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Veränderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese
(2023)
Das Mamma-Karzinom gehört zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erhöhter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellulärer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert.
Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Präparaten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen und eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit für Immunzellen. Dies ist für die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grundsäulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht.
Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivität und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verstärkt.
Die Kollageninhibition hatte zusätzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgefäßdichte zufolge.
Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen künftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.
After implementing a reliable mass spectrometry based kinetic study the indole conjugation with different organometallic indoles led to questions about the electronical and sterical influences on reactivity. The substitution pattern of the ferrocene functionalized indoles at the six-membered ring determines the electron density on the C3 atom, which reacts with the formed Schiff base. Since the experimental results showed the exact opposite trend, covalent docking studies were performed elucidating the importance of surface interactions. These studies were in harmony with the experimental results and determined lysine 33 as most preferable conjugation site as well as substitution in 6-position as most favourable pattern. The amine motif in compounds 6, 7 and 8 proofed to be easily fragmented by the ESI method used. The amide linker in 10 remains intact but shows a lower conversion. Those two inherent characteristics are however preferable for well-defined and site-specific bioconjugation. The synthesis and evaluation of piano stool complex derivatives with manganese and rhenium metal centre 15, 16, 18 and 22 gave additional guidance by the interpretation of applicable structural motifs. The electron-withdrawing carbonyl groups lead to the hindrance of fulvene formation and thus to no fragmentation as seen with the ferrocene group. The total conversion is low compared to 8, only 22 shows a good enough conversion to mainly monoconjugate of 45% and a possible radio-labelling application as 99mTc analogue. As consequence manganese complexes with a stable facial tricarbonyl unit and a tridentate chelator with 4-, 5- and 6-substituted aminomethylindole conjugated through an amide bond were synthesized and consecutively evaluated. The resulting organometallic indole derivatives 29, 30 and 31 all showed a total conversion around 40% similar to 16, but at the same time a rate constant in the range of 10-4 s-1 like the organic indole. Besides the similar conversion, the rate constants followed the trend of the 6-substituted derivative as fastest and then 5- and 4- substituted derivative with decreasing reactivity. For underlining the usage as technetium label for the best out of the series 31, a rhenium analogue was prepared. The resulting compound 32 was especially interesting, because the conversion was even higher than the 70% of 8 with a total of 88%. Additionally, the rate constant was a tenfold higher as well. This rendered compound 32 as best possible 99mTc analogue for further application as radio-label. After the success of 32 and realizing the sterical benefits resulting from the flexible tridentate ligand-system, substitution at the five-membered ring was explored. The complexes 33, 34 and 35 are based on indole-2-carboxylic acid and with the difference of the length of the alkyl spacer between amide and complex to probe for the influence and sterical hindrance, but all three derivatives showed no conjugation which excludes functionalization in 2-position. As the C3 is used for the actual bioconjugation, the last possible derivatization was realized on the indole-N1 by using 1-(3-bromopropyl)indole as building block during the synthesis of the ligand-system. The corresponding manganese 36 and rhenium 37 complexes both showed similar properties of a moderate conversion like 22 and a rate constant in the range of 10-5 s-1. In conclusion the rhenium complex 32 with the 6-substitution pattern at the tridentate indole-bearing ligand remains the most promising structure.
The here developed liquid chromatography coupled mass spectrometry-based assay for the determination of inhibitory activity of drug candidates against the 3CLpro of the sever acute respiratory syndrome coronavirus type 2 was successfully implemented and especially designed to give, due to the available absorption spectra and corresponding mass traces, further insight in the otherwise through fluorescence resonance energy transfer-based assays neglected influences on the inhibition results. Starting with a literature-known quinolone containing covalent inhibitor 42 an N1-methylated derivative 43 and their analogues 44 and 45 in which the benzoic acid was exchanged for ferrocene carboxylic acid were synthesized. The inhibition of 3CLpro was evaluated by the concentration of initial 15mer peptide left after incubation and for that purpose the for 280 nm defined molar attenuation coefficient of (26.41±0.59) L*mol-1*cm-1 determined and used. The results showed a reaction of DL dithiothreitol with the less stable benzoic acid esters leading to a moderate inhibitory effect. The methylation in N1-position showed an increase in stability. The methylated and with ferrocene carboxylic acid functionalized derivative showed a complete inhibition during the timeframe of the assay. In search of a fluorescent and therefore traceable inhibitor, 4 hydroxycoumarin was used to synthesize the analogue with benzoic acid 49 and ferrocene carboxylic acid 50. Both derivatives were less stable than their analogues but exhibited the same trend of a more stable ferrocene-derived compound, which exerted a higher inhibition as well. After preparing and testing the model thioester 53 and showing an inactivation of the established inhibitor ebselen, it was concluded that the reaction with DL dithiothreitol reduces the concentration of active intact inhibitor and therefore decreases the inhibition rate during the assay. The next step was proofing the reducing agent as non-essential for the fast assay conducted in a timeframe of 5 min to circumvent the negative influence of DL dithiothreitol. By excluding every inhibition-altering part, the resulting method is the perfect tool for precise statements in relation of inhibitory activity. Then the inhibition assay was repeated for ebselen and the best out of the here introduced organometallic inhibitors 45. Both give equivalent results of a complete inhibition during the measurement. The implemented liquid chromatography coupled mass spectrometry-based assay has many advantages over the fluorescence resonance energy transfer-based assays in which all the information and insight accumulated by the evaluation of uv/vis traces and mass spectra are not available leading to wrong or deviating results regarding the inhibitory capacity of inhibitor candidates.
Es erfolgte eine elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren. Dabei wurden die Kristallisationsinhibitoren Zitronensäure, treta-Natriumdiphosphat-Decahydrat und Phytinsäure verwendet und die entstandenen Schichten mit denen ohne Inhibitorzugabe verglichen. Um das Ausmaß der Inhibierung zu verifizieren, wurde die Masse aller Schichten gemessen, welche für die Inhibition mit Zitronensäure und Phytinsäure abnahm und für Natriumdiphosphat zunahm. Die kristallographische Zusammensetzung der mit und ohne Inhibierung abgeschiedenen Schichten wurde mit Hilfe der Röntgendiffraktometrie bestimmt und zeigte, dass sich reine Bruschitschichten mit unterschiedlichem amorphem Anteil abschieden. Die daraus entstandenen Werte lieferten zugleich die Informationen über die einzelnen Kristallitgrößen innerhalb der Schichten. Über den Einfluss der Inhibitoren auf die Schichtmorphologie gaben rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen weiteren Aufschluss. Die Inhibition verursachte teils mit Rissen durchzogene Schichten, deren Kristallformationen sich von Standardelektrolyt unterschieden. Ausgewählte Proben wurden unter verschiedenen Bedingungen desinfiziert bzw. sterilisiert und nachfolgend erneut gewogen und mittels Röntgendiffraktogrammetrie und Rasterelektronenmikroskopie analysiert. Nach der Desinfektion entstanden reine Bruschitschichten, die an Masse verloren aber trotzdem die typischen Kristallformationen zeigten. Die Sterilisation führte zur Umwandlung von Bruschit in Monetit und Hydroxylapatit. Des Weiteren wurde die biologische Reaktion der Schichten auf humane fötale Osteoblasten-Zelllinien zur Überprüfung der Zellverträglichkeit ermittelt. Die entstandenen Ergebnisse waren nicht verwertbar und enthielt sehr hohe Standardabweichungen.
Durch Phosphorylierung inaktiviert GRK2 kardiale ß-Adrenorezeptoren und vermindert dadurch die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten. Als natürlicher Inhibitor der GRK2 beeinflusst RKIP die Signalweiterleitung bei Stimulation von ß-Adrenorezeptoren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von RKIP die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten erhöht. Es wurde die Anzahl auftretender Spontankontraktionen vor und nach Stimulation mit Isoproterenol erfasst sowie eine zeitliche Analyse der Calciumfreisetzung und –aufnahme nach elektrischer Stimulation durchgeführt. Im unstimulierten Zustand zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, die Wildtyp-RKIP überexprimierten, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich auftretender Spontankontraktionen. Nach Stimulation mit Isoproterenol zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, in denen Wildtyp-RKIP überexprimiert wurde, eine signifikant höhere Anzahl auftretender Spontankontraktionen. Eine Analyse der Calciumtransienten zeigte bei RKIP-Wildtyp überexprimierenden neonatalen Rattenkardiomyozyten eine erhöhte Calciumfreisetzung während der Systole sowie eine beschleunigte Calciumwiederaufnahme während der Diastole. Zudem wurden die RKIP-Mutanten RKIPS51V und RKIPS52V im Hinblick auf ihre Kontraktilität untersucht. Neonatale Rattenkardiomyozyten welche RKIPS51V und RKIPS52V überexprimierten zeigten weder im Hinblick auf auftretende Spontankontraktionen noch bei der Analyse der Calciumtransienten signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. Da auch eine Phosphorylierung an Aminosäureposition 51 bzw. Aminosäureposition 52 ohne direkte Auswirkung auf die Kontraktilität möglich ist, wurde in einem in vitro Kinase Assay analysiert, ob neben der bekannten Phosphorylierungsstelle S153 eine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKA oder PKC erfolgt. Bei Einsatz der an Aminosäureposition 153 phosphorylierungsdefizienten RKIP Mutante RKIPS153A konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte neben einer Phosphorylierung an S153 keine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKC oder PKA beobachtet werden.
G protein coupled receptor kinases (GRK) phosphorylate and thereby desensitize G protein coupled receptors (GPCR) including β-adrenergic receptors (βAR), which are critical regulators of cardiac function. We identified the Raf kinase inhibitor protein (RKIP) as an endogenous inhibitor of GRK2 that leads to increased cardiac contractility via βAR activation. RKIP binds to the N-terminus (aa1-185) of GRK2, which is important for the GRK2/receptor interaction. Thereby it interferes with the GRK2/receptor interaction without interference with cytosolic GRK2 target activation. In this project, the RKIP/GRK interface was investigated to develop strategies that simulate the effects of RKIP on βAR.
RKIP binding to different isoforms of GRK expressed in the heart was analyzed by protein interaction assays using full-length and N-termini of GRK2, GRK3 and GRK5: 1-53, 54-185 and 1-185. Co-immunoprecipitation (Co-IPs) and pull-down assays revealed that RKIP binds to the peptides of GRK2 and GRK3 but not to the ones of GRK5, which suggests the existence of several binding sites of RKIP within the N-termini of GRK2 and GRK3. To analyze whether the peptides of GRK2 and GRK3 are able to simulate the RKIP mediated interference of the GRK2/receptor interaction, we analyzed the β2-AR phosphorylation in the absence and presence of the peptides. Interestingly, N-termini (aa1-185) of GRK2 and GRK3 reduced β2AR phosphorylation to a comparable extent as RKIP. In line with reduced receptor phosphorylation, the peptides also reduced isoproterenol-stimulated receptor internalization as shown by [3H] CGP-12177 radioligand binding assay and fluorescence microscopy compared to control cells. Subsequently, these peptides increased downstream signaling of β2AR, i.e. the phosphorylation of the PKA substrate phosducin. In an attempt to elucidate the mechanism behind the observed effects, Co-IPs were performed in order to investigate whether the peptides bind directly to the β2-AR and block its phosphorylation by GRK2. Indeed, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 could bind the receptor, suggesting that this way GRK2 is prevented from inhibiting the receptor. To investigate the physiological effect of GRK2 1-185, GRK3 1-185 and GRK5 1-185, their effect on neonatal mouse cardiomyocyte contractility and hypertrophy was analyzed. After long-term isoproterenol stimulation, in the presence of GRK2 1 185 and GRK3 1-185 the cross-sectional area of the cardiomyocytes showed no significant increase in comparison to the unstimulated control cells. In addition, upon isoproterenol stimulation, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 increased the beat rate in cardiomyocytes, mimicking RKIP while the base impedance, an indicator of viability, remained stable.
