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Unter dem Einfluss von M-CSF und GM-CSF entwickeln sich CD14-positive periphere humane Blutmonozyten zu CD68-positiven M-CSF- bzw. GM-CSF-Makrophagen. M-CSF-Makrophagen lassen sich mit INFg und LPS zu klassisch aktivierten M1-Makrophagen, oder mit IL-4 und IL-10 zu alternativ aktivierten M2-Makrophagen differenzieren. Durch GM-CSF werden aus Monozyten GM-CSF-Makrophagen induziert. Im Gegensatz zu M1-Makrophagen sind GM1-Makrophagen bisher noch wenig untersucht. Mit INFg und LPS werden GM-CSF-Makrophagen zu GM1-Makrophagen aktivert. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, wie groß die Übereinstimmung zwischen M-CSF- und M2-Makrophagen sowie zwischen GM-CSF- und M1-Makrophagen / GM1-Makrophagen ist. Im Gegensatz zu M-CSF- und GM-CSF stellt Laktat aber keinen Differenzierungsfaktor für Monozyten dar. Jedoch beeinflusst Laktat den Phänotyp von M2-Makrophagen und hemmt die Ausschüttung von IL-12 und NO durch M1- und GM1-Makrophagen.
Die zelltoxische Wirkung von AVEMAR, einem medizinischen Nahrungsergänzungsmittel, wurde erstmalig an einer Vielzahl humaner Tumorzelllinien systematisch untersucht. Die einzelnen Tumorzelllinien reagierten sehr unterschiedlich auf die Inkubation mit AVEMAR. So weisen vier der zwölf Tumorzelllinien (33 %) einen EC50-Wert von mehr als 50 mg/ml auf und waren somit resistent gegenüber AVEMAR, während fünf der zwölf Tumorzelllinien (42 %) einen EC50 Wert von <10 mg/ml aufweisen. Für drei Zelllinien wurde ein EC50-Wert zwischen >10 und <25 mg/ml nachgewiesen. Zwischen der Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen und ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem AVEMAR-Effekt war kein Zusammenhang zu erkennen; ebenso wurde ausgeschlossen, dass der AVEMAR Effekt auf einer unspezifischen Wirkung beruht. Zur weiteren Untersuchung wurden vier der zwölf Zelllinien ausgewählt: BxPC-3 (EC50: 4,9 +/- 0,42 mg/ml); 23132/87 (EC50: 9,3 +/- 0,28 mg/ml); HT-29 (EC50: 15,35 +/- 0,21 mg/ml) und HRT-18 (EC50: 21,3 +/- 0,42 mg/ml). Die Wirkung von 10 mg/ml AVEMAR auf diese vier Zelllinien war nach einer Inkubationsdauer von 24 Stunden: zelltoxisch (BxPC-3), zytostatisch (23132/87 und HT-29) und schwach zytostatisch (HRT-18). Insbesondere für HRT-18 war der zytostatische Effekt von AVEMAR begrenzt und bereits nach 48 Stunden in Kultur ohne AVEMAR nicht mehr zu beobachten. Im Gegensatz dazu war der zelltoxische Effekt von AVEMAR auf Zellen der Linie BxPC-3 extrem rasch (<24 Stunden) und absolut irreversibel. Dieser zelltoxische Effekt ähnelt der Wirkungsweise von 2,6-Dimethoxy-1,4-Benzochinonen, wobei nicht geklärt ist, ob reaktive Sauerstoffspezies oder andere Formen von Radikalen, z.B. Stickstoffradikale, entstehen. Diese Vermutung wird dadurch gestützt, dass ausschließlich Glutathion, welches als Radikalfänger an zahlreichen enzymabhängigen Reduktionsreaktionen beteiligt ist, die zelltoxische Wirkung von AVEMAR kompensieren konnte. Katalase, die die Detoxifikation von Wasserstoffperoxid katalysiert, zeigte in Gegenwart von AVEMAR keine Wirkung, war aber in Gegenwart von Benzochinonen wirksam. Da bei oxidativem Stress auch Wasserstoffperoxid entsteht, scheint die zelltoxische Wirkung von AVEMAR bei BxPC-3 nicht auf Auslösung von oxidativem Stress zu beruhen, sondern auf der Induktion von Radikalen bzw. toxischen Metaboliten anderer Art. Der bei den Tumorzelllinien 23132/87 und HT-29 beobachtete, weniger aggressive zytostatische Effekt von AVEMAR basiert nicht auf der Induktion freier Radikale, da