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Imprinted genes play important roles in brain development. As the neural developmental capabilities of human parthenogenetic embryonic stem cells (hpESCs) with only a maternal genome were not assessed in great detail, hence here the potential of hpESCs to differentiate into various neural subtypes was determined. In addition DNA methylation and expression of imprinted genes upon neural differentiation was also investigated. The results demonstrated that hpESC-derived neural stem cells (hpNSCs) showed expression of NSC markers Sox1, Nestin, Pax6, and Musashi1 (MS1), the silencing of pluripotency genes (Oct4, Nanog) and the absence of activation of neural crest (Snai2, FoxD3) and mesodermal (Acta1) markers. Moreover, confocal images of hpNSC cultures exhibited ubiquitous expression of NSC markers Nestin, Sox1, Sox2 and Vimentin. Differentiating hpNSCs for 28 days generated neural subtypes with neural cell type-specific morphology and expression of neuronal and glial markers, including Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 and GABA. hpNSCs also responded to region-specific differentiation signals and differentiated into regional phenotypes such as midbrain dopaminergic- and motoneuron-type cells. hpESC-derived neurons showed typical neuronal Na+/K+ currents in voltage clamp mode, elicited multiple action potentials with a maximum frequency of 30 Hz. Cell depicted a typical neuron-like current pattern that responded to selective pharmacological blockers of sodium (tetrodotoxin) and potassium (tetraethylammonium) channels. Furthermore, in hpESCs and hpNSCs the majority of CpGs of the differentially methylated regions (DMRs) KvDMR1 were methylated whereas DMR1 (H19/Igf2 locus) showed partial or complete absence of CpG methylation, which is consistent with a parthenogenetic (PG) origin. Upon differentiation parent-of-origin-specific gene expression was maintained in hpESCs and hpNSCs as demonstrated by imprinted gene expression analyses. Together this shows that despite the lack of a paternal genome, hpNSCs are proficient in differentiating into glial- and neuron-type cells, which exhibit electrical activity similar to newly formed neurons. Moreover, maternal-specific gene expression and imprinting-specific DNA-methylation are largely maintained upon neural differentiation. hpESCs are a means to generate histocompatible and disease allele-free ESCs. Additionally, hpESCs are a unique model to study the influence of imprinting on neurogenesis.
Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob mittels IHH-Gentransfer aus Hüftköpfen gewonnene hMSCs chondrogen im Pelletkultursystem differenziert werden können und ob zugleich durch IHH eine Modulation der hypertrophen Enddifferenzierung der hMSCs in diesem System möglich ist. IHH bestimmt in der Wachstumsfuge zusammen mit PTHrP während der endochondralen Ossifikation die Chondrozytenreifung und -differenzierung entscheidend mit und ist daher ein interessanter Kandidat zur Induktion von hyalinem oder zumindest hyalin-ähnlichem Knorpelgewebe in der stammzellbasierten Gentherapie. Nach Gewinnung und Kultivierung der hMSCs wurden diese mit Ad.GFP, Ad.IHH, Ad.IHH+TGF-β1, Ad.IHH+SOX-9 oder Ad.IHH+BMP-2 transduziert bzw. ein Teil für die Negativkontrolle nicht transduziert und im Anschluss alle Gruppen zu Pellets weiterverarbeitet. Histologische, biochemische sowie molekularbiologische Untersuchungen wurden an verschiedenen Zeitpunkten zur Evaluierung des chondrogenen Differenzierungsgrades sowie der hypertrophiespezifischen Merkmale der kultivierten Pellets durchgeführt. Es konnte durch diese Arbeit sowohl auf Proteinebene als auch auf Genexpressionsebene reproduzierbar gezeigt werden, dass primäre hMSCs im Pelletkultursystem sowohl durch den adenoviralen Gentransfer von IHH allein als auch durch die Co-Transduktionsgruppen IHH+TGF-β1, IHH+SOX-9 und IHH+BMP-2 chondrogen differenziert werden können. Dabei zeigten alle IHH-modifizierten Pellets Col II- und CS-4-positive immunhistochemische Anfärbungen, eine gesteigerte Synthese von Glykosaminoglykanen im biochemischen GAG-Assay sowie eine Hochregulation von mit der Chondrogenese assoziierten Genen. Das Auftreten hypertropher Merkmale bei den chondrogen differenzierten MSCs konnte durch IHH-Gentransfer nach 3 Wochen in vitro-Kultivierung nicht vollkommen unterdrückt werden, war jedoch besonders stark ausgeprägt, wenn BMP-2 co-exprimiert wurde und war etwas weniger evident in der IHH+SOX-9-Gruppe. Dabei zeigte die Ad.IHH+BMP-2-Gruppe sowohl in der ALP-Färbung als auch in dem ALP-Assay und der quantitativen RT-PCR die stärkste Hochregulierung des hypertrophen Markers ALP. Möglicherweise brachte die Überexpression von IHH das fein aufeinander abgestimmte Regulationssystem zwischen IHH und PTHrP aus dem Gleichgewicht und könnte als ein Grund dafür angeführt werden, warum die Hypertrophie im Pelletkultursystem nicht vollkommen supprimiert werden konnte. Es bleibt abzuwarten, ob IHH in vivo die Chondrogenese induzieren und dabei zugleich das Phänomen der chondrogenen Hypertrophie regulieren kann. In der Zukunft würde dies letztlich der stammzellbasierten Knorpelregeneration in vivo zu Gute kommen.