The N-termini (1-185) of GRK2 and GRK3 simulated RKIP’s function and had a significant influence on β2AR phosphorylation, on its downstream signaling and internalization, could bind β2-AR, increased beat rate and did not significantly induce hypertrophy, suggesting that they may serve as a model for the generation of new and more specific targeting strategies for GRK mediated receptor regulation.
Mechanistic Insights into the Inhibition of Cathepsin B and Rhodesain with Low-Molecular Inhibitors
(2019)
Cysteine proteases play a crucial role in medical chemistry concerning various fields reaching from more common ailments like cancer and hepatitis to less noted tropical diseases, namely the so-called African Sleeping Sickness (Human Arfican Trypanosomiasis). Detailed knowledge about the catalytic function of these systems is highly desirable for drug research in the respective areas. In this work, the inhibition mechanisms of the two cysteine proteases cathepsin B and rhodesain with respectively one low-molecular inhibitor class were investigated in detail, using computational methods. In order to sufficiently describe macromolecular systems, molecular mechanics based methods (MM) and quantum mechanical based method (QM), as well as hybrid methods (QM/MM) combining those two approaches, were applied.
For Cathespin B, carbamate-based molecules were investigated as potential inhibitors for the cysteine protease. The results indicate, that water-bridged proton-transfer reactions play a crucial role for the inhibition. The energetically most favoured pathway (according to the calculations) includes an elimination reaction following an E1cB mechanism with a subsequent carbamylation of the active site amino acid cysteine.
Nitroalkene derivatives were investigated as inhibitors for rhodesain. The investigation of structurally similar inhibitors showed, that even small steric differences can crucially influence the inhibition potential of the components. Furthermore, the impact of a fluorination of the nitroalkene inhibitors on the inhibition mechanism was investigated. According to experimental data measured from the working group of professor Schirmeister in Mainz, fluorinated nitroalkenes show – in contrast to the unfluorinated compounds – a time dependent inhibition efficiency. The calculations of the systems indicate, that the fluorination impacts the non-covalent interactions of the inhibitors with the enzymatic environment of the enzyme which results in a different inhibition behaviour.
Background:
Single drug use has not achieved satisfactory results in the treatment of prostate cancer, despite application of increasingly widespread targeted therapeutics. In the present study, the combined impact of the mammalian target of rapamycin (mTOR)-inhibitor RAD001, the dual EGFr and VGEFr tyrosine kinase inhibitor AEE788 and the histone deacetylase (HDAC)-inhibitor valproic acid (VPA) on prostate cancer growth and adhesion in vitro was investigated.
Methods:
PC-3, DU-145 and LNCaP cells were treated with RAD001, AEE788 or VPA or with a RAD-AEE-VPA combination. Tumor cell growth, cell cycle progression and cell cycle regulating proteins were then investigated by MTT-assay, flow cytometry and western blotting, respectively. Furthermore, tumor cell adhesion to vascular endothelium or to immobilized extracellular matrix proteins as well as migratory properties of the cells was evaluated, and integrin alpha and beta subtypes were analyzed. Finally, effects of drug treatment on cell signaling pathways were determined.
Results:
All drugs, separately applied, reduced tumor cell adhesion, migration and growth. A much stronger anticancer effect was evoked by the triple drug combination. Particularly, cdk1, 2 and 4 and cyclin B were reduced, whereas p27 was elevated. In addition, simultaneous application of RAD001, AEE788 and VPA altered the membranous, cytoplasmic and gene expression pattern of various integrin alpha and beta subtypes, reduced integrin-linked kinase (ILK) and deactivated focal adhesion kinase (FAK). Signaling analysis revealed that EGFr and the downstream target Akt, as well as p70S6k was distinctly modified in the presence of the drug combination.
Conclusions:
Simultaneous targeting of several key proteins in prostate cancer cells provides an advantage over targeting a single pathway. Since strong anti-tumor properties became evident with respect to cell growth and adhesion dynamics, the triple drug combination might provide progress in the treatment of advanced prostate cancer.
Ziel der vorliegenden Arbeit waren pharmakologische Untersuchungen zum antiproliferativen Effekt der beiden Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin sowie des MRP1-Inhibitors Reversan einzeln und in Kombination bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen in vitro zu untersuchen. Zusätzlich wurde der antiproliferative Effekt der drei Inhibitoren mit dem antiproliferativen Effekt von 5-FU verglichen.
Das Konzept zu dieser Arbeit basiert auf Gemeinsamkeiten zwischen LDH und MRP1 in malignen Zellen. Eine ist, dass beide Moleküle von zahlreichen Tumoren überexprimiert werden. Weiter sind beide an der Ausbildung von Chemoresistenz beteiligt und beide werden auch in Hypoxie exprimiert. Zudem wird das für die Funktion von MRP1 notwendige ATP in malignen Zellen hauptsächlich mit der hyperaktiven Glykoloyse gebildet, deren Stoffumsatz auch von der LDH-Aktivität abhängig ist. Eine kombinierte Inhibition beider Zielstrukturen scheint somit geeignet zu sein, um die Proliferation maligner Zellen gezielt zu hemmen. Da in großen Teilen solider Tumoren hypoxische bzw. anoxische Bedingungen vorherrschen, wurde die Wirksamkeit der drei Inhibitoren auch bei 5 % und 1 % Sauerstoff, die als tumorphysiologisch gelten, untersucht.
Die wichtigsten Ergebnisse aus dieser Arbeit sind, dass die beiden LDH-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin und der MRP1-Inhibitor Reversan einen antiproliferativen Effekt bei kolorektalen Karzinomzellen auslösen, der auch für tumorphysiologische Sauerstoffkonzentrationen nachzuweisen war. So verringerte sich durch Natriumoxamat bzw. Galloflavin der Anteil vitaler Zellen um bis zu 45 % und durch Reversan um bis zu 60 % bei 5 % und 1 % Sauerstoff im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
Auch unterschiedliche Kombination aus Natriumoxamat, Galloflavin und Reversan führten zu einer Steigerung des antiproliferativen Effektes, der auch immer bei tumorphysiologischen Konzentrationen nachzuweisen war. Den stärksten antiproli-ferativen Effekt wies die Dreifachkombination aus Galloflavin, Natriumoxamat und Reversan auf. So verringerte sich der Anteil vitaler Zellen bei 1 % Sauerstoff durch diese Kombination auf bis zu 28 % bei vier der fünf kolorektalen Karzinomzelllinien. Die Dreifachkombination wies einen gleichstarken bzw. stärkeren antiproliferativen Effekt auf als das Chemotherapeutikum 5-FU und zwar ebenfalls bei 5 % und 1 % Sauerstoff.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum antiproliferativen Effekt von Natriumoxamat, Galloflavin (beides LDH-Inhibitoren) und Reversan (MRP1-Inhibitor) in vitro lassen den Schluss zu, dass das Konzept der Arbeit, einen antiproliferativen Effekt auch bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen zu induzieren, grundsätzlich bestätigt wurde. Auch löste die gemeinsame Hemmung von LDH und MRP1 einen teilweise stärkeren antiproliferativen Effekt aus als 5-FU. Weitere Untersuchungen sind aber ohne Frage nötig, um die molekularen Interaktion zwischen LDH und MRP1 sowie ihrer Inhibition im Detail zu verstehen.
Das Raf kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Kinaseregulator, der im Herzen eine Präferenz für die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) zeigt. Die Regulation erfolgt durch direkte Interaktion beider Proteine, wird durch eine PKC-Phosphorylierung an Serin 153 des RKIP induziert und inhibiert die GRK2-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GRK2 desensitiviert GPCR und eine Hemmung der GRK2-Aktivität wirkt sich so positiv auf die Ansprechbarkeit von GPCR aus. Die \textbeta-adrenergen Rezeptoren (\textbeta AR) sind im Herzen maßgeblich an der Regulation der kardialen Kontraktilität beteiligt. Erste Zusammenhänge zwischen der RKIP-Expression und der kontraktilen Antwort von Kardiomyozyten wurden bereits in einer früheren Arbeit untersucht und bestätigt. Sie begründen die Fragestellung nach Effekten einer verstärkten RKIP-Expression auf \textbeta-adrenerge Rezeptorsignale, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz.
Im Rahmen dieses Projektes konnten die Effekte des RKIP auf \textbeta-adrenerge Signalwege detaillierter beschrieben werden. Dabei erwies sich die inhibitorische Funktion auf die GRK2 als rezeptorspezifisch ohne Einfluss auf zytosolische Angriffspunkte der GRK2 zu nehmen. Verstärkte \textbeta-adrenerge Signale zeigten sich in neonatalen Kardiomyozyten an Hand der erhöhten cAMP-Level, PKA-Aktivität, sowie Kontraktionsrate und Relaxationsgeschwindigkeit nach \textbeta-adrenerger Stimulation. Im Einklang damit konnte eine erhöhte PKA- und CaMKII-Aktivität und eine positive Inotropie in transgenen Tieren, mit herzspezifischer Überexpression von RKIP, beobachtet werden. Durch Messung des Calcium-\textit{Cyclings} in Kardiomyozyten konnte der Phänotyp auf eine verbesserte Rückführung des Calciums, einer daraus resultierenden erhöhten Calciumbeladung des sarkoplasmatischen Retikulums und einem gesteigerten systolischen Calciumspiegel, zurückgeführt werden. Die Untersuchung der Phosphorylierung von Calciumkanälen, L-Typ-Calciumkanal und Ryanodin-Rezeptor 2, die den einwärtsgerichteten Calciumstrom vermitteln konnte ihre Beteiligung an der positiv inotropen Wirkung ausschließen.
Neben dem kontraktilen Phänotyp konnten zusätzliche protektive Effekte beobachtet werden. In Modellen, die eine chronische \textbeta-adrenerge Stimulation imitieren, bzw. eine Nachlasterhöhung induzieren konnte eine Verringerung der interstitiellen Fibrose und der damit assoziierten Marker, gezeigt werden. Mit Hilfe von \textit{in vivo} EKG-Messungen konnte die Neigung zur Ausbildung von Arrhythmien untersucht werden. Auch im Hinblick auf die Anzahl der Extrasystolen waren RKIP-transgene Tiere geschützt. Infolge der Untersuchung der Phänotypen in Deletionshintergründen der einzelnen \textbeta AR-Subtypen (\textbeta\textsubscript{1}AR, \textbeta\textsubscript{2}AR) konnte die positive Inotropie mit den spezifischen Signalwegen des \textbeta\textsubscript{1}AR assoziiert und die protektiven Effekte gegenüber den Umbauprozessen und der Arrhythmieneigung dem \textbeta\textsubscript{2}-adrenergen Signalen zugeschrieben werden. Zusätzlich bestätigt sich eine besondere Rolle der G\textalpha\textsubscript{i}-Kopplung des \textbeta\textsubscript{2}AR, durch die er einen hemmenden Einfluss auf die \textbeta\textsubscript{1}AR-Singale nehmen kann.
