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In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden Sphäroide aus mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe oder dem Knochenmark mittels der Micromold-Methode hergestellt. Den Sphäroiden wurden entweder Calciumphosphat- oder Calcium-Magnesium-Phosphat-Partikel hinzugefügt. Zum einen sollte überprüft werden, ob die Zugabe von Partikeln die osteogene Differenzierung der Sphäroide fördert und somit zur weiteren Entwicklung von körpereigenem Knochenersatzmaterial in der regenerativen Medizin beiträgt. Zum anderen sollte festgestellt werden, ob eine der beiden Biokeramiken hinsichtlich der osteogenen Differenzierung überlegen ist.
Was vor einigen Jahren undenkbar erschien, könnte zukünftig möglich sein: Krankes Gewebe mit Gesundem ersetzen, das in vitro mit modernsten Biofabrikationstechniken hergestellt wird. Dabei werden bisherige Grenzen überschritten: Während lichtbasierte Biodruckverfahren wie die Zwei-Photonen-Polymerisation Auflösungen bis in den Nanometerbereich erzielen, ermöglicht der Volumetrische Biodruck (VB) den Druck zentimetergroßer Konstrukte in wenigen Sekunden. Diese Geschwindigkeiten erweisen sich unter Biodruckverfahren als konkurrenzlos und werden erreicht, da das Bioharz nicht konsekutiv, sondern zugleich vernetzt wird. Einschränkend gilt bislang nur der Mangel an geeigneten Bioharzen für den VB. Daher beschäftigt sich vorliegende Arbeit mit der Charakterisierung und Modifikation eines dafür geeigneten Bioharzes: Gelatine-Methacrylat (GelMA). Dank seiner Zusammensetzung ähnelt das etablierte Hydrogelsystem der Extratrazellularmatrix: Der Gelatine-Anteil ermöglicht Biokompatibilität und Bioaktivität durch zelladhäsive sowie degradierbare Aminosäure-Sequenzen. Zugleich können durch photovernetzbare Methacryloyl-Substituenten Konstrukte mit einer Formstabilität bei 37 °C erzeugt werden.
Zunächst wurde das Bioharz zellbiologisch charakterisiert, indem mit der embryonalen Mausfibroblasten-Zelllinie NIH-3T3 beladene GelMA-Zylinder gegossen, photopolymerisiert und kultiviert wurden. Im Verlauf einer Woche wurde die Zytokompatibilität der Gele anhand der Proliferationsfähigkeit (PicoGreen-Assay), des Metabolismus (CCK-8-Assay) und der Vitalität (Live/Dead-Assay) der Zellen beurteilt. Dabei wurden Polymerkonzentrationen von 6 – 8 % sowie GelMA-Harze zweier verschiedener Molekulargewichte verglichen. Alle hergestellten Gele erwiesen sich als zytokompatibel, 6 % ige Gele ließen im Inneren jedoch zusätzlich eine beginnende Zellspreizung zu und ein niedriges GelMA-Molekulargewicht verstärkte die gemessene Proliferation. Die sich anschließende mechanische und physikalische Charakterisierung belegte, dass höher konzentrierte Gele einen größeren E-Modul aufwiesen und damit steifer waren. Eine Modifikation der Gele mit Fibronektin beeinflusste die Zellverträglichkeit weder positiv noch negativ und die Zugabe von Kollagen war wegen Entmischungseffekten nicht bewertbar. Es liegt die Vermutung nah, dass eine weitere Reduktion der Polymerkonzentration und damit Verringerung der Gelsteifigkeit der Schlüssel für mehr Zellspreizung und -wachstum ist. Da jedoch die Druckbarkeit des Bioharzes die weitere Senkung des GelMA-Gehalts limitiert, sollten zunächst Methoden entwickelt werden, welche die Netzwerkdichte des GelMAs anderweitig herabsetzen.
Das Ziel der experimentellen Studie war die Erprobung der (bereits in vitro erfolgreich getesteten) Ca(OH)2-Beschichtung In vivo unter dem Aspekt, ob und inwieweit die antibakteriellen und somit auch antiinflammatorischen bzw. entzündungsmoderierenden Eigenschaften der Ca(OH)2-Beschichtung eine sinnvolle und effektive Ergänzung zu den bisher erfolgreich eingesetzten Calciumphosphat(CaP)-Beschichtungen mit bewiesenen, guten proosseointegrativen Eigenschaften bei lasttragenden Implantaten sein können.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Ergebnisse der In vitro Untersuchung durch die In vivo Versuche in den Bereichen 0-100 KBE grundsätzlich als gestützt gelten können. Die Zuverlässigkeit der Wirkung durch Ca(OH)2 nimmt jedoch mit steigender KBE-Zahl ab, sodass weitere Testreihen sinnvoll sind.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte herausgefunden werden, inwiefern Calciumorthophosphatzemente (CPC) dafür geeignet sind, um als Prüfkörper zur Qualifizierung von Knochenklebern zu dienen, und worin ihre Limitationen bestehen. Dazu sollte nicht nur ein materieller Vergleich verschiedener hydroxylapatitbildender Zemente mit Knochen erfolgen. Es sollte auch das Adhäsionsverhalten neuartiger Knochenkleber auf den verschiedenen Prüfkörpermaterialien verglichen werden, um mögliche Rückschlüsse für die Eignung als standardisierbares in-vitro Prüfkörpermaterial ziehen zu können.
Gegenstand der Untersuchung war ein α-Tricalciumphosphat (α-TCP)-System und ein Tetracalciumphosphat (TTCP)-System welche im Rahmen einer Zement-Abbindereaktion calciumdefizitären Hydroxylapatit (CDHA) bzw. stöchiometrischen Hydroxylapatit (HA) bilden. Die Materialien wurden dazu verwendet Prüfkörperteile in Form von Zylindern (5 x 5 mm) und Plättchen (20 x 10 x 5 mm) herzustellen, die dann mit verschiedenen Knochenklebern verklebt werden konnten. Der stärkste der verwendeten Kleber war ein Cyanoacrylat-Kleber (Truglue®). Er erzielte auf Prüfkörpern aus Knochen nach 24-stündiger Lagerung in PBS mittlere Abscherfestigkeiten von ca. 4,22 ± 1,92 MPa. Als zweitstärkster Kleber erwies sich ein neuartiger zementbasierter Kleber, der aus wärmebehandeltem Trimagnesiumphosphat-Hydrat und Phosphoserin bestand. Dieser Kleber erzielte unter den gleichen Umständen mittlere Abscherfestigkeiten von ca. 1,89 ± 0,29 MPa. Etwas schwächer schnitt ein ebenfalls neuartiger zementbasierter Kleber ab, der aus dem Magnesiumphosphat Farringtonit, sowie aus Magnesiumoxid und 25 % Phytinsäure bestand. Dieser Kleber erzielte mittlere Abscherfestigkeiten von ca. 0,51 ± 0,16 MPa. Insgesamt haben die Untersuchungen gezeigt, dass die in-vitro Qualifizierung von Knochenklebern unter Verwendung von Prüfkörpern aus Zement möglich wäre. Die Prüfkörper aus CDHA vereinten die meisten Vorteile und wären für Klebesysteme mit Abscherfestigkeiten von bis zu 2 MPa geeignet. Dabei erzeugten die Knochenkleber auf CDHA zwar abweichende Abscherfestigkeiten als auf Knochen, doch ließ sich ein vergleichbarer Trend bei stets reduzierten Varianzen erkennen. Durch die gute Konsistenz der Zementpaste war die Herstellung homogener Prüfkörper möglich. Aufgrund der Stabilität von CDHA unter wässrigen Bedingungen konnten Langzeitversuche ohne Einschränkungen vorgenommen werden. Die Limitationen der Prüfkörper aus CDHA bestanden allerdings darin, dass sie nicht für Abscherversuche von stärkeren Klebern geeignet waren. In solchen Fällen versagten die Prüfkörper noch bevor die maximale Abscherfestigkeit des jeweiligen Klebers gemessen werden konnte.
Heutige chirurgische Situationen können zeitweise den Einsatz eines Knochenkleber erfordern, welcher sich jedoch noch nicht in der klinischen Praxis etablieren konnte. In jüngster Vergangenheit haben mit Phosphoserin modifizierte Zemente (PMC) auf der Grundlage von Verbindungen zwischen o-Phosphoserin (OPLS) und Calciumphosphaten wie Tetracalciumphosphat (TTCP) oder α-Tricalciumphosphat (α-TCP) an Popularität gewonnen. Ebenso bekommen chelatbildende Magnesiumphosphatzemente als mineralische Knochenadhäsive mehr Zuspruch. In dieser Arbeit wurden neue mineralorganische Knochenzemente auf der Basis von Phosphoserin und Magnesiumphosphaten oder -oxiden untersucht, die hervorragende Hafteigenschaften besitzen. Diese wurden mittels Röntgenbeugung, Fourier-Infrarot-Spektroskopie und Elektronenmikroskopie analysiert und mechanischen Tests unterzogen, um die Haftfestigkeit am Knochen nach Alterung unter physiologischen Bedingungen zu bestimmen. Die neuartigen biomineralischen Klebstoffe zeigen eine ausgezeichnete Haftfestigkeit an Knochen mit etwa 6,6-7,3 MPa unter Scherbelastung. Die Adhäsive sind auch aufgrund ihres kohäsiven Versagensmusters und ihres duktilen Charakters vielversprechend. In diesem Zusammenhang sind die neuen adhäsiven Zemente den derzeit vorherrschenden Knochenadhäsiven überlegen. Ergänzend wurde versucht, dieses neue System mit unterschiedlichen Additiven zu modifizieren. Dabei wurde Mannit erfolgreich als Porogen verwendet. Dreiarmiges sternförmiges NCO-sP(EO-stat-PO) sollte die adhäsiven Eigenschaften und das Leistungspotenzial unter Wasser verbessern. Zuletzt wurden mit Glycerol präfabrizierte Pasten hergestellt, welche gelagert werden können und bei Kontakt mit Wasser aushärten. Generell ist zu betonen, dass künftige Bemühungen um Knochenklebstoffe aus Phosphoserin und Mg2+ sehr lohnenswert erscheinen.
