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Die Rolle von Chronophin bei Schlaganfall-induziertem Funktionsverlust der Blut-Hirn-Schranke
(2018)
Der ischämische Schlaganfall ist mit einer jährlichen Inzidenz von 200/100 000 Einwohnern die häufigste Gefäßerkrankung in Deutschland. Atherothrombose, arterielle Hypertonie und Embolien unterschiedlichen Ursprungs sind die wesentlichen Ursachen des ischämischen Schlaganfalls. Die neurologischen Defizite nach einem Schlaganfall resultieren aus einem gestörten zerebralen Blutfluss und somit einer insuffizienten Sauerstoffversorgung. Zusätzlich ist die Ödembildung, welche von einer gesteigerten Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke verursacht wird, am neuronalen Zelltod beteiligt.
Chronophin ist eine Aktinzytoskelett-regulierende Serin-Phosphatase. In einem ischämischen Schlaganfall-Modell konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass der globale Verlust von Chronophin zu einer vermehrten Ödembildung und einem aggravierten neurologischen Zustand der Mäuse im Vergleich zu wildtypischen Kontrollen führte. Hirnlysate von wildtypischen Mäusen zeigten verringerte Chronophin-Level in der vom Schlaganfall betroffenen Hemisphäre. Jedoch konnten initiale immunhistochemische und zellbiologische Untersuchungen weder Chronophin-abhängige Veränderungen der Blut-Hirn-Schranke feststellen noch einen zerebralen Zelltyp identifizieren, der für den schützenden Effekt von Chronophin verantwortlich ist.
Diese Ergebnisse weisen auf einen komplexen, vielzelligen Mechanismus hin, dem die schützende Rolle von Chronophin im ischämischen Schlaganfall unterliegt. Die Entschlüsselung dieses Mechanismus ist Aufgabe künftiger Untersuchungen.
Die Phosphoglykolat-Phosphatase PGP (früher auch als AUM bezeichnet) wurde in unserem Labor als Mitglied der HAD-Typ-Phosphatasen identifiziert. Die genetische Inaktivierung des Enzyms im gesamten Mausorganismus führt ab E8.5 zu einer Wachstumsverzögerung muriner Embryonen und bis E12.5 schließlich zu deren Tod. Im Gegensatz dazu sind Mäuse mit einer PGP-Inaktivierung in hämatopoetischen Zellen und im Endothel lebensfähig und phänotypisch unauffällig. Neue Erkenntnisse schreiben dem Enzym neben einer Aktivität gegenüber Phosphoglykolat auch Aktivitäten gegenüber Glycerin-3-phosphat (G3P), P-Erythronat und P-Lactat zu. Da diese Phosphatase-Aktivitäten Auswirkungen auf den Lipidstoffwechsel nahelegen, wurde in der vorliegenden Arbeit mittels massenspektrometrischer Methoden der Einfluss der Phosphoglykolat-Phosphatase auf den Metabolismus von Signal-, Membran- und Speicherlipiden in murinen Embryonen und Lymphozyten untersucht.
Nach Inaktivierung der PGP im gesamten Organismus wurden in E8.5-Embryonen erhöhte Diacylglycerin (DG)-, Triacylglycerin (TG)- und Sphingomyelin (SM)-Spiegel gemessen, während niedrigere Phosphatidylcholin (PC)-Level vorlagen.
In PGP-inaktivierten Lymphozyten waren G3P-, DG-, TG-, PC- und SM-Level nicht verändert. Dafür kam es zu signifikanten Erhöhungen der Phosphatidylglycerol (PG*)- und Cardiolipin (CL)-Spiegel.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die PGP in unterschiedlichen Geweben differenzielle Effekte auf die Spiegel verschiedener Lipide hat. Dies deckt neue Funktionen der PGP für die Regulation des Lipidmetabolismus auf. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen über die genauen Ursachen und Folgen dieser Regulation dar und lässt auf eine wichtige Rolle der PGP als metabolische Phosphatase im Organismus schließen.
Staphylococcus aureus ist ein Kommensale, der die menschliche Haut und Schleimhaut der Nase und des Rachens besiedelt. Der Keim verursacht aufgrund zahlreicher Virulenzfaktoren leichte aber auch schwere Infektionen wie Pneumonie, Endokarditis oder Sepsis. Die Behandlung von S. aureus-Infektionen gestaltet sich heutzutage schwierig, da der Keim Resistenzen gegen verschiedenste Antibiotika ausgebildet hat. Zur Bekämpfung dieser Resistenzen werden neue Antibiotika benötigt, die u.a. mit der Zellphysiologie und der Zellwandwandsynthese der Bakterien interferieren.
