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Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren.
Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können.