Zelluläre Resorption 3D-gedruckter Knochenimplantate auf Basis von Calciummagnesiumphosphaten
(2023)
Für die Behandlung von Knochendefekten kritischer Größe gibt es heute eine Reihe von Therapiemöglichkeiten. Neuartige Ansätze mit Magnesiumphosphat- (MPC) und Calciummagnesiumphosphatzementen (CMPC) haben sich als echte Alternativen zu den etablierten Calciumphosphaten erwiesen.
Ziel war es, die Osteoklastogenese in vitro auf 3D-pulvergedrucktem CMPC und MPC zu induzieren und die zelluläre Resorption (zR) zu analysieren. Polystyrol (PS), Glas, β-TCP und Brushit-bildender Zement dienten als Referenzen.
Als Proben wurden Zemente der allgemeinen stöchiometrischen Summenformel CaxMg(3–x)(PO4)2 (x = 0; 0,25; 0,75; 3) verwendet, die Struvit oder Newberyit enthielten. Für die Osteoklastogenese wurden monozytenangereicherte PBMCs aus Buffy-Coat mittels dreifacher Dichtegradientenzentrifugation isoliert, auf die Prüfoberflächen ausgesät und über einen Zeitraum von 22 Tagen mit Zytokinen (M-CSF und RANKL) stimuliert. Die Interaktion der Zellen mit den Zementen bzw. PS/Glas wurde mittels TRAP-Färbung und -Aktivität, DNA- und Ionenkonzentrationen (Ca2+, Mg2+, PO43–, pH-Wert), Rasterelektronen-, Durchlicht-, Auflicht- und Fluoreszenzmikroskopie analysiert.
Auf den Struvit- und Newberyit-bildenden Zementen konnten keine für Osteoklasten typischen Riesenzellen nachgewiesen werden. Auf den Struvit-bildenden Zementen wurde deutlich mehr mononukleäre Zellen nachgewiesen wurden als auf den Newberyit-bildenden Zementen. Während die Freisetzung von Mg2+ und PO43– ausschließlich durch die chemische Degradation erfolgte, wurde Ca2+ zunächst adsorbiert und anschließend durch zR freigesetzt. Die erhöhte Ca2+-Adsorption im Vergleich zur Ca2+-Resorption führte insgesamt zu einer Calcium-Präzipitation.
Da lediglich auf β-TCP Resorptionslakunen beobachtet wurden, wird angenommen, dass auf den CMPC, MPC und Brushite-bildenden Zementen die zellvermittelte Ca2+-Freisetzung von den Präzipitaten ausging, die von Makrophagen auf den Zementen und/oder Riesenzellen auf den Wellplatten resorbiert wurden.
In kürzlich erschienenen Studien hat sich die Zementformulierung Baghdadit (Ca3ZrSi2O9) durch Eigenschaften wie eine hydraulische Aktivität, Röntgenopazität und bioaktive Wirkung als potenzielles Material für die endodontische Anwendung qualifiziert. Ziel dieser Studie war es, Baghdadit als einphasigen Biozement und in Form verschiedener Materialzusammensetzungen auf vorteilhafte Eigenschaften im Hinblick auf die Anwendung als endodontischen Funktionswerkstoff zu untersuchen. Nach eigenständiger Herstellung des mechanisch aktivierten Zementpulvers Ca3ZrSi2O9, erfolgte die Charakterisierung der verschiedenen Zementformulierungen maBag, Bag100Bru und Bag50Bru hinsichtlich der Injizierbarkeit, des pH-Verlaufs während der Abbindung, der Druckfestigkeit und Phasenzusammensetzung mittels XRD. Daneben wurde Baghdadit zu je drei verschiedenen Gewichtsanteilen als Füllstoff in eine Methacrylat-basierte Matrix integriert und hinsichtlich der Fließfähigkeit entsprechend der Norm DIN EN ISO 6876:2012, des qualitativen Polymerisationsgrads und der Druckfestigkeit geprüft. Mit einer Auswahl der oben genannten Materialien erfolgte die Untersuchung der antibakteriellen Wirksamkeit, der Röntgensichtbarkeit orientierend an der Norm DIN EN ISO 13116:2014 und der Dichtigkeit im Wurzelkanal.
Der steigende Bedarf an Knochenersatzmaterialien (KEM) in Medizin und Zahnmedizin verdeutlicht die Notwendigkeit der Etablierung weiterer alloplastischer, also synthetisch hergestellter, KEMs. Additive Fertigung ermöglicht die Herstellung patientenspezifischer Implantate. Hierfür wird auf Basis von 3D Bildgebung eines Knochendefekts, ein Implantat mittels CAD geplant und anschließend mittels additiver Fertigung, zum Beispiel durch 3D Pulverdruck hergestellt.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des osteogenen Potentials in vitro von Calciummagnesiumphosphatkeramiken mit der allgemeinen Strukturformel CaxMg(3-x)(PO4)2 mit x = 0; 0,25; 0,75; 1,5; 3 aus additiver Fertigung. Hierfür wurden Prüfkörper mittels 3D Pulverdruck gedruckt, anschließend durch Hochtemperatursinterung verfestigt und durch Behandlung mit reaktiven Lösungen nachgehärtet. Abhängig von der reaktiven Lösung wandelte sich die Keramik teilweise in Struvit, Bruschit und Newberyit um. Die biologische Testung in vitro erfolgte mit hFOB 1.19 Zellen und ergab eine gute Biokompatibilität sowie die Ausdifferenzierung osteogener Progenitorzellen für fast alle Keramikphasen, wobei die newberyithaltigen Keramiken tendenziell bessere Ergebnisse erzielten.
Knorpeldefekte gelten in der Medizin als besonders schwierig zu beheben, da das avaskuläre und aneurale hyaline Knorpelgewebe nur über sehr begrenzte Selbstheilungskräfte verfügt. Die Entwicklung neuer klinischer Therapien für eine erfolgreiche Regeneration bis hin zum vollständigen Ersatz von beschädigtem oder erkranktem Knorpel stellt daher das Ziel umfangreicher Forschung dar. Darüber hinaus zeichnet sich Knorpel durch eine organisierte, zonale Zell-Matrix-Verteilung und -Dichte aus, die möglichst naturgetreu nachgebildet werden muss, um einen adäquaten Gelenkknorpelersatz zu schaffen. Das dreidimensionale Bioprinting von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) in Hydrogelen ist hierbei ein vielversprechender Ansatz. Es sind jedoch umfangreiche Studien erforderlich, um herauszufinden, wie 3D-Stammzellkonstrukte mit unterschiedlichen Zelldichten und Zell-Zell-Wechselwirkungen in einer gedruckten Hydrogel Matrix interagieren. Deshalb wurde in dieser Arbeit untersucht, ob die mesenchymalen Stromazellen in Form von Einzelzellen oder Sphäroiden durch das Extrusionsdruckverfahren in ihrer Proliferationsfähigkeit und ihrem chondrogenen Differenzierungspotential beeinträchtigt werden.
Hierfür wurden in dieser Arbeit sowohl das Zellüberleben als auch Proliferations- und Differenzierungsmarker in gedruckten und nicht gedruckten Proben mit Einzelzellkonzentrationen von 2-20 Millionen Zellen sowie bei Sphäroiden mit ca 4000 Zellen/Sphäroid untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das extrusionsbasierte Druckverfahren keine negativen Auswirkungen auf die Überlebensfähigkeit und die Proliferation der hMSCs hat. Zum Nachweis der chondrogenen Differenzierung wurden mehrere Experimente durchgeführt. Durch die Expression von Typ-II-Kollagen und Aggrecan sowie durch die Quantifizierung von GAG welches zu einem großen Teil in der ECM von Knorpelgewebe zu finden ist, konnte bestätigt werden, dass die mesenchymalen Stromazellen durch den Druckprozess ihr chondrogenes Differenzierungspotential nicht einbüßen. Die beim 3D-Bioprinting auftretenden Scherkräfte scheinen die in-vitro Chondrogenese sogar ohne chemische Stimulation durch TGF-β1 anzustoßen. Außerdem zeigten die Sphäroidgruppen ein höheres chondrogenes Differenzierungspotential als die Einzelzellgruppen.
