und die Verbesserung der Lebensqualität der Patienten. In dieser Studie wurden Operationsfolgen und Komplikationen, funktionelle Einschränkungen und die postoperative Lebensqualität der Patienten für das an der Würzburger HNO-Universitätsklinik operierte Patientengut dargestellt. Neben dem Aktenstudium wurden hierfür Patientenfragebögen ausgewertet und die Patienten wurden nachuntersucht. Es konnten viele durch die operative Therapie und die adjuvante Strahlen- und Chemotherapie ausgelöste funktionelle Störungen festgestellt werden. Im Vordergrund standen dabei Schluckbeschwerden und Probleme mit dem Sprechen bzw. der Stimme. Eingeschränkte Beweglichkeit im Schulterbereich und Lymphödeme am Hals als typische Folgen der Neck Dissection kamen ebenfalls sehr häufig vor. Oft wurden auch Mucositis und Mundtrockenheit als Folgen der Strahlen- und Chemotherapie beobachtet. Auffällig war, dass die Häufigkeit der festgestellten Operationsfolgen davon abhängig war, ob sie vom untersuchenden Arzt oder vom Patienten selbst beobachtet wurden, was die Wichtigkeit von Fragebögen zur postoperativen Beurteilung der Operationsfolgen deutlich macht. Durch die Fragebögen konnte darüber hinaus die Lebensqualität der Patienten beurteilt werden. Die Auswertung ergab in den meisten Bereichen ein mittleres bis hohes Maß an Zufriedenheit mit den abgefragten Aspekten der Lebensqualität. Nur wenige Patienten gaben einzelne schlechte Bewertungen, vor allem die funktionellen Beschwerden wurden negativ bewertet. Trotzdem waren fast alle Patienten mit der Therapie zufrieden und würden sich wieder genauso entscheiden. Insgesamt konnte also gezeigt werden, dass trotz der häufig festgestellten funktionellen Einschränkungen ein hohes Maß an subjektiver Lebensqualität erreicht werden kann und eine Anpassung an die momentane Lebenssituation stattfindet.
The charge transport properties of disordered organic and nanocrystalline inorganic semiconductors as well as their combinations have been investigated in regard to the charge carrier density employing field-effect-transistor structures. The results were discussed in the framework of different theoretical models. In organic semiconductors the presence of positional and energetic disorder determines the transport of charges through the respective thin films and interfaces. The electronic disorder is characterized by statistically distributed and localized transport sites which were shown to form a Gaussian density of states. In this electronic environment the charge transport occurs via thermally activated hopping between the localized states and therefore depends on the temperature and the local electric field. Particularly, a dependence of the carrier mobility on the charge carrier concentration is observed due to filling of tail states. Inorganic nanocrystalline semiconductors, however, are expected to present a different electronic structure: Within the volume of a nanocrystallite the semiconductor is assumed to reflect the electronic properties of the crystalline bulk material. However, the outer shell is characterized by a relatively large density of surface states and correspondingly bending of the energy bands, which creates an energetic barrier between the adjacent particles. In a nanocrystalline thin film this characteristic can be rate-limiting for the inter-particle carrier transport as reflected by reduced charge carrier mobility. The effective barrier height can be reduced by controlled doping of the nanocrystals which results in improved majority carrier transfer rates across the barrier. However, doping results in the simultaneous increase of the defect density and consequently to enhanced limitation of the mobility due to charge carrier scattering. In the experiments, thin films of commercially available p- and n-type organic semiconductors (P3HT, and two derivatives of PCBM) were investigated in field-effect transistor structures. Further, sol-gel synthesized n-type nanocrystalline-ZnO (nc-ZnO) with varied doping concentration (agent: aluminum Al$^{3+}$) was introduced in order to establish an alternative way of customizing the charge transport properties of the neat material and in combination with the organic polymer semiconductor P3HT.
