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In Ratten und Mäusen aktiviert der superagonistische anti-CD28 monoklonale Antikörper (CD28SA) vorzugsweise regulatorische T-Zellen. In niedriger Dosierung führt CD28SA zu einer fast ausschließlichen Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Diese Beobachtung konnte inzwischen auch für menschliche Zellen in Zellkultur bestätigt werden.
In gesunden und freiwilligen Testpersonen deutet die Zytokin-Antwort nach Applikationen von niedrigen CD28SA-Dosen darauf hin, dass sich diese Beobachtung auch in-vivo bewahrheitet. Eine Gabe von CD28SA in niedriger Dosierung, die zu einer exklusiven Aktivierung von regulatorischen T-Zellen führt, könnte somit in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder von entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden.
Eine mechanistische Erklärung für dieses Phänomen blieb lange Zeit unklar. Die CD28SA-vermittelte T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Verstärkung von basalen tonischen Signalen, die T-Zellen über ihren T-Zell-Rezeptor erhalten. Diese Tatsache führte zu der Hypothese, dass die schwachen, tonischen Signale, die konventionelle CD4+ T-Zellen in Abwesenheit ihrer spezifischen Antigene über den T-Zell-Rezeptor erhalten, ein stärkeres CD28 Signal für ihre Aktivierung benötigen als die selbstreaktiven regulatorischen T-Zellen, die ein stärkeres Selbstpeptid-TCR Signal erhalten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blockade von MHC-Klasse-II-Molekülen in Mäusen, in-vitro und in-vivo, den Vorteil der regulatorischen T-Zellen gegenüber den konventionellen T-Zellen bezüglich der Antwort auf niedrige CD28SA Dosierungen, aufhebt.
Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ besitzt sehr vielgestaltige Funktionen und ist an Wachstums-und Differenzierungsvorgängen verschiedener Gewebe beteiligt. So fördert es in T-Lymphozyten über Transaktivierung des Il4-Promotors und Repression der TH1-Zytokine IL-2 und IFN-γ die Bildung eines TH2-Phänotyps [Berberich-Siebelt et al. 2000]. Durch Herabregulation von c-Myc bewirkt es einen Zellzyklusarrest in G1 und vermehrte Differenzierung der Zellen auch über eine reziproke Steigerung von Differenzierungsfaktoren wie Mad4 [Berberich-Siebelt et al. 2006]. In einer den G1-Arrest nachweisenden Zellzyklusanalyse von mit C/EBPβ transduzierten EL-4 Zellen zeigte sich daneben ein kleiner Sub-G1-Peak, der auf eine apoptotische Zellpopulation hinweist [Berberich-Siebelt et al. 2006]. Aufgabe dieser Arbeit war es, den möglichen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von C/EBPβ und Auslösung von Apoptose in EL-4 Zellen hinsichtlich seiner Spezifität und dabei favorisierter Signalwege zu untersuchen.
Gegenstand der Untersuchungen waren mit dem C/EBPβ-ERTM-Konstrukt alleine und in Kombination mit dominant-negativen Mutanten der Caspase-3 und der Caspase-9 transduzierte EL-4 Kulturzellen. Durch Einbringen der Caspasemutanten sollte eine kompetitive Hemmung der entsprechenden endogenen Caspasen bewirkt werden. Methodisch erfolgten Apoptosenachweise mittels durchflusszytometrischer Analysen von mit Annexin V-PE und 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) gefärbten EL-4 Zellen sowie die Detektion von gespaltener PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase), einem Substrat der Caspase-3 im Western Blot. Des Weiteren erfolgten mittels Ribonuklease-Protektionsanalysen Untersuchungen der RNA-Expression von Zytokinen, Caspasen und von Mitgliedern der Myc- und der Bcl-2-Proteinfamilien, um das Verhalten der Zellen unter Hemmung von Apoptosewegen bzw. Caspasen bei Aktivierung von C/EBPβ näher betrachten zu können.
In Annexin V-PE- und 7-AAD-Färbungen sowie durch Nachweis der spezifischen Spaltung von PARP konnte gezeigt werden, dass C/EBPβ Zelluntergang und Apoptose fördert. Diese war durch den Pancaspaseinhibitor Z-VAD fmk hemmbar, was, wie auch die PARP-Spaltung, auf einen caspaseabhängigen Signalweg hinweist. Hemmung der Caspase-3 durch Transduktion der Zellen mit einer Caspase-3-Mutante besaß kaum Einfluss auf die durch C/EBPβ veränderte Zytokinexpression und die Repression von c-Myc, doch erschien eine vermehrte Hochregulation des Differenzierungsfaktors Mad4, der endogenen Caspase3- und der Caspase11-RNA. Die Steigerung von Caspase-3 unter Aktivierung von C/EBPβ fand sich auch auf Proteinebene. Allerdings konnte eine Hemmung der Caspase-3 bei den untersuchten EL-4 Zellen die durch C/EBPβ vermittelte Apoptose nicht verhindern, was auf andere Apoptosewege oder kompensatorischer Effekte verwies. Durch Beeinflussung des intrinsischen Signalweges mit Hemmung der Caspase-9 zeigten sich ebenfalls kaum Auswirkungen auf die Zytokinexpression der untersuchten Zellen. Hier fanden sich Hochregulationen sowohl der pro- als auch antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Funktionell konnte auch eine Hemmung von Caspase-9 die Zellen nicht vor der Apoptose durch Aktivierung von C/EBPβ bewahren.
