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- TRPC-Ionenkanäle (1)
Einleitung:
TRPC-Kanäle spielen eine wichtige Rolle in der Pathologie der Herzinsuffizienz und kardialen Hypertrophie. Diese Effekte werden unter anderem über den Calcineurin-NFAT-Signalweg vermittelt. Ein wichtiger Interaktionspartner und Regulator von TRPC-Kanälen ist das Protein FKBP52. Mittels eines Yeast Two-Hybrid Systems wurde in einer kardialen cDNA library eine Interaktion zwischen einem C-terminalen Fragment von TRPC3 (AS 742-848), welches außerhalb der bekannten FKBP-Bindungsdomäne (AS 703-714) liegt, und FKBP52 beobachtet. Da dies eine weitere Bindungsstelle in FKBP52 vermuten ließ, erzeugten wir ein Fragment von FKBP52, welches FKBP52s genannt wurde und dem die funktionell relevante PPIase I-Domäne mit der bekannten Bindungsstelle fehlt. Eine erste Co-IP zwischen diesem Fragment und TRPC3 war erfolgreich.
Ziel:
Die Bestimmung, ob die Anwesenheit des verkürzten FKBP52 in vivo die Komplexbildung aus TRPC3 bzw. TRPC4 und dem Wildtyp-FKBP52 unterdrückt. Zusätzlich, ob FKBP52s die Interaktion zwischen TRPC3 bzw. TRPC4 und Calcineurin in vivo unterbricht und damit die Aktivierung des Calcineurin-NFAT-Signalweges hemmt.
Methoden:
Co-Immunopräzipitationen (Co-IP) wurden mit HEK-293-Zellen durchgeführt, die mit cDNA transfiziert wurden, welche Gene für TRPC3, TRPC4, Calcineurin A und FKBP52s enthielt. Zur Bestimmung der nukleären Translokation von NFATc1 mittels Fluoreszenzmikroskopie wurden HEK-293-Zellen mit TRPC3, TRPC4, GFP-NFATc1 ± FKBP52s transfiziert. Die statistische Analyse erfolgte mit einer One-Way ANOVA.
Ergebnisse:
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass FKBP52 sowohl mit TRPC3 als auch mit TRPC4 interagiert. Ebenso wurde festgestellt, dass FKBP52 auch ohne seine katalytische PPIase I-Domäne Bindungen mit TRPC3 bzw. TRPC4 eingeht. Dieses FKBP52-Konstrukt nimmt ebenso an der Komplexbildung mit TRPC3 bzw. TRPC4 und Calcineurin teil. Des Weiteren ließ sich für TRPC3 zeigen, dass unter Stimulation mit Carbachol (GPCR-Agonist) bei Anwesenheit dieses gekürzten FKBP52 eine signifikant geringere Aktivierung und Wanderung des Transkriptionsfaktors NFAT in den Nucleus erfolgte.
Schlussfolgerung:
FKBP52 spielt daher eine wichtige Rolle in dieser Signalkaskade, indem es entscheidend an der Aktivierung von Calcineurin und dessen Rekrutierung zum TRPC-Kanalkomplex beteiligt ist und damit auch an der Aktivierung des Calcineurin-NFAT-Signalweges.