Die Untersuchung einiger Marker, die eine physiologische von einer pathologischen Hypertrophie unterscheiden, konnte das in den RKIP-transgenen Mäusen auftretende Wachstum der Kardiomyozyten als kompensatorische und physiologische Hypertrophie charakterisieren. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine ausgeglichene Aktivierung der beiden Rezeptoren hin, die sich gegenseitig regulieren und durch die Inhibition der GRK2 in ihrer Anregbarkeit erhalten bleiben. Mittels einer AAV9-vermittelten Gentherapie konnte das therapeutische Potential dieses Prinzips weiter bestätigt werden, da es die prominentesten Veränderungen während der Herzinsuffizienzentwicklung, wie die Verschlechterung der linksventrikulären Funktion, die Dilatation des linken Ventrikels, die Ausbildung von Lungenödemen und interstitieller Fibrose sowie die Expression von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen, verhindern konnte. Auch konnten die Auswirkungen der Deletion des RKIP, die sich durch eine beschleunigte und gravierendere Herzinsuffizienzentwicklung auszeichnet, durch Reexpression von RKIP verhindert werden.
Diese Arbeit kann somit zeigen, dass das RKIP eine ausgeglichene Verstärkung von \textbeta-adrenergen Signalwegen verursacht, die positiv inotrop und gleichzeitig protektiv wirkt. Dieses Wirkprinzip könnte ferner eine Strategie zur Erhöhung der Kontraktilität in der Herzinsuffizienz darstellen, die entgegen etablierter Theorien auf der Stimulation beider \textbeta AR basiert.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine durch monoklonale Vermehrung terminal differenzierter Antikörper-produzierender B-Lymphozyten (Plasmazellen) im Knochenmark charakterisierte maligne Krankheit, die sich v.a. in osteolytischen Knochendestruktionen, hämatopoetischer und Niereninsuffizienz äußert. Verbesserte Therapieansätze wie die Hochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und anschließender autologer Stammzelltransplantation sowie die Einführung neuer pharmakologischer Substanzklassen (Proteasom-Inhibitoren, Cereblon-bindende Thalidomidderivate) führten zu einer Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit, für die meisten der Patienten ist die Erkrankung jedoch derzeit unheilbar. Die Erforschung neuer potenzieller therapeutischer Angriffspunkte auf Grund pathobiologischer Erkenntnisse bleibt daher unabdingbar. Ein Ansatz zur Verbesserung des Verständnisses der Pathogenese ist die funktionelle, molekulare und genetische Analyse des Signalnetzwerkes im MM. Im Zusammenhang mit diesem Konzept wurde entdeckt, dass wachstums-regulierende Signalwege in MM Zellen aktiviert oder dereguliert sind und zum Überleben und der Proliferation des Tumors beitragen. So konnte beispielsweise von unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass onkogenes Ras essentiell zum Überleben der MM Zellen beiträgt. Da Ras derzeit mangels spezifischer Inhibitoren pharmakologisch nicht angreifbar ist, stellen weitere funktionelle Bestandteile des Signalweges eine potenzielle therapeutische Zielstruktur dar. Während die Blockade von MEK1/2 in MM Zellen keinen Einfluss auf das Überleben hatte, konnte durch die Blockade von Raf in ersten Tests unserer Arbeitsgruppe Apoptose hervorgerufen werden. Aus diesem Grund habe ich in der vorliegenden Arbeit zur Evaluation eines neuen Therapieansatzes die Rolle der Raf-abhängigen Signaltransduktion eingehend untersucht. Als Grundlage diente dabei die Hypothese, dass die Raf-Kinasen entscheidende Effektoren der durch onkogenes Ras vermittelten apoptotischen Effekte darstellen. In einem ersten Schritt konnte ich nachweisen, dass alle drei Raf-Isoformen (A-, B- und C-Raf) in humanen MM Zelllinien und in primären MM Zellen aktiviert sind. Mittels shRNA-vermittelter, Isoform-spezifischer Raf-Knockdown-Experimente konnte ich zeigen, dass nur ein simultaner Knockdown aller Isoformen, d.h. ein Pan-Raf-Knockdown, zu einer De-Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 führte. Dieser Versuch ließ sich mittels pharmakologischer Raf-Inhibition, bei der ebenfalls nur eine Pan-Raf-Blockade zu einer Herunterregulation von MEK1/2 und ERK1/2 in MM Zellen führte, bestätigen. Das MEK/ERK-Modul stellte somit einen hervorragenden Surrogat- und Biomarker für die Pan-Raf-Aktivität dar. Im Gegensatz zur Blockade des MEK/ERK-Moduls führte eine Hemmung der Pan-Raf-Aktivität mittels shRNA oder pharmakologischer Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien und in der Mehrheit der primären MM Zellen zu einer starken Induktion von Apoptose. Da das Ansprechen auf eine Pan-Raf-Blockade nicht mit dem Ras-Mutationsstatus korrelierte, könnten die Raf-Kinasen eine von onkogenem Ras unabhängie Qualität als therapeutische Zielstruktur aufweisen. Zur Untersuchung möglicher MEK/ERK-unabhängiger Effektormechanismen der Pan-Raf-Inhibition habe ich die mRNA-basierten Genexpressionsprofile von INA-6 Zellen nach pharmakologischer Pan-Raf- oder MEK-Inhibition verglichen. Dabei führte die Pan-Raf-Inhibition zu einer Regulation von wesentlich mehr Genen, wobei sich auch die Art der regulierten Gene unterschied, darunter Gene mit tumorrelevanten Funktionen wie Regulation von Proliferation, Zellzyklus und Apoptose. Für eine dieser Gengruppen, die Gruppe der PI3K-abhängigen, mTOR-assoziierten Gene, konnte ich eine Regulation auch auf der Proteinebene nachweisen: die Phosphorylierungen von mTOR, p70S6K, Rb und AKT und die Expression von CyclinD1 und PDK1 waren nach Pan-Raf-Inhibition, nicht jedoch nach MEK-Blockade herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Ko-Regulation der PI3K-abhängigen Signaltransduktion durch die Raf-kinasen hin. Mittels spezifischer PI3K-Inhibitoren ließ sich sowohl bei der Regulation der untersuchten Proteine als auch bei der Induktion von Apoptose eine deutliche Verstärkung der Pan-Raf-Inhibition in HMZL und in primären Zellen erzielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Pan-Raf-Blockade eine neue Therapiemöglichkeit darstellt, die durch Kombination mit einer PI3K/AKT-Inhibition noch verstärkt werden kann.
Whereas most currently used antibiotics act by interfering with essential bacterial processes, a smaller group of antibacterials disturbs the integrity of the cell membrane. Since fatty acids are a vital component of membrane phospholipids, the type-II fatty acid biosynthesis pathway (FAS-II) of bacteria constitutes a promising drug target. The front-line anti-tuberculosis prodrug isoniazid blocks the FAS-II pathway in M. tuberculosis thereby leading to morphological changes and finally to cell lysis. When it became evident that the enoyl-ACP reductase in the FAS-II pathway is the target of the activated isoniazid, several programs were initiated to develop novel inhibitors directed against this protein in different pathogens. The S. aureus enoyl-ACP reductase (saFabI) is of particular interest since three promising drug candidates inhibiting this homologue have reached clinical trials. However, despite these prospects, no crystal structures of saFabI were publicly available at the time the present work was initiated. Thus, one major goal of this thesis was the generation of high-resolution atomic models by means of X-ray crystallography. The development of a highly reproducible approach to co-crystallize saFabI in complex with NADP+ and diphenyl ether-based inhibitors led to crystal structures of 17 different ternary complexes. Additional crystallographic experiments permitted the view into two apo-structures and two atomic models of saFabI in complex with NADPH and 2-pyridone inhibitors. Based on the established saFabI structure, molecular dynamics (MD) simulations were performed to improve our understanding of the conformational mobility of this protein. Taken together, these investigations of the saFabI structure and its flexibility served as an ideal platform to address important questions surrounding substrate and inhibitor recognition by this enzyme. Intriguingly, our saFabI structures provide several vastly different snapshots along the reaction coordinate of ligand binding and hydride transfer, including the closure of the flexible substrate binding loop (SBL). The extraordinary mobility of saFabI was confirmed by MD simulations suggesting that conformational motions indeed play a pivotal role during substrate delivery and turnover. A water chain linking the active site with a water-basin inside the homo-tetrameric enzyme was found likely to be crucial for the closure and opening of the SBL and, thus, for the catalyzed reaction. Notably, the induced-fit ligand binding process involves a dimer-tetramer transition, which could be related to the observed positive cooperativity of cofactor and substrate binding. Overall, saFabI displays several unique characteristics compared to FabI proteins from other organisms that might be necessary for the synthesis of branched-chain fatty acids, which in turn are required for S. aureus fitness in vivo. This finding may explain why S. aureus is sensitive to FAS-II inhibitors even in the presence of exogenous fatty acids. Accordingly, saFabI remains a valid drug target and our structures can be used as a molecular basis for rational drug design efforts. In fact, binding affinity trends of diphenyl ether inhibitors and, more importantly, the correlated residence times could be rationalized at the molecular level. Furthermore, the structure of saFabI in complex with the 2-pyridone inhibitor CG400549 revealed unique interactions in the wider binding crevice of saFabI compared to other FabI homologues explaining the narrow activity spectrum of this clinical candidate with proven human efficacy. In summary, these studies provide an ideal platform for the development of new, effective saFabI inhibitors as exemplified by the promising 4-pyridone PT166. In the context of this dissertation, crystal structures of the condensing enzyme KasA in complex with several analogs of the naturally occurring inhibitor thiolactomycin have been solved.
Molecular and cellular cross talk between angiogenic, immune and DNA mismatch repair pathways
(2015)
VEGF is a main driver of tumor angiogenesis, playing an important role not only in the formation of new blood vessels, but also acts as a factor for cell migration, proliferation, survival and apoptosis. Angiogenesis is a universal function shared by most solid tumors and its inhibition was thought to have the potential to work across a broad patient population. Clinical evidence has shown that inhibiting pathological angiogenesis only works in a subset of patients and the identification of those patients is an important step towards personalized cancer care. The first approved antiangiogenic therapy was bevacizumab (Avastin®), a monoclonal antibody targeting VEGF in solid tumors including CRC, BC, NSCLC, RCC and others.