Glutathion ohne Wirkung war. Mit der Zytostase einhergehend war eine deutliche Verringerung des intrazellulären ATP-Gehalts um bis zu 60 % bei 10 mg/ml bzw. 100 % bei 50 mg/ml AVEMAR. Zusätzlich zur Wirkung von AVEMAR wurden weitere Weizenprodukte auf mögliche zelltoxische bzw. zytostatische Effekte getestet und zwar Weizenkeimlinge, handelsübliches Weizenmehl vom Typ 405 und Weizenlektine. Interessanterweise wurde je nach Zelllinie auch für diese Weizenprodukte ein zelltoxischer Effekt in vitro nachgewiesen. AVEMAR weist zelltoxische und zytostatische Effekte auf. Beide Effekte werden nicht über oxidativen Stress vermittelt. Die zelltoxische Wirkung von AVEMAR wird durch Nicht-Sauerstoffradikale bzw. toxische Metabolite vermittelt. Damit wurde der postulierte Hauptmechanismus von AVEMAR - nämlich die Induktion von oxidativem Stress durch Benzochinone - nicht bestätigt. AVEMAR stellt ein nebenwirkungsarmes, gut verträgliches und günstiges Nahrungsergänzungsmittel dar. Die vorliegende Arbeit, aber auch klinische Studien haben eine Wirksamkeit von AVEMAR gegenüber Tumoren gezeigt. Da zahlreiche onkologische Patienten sehr motiviert sind, neben der Chemo- und Radiotherapie, weitere Maßnahmen gegen ihr Krebsleiden zu ergreifen, sind Empfehlungen von Supportivprodukten, deren zugrunde liegenden Mechanismen weitestgehend aufgeklärt sind und für die ein wissenschaftlicher Nachweis ihrer Wirksamkeit vorliegt, sicherlich ein zu begrüßender Schritt zur ganzheitlichen Betreuung onkologischer Patienten.
Ob eine Immunonutrition einen Nutzen in der Versorgung schwer kranker oder chirurgischer Patienten bringt, ist Thema kontroverser Diskussionen. Dabei scheint unklar, welches Patientenklientel von welcher Zusammensetzung verschiedener immunmodulatorischer Substanzen am meisten profitiert. Zudem ist nicht einheitlich geklärt, zu welchen Zeitpunkten und über welche Zeiträume die Immunmodulation den größten Nutzen bringt. Die hier durchgeführte Studie wurde konzipiert, um zu untersuchen, ob die Patienten, die einer aortokoronaren Bypassoperation unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine zugeführt werden, eine Verbesserung ihres klinischen Outcomes zeigen, wenn sie immunmodulatorische Substanzen perioperativ erhalten. Die konkreten Fragestellungen für diese Arbeit lauten daher: 1) Kann die Immunonutrition mit Glutamin, ௰-3-Fettsäuren und antioxidativ wirksamen Vitaminen die Inzidenz von postoperativen Infektionen bei Patienten, die einer aortokoronaren Bypassoperation zugeführt werden, verringern? 2) Verkürzt sich die Liegedauer der Patienten auf der Intensivstation und nach Verlegung auf Normalstation postoperativ bei regelmäßiger Einnahme der immunmodulierenden Substanzen über den Zeitraum des stationären Aufenthaltes? 3) Verbessert sich das klinische Outcome der Patienten durch die perioperative Substitution insgesamt, durch ein selteneres Auftreten von häufigen Komplikationen und Kreislaufinstabilitäten? Zu diesem Zweck wurde eine Kohortenstudie mit 137 Patienten durchgeführt, wovon sich 97 Patienten in der Kontrollgruppe und 40 in der Experimentalgruppe befanden. Die Patienten der Experimentalgruppe erhielten ab dem Tag ihrer stationären Aufnahme 2 unterschiedliche Substanzen zur oralen Einnahme verabreicht. Die eine enthielt einen hohen Anteil an Glutamin und antioxidativ wirksamen Substanzen (Glutamine Plus®) und die andere einen hohen Gehalt an ௰-3-Fettsäuren (Supportan® Drink). Das Glutamine Plus® wurde morgens und abends, der Supportan® Drink mittags verabreicht. Die