Refine
Has Fulltext
- yes (2)
Is part of the Bibliography
- yes (2)
Year of publication
- 2009 (2) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (2)
Keywords
- Pseudomonas syringae (2) (remove)
Institute
Phytohormones are known for their pivotal roles in promoting normal growth and development of the plants and contributing to the mechanism of defense. Although an over simplification, however, they may be categorized as stress specific and growth promoting. SA and JA/Ethylene are implicated in stress responses while auxins, cytokinins and gibberellins are involved in developmental processes. Phytohormones from the above perspective got much attention in the last few decades; however their reciprocal role is currently in focus. It is because of the reason that plant pathogens cause overall hormonal imbalance at host pathogen interface and alter host physiology for the sake of pathogenecity. Despite their importance in growth and development, cytokinins are among the most neglected phytohormones that are usually noticed as consequence rather than a cause of pathogen infection. Results presented in this thesis are based on the hypothesis that elevated levels of CKs embody plants with resistance against hemibiotrophic pathogens. To explore a connection between the spread of P. syringae and its tobacco host, CKs over producing transgenic plants were investigated whereby bacterial IPT gene was expressed under the control of pathogen inducible, tetracycline inducible and developmentally inducible promoters. To further validate the out-come of transgenic plants, various types of cytokinins were exogenously fed to detached tobacco leaves. Mentioned transgenics and exogenous CKs feeding approaches unanimously resulted in, “more cytokinins less disease symptoms” and vice versa. This state of cytokinins mediated resistance was further substantiated with various cellular, signaling, biochemical and microbial approaches wherein levels of SA and JA remained unaffected. Conversely, PR1 gene expression was strongly up-regulated in enhanced cytokinins accumulating samples. Moreover, less accumulation of ROS was observed in IPT expressing sites of the plants as compared to their corresponding controls. Additionally, we neither noticed any direct effect of cytokinins on the growth of P. syringae pv. tabaci nor found presence of anti-microbial peptides in cytokinins enriched extracts. Interestingly, enhanced accumulation of phtyoalexins in elevated CKs status of the plant proved to be a possible gesture in jeopardizing the spread of pathogen. Contrarily, no reduction was observed in the spread of fungal necrotrophic pathogen Sclerotinia sclerotiorum when leaves of elevated CKs were inoculated. Besides host-pathogen interaction in perspective of elevated cytokinins, impact of modulated sugar status of the plant on the spread of pathogen was also investigated. For this purpose, previously generated modulated invertase enzyme tobacco transgenic plants were analyzed. We showed that repression and de-repression of CIN1 gene under the control of tetracycline inducible-promoter did not affect the growth of P. syrinage pv. tabaci in Tet::CIN1 transgenic plants. Moreover, invertase inhibitor tobacco lines expressing NtCIF gene under the control of the same promoter failed to exhibit differential pathogenic responses in induced and non induced status of the plant. Similar was the case of tomato transgenic plants expressing NtCIF gene under the control of invertase gene Lin6 promoter in Lin6:: NtCIF plants for P.syringae pv. tomato DC 3000. Interestingly, when challenged Lin6:: NtCIF tomato plants with Botrytis cinerea, severe disease symptoms were observed on transgenic leaves as compared to control plants. To dissect a potential link between cytokinins and sugar metabolism with its effect on the growth of pathogen, invertase transgenic plants with elevated CKs were probed. When expressed exogenous IPT gene under the control of pathogen inducible promoter (4xJERE::IPT) in transgenic background of Tet::CIN1, we observed localized differences in symptom development for P.syringae pv. tabaci. Similarly, when exogenously fed with kinetin, detached leaves of Tet::CIN1 exhibited retarded growth of P.syringae pv. tabaci as compared to the tetracycline induced leaves. These results led to the conclusion that extracellular invertase may not play an essential role in cytokinins mediated disease resistance against hemibiotrophic pathogens.