Um dies im Zusammenhang mit dem 3D Extrusionsdruckverfahren zu bestätigen, erscheint es sinnvoll, weitere Versuche mit noch höheren Zellkonzentrationen in Form von Sphäroiden durchzuführen. Zusammenfassend zeigte sich in dieser Arbeit, dass das extrusionsbasierte Druckverfahren in Alginat/Gelatine Hydrogelen keine Zellschädigung verursacht und weder die chondrogene Differenzierung von Einzelzellen noch von Sphäroiden beeinträchtigt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Gefrierstrukturierung von Biopolymer-Keramik-Kompositen zur Nachahmung von osteochondralem Gewebe zu untersuchen. Dies diente der Forschung an alternativen Therapiemethoden zur Regeneration von osteochondralen Defekten, da durch derzeitige Therapien oftmals nur ein minderwertiger Reparaturknorpel gebildet wird und keine langfristigen Erfolge erzielt werden. Die Herstellung der Proben zur Nachahmung von osteochondralem Gewebe erfolgte mit der Technik der Gefrierstrukturierung, wodurch anisotrope und hoch geordnete Systeme erhalten wurden. Im Rahmen einer systematischen Untersuchung wurden mehrere Parameter, wie beispielsweise der externe Temperaturgradient, variiert und deren Auswirkungen auf die Proben untersucht. Im ersten Versuchsteil wurde die bidirektionale Gefrierstrukturierung untersucht, um die Morphologie der hergestellten Proben zu optimieren. Anschließend wurden zweischichtige Alginat- bzw. Kollagen-Bruschit-Systeme zur Nachahmung von osteochondralem Gewebe hergestellt. Die erste Schicht sollte Knochen imitieren, während die zweite Schicht Knorpel nachahmte. Die Morphologie der hergestellten Proben wurde unter dem Stereo- und Rasterelektronenmikroskop untersucht. Zur Untersuchung des mechanischen Verbundes zwischen den Schichten wurden Zugversuche durchgeführt. Alle hergestellten Systeme waren hoch geordnet und anisotrop. Die zweischichtigen Systeme wiesen einen Verbund beider Schichten auf und durch die Variation verschiedenster Parameter konnte ein näheres Verständnis des Einflusses dieser auf die Probenmorphologie erlangt werden.
Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung von aus Patientenisolaten gewonnenen S. aureus Kulturen und deren Biofilmbildung auf implantatähnlichen Titan-Oberflächen. Ziel war es, den zeitlichen Ablauf bakterieller periprothetischer Infektionen über einen Zeitraum von 21 Tagen zu beschreiben und besser zu verstehen. Dazu sollte überprüft werden, ob ein fluoreszenzspektrometrisch ausgewertetes LIVE/DEAD Assay eine zusätzliche Aussage zum Status der im Biofilm befindlichen Zellen liefern kann. Zudem wurde die Biofilmentwicklung anhand etablierter fluoreszenzspektrometrischer Methoden (Concanavalin-A-Markierung extrazellulärer Polymerer Substanzen, DNA-Markierung mit Hoechst 33342) untersucht. Es konnte ein reproduzierbarer Verlauf der Entwicklung des Biofilms, sowie der DNA-Menge aufgezeigt werden. Das LIVE/DEAD Assay lieferte keine signifikanten Ergebnisse in Bezug auf das Verhältnis lebender zu toter S. aureus Zellen im Biofilm.
Weiter wurde die Angreifbarkeit des frühen, am Titan adhärenten Biofilms (Alter 1-5 Tage) durch das in der Orthopädie gängig eingesetzte Antibiotikum Gentamicin untersucht. Die Wirksamkeit konnte zu jedem getesteten Zeitpunkt der ersten fünf Tage durch Anzucht von Kolonien bestätigt werden. Auch wurde die Wirksamkeit über das LIVE/DEAD Assay überprüft, jedoch konnten hier keine aussagekräftigen Daten gewonnen werden, die diese Methode zur Überprüfung der Antibiotikawirksamkeit empfehlen könnten.
Hydrogele stehen als Material für den 3D-Biodruck zunehmend im Fokus aktueller Forschung, da sie aufgrund ihrer wasserhaltigen Struktur optimale Voraussetzungen für Anwendungen der Zellkultur aufweisen. Durch die Verarbeitung solcher Biotinten mittels additiver Fertigungstechniken der Biofabrikation erhofft man sich beschädigtes oder krankes Gewebe zu heilen oder zu ersetzen. Allerdings wird der Fortschritt in diesem Bereich durch einen Mangel an geeigneten Materialien gebremst, weshalb die Entwicklung neuer Biotinten von zentraler Bedeutung ist. Das Polymer GelAGE ist ein am Lehrstuhl für Funktionswerkstoffe der Medizin und Zahnheilkunde der Universität Würzburg synthetisiertes Hydrogelsystem. Zu diesem über eine Thiol-En Reaktion vernetzenden Material stehen systematische Untersuchungen der für die in vitro Zellkultur relevanten Eigenschaften noch aus. Das Ziel dieser Arbeit war daher die biologische Evaluation von GelAGE und der Vergleich mit der Biotinte Alginat-Gelatine.
Zu diesem Zweck wurden L929-Zellen für 7 Tage in verschiedenen Hydrogelzusammensetzungen in vitro kultiviert. Um die zytokompatiblen Eigenschaften in den verschiedenen Versuchsgruppen zu untersuchen, wurden die Proben mittels der in vitro Testverfahren Live/Dead Färbung, DNA-Assay, CCK-8-Assay und Phalloidin-Färbung analysiert.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein Herstellungsprotokoll für das Material GelAGE etabliert werden, welches eine Grundlage für die Durchführung weiterer biologischer Experimente bietet. Das Resultat der biologischen Untersuchungen war, dass das Polymer GelAGE als zytokompatibel bewertet werden kann, es jedoch nicht die Qualität des Alginat-Gelatine Hydrogelsystems aufweist. Allerdings konnten die Eigenschaften der GelAGE Proben teilweise durch eine Modifikation mit Humanem Plättchenlysat verbessert werden. Des Weiteren konnten deutliche Unterschiede in der Zell-Material- Interaktion zwischen den verschiedenen GelAGE Varianten nachgewiesen werden.
Synthetische anorganische Knochenersatzmaterialien auf Calcium-Phosphat- und Magnesium-Phosphat-Basis wurden in der hier vorliegenden Dissertation mit verschiedenen handelsüblichen Antibiotika versetzt und deren Freisetzungsverhalten charakterisiert. Zudem wurde der Einfluss des Antibiotikazusatzes auf bestimmte materialcharakteristische Eigenschaften untersucht, hierbei fanden die Quecksilberporosimetrie, die Röntgendiffraktometrie und die Rasterelektronenmikroskopie ihre Anwendung. Insbesondere für die Knochenersatzmaterialien auf Calcium-Phosphat-Basis sollte eine klinisch praktikable und demnach möglichst einfache Methode etabliert werden, um die Kombination mit einem Antibiotikum durchzuführen. Die Detektion der Antibiotika erfolgte mit Hilfe eines UV/VIS-Spektrophotometers. Zudem wurde für einige ausgewählte Kombinationen aus Antibiotikum und Knochenersatzmaterial durch einen Agardiffusionstest die antibakterielle Wirkung nach der Freisetzung aus dem jeweiligen Trägermaterial bestätigt.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung vorgemischter Calciumphosphatzementpasten sowie die Übertragung des Konzepts dieser Pasten auf den 3D-Druck. Es wurden drei verschiedene Zementformulierungen untersucht, basierend auf Pulvermischungen aus α-TCP/DCPA/CaCO3 (Biozement D), TTCP/DCPA und β-TCP/MCPA, die auf verschiedene Materialeigenschaften geprüft und einem 3D-Druckversuch unterzogen wurden. Die Biozement D Paste wurde mit drei Pulver-Flüssigkeits-Verhältnissen (PLR) (80/20, 85/15, 87/13), die TTCP/DCPA Paste mit zwei PLR (83/17, 85/15), und die β-TCP/MCPA Paste ebenfalls mit zwei PLR (67/33, 70/30) getestet. Alle Pasten konnten mit dem 3D-Drucker erfolgreich verdruckt werden. Die Biozement D Paste mit dem PLR 85/15 stellte sich in ihrer Gruppe als die geeignetste Paste heraus. Bessere Ergebnisse bezüglich der Injizierbarkeit und Druckbarkeit erreichte die TTCP/DCPA Paste. Hier wurden mit beiden PLR formstabile Scaffolds erzielt. Feine Wabenmuster konnten mit dem PLR von 83/17 in Kombination mit einer hohen Druckgeschwindigkeit hergestellt werden. Mit dem höheren PLR (85/15) und einer niedrigeren Druckgeschwindigkeit stieg die Formstabilität weiter an, wodurch die hexagonale Struktur exakter gedruckt werden konnte. Ein gutes Druckergebnis konnte auch mit der β-TCP/MCPA Paste und dem PLR 70/30 erreicht werden.