Substitution erfolgte über den kompletten stationären Aufenthalt, abgesehen von dem Tag der Operation selber. Die Blutentnahmen für die entsprechenden infektiologischen Parameter erfolgten zu den Zeitpunkten präoperativ, 6 Stunden nach Ende der Operation, 2 Tage postoperativ und vor der Entlassung. Es zeigte sich, dass die Patienten, die die Substanzen erhielten, weniger postoperative Infektionen entwickelt hatten, als die Patienten in der Kontrollgruppe. Das wurde aus einer signifikanten PCT-Erhöhung in der Kontrollgruppe abgeleitet. Allerdings hatte diese postoperative Komplikation keine Auswirkung auf die Liegezeit der Patienten auf der Intensivstation oder auf die Dauer des stationären Aufenthaltes nach Verlegung von der Intensivstation auf eine periphere Station zur Folge. Ebenfalls zeigten sich keine Unterschiede zwischen den beiden Kohorten in der Notwendigkeit einer antibiotischen Therapie, sowie im Auftreten von Kreislaufinstabilitäten oder den häufigsten Komplikationen.
Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine.
Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein.
Knochensialoprotein (BSP) ist ein Protein der extrazellulären Matrix im Knochen und mineralisierten Geweben, wird aber auch von verschiedenen Tumorzellen exprimiert (Bellahcene et al., 1994, 1997, 1998). Dies ist assoziiert mit einer schlechten Prognose und einem erhöhten Risiko für eine spätere Entwicklung von Knochenmetastasen. Diel et al. (1999) konnte zeigen, dass ein erhöhter Serum-BSP-Wert bei Patientinnen mit Mammakarzinom zu einem gehäuften Auftreten von Knochenmetastasen im Laufe der Erkrankung führt. BSP scheint ein Marker für die Entstehung von Knochenmetastasen zu sein. In der Literatur ist ein Antikörper beschrieben, der ein Epitop des BSP erkennt, welches im BSP aus Tumorzellen nicht glykosyliert ist, im BSP aus mineralisiertem Gewebe allerdings schon (Armbruster et al., 2009). Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass Knochenmetastasen verhindert werden können bei gleichzeitiger Gabe von Tumorzellen und Antikörpern gegen BSP beziehungsweise, dass bei vorhandenen Knochenmetastasen eine Behandlung der Tiere mit einem Anti-BSP-Antikörper die Metastasen zurückbildet (Bäuerle et al., 2005, 2006). In der aktuellen Arbeit wird die Expression von BSP an menschlichem Gewebe von Knochenmetastasen mit unterschiedlichen Primärtumoren mittels Immunhistochemie untersucht. Insgesamt wurden 35 Fälle von Knochenmetastasen mit Primärtumor eines Mammakarzinoms untersucht, wobei 22,9% eine BSP Expression aufweisen, davon 5,7% eine starke. Knochenmetastasen mit dem Primärtumor Prostatakarzinom sind mit 8 Fällen repräsentiert, wobei 75% positiv für BSP sind, davon 25% stark positiv. Die einzelnen Fälle zeigen eine starke BSP Expression im Stroma und eine schwache BSP Expression der Tumorzellen. Diese Ergebnisse des Antikörpers gegen normal glykosyliertes BSP wurden verglichen mit dem Antikörper gegen nicht glykosyliertes BSP. Der Nachweis von BSP in Tumorzellen zeigt dasselbe Ergebnis, BSP im Stroma wird durch den Antikörper gegen nicht- glykosyliertes BSP intensiver dargestellt. Daraus lässt sich folgern, dass der Antikörper gegen nicht- glykosyliertes BSP nicht spezifisch für die Isoform des BSP aus Tumorzellen ist, sondern gleichermaßen in der Routinediagnostik von BSP eingesetzt werden kann. Die Untersuchung könnte sogar darauf hinweisen, dass dieser Antikörper die nicht- glykosylierte Isoform im Stroma erkennt und damit bei Untersuchung des Stromas die bessere Alternative darstellt.
