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Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) are exploited by human-specific pathogens to anchor themselves to or invade host cells. Interestingly, human granulocytes express a specific isoform, CEACAM3, that can direct efficient, opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria, Moraxella and Haemophilus species. As opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria depends on Src-family protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylation of the CEACAM3 cytoplasmic domain, we hypothesized that an SH2-containing protein might be involved in CEACAM3-initiated, phagocytosis-promoting signals. Accordingly, we screened glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins containing SH2 domains derived from a panel of signaling and adapter molecules for their ability to associate with CEACAM3. In vitro pull-down assays demonstrated that the SH2 domain of the adapter molecule Nck (GST-Nck SH2), but not other SH2 domains such as the Grb2 SH2 domain, interact with CEACAM3 in a phosphotyrosine-dependent manner. Either deletion of the cytoplasmic tail of CEACAM3, or point-mutation of a critical arginine residue in the SH2 domain of Nck (GST-NckSH2R308K) that disrupts phosphotyrosine binding, both abolished CEACAM3-Nck-SH2 interaction. Upon infection of human cells with CEACAM-binding Neisseria, full-length Nck comprising an SH2 and three SH3 domains co-localized with tyrosine phosphorylated CEACAM3 and associated bacteria as analyzed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. In addition, Nck could be detected in CEACAM3 immunoprecipitates confirming the interaction in vivo. Importantly, overexpression of a GFP-fusion protein of the isolated Nck SH2 domain (GFP-Nck-SH2), but not GFP or GFP-Nck SH2 R308K reduced CEACAM3-mediated phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria suggesting that the adaptor molecule Nck plays an important role in CEACAM3-initiated signaling leading to internalization and elimination of human-specific pathogens.
Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae sind humanpathogene Vertreter der Gattung Neisseria. Diese Erreger verfügen über eine Reihe von Virulenzfaktoren, um erfolgreich den menschlichen Körper zu besiedeln. Dabei spielen die neisseriellen OpaCEA-Proteine eine wichtige Rolle. Diese Adhäsine binden an bestimmte Rezeptoren der humanen CEACAM-Familie, die auf unterschiedlichen Zelltypen im menschlichen Körper exprimiert werden. Die Interaktion der OpaCEA-Proteine mit der stark konservierten aminoterminalen Domäne von bestimmten CEACAMs führt zu einer Aufnahme der Bakterien in die Zellen. Dort können sie, vor der humoralen Immunantwort geschützt, persistieren oder sich durch Transzytose in tiefer gelegene Gewebe weiter ausbreiten und letztendlich eine disseminierte Krankheit auslösen. Da CEACAMs eine entscheidende Rolle bei der Infektion mit pathogenen Neisserien spielen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion dieser zellulären Rezeptoren mit pathogenen Neisserien und die daraus resultierenden molekularen Ereignisse auf bakterieller bzw. zellulärer Seite näher untersucht. Zunächst wurde eine neuartige Methode entwickelt, die im Gegensatz zu herkömmlichen Strategien eine schnelle und quantitative Erfassung von Neisserien-CEACAM-Interaktionen ermöglicht. Bei dieser Methode wurden