Es erfolgte eine elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren. Dabei wurden die Kristallisationsinhibitoren Zitronensäure, treta-Natriumdiphosphat-Decahydrat und Phytinsäure verwendet und die entstandenen Schichten mit denen ohne Inhibitorzugabe verglichen. Um das Ausmaß der Inhibierung zu verifizieren, wurde die Masse aller Schichten gemessen, welche für die Inhibition mit Zitronensäure und Phytinsäure abnahm und für Natriumdiphosphat zunahm. Die kristallographische Zusammensetzung der mit und ohne Inhibierung abgeschiedenen Schichten wurde mit Hilfe der Röntgendiffraktometrie bestimmt und zeigte, dass sich reine Bruschitschichten mit unterschiedlichem amorphem Anteil abschieden. Die daraus entstandenen Werte lieferten zugleich die Informationen über die einzelnen Kristallitgrößen innerhalb der Schichten. Über den Einfluss der Inhibitoren auf die Schichtmorphologie gaben rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen weiteren Aufschluss. Die Inhibition verursachte teils mit Rissen durchzogene Schichten, deren Kristallformationen sich von Standardelektrolyt unterschieden. Ausgewählte Proben wurden unter verschiedenen Bedingungen desinfiziert bzw. sterilisiert und nachfolgend erneut gewogen und mittels Röntgendiffraktogrammetrie und Rasterelektronenmikroskopie analysiert. Nach der Desinfektion entstanden reine Bruschitschichten, die an Masse verloren aber trotzdem die typischen Kristallformationen zeigten. Die Sterilisation führte zur Umwandlung von Bruschit in Monetit und Hydroxylapatit. Des Weiteren wurde die biologische Reaktion der Schichten auf humane fötale Osteoblasten-Zelllinien zur Überprüfung der Zellverträglichkeit ermittelt. Die entstandenen Ergebnisse waren nicht verwertbar und enthielt sehr hohe Standardabweichungen.
Tumorzellen, Stromazellen, Extrazellulärmatrix (EZM) und lösliche Faktoren in der Tumormikroumgebung beeinflussen und verstärken sich gegenseitig in der Ausbildung eines malignen Phänotyps. Sowohl die fibrotische EZM als auch eine kleine Subpopulation von pluripotenten Tumorstammzellen sind bekanntermaßen für die Steigerung der Tumoraggressivität verantwortlich. Inwiefern diese beiden unabhängigen Faktoren im Kontext von Brustkrebs miteinander in Beziehung stehen, ist jedoch bis heute unklar.
Um untersuchen zu können, welchen Beitrag Tumorzellen, Stromazellen, EZM und lösliche Faktoren einzeln und im Zusammenspiel zur Malignität eines Tumors leisten, ist die Entwicklung geeigneter in-vitro-Modelle unabdingbar. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, ein 3D-Mikrotumormodell zu generieren, in dem eine Analyse dieser genannten Faktoren stattfinden könnte. An diesem Modell wurden darüber hinaus erste Untersuchungen von im Tumorkontext bekannten EZM-Proteinen durchgeführt. Um die dreidimensionale Anordnung von Tumorzellen und ihrer Gewebeumgebung adäquat wiedergeben zu können, beinhalteten die 3D-Tumorsphäroide sowohl Brustkrebszellen (MDA-MB-231) als auch Stromazellen (hASCs).
Die EZM als wichtiger Bestandteil der (Tumor-) Mikroumgebung sollte übersichtshalber durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung und detaillierter durch immunhistochemische Analyse nach zwei verschiedenen Kulturzeitpunkten charakterisiert werden, um EZM-Veränderungen im zeitlichen Verlauf darzustellen. Im Fokus der Analyse standen die beiden wichtigsten profibrotischen EZM-Proteine Fibronektin und Kollagen I, die maßgeblich an der Pathogenese von Brustkrebs beteiligt sind. Zudem wurde das Vorkommen des Myofibroblastenmarkers α-SMA untersucht.
An den Sphäroiden einer Kontrollgruppe, die lediglich hASCs beinhaltete, sollte vergleichend eine Analyse der genannten EZM-Proteine sowie α-SMA durchgeführt werden. Um schließlich den Einfluss der von Tumorzellen sezernierten löslichen Faktoren in der Tumormikroumgebung herauszustellen, wurden Sphäroide aus hASCs in tumorkonditioniertem Medium gezüchtet und darin ebenfalls Matrixproteine und α-SMA untersucht.
Abschließend erfolgte eine Korrelation der EZM-Analyse mit dem Vorhandensein von Tumorstammzellen in den 3D-Tumorsphäroiden. Dafür wurden die Tumorstammzellen mithilfe eines GFP-basierten Reporters für den Stammzellmarker NANOG (NANOG-GFP-Reporterzelllinie) in mikroskopischen Aufnahmen der 3D-Tumorsphäroide nachgewiesen und im Kontext mit der EZM lokalisiert.
Der 3D-Druck ist ein elementarer Bestandteil der Biofabrikation. Beispielsweise wird mittels Biotinten und einem geeigneten 3D-Druckverfahren Schicht für Schicht eine Geometrie aufgebaut. Durch die Gestaltung von mikrofluidischen Druckköpfen wird eine Möglichkeit geschaffen multiple Materialansätze im Druckkopf zu vermischen und so in einem bestimmten Mischungsverhältnis zu drucken.
Mit dem DLP-SLA-Drucker Vida HD Crown and Bridge (EnvisionTEC) und dem Harz E-Shell 600 (EnvisionTEC) wurden zunächst die Auflösungsgrenzen des Druckers ermittelt sowie Komponenten für die Realisierung eines mikrofluidischen Druckkopfes prozessiert.
Bei den Komponenten handelt es sich zum einen um Geometrien, die beispielsweise als Mischeinheit im Kanal dienen können und des Weiteren um senkrechte Kanäle die Biotinten führen können, sowie um Kanäle, die als Zuläufe für den Hauptkanal des mikrofluidischen Druckkopfs dienen können.
Die Eigenschaften und die technische Realisierbarkeit der gedruckten Objekte wurden eruiert.
Dabei wurden die jeweiligen Geometrien und Kanalöffnungen vermessen, große Aspektverhältnisse der Geometrien untersucht und die Durchgängigkeit der Kanäle geprüft.
Zukünftig können die prozessierten Komponenten für einen mikrofluidischen Druckkopf variabel kombiniert werden und auf dieser Basis weiterführende Experimente stattfinden.
Elektrochemisch gestützte Abscheidung kupfer- und zinkdotierter Magnesiumphosphatschichten auf Titan
(2020)
Zur Entwicklung von Implantaten, welche eine komplikationsärmere Einheilung aufweisen, wurde eine dünne, homogene Beschichtung von Titanprobenkörpern mit Struvit mithilfe elektrochemischer Abscheidung generiert. Hierbei wurden dem Basiselektrolyt in den Versuchsreihen unterschiedliche Konzentrationen an Kupfer-(II)-nitrat-3-hydrat- und/oder Zinknitrat-6-hydratlösung hinzugefügt. Die experimentelle Freisetzung erfolgte in drei unterschiedlichen physiologischen Nährmedien: simulated body fluid (SBF), fetal calf serum (FCS) und Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Es konnte gezeigt werden, dass eine antibakteriell wirkende Menge an Kupfer- und Zinkionen freigesetzt wurde. Zusammenfassend stellt die elektrochemische Abscheidung von mit Kupfer- und Zink-dotierten Struvit auf Titanoberflächen einen vielversprechenden Ansatz in der Implantologie hinsichtlich der Einheilzeit im Knochen sowie der Risikominimierung des Verlustes dar.
Infektionen von Endoprothesen sind auch heute noch, obgleich aufgrund aktueller Hygienestandards seltener, eine schwerwiegende Komplikation. Die Folgen können risikoreiche Revisionsoperationen bis hin zum kompletten Prothesenverlust sein. Um die Gefahr bakterieller Protheseninfektionen zu minimieren, rückten unter anderem Oberflächenbeschichtungen mit antimikrobieller Wirkung in den Fokus der Forscher. Eine Kombination aus dem antimikrobiell wirksamen Metall Silber und dem die Härte verbessernden Stickstoff – als TiAgN – Beschichtung – zeigte bereits gute in vitro Ergebnisse (Moseke et al. 2011).
Auf Grundlage dieser positiven in vitro Studie wurde die TiAgN – Beschichtung in der hier vorliegenden Arbeit in vivo im Tiermodell untersucht. Ziel der Studie war es das Einwachsen TiAgN – beschichteter Titanimplantate im Kaninchenknochen mit unbeschichteten Titanimplantaten zu vergleichen. Hierzu wurden bei insgesamt drei Kaninchen jeweils zwei TiAgN – beschichtete Proben und eine unbeschichtete Kontrolle in beide Femora implantiert. Der Einheilzeitraum betrug drei Monate.
Nach der Entnahme der Femora wurde zunächst durch Röntgenaufnahmen die genaue Lage der Implantate festgesellt. Nach der Anfertigung von Dünnschliffen nach Donath und der Trichrom – Färbung nach Masson – Goldner wurden für die histologische Auswertung lichtmikroskopische Bilder in 40 – facher Vergrößerung angefertigt. Um den gesamten Umfang der Implantatanschnitte vermessen zu können, wurden die aufgenommen Einzelbilder zu den ursprünglichen Gesamtbildern zusammengesetzt. Die Vermessung der Implantatumfänge erfolgte hinsichtlich der Untersuchungsparameter Knochen – Implantat – Kontakt (KIK), nicht mineralisierter Knochen (Osteoid), Bindegewebe und Spalten – Implantatoberflächenbereiche an denen kein Gewebe angewachsen ist. Für die drei beobachteten Kaninchen ergab sich für die TiAgN – beschichteten Probeimplantate ein KIK von 94,87 %, ein Osteoidanteil am KIK von 45,15 % und ein Spaltanteil von 2,82 % verglichen mit den unbeschichteten Kontrollen von 97,31 % für den KIK, 60,12 % für den Osteoid – sowie 2,69 % für den Spaltanteil. Somit zeigt sich für TiAgN – beschichtete Titanimplantate kein signifikant schlechteres Einwachsen im Vergleich zu unbeschichteten Titanimplantaten.
