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1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenomme-nen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays gewonnen werden: a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-ähnliche Anionenkanäle identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkanäle der Schließzellen wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert. b. Darüber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-Elektroden-Technik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenläufige Polarisation des Membranpotentials während der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein zu Mais ähnliches Verhalten während der Stomabewegung zeigte und gegenläu-fig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein ähnli-ches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend. c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkali-sierung während der Licht-induzierten Stomaöffnung beobachtet, die bei Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zurückkehrte. d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen konnte ein Volumenverhältnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw. 1:4 bei geöffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden. Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewon-nenen Erkenntnisse schlüssig in ein Modell zur Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Neben- und Schließzellen während der Licht-induzierten Stomabewegung eingebunden werden. 2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließ-zellen in Patch-Clamp-Experimenten näher untersucht. Dabei waren die S-Typ-Anionenströme bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1-Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universität Würzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-Typ-Anionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 ko-diert für einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-ähnliche Anionenströme generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion dar-stellte oder den Chlorid-basierten Lösungen externes Nitrat zugegeben wurde, scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg für die Ent-lassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen. 3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkanäle in A. thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal ähnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsab¬hängigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabhängigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana nicht durch externes Malat beeinflusst. Jedoch war unter externen Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, während unter externen Sulfatbe¬dingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszu¬machen waren. ALMT12 scheint demnach für den Malat-aktivierten Teil des R-Typ-Anionenkanals verantwortlich zu sein.
Die Rolle von Kaliumkanälen der AKT1-Unterfamilie für Kaliumaufnahme und gerichtetes Wachstum
(2005)
In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Transkription des Kaliumaufnahmekanals ZMK1 durch IAA stimuliert wird und dass dieser eine wichtige Rolle für das differentielle Zellstreckungswachstum während der gravitropen Krümmung spielt. Dieser Annahme folgend wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ZMK1 auch in phototrop stimulierten Maiskeimlingen am differentiellen Wachstum der Koleoptile beteiligt ist. Im Hinblick auf diese Fragestellung wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: i. Auch in photostimulierten Keimlingen folgt die Transkription von ZMK1 dem endogenen IAA-Gradienten. Vor allem in der Koleoptilenspitze, wo die Umverteilung der freien IAA in die unbelichtete Flanke stattfindet, wurde der größte ZMK1-mRNA Gradient gemessen. ii. Der Krümmungswinkel photostimulierter Koleoptilen war erheblich kleiner als der ebenso lange gravitrop gereizter Keimlinge. Pflanzen, die auf einem Klinostaten einseitig mit Blaulicht bestrahlt worden waren, zeigten jedoch eine ähnlich starke Krümmung wie gravistimulierte Pflanzen. Der Einfluss der Schwerkraft verhinderte demzufolge eine stärkere Krümmung photostimulierter Koleoptilen. iii. Die ausgeprägtere Krümmungsreaktion von auf dem Klinostaten photostimulierten Maiskeimlingen war mit einer drastischen Auxinverschiebung in der Koleoptilenspitze und einer länger anhaltenden differentiellen Expression von ZMK1 verbunden. Die Wachstumsantwort der Keimlinge konnte daher direkt mit der Verteilung freier IAA und der daraus resultierenden Regulation von ZMK1 korreliert werden. iv. Die Wahrnehmung zweier verschiedener Reize (Schwerkraft, Blaulicht) mündet in einen gemeinsamen Signalweg, welcher zur Umverteilung endogenen Auxins innerhalb der Koleoptile und zur differentiellen Kaliumaufnahme über ZMK1 in den gegenüberliegenden Flanken führt. Die hierdurch bedingte stärker ausgeprägte Zellstreckung in der unbelichteten Koleoptilenhälfte hat schließlich die Krümmung des Keimlings zur Folge. Mit dem Ziel, auch den ZMK1-orthologen Kaliumkanal in einer der wichtigsten Nutzpflanzen, Reis, zu charakterisieren, wurden molekularbiologische und biophysikalische Analysen durchgeführt. Im Bezug auf die verfolgten Ziele dieser Arbeit lassen sich die gewonnenen Ergebnisse wie folgt zusammenfassen: v. Aus Oryza sativa-Keimlingsgewebe konnte das cDNA-Molekül OsAKT1 isoliert und anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz der AKT1-Unterfamilie des Shaker- Typs pflanzlicher Kaliumkanäle zugeordnet werden. vi. Die Transkripte von OsAKT1 wurden in Koleoptile und Wurzel 5 Tage alter Reiskeimlinge lokalisiert. Im Gegensatz zur Expression des AKT1-orthologen Kanals in Mais ZMK1 blieb die Transkription von OsAKT1 durch die Erhöhung exogenen Auxins in Koleoptilsegmenten unbeeinflusst. Demzufolge ist es unwahrscheinlich, dass OsAKT1 ähnlich wie ZMK1 eine wichtige Rolle während des auxininduzierten Streckungswachstums spielt. vii. Nach heterologer Expression in HEK293-Zellen wurde OsAKT1 als spannungsabhängiger, kaliumselektiver Einwärtsgleichrichter charakterisiert, der durch Ca2+ und Cs+ geblockt und durch extrazelluläre Protonen aktiviert wird. Ähnliche Eigenschaften konnten in Protoplasten beobachtet werden, die aus Keimlingswurzeln isoliert worden waren. Diese Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass OsAKT1 der dominante Kaliumaufnahmekanal in Reiswurzeln ist. Keimlinge des verwendeten Reiskultivars waren in Reaktion auf Salzstress im Vergleich zu Kontrollpflanzen erheblich im Wachstum verzögert und wiesen einen geringeren Kaliumgehalt auf. Dieser Phänotyp wurde von einer Abnahme der OsAKT1-Transkripte und der Verringerung der durch OsAKT1 getragenen Kaliumströme in Wurzelprotoplasten salzbehandelter Keimlinge begleitet. Dieser Zusammenhang deutet darauf hin, dass die OsAKT1-vermittelte Aufnahme von Kalium über die Wurzel essentiell für das pflanzliche Wachstum und die Ionenhomöostase salzgestresster Pflanzen ist.