So konnte hier gezeigt werden, dass Aktivierung von C/EBPβ in den untersuchten EL-4 Zellen Apoptose fördern kann, dies über eine Aktivierung der Caspasekaskade zu geschehen scheint und mit einer Steigerung endogener Caspase-3-Expression einhergeht. Aus den Untersuchungen dieser Arbeit konnte eine Favorisierung eines bestimmten Apoptosesignalweges nicht abgeleitet werden, da eine Hemmung des intrinsischen Weges die Zellen nicht vor dem Zelltod schützen konnte. Insgesamt lässt sich aber, obwohl nicht alle Details geklärt werden konnten, festhalten, dass C/EBPβLAP in T-Zellen neben Proliferationshemmung und Differenzierungsinduktion auch für Caspase vermittelten Zelltod verantwortlich ist.
Durch die im Labor der AG Topp standardisierte Verfahren konnten im Rahmen dieser Arbeit stabile T Zell Linien aus primär humanen CMV spezifischen T Zellen und CMV spezifischen T Zellen mit chimärischen Rezeptoren hergestellt werden. Die Anzahl der chimärischen Rezeptoren auf den unterschiedlichen T Zellinien ist nicht signifikant unterschiedlich und beträgt ca. 17000 Rezeptoren pro Zelle. Bei der Überprüfung des Lyseverhaltens CMV spezifischer T Zellen gegenüber CMV spezifischer T Zellen transduziert mit einem chimärischen Rezeptor zeigt sich das gleiche Lyseverhalten. Um die zeitliche Dynamik dieses Verhaltens besser darzustellen, wurde ein FACS basierter Lysierungsversuch selbstständig entwickelt und etabliert. Somit konnte herausgestellt werden, dass das Lyseverhalten der T Zelllinien sowohl der CMV spezifischen T Zellen als auch das der Erst- und Zweitgeneration- T Zelllinien CAR CD19z und CAR CD19/28z vergleichbar war. Alle genannten Zelllinien lysieren ihre Targetzellen sowohl in der Quantität als auch in der zeitlichen Dynamik vergleichbar. Dies ist die einzige Gemeinsamkeit der verglichenen T Zell Aktivierungssysteme. In allen anderen funktionellen Versuchen ist die Aktivierung der T Zellen über einen chimärischen Rezeptor dem der physiologischen Aktivierung über den T Zell Rezeptor unterlegen. Der Proliferationsversuch mit CFSE zeigt eindeutig, dass nur die T Zellen, die über den TCR aktiviert werden, das Potential haben, sich zu teilen. Die T Zellen, die über den CAR sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, teilen sich nicht. Der Defekt der CAR T Zellen zeigt sich auch in der Hochregulation von CD25, einem Aktivierungsmarker für T Zellen. Die T Zellen, die durch die chimärischen Rezeptoren sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, regulieren CD25 nicht so stark nach oben wie die T Zellen, die physiologisch durch den TCR aktiviert werden. Diese Minderaktivierung spiegelt sich auch in der Zytokinproduktion wieder. Auch hier zeigt sich die unvollständige Aktivierung der CAR T Zellen. In der intrazellulären Zytokinmessung sieht man, dass bei CAR T Zellen der ersten und zweiten Generation zum einen die Einzelzellen weniger IFNy produzieren, zum anderen die Gesamtzahl der Zellen, die Zytokine produzieren, weniger ist als im Vergleich zur TCR Aktivierung. Dieses Phänomen der defizienten Aktivierung und der funktionellen Defekte von CAR T Zellen ist bekannt. Dies konnte noch einmal unter standardisierten und kontrollierten Bedingungen bestätigt werden. Durch die relativ neue Methode der durchflusszytometrischen Bead Technologie konnte dies nun zum ersten Mal realisiert werden. Es zeigte sich, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Aktivierungsmodi der T Zellen besteht. Eine physiologische Aktivierung von T Zellen führt zu einer höheren Maximum-Phosphorylierung als eine Aktivierung über den Erstgeneration CAR. Der signifikante Unterschied zeigt sich bei den MAP Kinasen ERK, JNK und p38. Somit ist dies ein Hinweis, dass die Signaltransduktion auf breiter Ebene aufgrund des alleinigen Vorhandenseins der Zeta Kette bei den CAR CD19z T Zellen, defizient ist und nicht ausreicht für eine volle Aktivierung, die eine volle Funktionalität der T Zelle nach sich ziehen würde. Diese unzureichende Aktivierung soll durch die kostimulatorische Komponente CD28 beim Zweitgenerationrezeptor CAR CD19/28z aufgehoben werden. In der Proliferation, Zytokineproduktion und den Aktivierungsmarkern zeigt sich keine Verbesserung im Vergleich zum Erstgenerationrezeptor bei CMV spezifischen T Zellen. Dieses Ergebnis wird bestätigt und korreliert damit, dass es keinen Unterschied in der maximalen Phosphorylierung von ERK, JNK und p38 zwischen Erstgeneration CAR CD19z und Zweitgeneration CAR CD19/28z gibt. Somit ist dieses System geeignet, um aus dem Phosphorylierungsstatus von MAP Kinasen von CAR T Zellen auf die Funktionalität dieser T Zellen zu schließen.