In addition to endothelial cells, VEGF receptors are present on a number of different cell types including tumor cells, monocytes and macrophages. The work presented in this thesis looked at the in vitro cellular changes in tumor cells and leukocytes in response to the inhibition of VEGF signaling with the use of bevacizumab. In the initial experiments, VEGF was induced by hypoxia in tumor cells to evaluate changes in survival, proliferation, migration and changes in gene or protein expression. There was a minimal direct response of VEGF inhibition in tumor cells that could be attributed to bevacizumab treatment, with minor variations in some of the cell lines screened but no uniform or specific response noted.
MMR deficiency often results in microsatellite instability (MSI) in tumors, as opposed to microsatellite stable (MSS) tumors, and accounts for up to 15% of colorectal carcinomas (CRCs). It has been suggested in clinical data that MMR deficient tumors responded better to bevacizumab regimens, therefore further research used isogenic paired CRC tumor cell lines (MMR deficient and proficient). Furthermore, a DNA damaging agent was added to the treatment regimen, the topoisomerase inhibitor SN-38 (the active metabolite of irinotecan). Inhibiting VEGF using bevacizumab significantly inhibited the ability of MMR deficient tumor cells to form anchor dependent colonies, however conversely, bevacizumab treatment before damaging cells with SN-38, showed a significant increase in colony numbers. Moreover, VEGF inhibition by bevacizumab pretreatment also significantly increased the mutation fraction in MMR deficient cells as measured by transiently transfecting a dinucleotide repeat construct, suggesting VEGF signaling may have an intrinsic role in MMR deficient cells. A number of pathways were analyzed in addition to changes in gene expression profiles resulting in the identification of JNK as a possible VEGF targeted pathway. JUN expression was also reduced in these conditions reinforcing this hypothesis, however the intricate molecular mechanisms remain to be elucidated.
In order to remain focused on the clinical application of the findings, it was noted that some cytokines were differentially regulated by bevacizumab between MMR proficient and deficient cells. Treatment regimens employed in vitro attempted to mimic the clinical setting by inducing DNA damage, then allowing cells to recover with or without VEGF using bevacizumab treatment. Inflammatory cytokines, CCL7 and CCL8, were found to have higher expression in the MMR deficient cell line with bevacizumab after DNA damage, therefore the cross talk via tumor derived factors to myeloid cells was analyzed. Gene expression changes in monocytes induced by tumor conditioned media showed CCL18 to be a bevacizumab regulated gene by MMR deficient cells and less so in MMR proficient cells. CCL18 has been described as a prognostic marker in gastric, colorectal and ovarian cancers, however the significance is dependent on tumor type. CCL18 primarily exerts its function on the adaptive immune system to trigger a TH2 response in T cells, but is also described to increase non-specific phagocytosis. The results of this study did show an increase in the phagocytic activity of macrophages in the presence of bevacizumab that was significantly more apparent in MMR deficient cells. Furthermore, after DNA damage MMR deficient cells treated with bevacizumab released a cytokine mix that induced monocyte migration in a bevacizumab dependent manner, showing a functional response with the combination of MMR deficiency and bevacizumab. In summary, the work in this thesis has shown evidence of immune cell modulation that is specific to MMR deficient tumor cells that may translate into a marker for the administration of bevacizumab in a clinical setting.
VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird.
VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden.
Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten.
In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte.
Arzneistoffe werden nach ihrer Applikation durch verschiedene fremdstoff-metabolisierende Enzyme des Organismus biochemisch verändert. Durch eine Hemmung dieser Enzyme, z. B. durch Grapefruitsaft oder einen gleichzeitig eingenommenen Arzneistoff, kann es insbesondere bei Arzneistoffen mit geringer therapeutischer Breite, wie z. B. Theophyllin oder Phenprocoumon, zu gefährlichen Nebenwirkungen kommen. Besonders gefährdet sind multimorbide Patienten, die eine Therapie mit einer Vielzahl von Arzneimitteln erhalten. Um den Metabolismus von neuen Wirkstoffen und deren Interaktionspotential zu untersuchen, werden u. a. In-vitro-Experimente mit Zellfraktionen oder einzelnen Enzymen durchgeführt. Bei Inhibitionsassays wird der Einfluss von Arzneistoffen auf die Umsetzung eines Testsubstrates untersucht. Ein Großteil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit der Entwicklung von Methoden, mit denen die Inhibition wichtiger fremd-stoffmetabolisierender Enzyme, wie Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme), Glutathion-S-Transferasen (GSTs) und Carboxylesterasen (CES), untersucht werden kann. Dabei wurde auch eine Charakterisierung der Testsubstrate vorgenommen. Darüber hinaus wurden die Bioaktivierung von Clopidogrel und die Bildung von reaktiven Metaboliten untersucht.
Aufgrund aktueller Diskussionen über die Interaktion zwischen Clopidogrel und Omeprazol wurde in dieser Arbeit die Bioaktivierung von Clopidogrel mit Hilfe von LC/MS/MS-Analysen und rekombinanten CYP-Enzymen sowie humanen Lebermikrosomen untersucht. Aufgrund der Instabilität des aktiven Metaboliten wurde in den inkubierten Proben eine Derivatisierung mit Dimedon durchgeführt. Die Untersuchungen zeigten, dass die Umwandlung zum 2-Oxo-Clopidogrel durch mehrere CYP-Enzyme erfolgt. Neben CYP2C19 sind CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP3A4 beteiligt. Anhand von selektiven Inhibitoren konnte CYP3A4 für die Bildung des aktiven Metaboliten aus 2-Oxo-Clopidogrel identifiziert werden. Neben der Biotransformation durch CYP-Enzyme wird hauptsächlich der Carbonsäureester des Clopidogrels hydrolysiert. Untersuchungen mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterasen zeigen, dass die Esterhydrolyse durch CES1 katalysiert wird. Des Weiteren wurde der Metabolismus von Omeprazol untersucht. Es stellte sich heraus, dass die 5-Hydroxylierung und die 5-O-Demethylierung hauptsächlich durch CYP2C19 und CYP2D6 erfolgen. Dabei besitzt Omeprazol die höchste Affinität zu CYP2C19. Die Bildung von Omeprazolsulfon wird hingegen nur durch CYP3A4 katalysiert. Mit Hilfe etablierter CYP-Inhibitionsassays wurde der Einfluss von Clopidogrel und Omeprazol auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Durch Clopidogrel wurden CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) und CYP1A2 (IC50 = 2.8 µM) gehemmt. Omeprazol inhibiert v. a. CYP2C19 (IC50 = 2 µM) und CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Im Folgenden wurde auch der Einfluss von Omeprazol auf die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel untersucht. Die Bioaktivierung wurde allerdings erst bei einer Omeprazol-Konzentration von mehr als 10 µM beeinflusst. Am stärksten wurde dabei CYP2C19 (IC50 ca. 100 µM) gehemmt. Aufgrund der recht schwachen Inhibition von CYP2C19 durch Omeprazol und der Tatsache, dass mehrere CYP-Enzyme die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel katalysieren, lässt sich der Wirkungsverlust von Clopidogrel bei einer gleichzeitigen Einnahme von Omeprazol anhand der Ergebnisse der In-vitro-Versuche nicht durch eine Hemmung von CYP2C19 erklären.
Eine bisher nur wenig bei In-vitro-Interaktionsstudien untersuchte Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Carboxylesterasen (CES), die v. a. bei der Bioaktivierung von Esterprodrugs eine wichtige Rolle spielen. Für die Entwicklung von Inhibitionsassays wurden zunächst verschiedene Modellsubstrate ausgewählt. Nach Inkubation dieser Substrate mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterase-Enzymen wurden die Metaboliten mit Hilfe einer HPLC/UV-Analyse quantifiziert. Es zeigte sich, dass Methyl-4-nitrobenzoat und Mycophenolatmofetil selektiv durch CES1 hydrolysiert werden. Die Hydrolyse von Phenylacetat, p-Nitrophenylacetat und 4-Methylumbelliferylacetat wurde durch alle verwendeten Enzyme katalysiert. Darüber hinaus konnte eine Hydrolyse der aus Boswellia-Arten (Weihrauch) stammenden 3-O-Acetyl-11-keto--boswelliasäure durch CES2 beobachtet werden. Aufgrund der bei den meisten Modellsubstraten auftretenden Instabilität im Inkubationspuffer war eine Korrektur mit Hilfe von Blindproben erforderlich. Die Hydrolyse konnte durch Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und durch die Zugabe von Essigsäure zur Stopplösung verlangsamt werden. Anschließend wurde die Beeinflussung der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat durch Pflanzenextrakte untersucht. Es zeigte sich, dass zahlreiche Extrakte die Esterasen aus der humanen Leber hemmten und die Aktivität bei einer Extraktkonzentration von 25-50 µg/ml weit unterhalb von 50 % lag. Die Inhibition von CES durch Pflanzenextrakte stellt daher ein bisher unbekanntes Risiko für Arzneimittelinteraktionen dar.
Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme) sind die wichtigste Gruppe fremdstoff-metabolisierender Enzyme. Zur Untersuchung der Beeinflussung dieser Enzyme durch neue Wirkstoffe werden daher standardmäßig In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Von der Food and Drug Administration (FDA) wurden daher für jedes CYP-Enzym verschiedene Arzneistoffe als Testsubstrate vorgeschlagen. Zusätzlich kommen bei solchen Untersuchungen Modellsubstrate zum Einsatz, deren Metaboliten fluoreszieren und die somit für ein Hochdurchsatz-Screening mit Hilfe von Mikrotiterplatten verwendet werden können. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Modellsubstanzen (Cumarin- und Harman-Derivate) auf ihre Eignung als Substrate für CYP-Inhibitionsassays untersucht. Nach der Entwicklung von Methoden zur Detektion der Metaboliten, die durch LC/MS/MS-Analysen oder durch HPLC/Fluoreszenzanalysen erfolgte, wurden die CYP-Enzyme identifiziert, die an der Umsetzung der Substrate beteiligt sind und mit Hilfe von CYP-Enzymen und humanen Lebermikrosomen wurden die Km-Werte der Substrate bestimmt. Die Untersuchungen zur Stabilität der CYP-Enzyme über 60 min zeigten, dass diese bei 37 °C stark an Aktivität verlieren, insbesondere CYP1A2. Für eine maximale Umsetzungsgeschwindigkeit war eine NADPH-Konzentration von 1 mM ausreichend. Die Untersuchung von 14 Standardsubstraten ergab, dass die Mehrheit selektiv durch das entsprechende CYP-Enzym umgesetzt wird. Die Amodiaquin-N-deethylierung, die Tolbutamidhydroxylierung, die Chlorzoxazon-6-hydroxylierung und die 4-Nitrophenol-2-hydroxylierung wurden durch mehrere CYP-Enzyme katalysiert. Als Positivkontrollen für die Inhibitionsassays und zur Identifizierung der am Metabolismus beteiligten CYP-Enzyme werden von der FDA verschiedene Inhibitoren vorgeschlagen. Da nicht zu allen Inhibitoren Daten über deren Isoenzymselektivität vorliegen, wurde mit Hilfe der Assays die inhibitorische Aktivität von zwölf Inhibitoren auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Alle Inhibitoren hemmten das jeweilige angegebene CYP-Enzym. Bei Furafyllin (CYP1A2), Tranylcypromin (CYP2A6), Clopidogrel (CYP2B6), Montelukast (CYP2C8), Sulfaphenazol (CYP2C9), Chinidin (CYP2D6) und Ketoconazol (CYP3A4) konnte eine Konzentration ermittelt werden, bei der nur ein CYP-Enzym gehemmt wird. Für Quercetin, Nootkaton, Diethyldithiocarbamat, Sertralin und Ticlopidin wurde eine Inhibition mehrerer CYP-Enzyme festgestellt. Mit Hilfe der CYP-Inhibitionsassays wurden Extrakte lebertoxischer Arzneipflanzen, wie z. B. Tussilago farfara (Huflattich) oder Chelidonium majus (Schöllkraut), untersucht. Alle Extrakte hemmten konzentrationsabhängig die CYP-Enzyme, am stärksten die Enzyme der Subfamilie CYP2C.
