Refine
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- yes (3)
Document Type
- Doctoral Thesis (3)
Keywords
- Glia (3) (remove)
Institute
Sonstige beteiligte Institutionen
In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte des neurotrophen Faktors GDNF auf die Struktur und Funktion der intestinalen Epithelbarriere untersucht. Zellkulturen mit Caco2 beziehungsweise HT29B6 dienten als Modellsysteme für die Epithelschicht der Darmschleimhaut. Transwellsassays und TER-Messungen mittels ECIS-Gerät fungierten als zentrale Untersuchungsmethoden zur Evaluation der funktionellen Barriereeigenschaft der Zellmonolayer. Die morphologischen und quantitativen Veränderungen von Zelljunktionsproteinen wurden mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbungen beziehungsweise Western Blot-Untersuchungen dargestellt. Um Migration- und Proliferationsverhalten nach Verletzung des Zellmonolayers zu untersuchen, führten wir in vitro-Scratch-Assays durch.
Zunächst wurde bestätigt, dass intestinale Epithelzellen die GDNF-Rezeptoren GFRα1, GFRα2 und RET exprimieren. Es zeigte sich sowohl in Immunfärbungen gegen Junktionsproteine als auch in Permeabilitätsmessungen, dass GDNF zu einer verstärkten Differenzierung der intestinalen Epithelbarriere führt. In Inhibitions- und Aktivierungsexperimenten mit verschiedenen Mediatoren wurde als zugrunde liegender Mechanismus die Inaktiverung der p38 MAPK durch GDNF identifiziert. Weiterhin zeigten Versuche mit epithelialen Wundheilungsassays, dass GDNF, über eine cAMP/PKA-abhängige Induktion der Proliferation, zu einer Verbesserung der Wundheilung führt. In Immunfärbungen und Western Blot-Analysen wurde beobachtet, dass auch intestinale Epithelzelllinien in der Lage sind GDNF zu synthetisieren.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der neurotrophe Faktor GDNF direkt auf die Differenzierung und Proliferation von kultivierten Enterozyten Einfluss nehmen kann. Die Tatsache, dass intestinale Epithelzellen selbst GDNF synthetisieren und sezernieren können, weist auf einen neuen autokrinen- oder parakrinen Wirkmechanismus des neurotrophen Faktors hin.
Multiple Sklerose ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die zu motorischen, sensiblen und vegetativen Einschränkungen führt. Häufig beginnt die Erkrankung mit einem schubförmigen Verlauf, dem eine progrediente Verschlechterung folgt. Trotzdem leiden ca. 15% der Patienten bereits von Beginn an, an einer primär progressiven Variante der MS, die bereits mit der progredienten Phase beginnt. Bis jetzt ist die Pathophysiologie nicht vollständig verstanden. Lange Zeit dachte man, dass MS primär eine reine Autoimmun-Erkrankung darstellt, aber in den letzten Jahren ergab sich die Frage, ob es vor allem in den progressiven Formen, eine zytodegenerative Komponente gibt, auf die eine sekundäre Inflammation folgt. Eine mögliche Ursache stellen hier Mutationen des PLP 1 Gens dar, die normalerweise mit leukodystrophischen Erkrankungen assoziiert sind. Es gab zwei Fallberichte, in denen von Patienten berichtet wurde, die unterschiedliche Mutationen in diesem Gen hatten und den klinischen Phänotyp einer MS zeigten. Diese Arbeit sollte nun die Auswirkungen der Mutationen, beziehungsweise einer Nullmutation des PLP 1 Gens in 18- und zum Teil 12-Monate alten Mausmutanten untersuchen. Hier konnten Myelin-Veränderungen und axonaler Schaden in immunhistochemischen Untersuchungen sowie mittels Elektronenmikroskopie und optischer Kohärenztomographie gezeigt werden. Weiter konnte eine Neuroinflammation und damit einhergehend eine zunehmende Anzahl CD8+ T-Zellen sowie einer erhöhten Anzahl an Mikroglia/Makrophagen gefunden werden. Dies ging mit vergleichsweise reduzierten Leistungen der Mutanten bei der motorischen Rotarod-Analyse einher. Interessanterweise wurde weniger neuraler Schaden in den heterozygoten Varianten gefunden, obwohl das Ausmaß der Entzündung gleichblieb. Dies könnte für eine zielgerichtete immunvermittelte Schädigung der Oligodendrozyten sprechen, die zu neuronalem Schaden führt. So konnte gezeigt werden, dass es durch Punktmutationen in einem Myelinprotein-codierendem Gen zu einer sekundären Entzündung kommen kann, die mit dem klinischen Phänotyp einer progressiven MS einhergeht. Weiter sind diese Mausmodelle ein Beispiel für eine genetische Erkrankung des ZNS, in denen die Klinik maßgeblich durch die begleitende Inflammation und nicht allein durch den genetischen Schaden verursacht wird.