Die Zellphysiologie und Zellwandsynthese wird abhängig von der Wachstumsphase und Umwelt-einflüssen in den Bakterien streng reguliert. Neben den Zweikomponentensystemen sind Serin/Threonin-Proteinkinasen und -Phosphatasen wesentliche Sensoren und Regulatoren der Bakterien. Durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung bewirken diese beiden Systeme eine Hemmung oder Aktivierung der entsprechenden Zielproteine. Dadurch kann sich die Bakterienzelle an innere und äußere Reize anpassen. In dieser Arbeit wurde die konservierte Serin/Threonin-Proteinkinase Stk und die Serin/Threonin-Phosphatase Stp von S. aureus untersucht. Die beiden Proteine Stk und Stp haben einen großen Einfluss auf die Signalweiterleitung, den zentralen Metabolismus, die Stressantwort, die Antibiotikaresistenz und die Virulenz von S. aureus.
Im ersten Teil dieser Arbeit wird dargelegt, dass Stk und Stp in der bakteriellen Membran lokalisiert sind, dort miteinander interagieren und antagonistisch Zielproteine phosphorylieren bzw. dephospho-rylieren. Die Deletion der Phosphatase Stp bewirkt, dass zahlreiche Proteine in der Zelle permanent phosphoryliert und daher vermutlich nur noch eingeschränkt funktionstüchtig sind. Die ausbleibende Dephosphorylierung der Proteine in der stp-Mutante hat einen dramatischen Effekt auf die Zellwand-synthese und die Virulenz von S. aureus. So hat die stp-Mutante eine verdickte Zellwand und ist weniger virulent als die stk-Mutante und der Wildtypstamm. Im Rahmen dieser Arbeit wird erstmals eine Erklärung präsentiert, die die strukturellen Besonderheiten von Stk und deren Auswirkung auf die Zellwandsynthese zusammenführt: In der stp-Mutante akkumulieren Zellwandvorläufer in der Zelle, da vermutlich die entsprechenden Zellwandsyntheseproteine durch Stk-vermittelte Phosphorylierung gehemmt werden. Die Proteine FemXAB nehmen eine zentrale Rolle in der Zellwandsynthese ein, indem sie die Pentaglycin-Interpeptidbrücke des Zellwandvorläufers Pentaglycin-Lipid II syntheti-sieren. Stk wird durch die Bindung seiner extrazellulären Domänen an Pentaglycin-Lipid II aktiviert. In der vorliegenden Arbeit konnte FemX als in vitro Substrat von Stk und Stp identifiziert werden. Die permanente Phosphorylierung von FemX in der stp-Mutante führt zur verminderten Synthese der Pentaglycin-Brücken am Lipid II und infolgedessen zum Einbau von unvollständigen Muropeptiden in den neuen Peptidoglycanstrang. Diese strukturelle Veränderung führt zur Verdickung der Zellwand und folglich zur verminderten Empfindlichkeit gegenüber der Glycyl-Glycinpeptidase Lysostaphin. Neben FemX interagiert Stk mit weiteren Zellwandsyntheseproteinen wie FemAB und einigen Zellteilungsproteinen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Stk das Vorkommen seines extrazellulären Liganden Lipid II detektiert und dementsprechend die Zellwandsynthese über FemX reguliert.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde anhand verschiedener Omics-Techniken die stk-, stp- und stk/stp-Mutante im Vergleich zum S. aureus NewmanHG Wildtyp charakterisiert. Dabei zeigten sich teilweise große Unterschiede zwischen der stp-Mutante und den anderen Stämmen. Mit diesen Unter-suchungen konnten Ergebnisse aus anderen Studien bestätigt und mit weiteren Daten untermauert werden. So lässt sich die verminderte Virulenz der stp-Mutante mit der reduzierten Expression und Sekretion von Toxinen wie Hämolysinen und Leukozidinen erklären. Dies führt zu einer verminderten Hämolyse von Erythrozyten und einer verminderten Immunantwort gegen diese Toxine im Infektions-versuch. Stk und Stp phosphorylieren bzw. dephosphorylieren Transkriptionsfaktoren und Antwort-regulatoren von Zweikomponentensystemen, was zu der veränderten Expression und Sekretion der Virulenzfaktoren führt. Die Analyse der Mutanten offenbart, dass Stk ein negativer und Stp ein positiver Regulator der Virulenz in S. aureus ist. Außerdem regulieren Stk und Stp zentrale Aspekte des Metabolismus in S. aureus. So ist die Konzentration an Nukleotidtriphosphaten in der stp-Mutante reduziert, was auf eine verminderte Expression der Gene der Pyrimidinsynthese zurückzuführen ist. Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass Stk und Stp wesentliche Aspekte der Zellphysiologie wie die Zellwandsynthese, den zentralen Metabolismus und die Virulenz von S. aureus regulieren.