Die Herkunft hochenergetischer solarer Teilchen konnte in den vergangenen Jahren eindeutig auf Schockbeschleunigung an koronalen Masseauswürfen zurückgeführt werden. Durch resonante Interaktionen zwischen Wellen und Teilchen werden zum einen geladene Teilchen unter Veränderung ihrer Energie gestreut, zum anderen wird die Dynamik der Plasmawellen in solchen Beschleunigungsregionen durch diese Prozesse von selbstgenerierten Wellenmoden maßgeblich beeinflusst. Mittels numerischer Modellierungen wurden im Rahmen dieser Arbeit die grundlegenden physikalischen Regimes der Turbulenz und des Teilchentransports beschrieben. Die Simulation der Plasmadynamik bedient sich der Methodik der Magnetohydrodynamik, wohingegen kinetische Einzelteilchen durch die elementaren Bewegungsgleichungen der Elektrodynamik berechnet werden. Es konnten die Turbulenztheorien von Goldreich und Sridhar unter heliosphärischen Bedingungen bei drei solaren Radien bestätigt werden. Vor allem zeigten sich Hinweise für das Erreichen der kritischen Balance, einem Schlüsselparameter dieser Theorien. Weiterhin werden Ergebnisse der dynamischen Entwicklung angeregter Wellenmoden präsentiert, in denen die Bedeutsamkeit für die gesamte Turbulenz gezeigt werden konnte. Als zentraler Prozess bei hohen Energien hat sich das wave-steepening herausgestellt, das als effizienter Energietransportmechanismus in paralleler Richtung zum Hintergrundmagnetfeld identifiziert wurde und somit turbulente Strukturen bei hohen parallelen Wellenzahlen erklärt, deren Entstehung das Goldreich-Sridhar Modell nicht beschreiben kann. Darüber hinaus wurden grundlegende Erkenntnisse über die quasilineare Theorie des Teilchentransports erzielt. Im Speziellen konnte ein tieferes Verständnis für die Interpretation der Diffusionskoeffizienten von Welle-Teilchen Wechselwirkungen erlangt werden. Simulationen zur Streuung an angeregten Wellenmoden zeigten erstmals komplexe resonante Strukturen die im Rahmen analytischer Modelle nicht mehr adäquat beschrieben werden können.
5.1 Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden Tumore bestehen nicht nur aus Tumorzellen, sondern auch aus der sie umgebenden extrazellulären Matrix (EZM), und Stromazellen wie Fibroblasten (cancer-associated fibroblast; CAF) und Endothelzellen (tumor endothelial cell; TEC). Diese Stromazellen haben durch die Ausschüttung von Zytokinen, proteolytischen Enzymen, Wachstums- und Angiogenesefaktoren einen entscheidenden Einfluss auf die Tumorprogression. Sie unterscheiden sich von den Stromazellen der normalen Gewebe durch die Expression von sogenannten Tumorstroma-assoziierten Antigenen (TSAA). Damit sollten Therapien, die auf TSAA abzielen, universell einsetzbar und weniger anfällig gegenüber Resistenzentwicklungen (immune escape Mechanismen) sein, da Stromazellen im Gegensatz zu neoplastischen Zellen genetisch relativ stabil sind. Für eine Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden wählten wir die TSAA Endoglin und Fap, welche während der Wundheilung und im Tumorstroma induziert werden. Dabei sollte überprüft werden, ob prophylaktische Vakzinierungen in C57Bl/6j Mäusen Peptid-reaktive T-Zellen induzieren können, und das Wachstum von transplantieren Grm1-transgenen Tumoren reduziert werden kann. In der Tat konnten wir sowohl bei Endoglin- als auch bei Fap Peptid vakzinierten Tieren in vivo Peptid-reaktive Lymphozyten im Blut und zu einem geringeren Anteil auch in der Milz nachweisen, welche Peptid-gepulste syngene Milzzellen lysieren konnten. Allerdings konnte in beiden Fällen keine Reduktion des Tumorwachstums gegenüber der Kontrollgruppe beobachtet werden. Bei der Fap-Peptid-vakzinierten Gruppe war das Tumorwachstum gegenüber der Kontrollgruppe sogar gesteigert. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Induktion Fap-Peptid-reaktiver T-Zellen tumorpromovierend wirkt. Möglicherweise könnte aber durch eine Modifikation des Vakzinierungsprotokolls bzw. durch eine Kombination mit anderen Immuntherapeutika ein verbessertes Ansprechen auf eine Endoglin bzw. Fap basierte Immuntherapie erzielt werden. 5.2 Immunsuppressive Mechanismen im Grm1-transgenen Melanom-Modell Grm1-transgene Mäuse entwickeln spontan kutane Melanome. Dieses Modell erlaubte es uns in der vorliegenden Arbeit spontane Immunantworten im Laufe der Melanomentstehung zu untersuchen. Hierfür analysierten wir sowohl ex vivo als auch in vitro aus Milz und Lymphknoten gewonnene Lymphozyten von Mäusen, welche keine Tumorläsionen bzw. eine niedrige oder hohe Tumorlast aufwiesen. Dabei konnten wir ex vivo einen Anstieg der Frequenz aktivierter CD4+ und CD8+ Lymphozyten mit zunehmender Tumorlast zeigen. Bei tumortragenden Tieren exprimierten jedoch hauptsächlich CD4+ T-Zellen Aktivierungsmarker nach in vitro Stimulation. Interessanterweise waren diese Zellen tumortragender Tiere auch funktionell beeinträchtigt, was sich in einer verminderten Proliferationskapazität nach in vitro Stimulation zeigte. Weitere Analysen ergaben, dass die erhöhte Frequenz regulatorischer T Zellen bei tumortragenden Tieren ein frühes Ereignis im Laufe der Tumorentstehung ist. Gleichzeitig konnte auch ein starker Anstieg der immunsupprimierenden Zytokine Tgf-β1 und Il-10 sowohl in den Lymphknoten als auch im Tumorgewebe beobachtet werden. Dabei war die Tgf-β1-Expression sowohl im Tumor als auch im tumor-drainierenden Lymphknoten erhöht, während Il-10 im Tumor nur moderat exprimiert wurde, was eine komplexere Regulation der Il-10-Expression nahe legt. Dies bedeutet, dass in Grm1-transgenen Mäusen ähnlich wie auch bei Melanompatienten zelluläre und zytokinabhängige Mechanismen zur Tumorentstehung beitragen und dieses Modell daher geeignet ist, um präklinisch immunmodulierende Therapieansätze zu testen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Einblicke bezüglich des Transport-prozesses vakuolärer Protonenpumpen, Zuckertransporter und des SV-Kanals von Arabidopsis thaliana gewonnen: 1. Mittels Patch-clamp-Technik wurden ATP- und Pyrophosphat-induzierte Pump-ströme an Mesophyllvakuolen des Wildtyps gemessen. Die durch ATP hervor-gerufenen Pumpströme konnten durch den spezifischen V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A vollständig inhibiert werden. Messungen an der V-ATPase-Doppelmutante vha-a2-vha-a3 hingegen zeigten eine kaum vorhandene ATPase-Aktivität auf. Die vakuoläre Pyrophosphatase-Aktivität der vha-a2-vha-a3-Mutante war mit dem WT vergleichbar und konnte die verminderten Pumpströme der V-ATPase nicht kompensieren. Zudem wurde an A. thaliana WT-Pflanzen die Expressionsrate und Pumpstromdichte der V-ATPase von Schließzellen und Mesophyllzellen untersucht. Dabei konnte bei Schließzellen eine höhere Expressionsrate sowie Pumpleistung im Vergleich zu Mesophyllzellen detektiert werden, wodurch an der vakuolären Membran von Schließzellen eine starke protonenmotorische Kraft generiert werden kann. 2. Des Weiteren wurden die Transporteigenschaften des im Tonoplasten lokalisierten Transportproteins AtINT1 an Arabidopsis Mesophyllzellen des Wildtyps näher untersucht. Unter inversen pH-Wert-Bedingungen konnte AtINT1 als Symporter identifiziert werden, welcher myo-Inositol H+-gekoppelt aus der Vakuole in das Cytosol transportiert. 