Als In-vitro-Substrate für CYP-Inhibitionsassays werden aufgrund ihrer starken Fluoreszenz häufig Cumarin-Derivate eingesetzt. In dieser Arbeit wurden daher 18 O-alkylierte bzw. O-benzylierte Derivate von 7-Hydroxycumarin, 7-Hydroxy-4-methylcumarin und 7-Hydroxy-4-trifluormethylcumarin synthetisiert und die Umsetzung durch verschiedene CYP-Enzyme mit Hilfe der zuvor optimierten LC/LC/Fluoreszenz-basierten Assays untersucht. An der O-Desalkylierung der Cumarin-Derivate waren hauptsächlich CYP1A2, CYP2B6 und im geringeren Ausmaß CYP2C19, CYP2D6 und CYP2E1 beteiligt. Die höchste Affinität besaßen die Substrate zu CYP1A2. Debenzylierungen wurden neben CYP1A2 hauptsächlich durch CYP3A4 katalysiert. Die höchsten Umsetzungsgeschwindigkeiten wurden für die Debenzylierung von 7-Benzyloxy-4-methylcumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) und 7-Benzyloxy-4-trifluormethylcumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min) beobachtet. Für 7-Methoxy-4-trifluormethylcumarin (MFC) war die Umsetzungs¬geschwindigkeit für die O-Demethylierung mit CYP1A2 und CYP2B6 im Vergleich zu CYP2C9 deutlich höher. MFC und 7-Ethoxy-4-trifluormethylcumarin (EFC) eignen sich daher v. a. für Inhibitionsuntersuchungen von CYP2B6. Bei den untersuchten 7 Alkyloxycumarinen handelt es sich in allen Fällen nicht um selektive CYP-Substrate. Sie können demnach nicht für Inhibitionsuntersuchungen mit humanen Lebermikrosomen verwendet werden. Ein Einsatz für Simultanbestimmungen der Hemmung mehrerer CYP-Enzyme in einem Versuch (Cocktail-Assay) ist aus diesem Grund ebenfalls nicht möglich. Durch LC/MS-Analysen nach Inkubation der Cumarin-Derivate mit humanen Lebermikrosomen zeigte sich, dass neben den entsprechenden O Desalkylmetaboliten mehrere Hydroxymetaboliten entstehen und der O Desalkylmetabolit insbesondere bei Derivaten mit längeren Alkylsubstituenten nicht der Hauptmetabolit ist.
Ein Ziel der Arbeitsgruppe ist es zudem, neue In-vitro-Substrate zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen mit besseren enzymkinetischen und analytischen Eigenschaften zu entwickeln. Grundstruktur hierfür ist das -Carbolin, da -Carbolin-Derivate eine starke Fluoreszenz aufweisen. Von dem Naturstoff Harmin ist bekannt, dass dieser durch CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 und CYP2D6 O-demethyliert wird. Durch Modifizierung der Harman-Struktur sollte die CYP-Isoenzymselektivität für die O-Dealkylierung gesteigert werden und Substrate für weitere CYP-Enzyme erhalten werden. Hierfür wurden in der Arbeitsgruppe u. a. 2-Benzyl-7-benzyloxyharman (BBH), 2-Benzyl-7-methoxyharman (BMH), 7-Methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harman (MCBH) und 2-Methyl-7-methoxyharman (MMH) hergestellt. In dieser Arbeit wurden LC/LC/Fluoreszenz- und LC/MS/MS-Methoden zur Quantifizierung der aus diesen Derivaten entstehenden O-Desalkylmetaboliten entwickelt und die Substrate charakterisiert. Die Einführung von Benzylsubstituenten an der phenolischen Hydroxylgruppe von Harmol (BBH) führte zum Metabolismus durch CYP3A4 und die Substitution mit einem Carboxybenzylrest am Indolstickstoff (MCBH) verstärkte die Selektivität zu den Enzymen der Subfamilie 2C. Durch die Methylierung des Pyridin-Stickstoffs des Harmins (MMH) wurde ein selektives Substrat für CYP2D6 erhalten, weshalb bei dieser Substanz auch humane Lebermikrosomen verwendet werden können. Durch die im Vergleich zu anderen CYP2D6-Substraten erhaltene hohe Umsetzungsgeschwindigkeit lässt sich die Proteinkonzentration minimieren. Für die überwiegend an der O-Dealkylierung der Substrate beteiligten CYP-Enzyme wurden die Km-Werte ermittelt. Bei der Untersuchung von verschiedenen CYP-Inhibitoren zeigte sich, dass mit diesen Substraten vergleichbare IC50-Werte, wie mit den Standardsubstraten, erhalten werden. Die Harman-Derivate können daher zur Untersuchung der Inhibition wichtiger CYP-Enzyme eingesetzt werden und bieten eine Alternative zu den bisher vorhandenen Fluoreszenz-Substraten. Durch die Einstellung des pH-Wertes im Anschluss an die Inkubation lassen sich die Metaboliten ebenfalls fluorimetrisch in der Mikrotiterplatte detektieren und können für ein Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden. Allerdings müssen die Fluoreszenzeigenschaften weiter verbessert werden, um eine kontinuierliche Bestimmung während der Inkubation zu ermöglichen.
In der pharmazeutischen Industrie besteht ein großes Interesse an der Detektion von reaktiven Metaboliten, um eine potentielle Lebertoxizität von neuen Wirkstoffen vorhersagen zu können. Hierfür werden die Testsubstanzen mit humanen Lebermikrosomen inkubiert und die reaktiven Metaboliten mit Glutathion abgefangen. Zur Optimierung der LC/MS/MS-Analysen wurde in dieser Arbeit die Fragmentierung solcher Addukte anhand von Standardsubstanzen untersucht. Bei allen untersuchten Glutathion-Addukten trat eine Abspaltung der Pyroglutaminsäure bei positiver Polarität mit einer vergleichbaren Signalintensität auf, weshalb eine Detektion dieses Fragmentes durch einen Neutral-Loss-Scan am besten geeignet erschien. Mit Hilfe der Screening-Methode wurden zuerst Arzneistoffe untersucht, von denen reaktive Metaboliten bekannt sind. Für die Bioaktivierung von Clozapin konnten CYP1A2, CYP2D6 und CYP3A4 identifiziert werden, während die Toxifizierung von Paracetamol hauptsächlich durch CYP1A2 und CYP3A4 erfolgte. Auffällig war, dass mit steigender Paracetamolkonzentration keine Sättigung der Umsetzung auftrat. Durchgeführte Molekülveränderungen am Glutathion, wie die Einführung eines Dansylrestes oder eines Biotins, führten zu keiner deutlichen Verbesserung der Detektion der reaktiven Metaboliten. Darüber hinaus zeigte sich, dass bei den markierten GSH-Derivaten die Umsetzung durch GSTs erheblich reduziert ist. Mit der Screening-Methode wurden allerdings viele falsch positive Signale erhalten, so dass diese nicht für eine Untersuchung von Extrakten lebertoxischer Pflanzen eingesetzt werden konnte. Für eine eindeutige und schnelle Identifizierung der Signale als Glutathion-Addukte ist daher die hochauflösende Massenspektrometrie erforderlich.
Eine weitere Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Glutathion-S-Transferasen (GSTs), über deren Inhibition durch Arzneistoffe und Pflanzenextrakte in der Literatur nur wenige Daten vorliegen. Zur Entwicklung von Inhibitionsassays wurden die in der Literatur beschriebenen Substrate 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, 4 Nitrochinolin-N-oxid, 1,2-Dichlor-4-nitrobenzol und 4-Nitrobenzylchlorid verwendet. Die Detektion der Metaboliten erfolgte im Gegensatz zu der häufig eingesetzten Photometrie mit Hilfe der HPLC/UV- bzw. einer LC/MS/MS-Analyse. Für die Kalibrierung wurden zunächst die entsprechenden Glutathionkonjugate aus den Substraten synthetisiert. Bei den durchgeführten diskontinuierlichen Assays stellte die häufig auftretende nichtenzymatische Reaktion der Substrate mit Glutathion ein Problem dar. Durch die Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und der Senkung der Inkubationstemperatur von 37 °C auf 25 °C konnte die nichtenzymatische Reaktion während der Inkubation erheblich verlangsamt werden. Die nichtenzymatische Reaktion nach der Inkubation konnte durch Zugabe von Oxidationsmitteln gestoppt werden. Von den getesteten humanen Lebersubzell¬fraktionen besaß die cytosolische Fraktion bei allen Substraten die höchste Aktivität. Im Rahmen der Assayentwicklung wurde die Glutathion-, die Proteinkonzentration und die Inkubationszeit optimiert. Es wurden die Km- und Vmax-Werte für die Umsetzung der Substrate ermittelt. Als Positivkontrolle diente das ebenfalls synthetisierte Glutathionkonjugat der Etacrynsäure, für das die IC50-Werte mit jedem Substrat bestimmt wurden. Dabei konnte ein Einfluss des pH-Wertes des Inkubationspuffers und der Inkubationstemperatur auf die gemessene inhibitorische Aktivität beobachtet werden. Anschließend wurde ein Screening von Arzneistoffen, ausgewählten Naturstoffen und etwa 50 Pflanzenextrakten auf eine Inhibition der GSTs in humanem Lebercytosol mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, das am schnellsten von allen Substraten umgesetzt wurde, durchgeführt. Von den getesteten Naturstoffen fiel eine ausgeprägte Hemmung durch Biflavonoide auf. Nahezu alle untersuchten Pflanzenextrakte hemmten die GSTs. Eine starke Inhibition der GSTs zeigten Extrakte aus Cinnamomum cassia (Zimt), die sich als nicht-kompetitiv herausstellte. Weiterhin wurde eine starke Hemmung der Extrakte gerbstoffhaltiger Pflanzen, wie z. B. Hamamelis virginiana (virginische Zaubernuss) oder Krameria triandra (Ratanhia), beobachtet. Hier resultierten IC50-Werte zwischen 5 und 30 µg/ml. Ein Vergleich verschiedener Methoden zur Detektion des Metaboliten 2,4 Dinitrophenyl-S-glutathion zeigte, dass die Photometrie für die Untersuchung der Inhibition von Pflanzenextrakten aufgrund der Störung durch die Pflanzenmatrix ungeeignet ist. Mit Hilfe der verwendeten HPLC/UV- sowie der LC/MS/MS-Analyse konnte der Metabolit selektiv erfasst werden und reproduzierbare Ergebnisse für die Inhibition der GSTs durch Pflanzenextrakte erzielt werden.