Ausgehend von der guten antimikrobiellen Wirksamkeit und Zytokompatibilität in vitro (Moseke et al. 2011) sowie der guten Osseointegration in vivo präsentiert sich diese Beschichtung sehr vielversprechend. Dennoch sind weitere Untersuchungen erforderlich, wie beispielsweise die Überprüfung der Haftfestigkeit zwischen Beschichtung und Implantat sowie die antimikrobielle Wirksamkeit in vivo. Ergeben sich für diese Beschichtung weiterhin gute Ergebnisse, kann eine Studie am Menschen in Erwägung gezogen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche zementbasierte Knochenersatzmaterialien hinsichtlich ihres Potentials zur Behandlung knöcherner Defekte in vivo untersucht. Zwei verschiedene Calcium-dotierten Magnesiumphosphat Zementformulierungen (CMPC) wurden mit einem Referenzmaterial aus Calciumphosphat Zement (CPC) verglichen. Dazu wurden auf Basis von CMPC präfabrizierte, injizierbare Pasten bzw. sphärische Granulate hergestellt und anhand von orthotopen, potenziell kraftbelasteten Defekten in Kaninchenfemora getestet. Zentrales Ziel hierbei war es, herauszufinden, wie sich die Materialien in Defektsituationen mit Hartgewebekontakt biologisch verhalten und degradieren bzw. in Knochen umbauen. Nach einer Liegedauer von 6 bzw. 12 Wochen wurden die Knochenneubildung und die Degradation der Materialien mittels Histomorphometrie analysiert.
Alle Materialien waren biokompatibel und führten zur Bildung von neuem Knochen. Der CMPC-Zement zeigte im Vergleich zu CPC einen beschleunigten Abbau, während sich am Referenzmaterial mehr mineralisierter Knochen bildete. Die untersuchten Calcium-dotierten Struvit-bildenden Magnesiumphosphatzemente erwiesen sich als biokompatibel, gut resorbierbar und stellen mit ihrer Fähigkeit zur Knochenbildung ein vielversprechendes Knochenersatzmaterial dar.
In vorliegender Dissertationsarbeit wurde der Einfluss von MEW-gedruckten Scaffolds aus dem synthetischen Polymer PnPrOx, einem Poly(2-oxazolin), mit verschiedenen Oberflächenstrukturen (fibrillär, glatt) auf die Proteinexpression menschlicher Makrophagen untersucht. Dabei wurde überprüft, inwiefern die Beschaffenheit der Oberflächenstruktur des Polymers die Polarisierung von Makrophagen auf Proteinebene beeinflusst.
Entwicklung einer biofunktionalen Beschichtung für mit Silber dotierte Titandioxid-Nanopartikel
(2020)
Ziel dieser Arbeit war es, eine erfolgreiche Beschichtung der verschiedenen TiO2 Nanopartikel mit aufsteigendem Silberanteil herzustellen, um eine ausgeprägte Stabilisierung und Biokompatibilität der Partikel zu erreichen. Anschließend wurde ihre Wirkung gegenüber gesunden Zellen und Tumorzellen anhand von Zellversuchen untersucht.
Zunächst mussten die TiO2 Aggregate nach ihrer Redispergierung in Wasser, Toluol oder Tris Base gespalten werden, damit anschließend eine kontrollierte Beschichtung einzelner Nanopartikel durchgeführt werden konnte. Der Einfluss von Ultraschall in Form einer zweiminütigen Ultraschalltipbehandlung lieferte hierbei die niedrigsten Partikelgrößen in der DLS-Messung.
Die Beschichtungen wurden mit APTES, Dopamin und PEG-SH unter Einfluss von unterschiedlichen Ultraschalltipzeiten, Konzentrationen, Temperaturen, pH-Werten, Salzen sowie verschiedenen Magnetrührtechniken und Waschprozessen entwickelt. Durch die Charakterisierungsmethoden via dynamischer Lichtstreuung, Zetapotentialmessung, Infrarotspektroskopie, REM und STEM wurde jede Beschichtung analysiert und auf diese Weise ihre optimale Herstellungsmethode erarbeitet.
Schlussendlich wurde der Einfluss unbeschichteter sowie mit APTES, PDA und PEG-SH beschichteter TiO2 Nanopartikel mit steigendem Silberanteil anhand gesunder Zellen und Tumorzellen in vitro untersucht. Die Zellen wurden für 24 h mit den Partikeln inkubiert und anschließend mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Generell wurde nur eine geringfügige Auswirkung der Partikel auf die Zellen beobachtet. Die in der Literatur beworbene Aussage, dass silberdotierte TiO2 in der Lage sind, entartete Zellen zu töten, während gesunde Zellen ausgespart werden, konnte nicht bestätigt werden. Dennoch besaßen einige Faktoren einen Einfluss auf die Vitalität und Zellzahl. So spielte der steigende Silberanteil bei den Zellen eine Rolle, die einen Effekt auf die TiO2 Nanopartikel zeigten. Mit steigendem Ag-Anteil sanken Zellzahl und Vitalität stärker. Auch eine ansteigende Konzentration der beschichteten Partikel wirkte sich positiv auf das Absinken der Zellzahl aus. Besonders die adhärent wachsende Tumorzelllinie Panc02 zeigte sich sensibel gegenüber den beschichteten und unbeschichteten Partikeln. Die Beschichtung, welche die größte Auswirkung auf die Zellzahl- und Vitalitätsminderung der Zellen hatte, war eindeutig die PDA-Beschichtung.
Erstellung eines genregulatorischen Netzwerkes zur Simulation der Entstehung von Zahnhartsubstanz
(2020)
In dieser Dissertation beschreibt der Autor die Erstellung eines grundlegenden bioinformatischen Modelles der menschlichen Zahnschmelzreifung. Mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank wurde ein genregulatorisches Netzwerk (GRN) erstellt, welches maßgeblich auf den Signaltransduktionswegen Apoptose, Zellzyklus, Hedgehog-Signalweg, MAP-Kinase-Weg, mTOR-Signalweg Notch-Signalweg Signalweg, TGF-β-Signalweg und Wnt-Signalweg basiert. Im Weiteren wurde dieses Netzwerk durch zahlreiche verifizierte Wechselwirkungen erweitert und die zahnspezifischen Gene AMELX, AMELY, AMBN, ENAM und DSPP implementiert. In der anschließenden Simulation des Netzwerks mit dem Simulations-Tool Jimena konnten sechs stabile Zustände identifiziert werden. Diese wurden genauer untersucht und den Erkenntnissen eines GEO-Datensatzes gegenübergestellt. Langfristiges Ziel ist es, durch konsequente Optimierung des bioinformatischen Netzwerks Rückschlüsse auf die Odontogenese des Menschen zu ziehen.
Bei der Implantatversorgung von Patienten mit Osteoporose besteht weiterhin eine hohe Komplikationsrate vor allem durch aseptische Prothesenlockerungen. Eine vielversprechende Möglichkeit diese zu minimieren stellt eine Funktionalisierung der Implantate mit Strontium dar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es dabei die Wirkung lokal verfügbaren Strontiums auf osteoklastäre und osteoblastäre Zellen zu untersuchen.
Mittels elektrochemischer Abscheidung erfolgte die Beschichtung von Titanproben mit strontiumdotiertem Struvit, wobei sieben verschiedene Dotierkonzentrationen zwischen 6 µg und 487 µg Strontium pro Probe hergestellt wurden. Die Untersuchungen an osteoklastären RAW 264.7 Zellen erfolgten mittels Bestimmung von Zellzahl und -aktivität, verschiedener mikroskopischer Methoden sowie auf genetischer Ebene. Osteoblastäre MG63-Zellen wurden orientierend anhand von Zellzahl und Zellaktivität untersucht.
Zellbiologisch konnte ein hemmender Einfluss von Strontium auf Differenzierung sowie Proliferation und Aktivität osteoklastärer Zellen gezeigt werden. Die Dotierkonzentration mit den günstigsten Eigenschaften war unter vorliegenden Versuchsbedingungen 487 µg Strontium pro Probe, da sich hierbei zudem eine erhaltene ostoblastäre Proliferation und Aktivität zeigte.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung und Erprobung von innovativen Anwendungsformen kalthärtender Knochenersatzmaterialien aus Calcium-, und Magnesiumphosphaten, die nach dem Abbindevorgang vorzugsweise aus dem Mineral Struvit (MgNH4PO4·6H2O) bestehen. Diese neuartigen Knochenzemente versprechen im Vergleich zu den herkömmlichen Knochenersatzmaterialien eine deutlich schnellere knöcherne Regeneration und Abbaubarkeit. Damit wird das Ziel verfolgt schneller Implantate setzen zu können und dem Patienten somit eine lange Wartezeit und dementsprechenden Leidensdruck ersparen zu können. Ebenso müssen konventionelle Produkte erst im OP angerührt und hiernach in einem schmalen Zeitfenser verarbeitet werden. Die präfabrizierten Zement-Pasten sind dagegen direkt applikationsbereit und härten erst nach Kontakt mit dem feuchten Milieu aus. In vorangegangenen Projekten wurden sowohl präfabrizierte Pasten als auch Granulate auf Basis Struvit-bildender Calcium-Magnesiumphosphate erfolgreich entwickelt. Vorteil dieser Granulate ist ihre sphärische Form. Im Hinblick auf die klinische Anwendbarkeit sollten in der vorliegenden Studie beide Anwendungsformen vorgreifend auf eine tierexperimentelle Studie hinsichtlich ihrer Materialeigenschaften in vitro getestet werden.