GFP-fusionierte, lösliche aminoterminale CEACAM-Domänen eingesetzt, die spezifisch an OpaCEA-exprimierende Bakterien binden. Einzelne Bakterien einer Population, die mit den fluoreszierenden Rezeptordomänen assoziierten, konnten aufgrund ihrer erhöhten Fluoreszenz im Durchflußzytometer sehr schnell und quantitativ bestimmt werden. Diese Rezeptordomänen wurden außerdem als molekulares Werkzeug zur Erstellung eines OpaCEA-induzierten Transkriptionsprofils von Opa-positiven Meningokokken verwendet. Transkriptomanalysen mittels Mikroarrays zeigten, dass die Interaktion OpaCEA-exprimierender Meningokokken mit der löslichen, aminoterminalen Domäne von CEACAM1 eine Herrunterregulation von 56 Genen sowie eine Hochregulation von sieben Genen in Neisseria meningitidis MC58 zur Folge hatte. Dabei konnte ein hochreguliertes Gen identifiziert werden, dessen Genprodukt aufgrund seiner Homologie zu einem bakteriellen -Hämolysin möglicherweise virulenz-assoziiert ist. Die Erstellung dieses Transkriptionsprofils beruhte auf der Interaktion zwischen der aminoterminalen Domäne von CEACAM1 und seinen bis heute einzig bekannten neisseriellen Liganden, den OpaCEA-Proteinen. Bemerkenswerterweise konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Opa-negativer Meningokokkenstamm isoliert werden, der ebenfalls an CEACAM1 bindet und von CEACAM1-exprimierenden Zellen internalisiert wird. Da dieser Meningokokkenstamm keine Opa-Proteine exprimierte, muß er über ein weiteres Adhäsin verfügen, das mit CEACAM1 assoziiert. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass für die CEACAM1-vermittelte Aufnahme dieser Opa-negativen Meningokokken mehrere extrazelluläre Domänen des Rezeptors notwendig sind. Im Gegensatz zur Aufnahme OpaCEA-exprimierender Bakterien war die aminoterminale Domäne essentiell, aber nicht ausreichend für diesen phagozytischen Vorgang, der unabhängig vom Aktinzytoskelett erfolgte. Auch bei Bindungsstudien mit löslichen CEACAM1 Konstrukten gab es Differenzen zwischen den opaquen und nicht-opaquen Bakterienstämmen. So zeigte sich, dass im Gegensatz zu OpaCEA-exprimierenden Meningokokken, die mit monomeren Formen des löslichen Rezeptors assoziieren konnten, Opa-negativen Meningokokken nur mit multimerisierten Formen des Rezeptors interagierten. CEACAM1 stellt den einzigen Rezeptor aus der CEACAM-Familie dar, mit dem Opa-negative Meningokokken interagieren können. Demgegenüber assoziieren OpaCEA-exprimierende Neisserien mit mehreren Mitgliedern der CEACAM-Familie, unter anderem mit CEACAM3. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die c-Jun N-terminale Kinase an Signaltransduktionswegen, die durch Interaktion von OpaCEA-exprimierenden Neisserien mit CEACAM3 ausgelöst wurden, beteiligt ist. Erstaunlicherweise konnte durch Inhibition der c-Jun N-terminalen Kinase CEACAM3-vermittelte Aufnahme der opaquen Bakterien in die Zelle reduziert werden. Da die Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase unabhängig von der Phosphorylierung der ITAM-ähnlichen Sequenz erfolgte, scheint dieses Molekül an einem neuartigen Signalweg beteiligt zu sein, der komplementär zu bereits bekannten CEACAM3-vermittelten Signalprozessen abläuft. Die in der vorliegenden Arbeit zusammengefassten Befunde liefern neue Einblicke in die Wechselwirkung zwischen pathogenen Neisserien und ihren Wirtszellen und können als Ausgangspunkt für interessante weiterführende Analysen dienen.