Neben den GSTs wurde auch die Beeinflussung der Glutathionreduktase (GR) in dieser Arbeit untersucht. Hierfür wurde ein HPLC-basierter Assay entwickelt, bei dem das reduzierte Glutathion mit 5,5´-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) derivatisiert und das entstandene gemischte Disulfid aus Glutathion und 5-Thio-2-nitrobenzoesäure quantifiziert wurde. Zur Untersuchung der Inhibition durch Pflanzenextrakte wurde humanes Lebercytosol verwendet, das von allen humanen Lebersubzellfraktionen die höchste Aktivität besaß. Im Vergleich zu den GSTs wurde die GR durch die überwiegende Zahl der ausgewählten Pflanzenextrakte kaum gehemmt. Eine nennenswerte Inhibition der GR konnte nur bei Extrakten von Juglans regia (Walnuss) beobachtet werden.
Fazit
In dieser Arbeit wurden eine Reihe von In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen und weiteren fremdstoffmetabolisierenden Enzymen, wie CES oder GSTs, entwickelt. Aufgrund der dabei angewendeten selektiven HPLC-basierten Quantifizierung der Metaboliten durch UV-, Fluoreszenz- oder MS-Detektion können mit diesen Methoden auch Proben mit komplexer Matrix untersucht werden. Für alle Assays wurden die Inkubationsbedingungen optimiert und die enzymkinetischen Parameter vieler Substrate ermittelt. Darüber hinaus wurden wichtige Erkenntnisse über die Isoenzymselektivität dieser Substrate gewonnen. Die Eignung der Assays wurde anhand von Standardinhibitoren bewiesen. Schließlich wurde die inhibitorische Aktivität von zahlreichen Pflanzenextrakten bestimmt, deren Auswirkung auf fremdstoffmetabolisierende Enzyme bisher unbekannt war. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können für die Untersuchung des Metabolismus von Arzneistoffen und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme, die für eine Zulassung neuer Wirkstoffe erforderlich ist, routinemäßig eingesetzt werden.
Ziel der vorliegenden, experimentellen Arbeit war die Untersuchung der Persönlichkeitseigenschaft der Impulsivität bei adulten Patienten mit ADHS und vergleichbaren Versuchspersonen. Da die Ätiopathogenese erhöhter Impulsivität bei Patienten mit ADHS bislang ungeklärt ist, eine Beeinflussung des dopaminergen Systems durch vorausgehende Studien allerdings nahe liegt, wurden die verwendeten Impulsivitätsmessungen zusätzlich bezüglich einer möglichen Beeinflussung durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus analysiert. Die Untersuchung beinhaltet mit 71 adulten Patienten mit ADHS und 54 gesunden Kontrollpersonen, die nach Alter, Geschlecht, IQ, Kopfumfang und Händigkeit vergleichbar waren, eine der aktuell größten Stichproben adulter Patienten mit ADHS. Während einer Stoppsignal-Aufgabe zur Erfassung der Antworthemmungsfähigkeit als Korrelat der Impulsivität wurden die Verhaltensdaten der Stichproben sowie die hirnphysiologischen Veränderungen mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie aufgezeichnet und ausgewertet. Die erhobenen experimentellen Daten wurden anschließend mit selbstbewerteter Impulsivität des I7-Impulsivitätsfragebogens nach Eysenck verglichen und auf mögliche Zusammenhänge überprüft. Zudem wurden die beobachteten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf einen möglichen Einfluss durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus untersucht. Auf der Verhaltensebene zeigten Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen sowohl für die SSRZ als auch für die Go-RZ signifikant langsamere Reaktionszeiten. Im Vergleich der funktionellen Daten konnten für Patienten mit ADHS während der erfolgreichen Stopp-Trials signifikant bzw. tendenziell verminderte Aktivierungen im Bereich des IFC und DLPFC in beiden Hemisphären festgestellt werden. Die Untersuchung der selbstbewerteten Impulsivität anhand des I7-Fragebogens ergab ebenfalls einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Stichproben. Bezüglich der Zusammenhänge zwischen den einzelnen Impulsivitätsmessungen konnten für Patienten mit ADHS signifikant bzw. tendenziell negative Zusammenhänge zwischen SSRZ und Oxygenierung im rechten IFC sowie zwischen SSRZ bzw. Go-RZ und I7-Impulsivitätswerten festgestellt werden. In der Untersuchung des Einflusses durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus ergab sich ein sehr heterogenes Bild, in dem sich keine eindeutig systematischen Genotyp- oder Interaktionseffekte zeigten. Während die beobachteten Befunde auf Verhaltensebene auf eine generelle Verlangsamung adulter Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen hindeuten, könnte das verminderte Aktivierungsmuster im Bereich des IFC und DLPFC während der erfolgreichen Stopp-Trials bei Patienten mit ADHS möglicherweise das zugrundeliegende funktionelle Korrelat zu den beobachteten Reaktionsunterschieden zwischen den beiden Stichproben darstellen. Obwohl Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollen aufgrund ihrer erhöhten Impulsivität defizitär erscheinen, deuten die Befunde bezüglich des Zusammenhangs zwischen selbstbewerteter und experimentell erhobener Impulsivität innerhalb der Patientengruppe einen möglichen Vorteil erhöhter I7-Impulsivitätswerte für die Reaktionsfähigkeit in der Stoppsignal-Aufgabe an. Bezüglich der Beeinflussung der erhobenen Daten durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus lassen sich anhand der Befunde dieser Arbeit keine klaren Schlussfolgerungen ziehen.
Tregs dienen zur Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem. Die Infektion, Aktivierung oder Induktion von Tregs durch Pathogene kann diese Balance empfindlich stören, eine Immunsuppression zur Folge haben und zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Persistenzen beitragen. Das MV verfügt nicht nur über vielfältige Mechanismen der Immunsuppression, während einer MV-Infektion herrschen zudem Bedingungen vor, welche die Zahl und Aktivität von Tregs beeinflussen könnten. Aufgrund der Expression von Reifungsmarkern auf Trn ist zudem eine präferenzielle Infektion dieser Zellpopulation denkbar. MV-Infektionen können sowohl die akute MV-Enzephalitis, eine Autoimmunerkrankung, nach sich ziehen, als auch die Persistenz SSPE ausbilden. Ob diese Komplikationen mit spezifischen Aberrationen in der Menge und Aktivität von Tregs im Zusammenhang stehen, war bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auf unstimulierten Trn der Reifungsmarker und MV-Rezeptor CD150 exprimiert wird und es in Folge dessen in vitro zu einer präferentiellen nicht produktiven Infektion und Depletion von Trn kommt. Ex vivo ließ sich ein deutlicher Depletionseffekt während der frühen akuten MV-Enzephalitis nachweisen, der nach Vaczinierung eines gesunden Probanden und Challenge eines immunisierten Affen nicht auftrat. Ob dieser Depletionseffekt ursächlich für die Enzephalitis ist, oder es sich um einen Begleiteffekt handelt ließe sich an Modellorganismen durch mitogene Manipulation der Trn während einer MV-Infektion untersuchen. Auch bei SSPE kann es zu einer Depletion von Trn kommen, dies scheint jedoch nicht mit der Progression dieser Erkrankung im Zusammenhang zu stehen. Wahrscheinlich ist dagegen ein Zusammenhang mit der Induktion von Tregs. In MV-stimulierten Proben von SSPE-Patienten wurde im Mittel signifikant mehr IL-10 exprimiert als in den Kontrollen. In Proben seropositiver gesunder Spender wurde IL-10 in den ersten Stunden nach MV-Stimulation fast ausschließlich von induzierten Tregs exprimiert. Weitere Versuche sind nötig, um die Evidenz zu steigern und zu ermitteln, ob auch in Patientenproben die frühe IL-10 Expression nach MV-Stimulation von induzierten Tregs dominiert wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sowohl bei der MV-Enzephalitis als auch bei SSPE zu signifikanten Wechselwirkungen mit Tregs kommt. Ob sich eine MV-Enzephalitis auch ohne Depletion von Trn ausbilden kann und ob die Ausbildung von SSPE erhöhte IL-10 Expression voraussetzt, werden weitere Untersuchungen ergründen müssen.
The present work investigated the neural mechanisms underlying cognitive inhibition/thought suppression in Anderson’s and Green’s Think/No-Think paradigm (TNT), as well as different variables influencing these mechanisms at the cognitive, the neurophysiological, the electrophysiological and the molecular level. Neurophysiological data collected with fNIRS and fMRI have added up to the existing evidence of a fronto-hippocampal network interacting during the inhibition of unwanted thoughts. Some evidence has been presented suggesting that by means of external stimulation of the right dlPFC through iTBS thought suppression might be improved, providing further evidence for an implication of this region in the TNT. A combination of fNIRS with ERP has delivered evidence of a dissociation of early condition-independent attentional and later suppression-specific processes within the dlPFC, both contributing to suppression performance. Due to inconsistencies in the previous literature it was considered how stimulus valence would influence thought suppression by manipulating the emotional content of the to-be-suppressed stimuli. Findings of the current work regarding the ability to suppress negative word or picture stimuli have, however, been inconclusive as well. It has been hypothesized that performance in the TNT might depend on the combination of valence conditions included in the paradigm. Alternatively, it has been suggested that inconsistent findings regarding the suppression of negative stimuli or suppression at all might be due to certain personality traits and/or genetic variables, found in the present work to contribute to thought inhibition in the TNT. Rumination has been shown to be a valid predictor of thought suppression performance. Increased ruminative tendencies led to worse suppression performance which, in the present work, has been linked to less effective recruitment of the dlPFC and in turn less effective down-regulation of hippocampal activity during suppression trials. Trait anxiety has also been shown to interrupt thought suppression despite higher, however, inefficient recruitment of the dlPFC. Complementing the findings regarding ruminative tendencies and decreased thought inhibition a functional polymorphism in the KCNJ6 gene, encompassing a G-to-A transition, has been shown to disrupt thought suppression despite increased activation of the dlPFC. Through the investigation of thought suppression at different levels, the current work adds further evidence to the idea that the TNT reflects an executive control mechanism, which is sensitive to alterations in stimulus valence to some extent, neurophysiological functioning as indicated by its sensitivity to iTBS, functional modulations at the molecular level and personality traits, such as rumination and trait anxiety.