Es wurde die Expression der osteogenen Markerproteine Alkalische Phosphatase, Bone Sialoprotein, Kollagen Typ I und Osteopontin von humanen mesenchymalen Stromazellen nach Kultur auf elektrogesponnenen Scaffolds analysiert. Die Scaffolds wurden mittels der Melt electrospinning writing Methode erstellt und unterschieden sich in ihrer Maschenweite. Anhand weiterer Kontrollversuche auf Monolayern wurde ein möglicher Einfluss der Geometrie auf die Proteinexpression untersucht.
Knochenklebstoffe, welche eine unkonventionelle Möglichkeit im Bereich der chirurgischen Frakturversorgung darstellen, müssen bereits in vitro eine Reihe an klinischen Anforderungen erfüllen. Hinsichtlich entsprechender Prüfverfahren wurde noch keine Normierungsarbeit geleistet, weswegen Ergebnisse verschiedener Arbeiten schwierig vergleichbar sind.
Ziel der Arbeit war es daher Prüfverfahren vorzustellen, welche die Besonderheiten des „Werkstoffes Knochen“ berücksichtigen. In diesem Rahmen werden zwei neuartigen Klebstoffsysteme, ein in situ härtender Knochenzement aus Trimagnesiumphosphat, Magnesiumoxid und organischer Phytinsäure und ein lichthärtender Knochenklebstoff aus Polyethylenglycoldimethacrylat, NCO-sP(EO-stat-PO), Campherchinon und anorganischen Newberyit-Füllern, vorgestellt. Neben diesen sind drei kommerziell erhältliche Klebstoffe Gegenstand der Untersuchung. Dies sind zum einen Histoacryl® und TruGlue® Gewebekleber, zwei Klebstoffe auf Cyanoacrylat-Basis mit unterschiedlich langer Alkyl-Seitenkette, zum anderen Bioglue®, ein Gewebekleber aus Albumin und Glutaraldehyd.
Bei den Klebstoffen wurde die Zug- und Scherfestigkeit unter Einfluss der physiologischen Klebstoffalterung, der Variation der Klebefugenbreite, der Variation von komplementären Fügeteilen, sowie Fügeteiloberflächen inspiziert. Makro- und mikroskopische, sowie elektronenmikroskopischen Untersuchung der Bruchflächen auf mikrostrukturelle Besonderheiten und Versagemechanismus wurden angestellt.
Die neuartigen Klebstoffsysteme unterliegen zwar den konventionellen Cyanoacrylaten hinsichtlich mechanischer Parameter, weisen aber dennoch adäquate Klebefestigkeiten auf bei zugleich zahlreichen Vorteilen gegenüber konventionellen Systemen im Umgang mit Knochen.
Gerade der Magnesiumphosphatzement scheint auf Grund mechanischer Parameter und Vorzügen wie der guten Biokompatibilität und biologischen Abbaubarkeit, Osteoinduktivität, Osteokonduktivität, der einfachen Applizierbarkeit, einem hohen Kosten-Nutzen-Faktor oder dem günstigen Verhalten in wässrigen Milieu vielversprechend.
Ziel dieser Arbeit war die Herstellung fluoreszent markierter Präpolymere sowie deren Optimierung, die kontrollierte und reproduzierbare Synthese von redox-sensitiven und nicht redox-sensitiven NG mit und ohne Fluoreszenzmarkierung in einem durchschnittlichen Partikelgrößenbereich von 150 – 300 nm und mit einer Konzentration > 10*10 Partikel/ml, die Charakterisierung der NG, ihre Untersuchung bezüglich ihrer Stabilität und des Assoziationsverhaltens zu BSA sowie die Erlangung von Erkenntnissen bezüglich des Aufnahmemechanismus der NG in Abhängigkeit vom Transportpeptid Tat.
Abschließend kann zusammenfassend gesagt werden:
1. Das große Potential von PG-basierten NG für biologische bzw. medizinische Einsatzgebiete konnte weiter untermauert werden.
2. Das mit Cy5-Alkin markierte PG PG-SH-Cy5 erscheint aufgrund des relativ hohen erreichten Markierungsgrades bei der Herstellung als aussichtsreichster Kandidat für weitere Untersuchungen. Diese Umsetzung besitzt noch Optimierungspotentiale bezüglich einer Verringerung des Polymerverlusts bei der Aufarbeitung, des erreichbaren Markierungsgrades und der Markierungsausbeute. Möglichkeiten, dies zu erreichen, wurden diskutiert.
3. Klare Aussagen über den Einfluss des esterhaltigen bzw. esterfreien Ausgangspolymers PG-SH auf die Konzentration und die Partikelgröße konnten aufgrund einer nicht ausreichenden Datenlage nicht getroffen werden.
4. Die esterhaltigen PG-SH-Moleküle erscheinen aufgrund ihrer Labilität gegenüber Hydrolyse für die NP-Synthese weniger geeignet (geringere Stabilität).
5. Die Charakterisierung der aus den markierten und unmarkierten Ausgangspolymeren hergestellten NG, welche teilweise zusätzlich mit dem Transportpeptid Tat funktionalisiert wurden, erfolgte mittels NTA und zeigt für die meisten Spezies relativ schmale, gut definierte, monomodale Größenverteilungen mit einem Maximum um 100-200 nm im Bereich von ca. 40 – max. 400 nm mit Partikelkonzentrationen im Bereich von 1010 - 1011 Partikeln/ml.
6. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass der untersuchte, von PG-SH abgeleitete NP-Typ (z. B. NG_3, redox-sensitiv unmarkiert) aufgrund seiner Einheitlichkeit, Partikelgröße und der Reproduzierbarkeit der Herstellung als gut geeignet für den geplanten Einsatz in biologischen Systemen erscheint. Von den weiter derivatisierten NG erscheinen die folgenden aufgrund der oben geschilderten Kriterien als besonders geeignet für den geplanten Einsatz in biologischen Systemen und weiterer Untersuchungen wert: NG680_(TAT)_1-4 (redox-sensitiv, markiert), NGCy5_(TAT)_1 (redox-sensitiv, markiert), NG_MA_2 (nicht redox-sensitiv, unmarkiert), NGCy7_MA_1 (nicht redox-sensitiv, markiert). Aufgrund des relativ hohen erreichbaren Markierungsgrades bei der Markierung der Ausgangspolymere erscheinen die mit Cy5-markierten Verbindungen als besonders vorteilhaft.
7. Die esterfreien, redox-sensitiven NP erwiesen sich bei 14-tägiger Lagerung unter physiologischen Bedingungen als stabil. Ihre Konzentration nahm über 14 Tage um ca. 60 % vom Ausgangswert ab. Gleichzeitig nahm der Teilchendurchmesser während des Beobachtungszeitraums um ca. 25 % zu. Die Abnahme der Teilchenzahl ist - zumindest teilweise - durch eine Vergrößerung des mittleren Teilchendurchmessers und mögliche Adsorptionseffekte an die Gefäßwände des Versuchsaufbaus zu erklären.
8. Die Konzentration der esterfreien, nicht redox-sensitiven NP verringert sich bei 14-tägiger Inkubation unter physiologischen Bedingungen deutlich auf ca. 10 % des Ausgangswerts. Der mittlere Durchmesser der Partikel bleibt innerhalb des Untersuchungszeitraums innerhalb der Fehlergrenzen konstant. Die starke Abnahme der Partikelkonzentration ist wahrscheinlich auf die Hydrolyse des verwendeten esterhaltigen Crosslinkers PEGDA zurückzuführen. Desweiteren sind Adsorptionsphänomene an Oberflächen des Versuchsaufbaus nicht auszuschließen. Insgesamt hervorzuheben ist die wesentlich höhere Stabiliät der redox-sensitiven NP unter den Versuchsbedingungen. Diese Substanzklasse sollte daher weiter verfolgt werden.
9. Es wurde gezeigt, dass sowohl die NG, die das Aufnahmeprotein Tat enthalten, als auch die NG ohne Tat mit Fluoreszenz-markiertem BSA (8,3 µg/ml) wechselwirken und zusammen mit diesem bei der Zentrifugation abgeschieden werden. Über die Art der Wechselwirkung kann keine Aussage getroffen werden.
10. Durch in vitro Zellaufnahmeuntersuchungen an Hela-Zellen konnte gezeigt werden, dass die mit Tat funktionalisierten, redox-sensitiven, Fluoreszenz-markierten NP von den Zellen aufgenommen werden. Die Aufnahme erfolgt über eine deutlich erkennbare Vesikelbildung, die an der Plasmamembran verstärkt beobachtet werden kann. Im Gegensatz hierzu konnte bei den nicht mit Tat funktionalisierten NP keine vergleichbare in vitro Zellaufnahme beobachtet werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen insgesamt das große Potential der von Thiol-funktionalisierten PG abgeleiteten NG für die medizinische Forschung und zukünftige Anwendungen in der Diagnostik und Therapie. Es wird eine Reihe von Ansatzpunkten aufgezeigt, auf deren Basis weitere vertiefende Untersuchungen zur Charakterisierung und Optimierung sowie zu zukünftigen nutzbringenden Anwendungen vorgenommen werden sollten.
Untersuchungen zum Abbindeverhalten und der Injizierbarkeit von Magnesiumphosphat-Knochenzementen
(2018)
Ziel dieser Arbeit war die experimentelle Untersuchung von selbsthärtenden Magnesiumphosphat Zementen als Knochenersatzmaterial bezüglich der Verarbeitungsqualität, der Temperaturentwicklung beim Abbinden, der Injizierbarkeit und der mechanischen Eigenschaften. Der Schwerpunkt wurde dabei auf die Anpassung der rheologischen Eigenschaften der Zementpaste für eine minimal–invasive Applikation gelegt. Durch eine elektrische Aufladung der Partikeloberfläche von Farringtonit nach Adsorption von Citrat–Ionen und Zusatz der biokompatiblen Füllstoffe Struvit oder TiO2 für die Einstellung einer bimodalen Partikelgrößenverteilung, war es möglich, die Viskosität der Pasten zu erniedrigen und den filter–pressing−Effekt während der Injektion zu unterdrücken. Die Modifikation des Mg3(PO4)2 Pulvers und der flüssigen Phase erlaubte bei einer Verarbeitungszeit von ca. 10 min die nahezu quantitative Injektion des Zements durch eine 40 mm lange Kanüle mit einem inneren Durchmesser von ca. 800 μm. Zemente mit dem P/L–Verhältnis von 2,0 g/ml erreichten so eine Festigkeit von über 50 MPa nach 24 h Aushärtung. Obwohl die exotherme Abbindereaktion der Zemente teilweise zu einer Erwärmung auf bis zu 67 °C führte, geben literaturbekannte in vivo Studien keinen Hinweis auf Nebenwirkungen innerhalb des umliegenden Hart- bzw. Weichgewebes, was den Verdacht einer möglichen thermischen Nekrose aufgrund der exothermen Abbindereaktion ausschließt. Dies liegt eventuell auch darin begründet, dass die Temperaturmessungen in dieser Arbeit mit einer verhältnismäßig großen Menge an Zementpaste (∼15 g) durchgeführt wurden, während in vivo doch eher geringere Mengen (< 5 g) appliziert werden.
Bisher getestete Knochenkleber zeigen häufig geringe Klebeeigenschaften auf Knochen bei Zutritt von Feuchtigkeit. Gegenstand dieser Arbeit war es, die Haftfähigkeit im feuchten Milieu zu verbessern. Hierfür wurde der Einfluss sternförmiger, mit Isocyanaten funktionalisierter Poly(ethylenglykol) Moleküle (NCO-sP(EO-stat-PO)) auf die Klebefestigkeit und Alterungsbeständigkeit einer photopolymerisierbaren Poly(ethylenglykol)dimethacrylat-Basis (PEGDMA) untersucht. Die Polymerisation mittels energiereicher Strahlung erlaubt hohe Reaktionsraten bei Körpertemperatur sowie zeitliche und örtliche Kontrolle über die Polymerisationsreaktion. Durch den Zusatz degradierbarer, keramischer Füllstoffe auf Calciumsulfat- und Magnesiumphosphat-Basis in die Matrix sollten durch Lösungsprozesse Poren geschaffen werden. Diese könnten das Einwachsen neuer Knochensubstanz in das ausgehärtete Material ermöglichen. Die Veränderungen der kristallinen Strukturen wurden mittels Röntgendiffraktometrie beobachtet. Zudem wurden die Proben infrarotspektroskopisch und mikroskopisch untersucht. Die Klebefestigkeit auf kortikalem Rinderknochen im Abscherversuch ebenso wie die Biegefestigkeit vor und nach Lagerung in feuchter Umgebung wurde unter Variation des NCO-sP(EO-stat-PO)-Gehaltes ermittelt. Anschließend sollten die mikroskopische Analyse und energiedispersive Röntgenspektrometrie (EDX) Aufschluss über das Bruchverhalten des Materials beim Klebeversuch geben.
Es konnte gezeigt werden, dass durch die Zugabe von 20 bis 40 Gew.-% NCO sP(EO-stat-PO) zur Matrix die Klebefestigkeit auf Knochen von initial etwa 0,15 bis 0,2 MPa auf etwa 0,3 bis 0,5 MPa gesteigert werden kann. Während alle Referenzproben ihre Haftung an Knochen innerhalb von weniger als 24 Stunden verloren, zeigten Proben mit NCO sP(EO-stat-PO) auch nach 7-tägiger Lagerung noch Festigkeiten von 0,18 bis 0,25 MPa. Die höchste Festigkeit nach 7 Tagen war bei Proben mit dem Füllstoff Newberyit und einem NCO-sP(EO-stat-PO)-Anteil von 40 Gew.-% zu verzeichnen. Diese Proben wiesen auch in der mikroskopischen Analyse und im EDX eindeutig ein rein kohäsives Versagen auf. 20%-ige Proben zeigten zumindest in geringem Maße auch adhäsives Versagen.
Die 3-Punkt Biegefestigkeit lag initial bei 3,5 bis 5,5 MPa. Durch die Lagerung in PBS sank die Festigkeit auf ~1 MPa. Die Zugabe von NCO-sP(EO-stat-PO) und die Art des eingesetzten Füllstoffes hatten kaum einen Einfluss auf diese.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war eine systematische Analyse der Ver-arbeitbarkeit, Abbindedauer, pH Wert- und Temperatur-Verläufe während des Abbindens und der Eigenschaften der ausgehärteten Zementpaste, welche je-weils aus Farringtonit (Mg3(PO4)2) unterschiedlicher Reaktivität bestand und mit Diammoniumhydrogenphosphat und Polyacrylsäure zur Reaktion gebracht und konventionellen wässrigen Zementsystemen gegenübergestellt wurde.
Ein besonderer Fokus wurde hierbei auf die Beurteilbarkeit der Eignung dieser Zementsysteme als injizierbare Zementpasten in möglicherweise lasttragenden Bereichen gelegt. Eine Reaktivierung von Farringtonit und anschließendes Ab-binden mit Wasser konnte durch Hochenergiemahlung für 2 h bis 24 h erzielt werden. Mechanisch aktiviertes Farringtonit mit Polyacrylsäure (100.000 g/mol) bzw. kurzzeitig gemahlenes Farringtonit mit höher molekulargewichtiger Polyac-rylsäure führte auf Grund der zum Teil summierten Reaktivität in der sauren Umgebung der Polyacrylsäure zu einer schlechten Verarbeitbarkeit und unzu-reichenden Druckfestigkeiten. Um chelatisiertes Farringtonit mit angemessenen Festigkeiten zu erhalten, zeigte sich die Anwesenheit von Ammoniumionen als vielversprechende Strategie. Als hydratisierte Produkte wurden je nach Formu-lierung Struvit (MgNH4PO4·6H2O), Newberyit (MgHPO4·3H2O) oder Mag-nesiumphosphathydrat (Mg3(PO4)2·22H2O) gewonnen. Besonders die Kombina-tion von kurzzeitig gemahlenem Farringtonit mit 17,5 Gew.%iger Poly-acrylsäure Lösung und 23,1 Gew.%iger Diammoniumhydrogenphos-phat Lösung mit einem Pulver-zu-Flüssigkeitsverhältnis von 1,5 g/ml führte zu Zementpasten, die hinsichtlich ihres Abbindeverhaltens und der mechanischen Eigenschaften denen der Einzelbestandteile überlegen waren.
Die entwickelten Zementsysteme zeigten 60 min nach Beginn des Abbindevor-gangs einen pH-Wert von 4,7 bis 6,4 und Temperaturmaxima von 28,5 °C bis 52 °C je nach Zusammensetzung. Der Mischzement, für welchen maximale Druckfestigkeiten von 15,0±4,1 MPa gemessen wurden, zeigte ein deutlich we-niger sprödes Bruchverhalten im Vergleich zu den reinen Verdünnungen. Da der spröde Charakter klassischer mineralische Knochenzemente einen limitie-renden Faktor für die Anwendung in lasttragenden Bereichen darstellt, kann dies als deutliche Verbesserung der mechanischen Eigenschaften beurteilt wer-den. Immerhin lagen die erzielten Festigkeitswerte in der Größenordnung der humanen Spongiosa. Besonders hervorzuheben ist außerdem der synergisti-sche Effekt, welcher bei Zementformulierungen aus kurzzeitig gemahlenem Farringtonit mit 17,5 Gew.%iger Polyacrylsäure Lösung und 23,1 Gew.%iger Diammoniumhydrogenphosphat Lösung mit einem Pulver-zu-Flüssigkeitsver-hältnis von 1,5 g/ml beobachtet werden konnte. Diese Formulierung wies bis zu vierfach höhere Festigkeitswerte als die Einzelbestandteile auf. Somit bildet das entwickelte Mischzement-System eine gute Basis für weitere Entwicklungen hin zu mechanisch lasttragenden Defekten.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Modifizierung von porösem, calciumdefizitärem, nanokristallinem Hydroxylapatit mit verschiedenen Metallionen zu testen. Es wurden α‑TCP‑basierende Zementproben hergestellt, die durch zwei verschiedene Dotierungsmethoden mit bestimmten Metallionen (Cu2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, V3+, Zn2+) modifiziert wurden. Die eine Methode bestand in der Zusinterung der entsprechenden Metallionen zum α‑TCP‑Pulver. Bei der anderen Methode waren die Ionen in unterschiedlicher Konzentration (1 mmolar, 100 μmolar, 10 μmolar) in der Binderlösung enthalten. Die hergestellten Zementproben wurden hinsichtlich bestimmter Eigenschaften wie der initialen Abbindezeit und Druckfestigkeit untersucht und zusätzlich rasterelektronenmikroskopischen, röntgen-diffraktometrischen und massenspektrometrischen Analysen unterzogen. Als Referenz diente ein bereits am Menschen erfolgreich als Knochenersatzmaterial eingesetzter nanokristalliner, calciumarmer Hydroxylapatit-Zement. Da Hydroxylapatit nahezu nur durch Osteoklasten mittels einer lokalen pH‑Wert-Absenkung resorbiert werden kann, wurden in‑vitro‑Versuche mit einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie durchgeführt. Über einen 15‑tägigen Versuchszeitraum wurde die Zytokompatibilität mittels bestimmter Zellproliferations- und Zellaktivitätsmessungen überprüft. Zusätzlich wurden die mit Zellen besiedelten Proben unter dem Rasterelektronenmikroskop betrachtet und eine TRAP‑Färbung durchgeführt, um die Differenzierung zu osteoklastenähnlichen Zellen beurteilen zu können.