Eine Infektion durch das ausschließlich human-spezifische Pathogen Neisseria gonorrhoeae manifestiert sich bei einer symptomatischen Kolonisierung in der sog. Gonorrhö, einer venerischen Erkrankung, die durch akute Inflammation des befallenen Gewebes und durch die massive Infiltration von Granulozyten charakterisiert ist. Die Gonokokken können im Verlauf einer symptomatischen Infektion über ihre OpaCEA-Adhäsine mit CEACAM Proteinen unterschiedlicher Wirtszellen interagieren. In der vorliegenden Doktorarbeit sollten anhand verschiedener zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die molekularen Vorgänge während der OpaCEA-Gonokokken-Phagozyten-Interaktion untersucht werden. Der Kontakt von OpaCEA-Gonokokken mit primären Granulozyten induziert die Formation von Lamellipodien-ähnlichen Membranausstülpungen und führt zur CEACAM-abhängigen Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Schon in früheren in vitro Versuchen konnte die Reorganisation des Zytoskeletts und die Opsonin-unabhängige, CEACAM-vermittelte Aufnahme OpaCEA-exprimierender Gonokokken in differenzierte promyelomonzytären Zellen und Granulozyten mit der Stimulation von Kinasen der Src-Familie und der GTPase Rac in Verbindung gebracht werden. Erste in vitro Infektionsversuche mit CEACAM-exprimierenden 293 Zellen, in denen pharmakologische oder genetische Inhibitoren gegen Kinasen der Src-Familie eingesetzt wurden, deuteten darauf hin, dass ausschließlich die CEACAM3-vermittelte Internalisierung der Gonokokken die katalytische Aktivität von Kinasen der Src-Familie benötigt. Dies konnte auch in CEACAM3-exprimierenden, Src-Kinase defizienten Maus-Fibroblasten bestätigt werden, da nur c-Src rekonstituierte Zellen OpaCEA Gonokokken internalisieren. Die Adhäsion der OpaCEA Gonokokken an CEACAM3 induziert eine Src-abhängige Tyrosinphosphorylierung der zytoplasmatischen CEACAM3-Domäne und die Kinase selbst kann über ihre SH2-Domäne direkt an das phosphorylierte CEACAM3 binden. Auch die Stimulation der GTPase Rac verläuft über das CEACAM3 Protein, da die Expression einer dominant negativen Version der Rho GTPase ausschließlich mit der CEACAM3-, aber nicht mit der CEACAM6-abhängigen Internalisierung der OpaCEA Gonokokken interferiert. Zudem induziert nur die CEACAM3-vermittelte Aufnahme die Rekrutierung und GTP-Beladung des endogenen Rac. Eine zentrale Rolle dabei spielt die Integrität der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Die Mutation beider Tyrosinreste innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz oder die komplette Deletion der zytoplasmatischen Domäne inhibieren die CEACAM3-vermittelte Rac-Stimulation und blockieren die Internalisierung der OpaCEA Gonokokken. Aber nicht nur OpaCEA Gonokokken interagieren mit CEACAM3, sondern auch die CEACAM-bindenden Adhäsine von Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae führen zur Rac-Stimulation und damit zur Internalisierung der Pathogene. Im letzten Teil der Arbeit konnte das molekulare Bindeglied zwischen der CEACAM3-induzierten Signalkaskade und der Stimulation der kleinen GTPase Rac identifiziert werden. Das Vav Protein fungiert dabei als GEF für die kleine GTPase Rac. Eine dominant negative Version von Vav oder eine spezifische Vav-siRNA inhibieren die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-Gonokokken bzw. die GTP-Beladung von Rac. Interessanterweise bindet das Vav Protein über seine SH2 Domäne direkt an CEACAM3 und zwar nach Phosphorylierung durch aktive Src Kinasen an den Tyrosinrest 230 der ITAM-ähnlichen Sequenz. Die distinkte CEACAM3-induzierte Signalkaskade erlaubt es, die Bedeutung von CEACAM3 für die Phagozytose CEACAM-bindender Pathogene auch in primären Granulozyten zu untersuchen. Interessanterweise inhibiert PP2 die Aufnahme der Gonokokken dosisabhängig, wohingegen die Blockade der CEACAM1- bzw. CEACAM6-vermittelten Internalisierung der Gonokokken durch Nystatin keine Auswirkungen zeigt. Auch die Proteintransduktion der dominant-negativen Version von Vav (TAT-Vav-dn) bzw. Rac (TAT-Rac-dn) in primäre Granulozyten interferierte effektiv mit der Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Dementsprechend verhindert ausschließlich die Blockade der CEACAM3-vermittelten Phagozytose, aber nicht der CEACAM1- bzw.CEACAM6-vermittelten Aufnahme durch monoklonale Antikörper die Internalisierung bzw. die Elimination von CEACAM-bindenden Pathogenen. Diese Arbeiten beschreiben das exklusiv auf Granulozyten exprimierte CEACAM3 Protein als einen neuen gegen CEACAM-bindende Erreger gerichteten phagozytischen Rezeptor der angeborenen Immunantwort.