Der präfrontale Kortex wird im Allgemeinen mit exekutiven Funktionen in Verbindung gebracht, die unter anderem Aufmerksamkeitskontrolle, Inhibition, Arbeitsgedächtnis oder die Erkennung und Bewertung neuartiger Reize beinhalten. Für die situationsgerechte Anpassung der verschiedenen Kontrollmechanismen ist in dieser Hirnregion, wie sich in zahlreichen Studien gezeigt hat, der Neurotransmitter Dopamin entscheidend. Dieser liegt, u.a. bedingt durch den Val108/158Met-Polymorphismus der Catechol-O-Methyl-Transferase, interindividuell in verschiedenem Ausmaß vor und sollte dadurch Unterschiede in präfrontalen Funktionen zwischen einzelnen Individuen maßgeblich beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war es, diesen Einfluss mittels EEG und ereigniskorrelierten Potenzialen genauer zu bestimmen und zusätzlich herauszuarbeiten, welche kognitiven Prozesse genau durch den COMT-Genotyp beeinflusst werden. 60 gesunde Probanden absolvierten hierzu unter EEG-Ableitung eine Aufgabe mit variablem Aufmerksamkeitsbedarf. Es wurde zunächst der Zusammenhang zwischen den ereigniskorrelierten Potenzialen N200 und P300 mit präfrontalen Funktionen wie Aufmerksamkeitskontrolle, Inhibition und Konfliktdetektion bzw. –verarbeitung untersucht. Zusätzlich wurden sowohl das Verhalten als auch die elektrophysiologische Aktivität zwischen den sorgfältig gematchten Genotyp-Gruppen Val/Val, Val/Met und Met/Met (je 11 Probanden) verglichen. Es zeigte sich, dass die N200 v.a. durch eine Veränderung der Aufmerksamkeitsrichtung zwischen globalen und lokalen Stimuluseigenschaften beeinflusst wurde. Die P300 wurde dagegen sowohl von der Aufmerksamkeitsrichtung als auch der Konfliktstärke (lokale im Vergleich zu globalen Stimuluseigenschaften sowie erhöhter Konflikt mit vermehrter Beanspruchung von Aufmerksamkeitsressourcen) beeinflusst. Wir konnten keine Auswirkungen der COMT-Ausprägung auf die Performanz (Korrektheit und Reaktionsgeschwindigkeit) im VAC-Test feststellen. Die hirnelektrische Aktivität (N200 und P300) unterlag dagegen einem deutlichen Einfluss des COMT-Genotyps: Met-Allel-Homozygote zeigten ein effizienteres Arbeiten - es lag eine bessere Aktivierung des Kortex (höhere P300) sowie ein geringerer Bedarf an Inhibition bei gleicher Leistung wie bei Val-Allel-Trägern vor (niedrigere N200- Amplitude). Es zeigte sich zudem bei den Met-Allel-Homozygoten kaum Variabilität der Hirnaktivierung über alle Schwierigkeitsstufen hinweg, was möglicherweise Ausdruck einer geringeren kognitiven Flexibilität im Vergleich zu Val-Allel-Trägern ist.
Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.
Um Arzneimittelwechselwirkungen von Arzneistoffen sowie neuen Arzneistoffkandidaten zu vermeiden, werden zur Abschätzung des Interaktionsrisikos so genannte In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Hierfür werden vor allem Mikrotiterplatten-basierte Fluoreszenz- und LC/MS-Methoden verwendet. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Anwendbarkeit und Validität dieser In-vitro-Methoden bezüglich der Inhibition von CYP-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten belegen, dass die verwendeten Fluoreszenz-Assays für Pflanzenextrakte keine validen Ergebnisse liefern und für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten nur in wenigen Fällen geeignet sind. Bei einigen untersuchten Pflanzenextrakten wurden sehr starke inhibitorische Aktivitäten gefunden, da durch Quenching des Fluoreszenzsignals falsch positive Ergebnisse vorgetäuscht wurden. Ebenso war die Inhibition bei einigen Pflanzenextrakten aufgrund einer starken Eigenfluoreszenz sehr schwach oder konnte überhaupt nicht bestimmt werden. Des Weiteren wurden als Referenzmethoden für die Bestimmung der Inhibition von CYP-Enzymen LC/MS-basierte Methoden mit Online-Festphasenextraktion verwendet, die speziell für Pflanzenextrakte entwickelt und validiert wurden. Die Ergebnisse der LC/MS-basierten CYP-Assays wurden durch die Pflanzenmatrix nicht beeinflusst, so dass diese Assays hervorragend als Referenzmethoden für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten geeignet sind. Bei sehr hohen Extraktkonzentrationen zeigten einige Pflanzenextrakte sehr starke Abweichungen der mittels LC/MS und Fluorimetrie in Mikrotiterplatten erhaltenen inhibitorischen Aktivität. Die Verwendung von niedrigen Extraktkonzentrationen führte zu einer besseren Übereinstimmung der erhaltenen Ergebnisse. D.h. vor allem bei hohen Extraktkonzentrationen sind starke Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte zu erwarten. Dennoch sind auch bei niedrigen Extraktkonzentrationen diese Effekte nicht auszuschließen. In den meisten Veröffentlichungen wurden sehr hohe Testkonzentrationen für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten verwendet, so dass mit hoher Wahrscheinlichkeit aufgrund von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten falsch positive bzw. negative Ergebnisse erhalten wurden. Untersuchungen zum Quenching haben gezeigt, dass die meisten Extrakte in den üblicherweise verwendeten Konzentrationen (ca. 10-1000 µg/ml) die Fluoreszenzintensität der Metabolite sehr stark reduzierten. Die Quenching-Effekte der Pflanzenextrakte beeinflussten das Fluoreszenzsignal aller enzymatisch gebildeten Metabolite (Cumarin-Derivate, Resorufin, Fluorescein), wobei die Quenching-Effekte bei Resorufin und Fluorescein in ihrer Stärke und Häufigkeit geringer ausfielen. Bei CYP2B6, CYP2C9 und CYP2D6 wurden in Verbindung mit Fluoreszenzsubstraten, die eine Cumarinstruktur aufweisen, sehr oft falsch negative oder gar keine Ergebnisse erhalten, weil die Eigenfluoreszenz der Extrakte die Metabolitenfluoreszenz überlagerte. Quenching-Effekte traten bei den untersuchten Pflanzenextrakten weitaus häufiger auf als eine Eigenfluoreszenz. Aufgrund dieser Tatsachen können die Mikrotiterplatten-basierten Fluoreszenz-Methoden nur eingesetzt werden, wenn vorher gezeigt wurde, dass die Pflanzenextrakte bei allen Testkonzentrationen sowie bei verschiedenen Metabolitenkonzentrationen weder Quenching- noch Eigenfluoreszenz-Effekte zeigen. Ebenso wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die bisher in Veröffentlichungen durchgeführten Kontrollinkubationen nur bedingt zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten geeignet sind. Das Auftreten und Ausmaß der Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte sind abhängig vom Inhibitor (Pflanzenextrakt), der Inhibitorkonzentration, dem Metaboliten und dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie der Metabolitenkonzentration, die durch die enzymatische Umsetzung des Substrats und der inhibitorischen Aktivität des Inhibitors bestimmt wird. Während der Inhibitor, die zu testenden Inhibitorkonzentrationen, der Metabolit sowie dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge eine feste Größe darstellen, ist die Metabolitenkonzentration je nach inhibitorischer Aktivität des Inhibitors sehr unterschiedlich. D. h. letztendlich hängt das genaue Ausmaß der Eigenfluoreszenz- und Quenching-Effekte von der inhibitorischen Aktivität der Pflanzenextrakte ab. Es konnte gezeigt werden, dass je geringer die Metabolitenkonzentration ist, desto stärker wird das Fluoreszenzsignal reduziert (Quenching) bzw. erhöht (Eigenfluoreszenz). Eine sinnvolle Kontrollinkubation zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten kann also gar nicht durchgeführt werden. Bei In-vitro-Untersuchungen zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität ist die Metabolitenkonzentration nicht bekannt und somit der Einfluss der Effekte nicht bestimmbar.
Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie
(2009)
Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates.
Hintergrund und Ziel der Untersuchung: Patienten mit schizophrenen Erkrankungen zeigen in einer Vielzahl von Untersuchungssituationen eine verminderte Funktion frontaler Hirnregionen (Hypofrontalität), die insbesondere auch den anterioren cingulären Cortex (ACC) betrifft. Verschiedene Arten antipsychotischer Medikation unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Metabolismus und Funktion des Frontalcortex, wobei es Hinweise darauf gibt, dass atypische Antipsychotika diesen Bereich des Gehirns positiv beeinflussen, während konventionelle Antipsychotika (Typika) hier nur geringe oder sogar negative Effekte zeigen. Hinsichtlich der Auswahl eines Antipsychotikums zu Beginn einer medikamentösen Behandlung gibt es bislang keine etablierten neurophysiologischen/biologischen Marker, die eine Vorhersage der Therapie-Response unter verschiedenen Arten antipsychotischer Medikation erlauben. Ziel der Studie war es daher, die Eignung der NoGo-Anteriorisierung (NGA) als Prädiktor der Therapie-Response schizophrener Patienten unter typischer bzw. atypischer Medikation zu untersuchen. Die NGA ist ein neurophysiologischer Marker, der die Funktion präfrontaler Areale einschließlich des ACC widerspiegeln soll. Unter Zuhilfenahme dieses Parameters wurde an einer Gruppe schizophrener Patienten überprüft, ob das Ausmaß der initialen Hypofrontalität eine Vorhersage der individuellen Therapie-Response erlaubt. Methoden: Es wurden 76 Patienten mit Erkrankungen aus dem schizophrenen Formenkreis zu jeweils drei Messzeitpunkten neurophysiologisch, neuropsychologisch und psychometrisch getestet. Die Baseline-Messung (t1) fand innerhalb der ersten drei Tage eines stationär-psychiatrischen Aufenthalts, die beiden Folgemessungen (t2, t3) drei bzw. sechs Wochen nach Beginn einer Therapie mit typischen (n=36) oder atypischen Antipsychotika (n=40) statt. Im Rahmen der neurophysiologischen Untersuchung führten die Patienten eine Go-NoGo-Aufgabe durch, wobei anhand der durch Go- und NoGo-Stimuli evozierten ereigniskorrelierten Potentiale individuell die NGA ermittelt wurde. Beide Behandlungsgruppen wurden aufgrund der NGA-Werte zu t1 in Patienten mit initial starker vs. schwacher Frontalhirnfunktion unterteilt (Mediansplit). Ergebnisse: Alle Patientengruppen zeigten eine signifikante Besserung der psychotischen Symptomatik im Verlauf des 6-wöchigen Untersuchungszeitraums. Außerdem hatten Atypika hypothesengemäß einen signifikant positiven Einfluss auf die Entwicklung der neuropsychologischen Testleistungen, während Typika oftmals mit einer Verschlechterung entsprechender Maße einhergingen. Atypika hatten zudem eine günstigere Wirkung auf die subjektiv erlebte Lebensqualität der Patienten. Darüber hinaus war die zu t1 erhobene NGA ein signifikanter Prädiktor der Therapie-Response. Niedrige Werte der NGA zu Beginn der Behandlung sagten dabei ein besonders gutes Ansprechen auf atypische Antipsychotika voraus, während hohe Werte der NGA zu t1 mit einer besonders deutlichen klinischen Besserung unter typischer Medikation einhergingen. Die NGA korrelierte zudem signifikant mit den neuropsychologischen Testleistungen, unterlag selbst aber keinen systematischen Veränderungen unter typischer vs. atypischer Medikation. Schlussfolgerung: Der auf der Basis früherer Untersuchungen vermutete Zusammenhang zwischen der NGA und präfrontalen Hirnfunktionen konnte anhand der vorliegenden Befunde bestätigt werden. Außerdem war aufgrund der zu Beginn einer stationär-psychiatrischen Behandlung gemessenen NGA eine signifikante Vorhersage der Therapie-Response unter typischen und atypischen Antipsychotika möglich. Die NGA könnte somit im klinischen Alltag zu einer individualisierten Entscheidungsfindung bei der Auswahl eines antipsychotischen Präparats, unter Berücksichtigung pathophysiologischer Aspekte der Erkrankung, beitragen.