Seit der Entdeckung des ersten Gens für den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schlüssel-Enzym für die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zusätzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anfällt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen führen zu einem signifikanten Effekt auf die benötigte Coumarin-Dosis und die Stabilität der Hämostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1“ (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit völlig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellulären Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein können. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke Ähnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivität, wobei die Affinitäten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich höher sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen führt in beiden Proteinen zu einem fast vollständigen Verlust der Aktivität. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 – wie VKORC1 – in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine ähnliche Struktur, die gleiche zelluläre Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivität hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen könnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out Mäusen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem für Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als Köder 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferhäufigkeit und funktioneller Überlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation näher untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke Überschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies könnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, führt aber auch zu neuen Hypothesen bezüglich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1“ (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals Würzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein“ (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP führen zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die Ähnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch überhöhte Dosierung von Coumarinen während der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nicht bestätigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bedürfen weiterführender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen wäre auch eine kritische Betrachtung der übrigen 85 primären Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.
Das Mammakarzinom ist die häufigste Neoplasie bei Frauen und jede 11. Frau in Deutschland erkrankt im Lauf ihres Lebens an Brustkrebs. Die Überlebensaussichten haben sich in den letzten Jahrzehnten deutlich verbessert, was auf sensiblere Untersuchungsmethoden und die Therapieoptimierung zurückzuführen ist. Eine große Rolle spielt auch der Einsatz verschiedener Prognosefaktoren. Insbesondere Alter, Lymphknotenstatus, Tumorgröße, Histologie, Hormonrezeptor- und Her2-neu-Status kommen heute routinemäßig zum Einsatz. Trotz allen Fortschritts ist Brustkrebs weiterhin die führende Todesursache unter den Krebserkrankungen bei Frauen. Große Hoffnung wird in neue Therapiemethoden gesetzt, die in den Glukosestoffwechsel eingreifen. In letzter Zeit erlangten Glykolysemarker, die als Indikatoren für den veränderten Kohlenhydratstoffwechsel in Tumorzellen dienen, wachsendes Interesse. Obwohl Brustkrebs eine bereits häufig untersuchte Tumorentität ist, ist der Einfluss des Glukosestoffwechsels auf die Fähigkeit zur Metastasierung und die Überlebenszeit unbekannt. Für diese Studie wurde eine Gruppe von 160 Patientinnen ausgewählt, die vor mehr als 13 Jahren wegen einer Brustkrebsneuerkrankung behandelt wurden. Das bei der Operation entnommene Gewebe des primären Mammakarzinoms wurde immunhistochemisch auf die Expression von Tumor-M2-PK und pAkt, zweier ausgewählter Schlüsselenzyme der Tumorglykolyse, untersucht. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper, die spezifisch an die dimere Isoform der M2-PK und das pAkt binden, wurden von jeder Probe der Expressionsgrad dieser beiden Marker sowie der immunreaktive Score bestimmt. Die Ergebnisse der Färbungen wurden mit klinisch-pathologischen- und Überlebensdaten der Patientinnen abgeglichen, um Informationen über die prognostische Relevanz dieser Marker zu erhalten. Eine Überexpression konnte in 58% der Fälle für M2-PK- und in 70% für pAkt nachgewiesen werden. Die übermäßig starke Expression der dimeren M2-Pyruvatkinase konnte als unabhängiger Prognosefaktor für das Langzeitüberleben beim Mammakarzinom identifiziert werden und die Mortalitätsrate bei Patientinnen mit positivem M2-PK/cut-off war deutlich geringer. Bei Frauen unter 52 Jahren und im Zusammenhang mit negativem Östrogenrezeptorstatus wurde häufiger die konstitutive Akt-Aktivierung beobachtet. Die routinemäßige Bestimmung der M2-PK könnte in Zukunft bei der Entwicklung individueller Behandlungskonzepte zum Einsatz kommen und die pAkt könnte als prädiktiver Faktor für die adjuvanten Therapie des Mammakarzinoms dienen.