3. Überdies wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung des AtSUC4-Transporters durchgeführt. Unter einem physiologischen Protonengradienten konnte bei WT- und Atsuc4.1-Vakuolen ausschließlich ein Saccharose/H+ ge-triebener Antiportmechanismus detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten 60 % der AtSUC4-ÜE unter inversen pH-Gradienten während Saccharose-Applikation Ströme, die auf einen Saccharose/H+-Symportmechanismus hinweisen. Bei der Atsuc4.1-Verlustmutante hingegen konnten unter gleichen Lösungsbedingungen ausschließlich Ströme detektiert werden, die mit einem Saccharose/H+-gekoppelten Antiportmechanismus in Einklang zu bringen sind. Durch die Erkenntnisse der Arbeitsgruppe unter Norbert Sauer, Universität Erlangen, wird die Vermutung untermauert, dass AtSUC4 Saccharose im Symport mit H+ aus der Vakuole in das Cytosol transportiert und somit eine Rolle bei der Remobilisierung der in der Vakuole gespeicherten Saccharose übernimmt. 4. Darüber hinaus konnten Studien am nichtselektiven spannungsabhängigen „slow-vacuolar-channel“ (SV-Kanal) von Arabidopsis Mesophyllvakuolen durchgeführt werden. Dabei wurde das 14-3-3-Protein GRF6 als regulatorisches Protein identifiziert, welches die SV-Kanalaktivität stark verringert. Die gain-of-function Mutante fou2 mit der Punktmutation D454N im TPC1-Kanalprotein zeigt abweichende Kanaleigenschaften zum WT auf. Das Aktivie-rungspotential des fou2-SV-Kanals liegt bei 30 mV negativeren Membranspan-nungen, was die Offenwahrscheinlichkeit des SV-Kanals unter physiologischen Membranspannungen erhöht. Die fou2-Mutation beeinflusst außerdem die luminale Ca2+-Bindestelle des SV-Kanals, wodurch die Affinität bzgl. luminalem Ca2+ geringer ist und die fou2-SV-Kanalaktivität bei hohen luminalen Ca2+-Konzentrationen bestehen bleibt. Die absolute Offenwahrscheinlichkeit des WT-SV-Kanals nimmt mit Ansäuern des vakuolären Lumens im Gegensatz zum fou2-SV-Kanal stark ab, die Einzelkanalleitfähigkeit des WT- als auch des fou2-SV-Kanals dagegen zu. Anhand der durchgeführten Messungen konnte eine regulatorische, vakuolär gelegene Ca2+-Bindestelle des TPC1-kodierten Kanals lokalisiert und charakterisiert werden, welche sich vermutlich nahe am Spannungssensor befindet und unter physiologischen Membranspannungen einen einwärtsgerichteten Kationenstrom ermöglicht. 5. Ferner wurden SV-Kanäle von Schließzellen untersucht und deren spezifische Eigenschaften mit Mesophyll-SV-Kanälen verglichen. In Schließzellen liegt neben einer erhöhten Transkriptmenge des single-copy Gens TPC1 eine höhere Stromdichte des SV-Kanals vor. Unter einwärtsgerichtetem K+-Gradienten liegt das Aktivierungspotential von Schließzell-SV-Kanäle um 30 mV negativer als bei Mesophyllvakuolen, was unter physiologischen Membranspannungen zu einem ausgeprägtem K+-Einstrom führt. Darüber hinaus zeigte der Schließzell-SV-Kanal eine höhere Permeabilität von Na+- gegenüber K+-Ionen (1,3:1) auf. Während Schließzell- und Mesophyll-SV-Kanäle eine vergleichbare luminale Ca2+-Sensitivität aufweisen, zeigen Schließzell-SV-Kanäle eine höhere cytosoli-sche Ca2+- und vakuoläre pH-Sensitivität auf. Sequenzanalysen der TPC1-cDNA zeigten, dass die Zelltypspezifischen Unterschiede des SV-Kanals nicht durch posttranskriptionale Modifikation hervorgerufen werden.