Bei der Auswertung der Versuche wurde deutlich, dass nicht das Metall alleine maßgeblich für Veränderungen der physikalischen Eigenschaften im Vergleich zum metallfreien Referenzzement war. Auch die Art der Metallionendotierung, ob durch Zugabe mit der Binderlösung oder durch Zusinterung, hatte bei den Metallen unterschiedliche Auswirkungen auf die Zementeigenschaften. Während der Versuche wurden Abbindezeiten von 18 Minuten bis über 60 Minuten gemessen und Druckfestigkeiten zwischen 9,3 MPa und 30,5 MPa festgestellt. Bei der Auswertung der Zellversuchsreihe wurde festgestellt, dass die Zellen auf den mit Metallionen modifizierten Zementplättchen tendenziell eine niedrigere Aktivität bei gleich bleibender Proliferation aufwiesen als auf den metallfreien Referenzproben. Dieses Ergebnis konnte mikroskopisch bestätigt werden.
Der Einfluss von Laktobazillen auf Oberfläche und Eigenschaften von verschiedenen Nahtmaterialien
(2015)
Hintergrund: Nach oralchirurgischen Eingriffen empfiehlt der Operateur allgemein die Vermeidung von Milchprodukten in Hinblick auf eine bessere Heilung im Wundgebiet. Dies stützt sich u.a. auf die Annahme, dass Laktobazillen und ihre Stoffwechselprodukte (z.B. Milchsäure) Nahtmaterial angreifen können. Der Aufbau dieser Studie zielte darauf ab, diesen Sachverhalt in Frage zu stellen und Funktionsverluste bei Milchsäureexposition sowie Besieldungsverhalten der Bakterien zu charakterisieren.
Material und Methoden: Polyamid (PA), Polyester/Polyethylenterephtalat (PET), Polypropylen (PP), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Seide, Polyglycolsäure (PGA bzw. PGACL), teilweise mit Polylactid (PLA), Polydioxanon (PDO) und Polytetrafluorethylen (PTFE) kamen zur Anwendung. Die Fäden wurden mit L.acidophilus (LAC) beimpft, inkubiert und anschließen im Tensiometer mit verschiedenen Knotenvarianten getestet. Für die Keimbesiedlung (CFU) wurden die Fäden beimpft, inkubiert und das Keimmaterial anschließend mit Ultraschall- Vortex- Verfahren vom Faden abgelöst und ausgezählt. Dieses Verfahren wurde durch REM- Aufnahmen zusätzlich bewertet.
Ergebnisse: Reißfestigkeiten waren stets im Rahmen der Herstellerangaben bzw. darüber zu verzeichnen. Alle resorbierbaren Fäden hatten höhere Ausgangsreißkräfte als die nichtresorbierbaren Produkte. Die Applikation eines Knotens minderte ausschlaggebend für alle Produkte die maximale Reißfestigkeit eines Materials. Die Knotenhaltbarkeiten konnten sich während der Liegezeit im sauren wässrigen Milieu verändern. Die für klinische Anwendungen besten Ergebnisse verzeichneten PA als nichtresorbierbare, monofiles PDO und polyfiles PGA/PLA + CHX als resorbierbare Vertreter. Eine erhöhte CFU-Zahl auf polyfilen Fäden im Vergleich zu monofilen Fäden wurde bestätigt. Seide (polyfil, nicht resorbierbar) hatte mit Abstand die höchsten CFU, gefolgt von PGACL (polyfil, resorbierbar). PVDF (monofil, nichtresorbierbar) hatte die niedrigsten CFU- Werte. Im Schnitt war die CFU-Zahl von PGA/PLA+CHX (polyfil, resorbierbar) ähnlich hoch wie die von monofilen Produkten.
Diskussion: Die Annahme, dass eine Kontamination mit LAC den Heilungserfolg beeinflussen kann, wurde im Hinblick auf Materialermüdung durch Säureexposition aus Stoffwechselprodukten des Bakteriums entkräftet. Die für klinische Anwendungen besten Ergebnisse verzeichneten PA als nichtresorbierbare, polyfiles PGA/PLA + CHX als resorbierbare Vertreter. Alle getesteten Produkte entsprachen trotz LAC- Einwirkungen den Herstellerangaben und haben somit die materiellen Voraussetzungen einer vorhersagbaren Nahthaltbarkeit erbracht.
Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität mineralischer Knochenzemente aus Calciumorthophosphaten (CPC) wurde in einem TTCP/DCPA-System das Zementedukt TTCP mit verschiedenen biokompatiblen Oxiden (SiO2, TiO2, ZrO2) während des Herstellungsprozesses dotiert. Dies führte zur Bildung von Calciummetallaten und einer Herabsetzung der Löslichkeit der TTCP-Komponente des Zements. Gegenüber einem oxidfreien Zement konnte die Druckfestigkeit von 65 MPa auf 80 MPa (SiO2) bzw. 100 MPa (TiO2) gesteigert werden.
In einem zweiten Ansatz zur Verbesserung der Injizierbarkeit wurden die Wechselwirkungen der Partikeloberflächen mit der flüssigen Zementphase betrachtet. Durch biokompatible Additive sollte eine repulsive elektrostatische Wechselwirkung eingestellt werden, um Partikelagglomerate effektiv zu dispergieren und eine verflüssigende Wirkung zu erreichen. Die Injizierbarkeit eines TTCP/DCPA-Zements durch eine Kanüle mit 800 µm Durchmesser konnte durch die Verwendung von 500 mM tri-Natriumzitrat-Lösung aufgrund einer deutlichen Herabsetzung der Viskosität der Zementpaste signifikant gesteigert werden (>95%, P/L 3,3/1, Kraftaufwand 20 N).
Abschließend wurde der Einfluss der Partikelgrößenverteilung auf die Festigkeit und Injizierbarkeit einer auf monomodaler Partikelgrößenverteilung basierten Zementmatrix untersucht. Hierzu wurden einem mechanisch aktivierten a-TCP-System unreaktive, feinkörnige Füllstoffpopulationen (TiO2, CaHPO4, CaCO3) zugesetzt und systematisch deren Effekt in Verbindung mit einer Partikelaufladung durch tri-Natriumzitrat auf die rheologischen und mechanischen Eigenschaften untersucht.
Erst die Kombination einer bimodalen Partikelgrößenverteilung mit tri-Natriumzitrat-Lösung führte zu einer starken Erniedrigung der Viskosität, damit zur nahezu vollständigen Injizierbarkeit der Zemente und einer teilweise signifikanten Steigerung der mechanischen Festigkeiten (z.B. 72 MPa reiner a-TCP-Zement auf 142 MPa mit Zusatz von CaHPO4).
Magnesiumphosphatschäume nehmen auf Grund ihrer guten Resorbierbarkeit, unter physiologischen Bedingungen, einen immer größeren Stellenwert als Knochenersatzmaterial ein. Ein weiterer Vorteil ist der neutrale pH-Wert den das entstehende Material besitzt. Magnesiumphosphatschäume besitzen eine hochporöse offenporige Struktur um zum einen den Knochen nachzuahmen und zum anderen die Steuerung und Bildung von Knochengewebe zu ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die mechanischen Eigenschaften als auch die Zytokompatibilität der hergestellten Schäume untersucht.
Es wurden unterschiedliche Herstellungsverfahren genutzt um Magnesiumphosphatschäume zu erhalten. Zum einen das Replika- Verfahren, die dabei entstandenen Farringtonit Schäume (Mg3(PO4)2, Farringtonit) wurden zu Struvit ((NH4)Mg(PO4)•6H2O) umgewandelt bzw. mit PLGA infiltriert und auf ihre mechanische Eigenschaften hin untersucht. Zum anderen wurde ein proteinbasierter Schaumbildner verwendet. Die Zytokompatibilitätsprüfung wurde mit der Osteosarkomzelllinie MG-63 durchgeführt. Es erfolgte die Untersuchung der Zellproliferation und der Zellaktivität (WST). Zudem wurden Proben mittels Licht- und Elektronenmikroskopie analysiert. Die Feststellung der Proteinexpression erfolgte nach gelelektrophoretischer Auftrennung mittels Western Blot und PCR Analyse.