Die Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des glatten Muskeltonus. NO ist einer der wichtigsten vaskulären Faktoren für die Relaxation der Blutgefäße sowie für die Regulation des Blutdruckes und fungiert ebenfalls als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter im gastrointestinalen Trakt. Es wirkt hauptsächlich über die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen führt zu einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). GCKO-Mäuse zeigen keine NO-induzierte Relaxation der vaskulären und gastrointestinalen glatten Muskulatur. Die Mäuse zeigen eine arterielle Hypertonie und eine verlängerte Magen-Darm-Transportzeit, die in eine gastrointestinale Dysfunktion mündet. Allerdings erlaubt eine vollständige Deletion der NO-GC in den Mäusen keine Identifikation des Zell- bzw. Gewebe-Typs, der für den erhöhten Blutdruck und die gastrointestinale Dysfunktion verantwortlich ist. Um die relative Beteiligung der glatten Muskelzellen an der Hypertonie und der gestörten Darm-Motilität zu bestimmen, wurden Glattmuskel-spezifische Knockout-Mäuse für die ß1-Untereinheit der NO-GC (SM-GCKO) generiert. Die SM-GCKO-Mäuse entwickelten im Verlauf der Deletion eine arterielle Hypertonie in Kombination mit einem Verlust der NO-induzierten Glattmuskelrelaxation. Diese Daten zeigen, dass die Deletion der NO-GC in den glatten Muskelzellen völlig ausreichend ist, eine Hypertonie zu erzeugen. Überraschenderweise ist die Darm-Motilität der SM-GCKO-Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen unverändert. In gastrointestinaler Muskulatur exprimieren neben den glatten Muskelzellen auch die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) die NO-GC. Mithilfe einer Cre-spezifischen Maus für ICC wurde eine Mauslinie generiert, der die NO-GC in beiden Zelltypen fehlt. Der gastrointestinale Phänotyp dieser Doppel-Knockouts ähnelt dem der totalen GCKO-Tiere: Die nitrerge Relaxation fehlt und die Magen-Darm-Transportzeit ist verlängert. Zusammenfassend führt eine Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und gleichzeitig in den ICC zu einer vollständigen Unterbrechung der nitrergen Relaxation in GI Trakt.
The contribution of the present thesis consists of three parts. They are centered around investigating certain semiconductor heterointerfaces relevant to spin injection, exploring novel, diluted magnetic single barrier tunneling structures, and further developing diluted magnetic II-VI resonant tunneling diodes.
Investigation on Distinct Roles of Smad Proteins in Mediating Bone Morphogenetic Proteins Signals
(2011)
Bone morphogenetic proteins (BMPs) belong to the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and play important roles in numerous biological events in the development of almost all multi-cellular organisms. Dysregulated BMP signaling is the underlying causes of numerous heritable and non-heritable human diseases including cancer. The vast range of biological responses induced by BMPs converges on three closely related Smad proteins that convey intracellular signals from BMP receptors to the nucleus. The specificity of BMP signaling has been intensively investigated at the level of ligand-receptor interactions, but how the different Smad proteins contribute to differential signals elicited by BMPs remains unclear. In this work, we investigated the BMP/Smad signaling in different aspects. In search for an appropriate fluorescence reporter in zebrafish, we compared different photo-switchable proteins and found EosFP the best candidate this model system for its fast maturation and fluorescence intensity. We modified and created appropriate vectors enabling Tol2-transposon based trangenesis in zebrafish, with which transgenic zebrafish lines were generated. We combined fluorescence protein tagging with high resolution microscopy and investigate the dynamics of Smad proteins in model system zebrafish. We observed that Smad5 undergoes nucleo-translocation as BMP signal transmitter during zebrafish gastrulation. We explored the Smad involvement during myogenic-to-osteogenic conversion of C2C12 cell line induced by BMP4. We created transient loss-of-function of Smads by siRNA-mediated knockdowns and analyzed the effects on these coupled yet distinct procedures by quantitative real-time PCR and terminal marker staining. We found that different Smad-complex stoichiometry might be responsible for distinct cellular signals elicited by BMPs.