The enteric nervous system (ENS) innervates the gastrointestinal (GI) tract and controls central aspects of GI physiology including contractility of the intestinal musculature, glandular secretion and intestinal blood flow. The ENS is composed of neurons that conduct electrical signals and of enteric glial cells (EGCs). EGCs resemble central nervous system (CNS) astrocytes in their morphology and in the expression of shared markers such as the intermediate filament protein glial fibrillary acidic protein (GFAP). They are strategically located at the interface of ENS neurons and their effector cells to modulate intestinal motility, epithelial barrier stability and inflammatory processes. The specific contributions of EGCs to the maintenance of intestinal homeostasis are subject of current research.
From a clinical point of view EGC involvement in pathophysiological processes such as intestinal inflammation is highly relevant. Like CNS astrocytes ECGs can acquire a reactive, tissue-protective phenotype in response to intestinal injury. In patients with chronic inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease and ulcerative colitis, alterations in the EGC network are well known, particularly a differential expression of GFAP, which is a hallmark of reactive gliosis in the CNS.
With increasing recognition of the role of EGCs in intestinal health and disease comes the need to study the glial population in its complexity. The overall aim of this thesis was to comprehensively study EGCs with focus on the reactive GFAP-expressing subpopulation under inflammatory conditions in vivo and in vitro. In a first step, a novel in vivo rat model of acute systemic inflammation mimicking sepsis was employed to investigate rapidly occuring responses of EGCs to inflammation. This study revealed that within a short time frame of a few hours, EGCs responded to the inflammation with an upregulation of Gfap gene expression. This inflammation-induced upregulation was confined to the myenteric plexus and varied in intensity along the intestinal rostro-caudal axis. This highly responsive myenteric GFAP-expressing EGC population was further characterized in vivo andin vitro using a transgenic mouse model (hGFAP-eGFP mice). Primary purified murine GFAP-EGC cultures in vitro were established and it was assessed how the transcriptomic and proteomic profiles of these cells change upon inflammatory stimulation. Here, myenteric GFAP-EGCs were found to undergo a shift in gene expression profile that predominantly affects expression of genes associated with inflammatory responses. Further, a secretion of inflammatory mediators was validated on protein level. The GFAP+ subpopulation is hence an active participant in inflammatory pathophysiology. In an acute murine IBD model in vivo, GFAP-EGCs were found to express components of the major histocompatibility complex (MHC) class II in inflamed tissue, which also indicates a crosstalk of EGCs with the innate and the adaptive lamina propria immune system in acute inflammation.
Taken together, this work advances our knowledge on EGC (patho-)physiology by identifying and characterizing an EGC subpopulation rapidly responsive to inflammation. This study further provides the transcriptomic profile of this population in vivo and in vitro, which can be used to identify targets for therapeutic intervention. Due to the modulating influence of EGCs on the intestinal microenvironment, the study further underlines the importance of integrating EGCs into in vitro test systems that aim to model intestinal tissues in vitro and presents an outlook on a potential strategy.