An der pflanzlichen Plasmamembran geschieht die erste Wahrnehmung von mikrobiellen Molekülen, die MAMPs genannt werden. MAMP/PAMP Rezeptoren leiten frühe Abwehrantworten, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), externe Alkalisierung oder Ethylen, ein. Die Arabidopsis FLS2 rezeptorartige Kinase (RLK) stellt einen plasmamembran-lokalisierten MAMP Rezeptor dar, der über die Detektion des Flagellum von Pseudomonas species, eine basale Immunität in Arabidopsis thaliana vermittelt. Flg22, der kürzeste aktive Teil des bakteriellen Flagellins besteht aus 22 Aminosäuren und ist der bestuntersuchte bakterielle Elizitor. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir eine starke Beteiligung von Ionenflüssen in der Initiationsphase der basalen Immunität. Unsere Messungen an intakten Arabidopsis Pflanzen und Pflanzengeweben sind in höchstem Masse reproduzierbar und öffnen eine neue Sicht, über die Natur von Ionentransporten in der Pflanzen - Mikroben Interaktion. Als Antwort auf die Applikation von flg22, haben wir nach einer Verzögerungsphase von etwa 2 Minuten eine transiente, dosis-abhängige Depolarisation (EC50=0,2 nM) in Mesophyll- und Wurzelhaarzellen von A. thaliana messen können. Das um 2 Aminsäuren kürzere Peptid flg22 Δ2 oder das Flagellin anderer Bakterien (Agrobacterium or Azospirillum) führten zu keiner Membrandepolarisation. Ebenso konnten keine Membranspannungsänderungen in dem Arabidopsis Ökotypen Ws-0, dem der funktionelle FLS2 Rezeptor fehlt, detektiert werden. Die Komplementation von Ws-0 Pflanzen mit dem intakten FLS2 Rezeptorgen rief eine Resensibilisierung für flg22 hervor. Mit dem EF-Tu Elizitor Peptid aus E.coli, welches durch den Arabidopsis MAMP Rezeptor EFR detektiert wird, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Auf der Basis von Aequorin wurden Kalzium-induzierte Lumineszenzmessungen durchgeführt, in denen ein transienter Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration als Antwort auf die Applikation von flg22 gemessen werden konnte. Dosis-Abhängigkeitsmessungen von flg22 und [Ca2+]cyt wiesen zwei unterschiedliche EC50 Werte, von 43 ± 2 pM und 67 ± 42 nM, auf. Möglicherweise wird auf zwei verschiedene Kalziumpools zugegriffen oder es werden zwei verschiedene Kalziumleitfähigkeiten aktiviert. Die Ionenkanalaktivierung und folgende Depolarisation benötigt die aktive Rezeptorkinase. In bak1-4 Arabidopsis Pflanzen, in denen die FLS2 Untereinheit BAK1 – eine weitverbreitete RLK, die auch mit dem Brassinosteroid Rezeptor assoziiert ist – fehlt, konnte keine Depolarisation als Antwort auf flg22 gemessen werden. Arabidopsis Mesophyllzellen zeigten die typische Alkalisierung des Apoplasten als Antwort auf flg22. Nicht-invasive MIFETM Experimente mit Ionen-selektiven Elektroden ergaben, dass der pH-Anstieg durch einen Einstrom von Protonen hervorgerufen wurde. Zusätzlich wurde ein Ausstrom von Chlorid und Kalium aufgezeichnet. Ähnlich wie das Kalziumsignal waren alle detektierten Ionenströme von transienter Natur. Im zweiten Ansatz wurden Membranpotential-Messungen durchgeführt, während in der externen Lösung die Konzentrationen von Protonen, Kalzium, Kalium oder Anionen variiert wurden. Nur eine Änderung des Anionengradienten hatte einen entscheidenden Einfluss auf die flg22-induzierte Depolarisation, was die Wichtigkeit der Anionenkanalaktivierung unterstreicht. Exudat Analysen ergaben, dass Nitrat das bevorzugt transportierte Ion ist. Unter zahlreichen getesteten Ionenkanalblockern erwies sich lediglich Lanthan als effektiver Blocker des flg22-induzierten zytosolichen Kalziumanstiegs, des Protoneneinstroms und der Membrandepolarisation. Da Lanthan bekanntlich unspezifische Kationenkanäle blockt, kann man an diesem Punkt davon ausgehen, dass Kalzium-aktivierte Anionenkanäle die Membrandepolarisation vermitteln und darauf eine Aktivierung von auswärtsgerichteten Kaliumkanälen folgt. Zukünftige Studien mit Doppelläufigen-Mikroelektroden Spannungsklemmexperimenten oder externen ionenselektiven Elektroden an intakten Schliesszellen werden helfen weitere Informationen über die Natur der Ionenkanäle in der basalen Immunität oder generell in der Pflanzen-Mikroben Interaktion zu erhalten. Über die elektrophysiologische Charakterisierung der multiplen Ionenströme in der basalen Immunität hinaus, ist natürlich der nächste wichtige Schritt das oder die Gene zu finden, die für die Ionenkanäle oder Transporter kodieren, die durch nicht nekrotisierende Elizitoren wie flg22 in der basalen Immunantwort in Pflanzen aktiviert werden.