Inhibition of Nuclear Import of Calcineurin Prevents the Development of Myocardial Hypertrophy
(2007)
The Calcineurin/NFAT signaling cascade is a crucial transducer of cellular function. It has recently been emerged that in addition to the transcription factor NFAT, the phosphatase Calcineurin is also translocated to the nucleus. Our traditional understanding of Calcineurin activation via sustained high Ca2+-levels was also advanced by recent findings from this working group (AG Ritter), which showed that Calcineurin is activated by proteolysis of the C-terminal autoinhibitory domain. This leads to the constitutive activation and nuclear translocation of Calcineurin. Therefore, Calcineurin is not only responsible for dephosphorylating of NFAT in the cytosol thus enabling its nuclear import, its presence in the nucleus is also significant in ensuring the full transcriptional activity of NFAT. Formation of complexes between transcription factors and DNA regulates the transcriptional process. Therefore, the time that transcription factors remain nuclear is a major determinant of transcriptional activity. The movement of proteins over ~40 kDa into and out of the nucleus is governed by the nuclear pore complex (NPC). Transcription factors and enzymes that regulate the activity of these proteins are shuttled across the nuclear envelope by proteins that recognize nuclear localization signals (NLS) and nuclear export signals (NES) within the amino acid sequence of these transcription factors. In this study, the precise mechanisms of Calcineurin nuclear import and export were identified. Additionally to the nuclear localization sequence (NLS) and the nuclear export sequence (NES) within the sequence of Calcineurin, the respective nuclear cargo proteins, responsible for nuclear import, Importinβ1, and for nuclear export, CRM1, were identified. Inhibition of the Calcineurin/importin interaction by a competitive peptide, called Import Blocking Peptide (IBP), which mimicked the Calcineurin NLS, prevented nuclear entry of Calcineurin. A non-inhibitory control peptide showed no effect. Using this approach, it was able to prevent the development of myocardial hypertrophy. In Angiotensin II stimulated cardiomyocytes, both the transcriptional and the translational level was suppressed. Additionally, cell size and expression of Brain natriuretic peptide (as molecular marker for hypertrophy) were significantly reduced compared untreated controls. IBP worked dose-dependent, but did not affect the Calcineurin phosphatase activity. In conclusion, Calcineurin is not only capable of dephosphorylating NFAT, thus enabling its nuclear import, its presence in the nucleus is also important for full NFAT transcriptional activity. Using IBP to prevent the nuclear import of Calcineurin is a completely new approach to prevent the development of myocardial hypertrophy.
Der inhibitorische Einfluss von CD22 auf das B-Zellrezeptorsignal nach Stimulation der B-Zelle
(2003)
CD22 ist ein B-zellspezifisches Transmembranprotein der Immunglobulin (Ig)-Superfamilie. Es übernimmt zwei unterschiedliche Aufgaben. Zum einen hat CD22 eine inhibitorische Wirkung auf das BZR-Signal. Nach BZR-Ligation lagert sich die Tyrosin-Phosphatase SHP-1 an die cytoplasmatische Domäne von CD22 an, wodurch SHP-1 aktiviert wird. Durch die dephosphorylierende Aktivität der Phosphatase moduliert sie das BZR-Signal. Zum anderen ist CD22 ein Adhäsionsmolekül, das in die Gruppe der Siglecs (Sialic acid-binding Ig-like lectin) gehört. Die N-terminale Ig-Domäne von CD22 weist die Bindungseigenschaften eines Lectins auf und bindet spezifisch 2,6-gekoppelte Sialinsäure. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die inhibitorische Wirkung von CD22 auf das BZR-Signal molekular zu definieren. Daher wurde das Substrat der an CD22 rekrutierten und aktivierten Phosphatase SHP-1 in vergleichenden Analysen von CD22-defizienten und Kontroll-B-Zellen nach BZR-Stimulation gesucht. Wir konnten zeigen, dass in CD22-defizienten B-Zellen nach BZR-Stimulation das Adaptermolekül SLP-65, auch BLNK oder BASH genannt, früher und stärker Tyrosin-phosphoryliert vorliegt, als in Kontroll-B-Zellen. Transfektionsexperimente mit der CD22-defizienten Plasmazytom-Zelllinie J558Lm3 wurden begonnen, um den molekularen Zusammenhang zwischen CD22, SHP-1 und SLP-65/BLNK zu bestätigen. Das in J558Lm3 Zellen ektopisch exprimierte CD22 wurde Tyrosin-phosphoryliert, und SHP-1 konnte mit CD22 co-präzipitiert werden. Jedoch war in den CD22-Transfektanten keine Reduktion der Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK nach BZR-Stimulation im Vergleich zu untransfizierten Zellen nachweisbar. Da in unabhängigen Experimenten die Liganden-Bindung von CD22 als Voraussetzung für die inhibitorische Wirkung von CD22 deutlich wurde, etablierten wir 2,6 Sialinsäure- und CD22-positive J558Lm3 Doppeltransfektanten. Auf diesen konnte die cis-Maskierung von CD22 nachgewiesen werden. In Stimulationsexperimenten der Doppeltransfektanten wurde die reduzierte Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK in Abhängigkeit von CD22 in der Mehrzahl der Klone bestätigt. Allerdings mussten die Resultate in Frage gestellt werden, als in den meisten Klonen einer Kontrolltransfektion ebenfalls eine Reduktion der Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK festgestellt wurde. Um den Einfluss von CD22 und SLP-65 auf das BZR-Signal zu klären, wurden CD22- und SLP-65-defiziente Mäuse gekreuzt. Durch die zusätzliche Deletion von CD22 in SLP-65-/- Mäusen konnte das Ca2+-Signal nach BZR-Stimulation wieder hergestellt werden. Jedoch zeigte die weitere Analyse der doppel-defizienten Mäuse, dass in der Regel der Phänotyp der SLP-65-defizienten Mäuse dominiert. Diese Ergebnisse verdeutlichten, dass das Adaptermolekül SLP-65/BLNK zwar ein Substrat des CD22/SHP-1 Signalweges ist, aber keine essentielle Rolle in der inhibitorischen Wirkung von CD22 übernimmt. Weiterhin wurde der Einfluss der Ligandenbindung von CD22 auf dessen intrazelluläre, inhibitorische Wirkung auf das BZR-Signal untersucht. Ein synthetisches Sialoside stand zur Verfügung, das hochspezifisch die Interaktion von CD22 mit dessen Liganden stört. Wurden die Zellen einer humanen B-Zelllinie in Gegenwart des Sialosids über den BZR stimuliert, konnte ein erhöhtes Ca2+-Signal gemessen werden. Dieses Resultat erinnerte an die stärkere Ca2+-Mobilisierung in CD22-defizienten B-Zellen. Entsprechend war die Tyrosin-Phosphorylierung von CD22 nach Vorbehandlung mit dem Sialosid in den humanen B-Zellen verringert, und weniger SHP-1 konnte mit CD22 co-präzipitiert werden. Mit diesen Ergebnissen wurde deutlich, dass die Adhäsionsdomäne von CD22 einen direkten, positiven Einfluss auf die intrazelluläre, inhibitorische Domäne von CD22 hat. Als Nebenprojekt wurde die Rolle von CD22 in knock-out Mäusen des transkriptionellen Co-Aktivators BOB.1/OBF.1 untersucht. Ein Entwicklungsblock im transitionalen B-Zellstadium im Knochenmark der BOB.1/OBF.1-defizienten Mäuse verursacht eine deutliche Reduktion reifer B-Zellen in der Milz. Die Analyse des Knochenmarks der BOB.1/OBF.1-defizienten Mäuse zeigte, dass ausschließlich die Expression von CD22 auf den B-Vorläufer Zellen erhöht war. Nach zusätzlicher Deletion von CD22 in BOB.1/OBF.1-/- Mäusen war nach BZR-Stimulation ein deutliches Ca2+-Signal in den doppel-defizienten B-Zellen messbar. Dieses könnte die normalisierte Anzahl transitionaler B-Zellen im Knochenmark und die gestiegene Anzahl reifer B-Zellen in der Milz der doppel-defizienten Mäuse bewirken. Allerdings waren die doppel-defizienten Mäuse, entsprechend den BOB.1/OBF.1-/- Mäusen, nicht in der Lage, eine humorale Immunantwort einzuleiten oder Keimzentren zu bilden. Die Proliferation von CD22-defizienten B-Zellen nach LPS-Stimulation verlief unabhängig von der An- oder Abwesenheit von BOB.1/OBF.1. Mit den Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Differenzierungsschwierigkeiten der BOB.1/OBF.1-defizienten B-Zellen vom BZR-Signal abhängen. Allerdings muss das Ausbleiben der Keimzentrenbildung auf einen anderen Mechanismus zurückgeführt werden.
The identification of NRAGE
(2001)
The inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) have been shown to interact with a growing number of intracellular proteins and signalling pathways in order to fulfil their anti-apoptotic role. In order to investigate in detail how the avian homologue ITA interfered with both TNF induced apoptosis and the NGF mediated differentiation in PC12 cells, a two hybrid screen was performed with a PC12 library using ITA as a bait. The screen resulted in the identification of several overlapping fragments of a previously unknown gene. The complete cDNA for this gene was isolated, the analysis of which revealed a high homology with a large family of tumour antigens known as MAGE (melanoma associated antigens). This newly identified member of the MAGE family, which was later named NRAGE, exhibited some unique characteristics that suggested for the first time a role in normal cellular physiology for this protein family. MAGE proteins are usually restricted in their expression to malignant or tumour cells, however NRAGE was also expressed in terminally differentiated adult tissue. NRAGE also interacted with the human XIAP in direct two-hybrid tests. The interactions observed in yeast cells were confirmed in mammalian cell culture, employing both coimmunoprecipitation and mammalian two-hybrid methods. Moreover, the results of the coimmunoprecipitation experiments indicated that this interaction requires the RING domain. The widely studied 32D cell system was chosen to investigate the effect of NRAGE on apoptosis. NRAGE was stably transduced in 32D cells, and found to augment cell death induced by the withdrawal of Interleukin-3. One reason for this reduced cell viability in NRAGE expressing cells could be the binding of endogenous XIAP, which occurred inducibly after growth factor withdrawal. Interestingly, NRAGE was able to overcome the protection afforded to 32D cells by the exogenous expression of human Bcl-2. Thus NRAGE was identified during this research doctorate as a novel pro-apoptotic, IAP-interacting protein, able to accelerate apoptosis in a pathway independent of Bcl-2 cell protection.
Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden.