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- Broad Institute, USA (1)
- Department Pharmazie - Zentrum für Pharmaforschung, Ludwig-Maximilians-Universität München (1)
- Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie Hans-Knöll-Institut (1)
- Nationales Referenzzentrum für Invasive Pilzinfektionen (NRZMyk) (1)
- Nationales Referenzzentrum für invasive Pilzinfektionen (1)
Die Alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine tödliche Infektionserkrankung, die durch den parasitären Plattwurm Echinococcus multilocularis verursacht wird. Genomanalysen von E. multilocularis ergaben ein Gen, das laut Vorhersage für eine DyP-Typ Peroxidase codiere. Ziel dieser Arbeit ist die biologische Funktion des codierten Enzyms besser zu verstehen und Hinweise auf eine mögliche Rolle in der Abwehr von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu erlangen.
Das Gen wurde heterolog in E. Coli exprimiert und molekulare Charakteristika des Gens mit bioinformatischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Quantitative RT-PCR Untersuchungen gaben Aufschluss über das Transkriptprofil von emipox in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von E. mulitlocularis. Mittels Whole-Mount In Situ-Hybridisierung (WMISH) wurden die Transkripte zudem lokalisiert und ihre Beziehung zum Stammzellsystem von E. multilocularis näher untersucht.
Die Zugehörigkeit von EmIPOX zur Gruppe der DyP-Typ Peroxidasen wurde bestätigt. Homologe beim Menschen kommen nicht vor. Es konnte nachgewiesen werden, dass Transkripte von emipox auch, aber keinesfalls ausschließlich, in Stammzellen vorliegen. Überdurchschnittlich viele Transkripte liegen im aktivierten Protoscolex und im Metacestoden ex vivo aus einer infizierten Wirtsleber vor. Untersuchungen zur Enzymaktivität von EmIPOX zeigten neben einer Peroxidase- auch eine Katalaseaktivität.
Die vorliegende Arbeit ist die erste Charakterisierung einer DyP-Typ Peroxidase bei Tieren. Sie legt nahe, dass EmIPOX eine Rolle in der Entgiftung von ROS in E. multilocularis spielt und stellt den Charakter von EmIPOX als potenzieller pharmakologischer Zielstruktur heraus.
Fusarium (F.)-Infektionen des Auges zeigen oft einen schwerwiegenden Verlauf und sind am häufigsten mit Spezies des Fusarium solani species complex assoziiert. Dabei sind das Tragen von weichen Kontaktlinsen sowie Traumata die wichtigsten prädisponierenden Faktoren. Vorangegangene Untersuchungen des Nationalen Referenzzentrums für invasive Pilzinfektionen hatten ergeben, dass Infektionen durch F. petroliphilum mit der Nutzung von Kontaktlinsen, Infektionen durch F. falciforme jedoch überwiegend traumaassoziiert uns vor allem aus tropischen und subtropischen Ländern bekannt sind.
Das Ziel dieser Arbeit war es daher zu untersuchen, ob F. falcifomre und F. petroliphilum physiologische Merkmale aufweisen, die für die Unterschiede in den Risikofaktoren für Keratitiden durch die beiden Arten verantwortlich sein könnten.
Die Zahl invasiver Pilzinfektionen ausgelöst durch C. glabrata steigt zunehmend und auch die Ausbildung multipler Resistenzen wird immer häufiger registriert. In dieser Arbeit wurden zwei klinische MDR-C. glabrata-Stämme systematisch analysiert, um den Ursprung der Mehrfachresistenz zu finden. Aufgefallen waren jene Isolate in vorhergehenden Untersuchungen von Aldejohann et. al., die 176 Stämme, die dem Referenzzentrum NRZ-Myk zugesandt wurden, auf ihr Resistenzverhalten gegen Echinocandine analysierten und auf FKS-Mutationen untersuchten. Die Isolate CG22 und CG56 zeigten ein Resistenzverhalten gegen Anidulafungin ohne eine FKS-Mutation aufzuweisen. In Mehrfachtestungen wurde das einheitliche Verhalten von CG56 in zehn Einzelkolonien verifiziert, um Mischkulturen oder heterogenes Verhalten innerhalb des Isolates ausschließen zu können. Nach Analyse der gesamten Genomsequenz von CG56 zeigte sich eine Mutation kurz vor der HS-Region von FKS2, die eine Erklärung für das Resistenzverhalten zu liefern scheint. Neben der Mutation in FKS2 wurde ebenfalls eine Mutation in FKS1 und in ERG3 bestätigt. Die Mutation in ERG3 führt zu einer Verschiebung im Sterolsynthesepathway und zu einer Neuverteilung der Zellmembranbestandteile. Das klinische Isolat CG22 fällt mit Resistenzen gegen Azole, Echinocandine und Amphotericin B auf und zeigte ebenfalls eine Mutationen in ERG3. Zusätzlich dazu ergab sich eine Loss-of- Function-Mutation in ERG4 und damit verbunden einen massiv reduzierten Ergosterolgehalt der Zellmembran. Die seltene Kombination aus ERG3 und ERG4 Mutation scheint die Erklärung für die außergewöhnliche Amphotericin B-Resistenz von CG22 zu liefern und wird hier als erstmals bei einem C. glabrata Isolat beschrieben. Dieser besondere Stamm, der sogar als panresistent bezeichnet werden kann, sollte Bestandteil weiterer Forschung werden. Der Sterolsynthesepathway dient als Angriffspunkt vieler Antimykotika und kann durch seine vielen Intermediate und abweichenden Abläufen zu unterschiedlichen Stoffwechselendprodukten führen. Der Ergosterolgehalt der Zellmembran eines C. glabrata-Stammes kann weitere Rückschlüsse auf die Empfindlichkeit des Isolates geben und somit die Chancen des Therapieerfolges der Antimykotikagabe besser vorhersagen und könnte somit einen vielversprechenden Beitrag zur Behandlung lebensbedrohlicher Candidosen leisten.
Die Inzidenz invasiver H. influenzae-Infektionen in Deutschland steigt seit Jahren an. Die akkurate Identifizierung und Resistenztestung dieses Erregers sind von großer klinischer und epidemiologischer Bedeutung. Daher wurden im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit umfangreiche Untersuchungen zur Diagnostik und zur Epidemiologie von Antibiotikaresistenzen bei H. influenzae durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass die in der Routinediagnostik mittlerweile weit verbreitete MALDI-TOF-MS-Diagnostik durch das VITEK MS IVD nur eingeschränkt zur sicheren Unterscheidung von H. influenzae und H. haemolyticus einsetzbar ist. H. influenzae-Isolate erkannte das System mit einer Genauigkeit von 100 %. Bei H. haemolyticus-Isolaten wurden dagegen 42 % der untersuchten Stämme fälschlicherweise als H. influenzae erkannt. Dieser Fragestellung wurde mit der bisher umfangreichsten molekularbiologisch charakterisierten Studienpopulation beider Bakterienspezies nachgegangen.
Die kalkulierte antibiotische Therapie einer Sepsis oder Meningitis erfolgt häufig mit Carbapenemen, die leitliniengerechte Therapie invasiver H. influenzae-Infektionen mit Drittgenerations-Cephalosporinen. Imipenem und Cefotaxim gehören zu den Hauptvertretern dieser Gruppen. Bezüglich der Antibiotikaresistenztestung wurde erstmalig für H. influenzae herausgefunden, dass die routinemäßig verwendete Gradientenagardiffusion (GAD) bei der Testung von Cefotaxim im Vergleich zum Goldstandard Bouillon-Mikrodilution gleichwertig und bei Imipenem sogar sensitiver in der Detektion von Heteroresistenzen ist.
Die Epidemiologie dieser Resistenzen wurde in dieser Arbeit erstmalig für Deutschland systematisch erfasst, indem alle verfügbaren invasiven Isolate gemeldeter H. influenzae-Infektionen der Jahre 2016 (Imipenem) beziehungsweise 2016-2019 (Cefotaxim) untersucht wurden. Es wurde eine hohe Prävalenz einer Imipenem-Resistenz von 13,5 % festgestellt. Die Prävalenz einer Cefotaxim-Resistenz lag bei 0,9 %.
Zur molekularen Typisierung wurde bei den Imipenem-resistenten Isolaten eine Multilocus-Sequenztypisierung, bei den Cefotaxim-resistenten Stämmen eine Sequenzierung des vollständigen Genoms durchgeführt. Hierbei wurde eine hohe genetische Diversität der Stämme festgestellt, was die Schlussfolgerung zulässt, dass resistente Mutanten sporadisch entstehen. Die Untersuchung möglicher spatio-temporaler Cluster führte zum Nachweis einer sehr selten vorkommenden Übertragung eines Imipenem-resistenten Stamms. Durch die Sequenzierung von Resistenzgenen wurde die Epidemiologie und Relevanz bekannter Aminosäuresubstitutionen beleuchtet. Unter anderem wurde für die PBP3-Substitutionen L389F und Y557H eine hochsignifikante Korrelation mit dem Auftreten von Cefotaxim-Resistenzen nachgewiesen. Die gewonnenen Genomdaten bieten die Grundlage für die Forschung an weiteren Antibiotikaresistenzdeterminanten von H. influenzae.
Bei dem 2009 erstbeschriebenen Hefepilz C. auris handelt es sich um einen Keim, welcher aufgrund von nosokomialen Ausbrüchen und hohen Antimykotikaresistenzen Aufmerksamkeit erregte. Ziel dieser Arbeit war es in Deutschland gesammelte Isolate bezüglich vorhandener Resistenzen und Mutationen in Resistenzregionen zu testen und das epidemiologische Geschehen hierzulande mit dem globalen Auftreten des Keims zu vergleichen. Bezüglich der durchgeführten Resistenztestungen wiesen die CLSI-konformen Testarten (YO-Platten und E-Test-Verfahren) meist vergleichbare Ergebnisse auf. Für das EUCAST-konforme Mikrodilutionstestverfahren kann aufgrund eines stark ausgeprägten paradoxen Wachstumseffekts nur Anidulafungin, nicht jedoch Caspofungin, zur Testung empfohlen werden. Insgesamt erwiesen sich 25 % der Isolate als Caspofungin-resistent. Zwei Isolate zeigten eine Resistenz gegenüber allen getesteten Echinocandinen (16,7 %). Die höchsten Resistenzraten wurden gegenüber Fluconazol (92 %) beobachtet. Zwei der Isolate zeigten sich gegenüber Voriconazol resistent (16,7 %). Für Amphotericin B konnte eine Resistenzrate von 33,3 % festgestellt werden. Für die Wirkstoffe Posaconazol und Itraconazol erwiesen sich alle untersuchten Isolate als sensitiv. Dies konnte auch mit Ausnahme eines Isolates für 5-Flucytosin beobachtet werden. Die durch eine Sanger-Sequenzierung erhaltenen Sequenzen der Gene FKS1 und ERG11 wurden auf Mutationen untersucht, welche zu Aminosäuresubstitutionen im Gesamtprotein führten. Hierbei ergaben sich für zwei Isolate (16,7 %) Mutationen im FKS1-Hot Spot 1 (Typ S639F und S639Y). Beide Isolate zeigten sich in den AFST Echinocandin-resistent. Bei allen untersuchten Isolaten lagen Mutationen im ERG11 Gen vor. So fand sich in 8 Fällen eine Mutation des Typen Y132F (66,7 %), in 3 Fällen der Typ K143R (25 %) und in einem Fall der Typ F126L (8,3 %). Im Rahmen eines anderen Projekts wurde mit den hier gewonnenen PCR-Produkten ein WGS durchgeführt, um die Isolate durch SNPs-Vergleich mit Referenzstämmen phylogenetischen Clades zuzuordnen. Dabei konnten 91,7 % der Isolate dem südasiatischen Clade I und ein Isolat dem südafrikanischen Clade III zugeordnet werden. Aufgrund der geringen epidemiologischen Fallzahlen in Deutschland scheint gegenwärtig keine Bedrohung von C. auris auszugehen. Berichte aus anderen Ländern konnten allerdings eine rasche, ausbruchartige Zunahme von C. auris Fällen nachweisen. So kann nur angeraten werden das infektiologische Geschehen in Deutschland weiterhin zu beobachten.
Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet.
Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt.
Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen.
Candida Spezies gehören als kommensale Organismen zur normalen menschlichen Mikroflora, können allerdings unter bestimmten Bedingungen Krankheitswert erlangen. Limitationen in der Behandlung durch immer mehr resistente Candida Spezies und die wachsende Zahl immunsupprimierter Patienten gelten als Hauptursachen für die steigende Häufigkeit invasiver Candidosen und systemischer Candidämien. Die 2009 entdeckte Spezies C. auris stellt durch ihre zahlreichen Resistenzen, das Potential zur Auslösung nosokomialer Ausbrüche in Krankenhäusern und die schnelle Verbreitung über mehrere Kontinente eine neue Herausforderung dar. Der Bedarf an neuen Antimykotika mit anderen Wirkmechanismen und neuen Zielstrukturen ist größer denn je. Die fungale Sphingolipid-Biosynthese wurde bereits mehrfach als potenzielles Ziel antimykotischer Therapie diskutiert, allerdings bezieht sich die meiste Forschung hierzu auf C. albicans]. In vorliegender Arbeit wurden die Auswirkungen der Inhibition der Sphingolipid Biosynthese durch Myriocin auf C. auris und sein Resistenzverhalten untersucht und mit denen auf andere Candida Spezies verglichen.
Sowohl die Mikrodilution als auch die Plattentropftests zeigten, dass C. auris verglichen mit anderen Candida Spezies besonders sensitiv auf die Anwesenheit von Myriocin reagierte und stärker im Wachstum gehemmt wurde. Der Survival Assay ergab für alle drei Spezies ein Absenken der CFU durch Myriocin, die Abweichungen zwischen den Stämmen waren jedoch unwesentlich. Unterschiede konnten in Vitalität und Vermehrung der verschiedenen Spezies unter Myriocineinfluss festgestellt werden.
Aus der Lebend/Tot-Färbung ging hervor, dass Myriocin bei allen Stämmen zum Absterben von Candida Zellen führte, C. albicans und C. glabrata allerdings signifikant niedrigere Überlebensraten im Vergleich zu den C. auris Isolaten aufwiesen. Im Gegensatz dazu konnte mithilfe der FITC-Mikroskopie gezeigt werden, dass Candida Zellen unter Zugabe von Myriocin weniger Tochterzellen ausbildeten, was auf eine erschwerte oder zumindest verlangsamte Zellvermehrung hindeutet. Dabei schien das Wachstum der C. auris Stämme durch Myriocin deutlich eingeschränkter zu sein als das von C. albicans und C. glabrata. Durch weitere Mikroskopie und die Kombination aus Lebend/Tot Färbung mittels PI und FITC Färbung, sollte die Verteilung der toten Zellen auf Mutter- und Tochterzellen evaluiert werden. Hier konnte ein Trend zu einem vermehrten Zellsterben der Tochterzellen, vor allem für C. auris, festgestellt werden. Abschließende E-Tests für Amphotericin B, Anidulafungin und Fluconazol ergaben eine signifikante Herabsetzung der MHK für alle C. auris Isolate durch Myriocin. Die hier vorgestellten Ergebnisse und die durch mehrere Studien festgestellten Differenzen in der Sphingolipidkomposition von C. auris verglichen mit anderen Candida Spezies geben Hinweis darauf, dass Sphingolipide für Vitalität, Zellteilung und vor allem für die Wirkung einiger Antimykotika auf C. auris eine besondere, wenn nicht übergestellte Bedeutung haben könnten. Zwar wurde die Sphingolipidsynthese bereits mehrfach als potenzieller Angriffspunkt für die antifungale Therapie diskutiert, allerdings lediglich am Beispiel anderer Candida Spezies. Der Sphingolipidstoffwechsel könnte somit ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung des sonst so therapieresistenten und lebensbedrohlichen Pilzes C. auris sein.
Candida glabrata ist die zweithäufigste Ursache von Candidämien und invasiven Hefepilzinfektionen in Europa. Im Gegensatz zu C. albicans zeigt C. glabrata eine reduzierte Empfindlichkeit gegen bestimmte Antimykotika und kann unter Therapie rasch Resistenzen entwickeln.
Diese Arbeit umfasst eine systematische geno- und phänotypische Resistenzanalyse einer der größten europäischen - durch das NRZMyk in 5 Jahren zusammengetragenen - C. glabrata Stammsammlungen bestehend aus 176 klinisch relevanter Isolate. 84 der Stämme wurden anhand Referenztestung nach EUCAST zunächst als Anidulafungin (AND) resistent eingestuft. 71 wiesen konkordante Mutationen in den für die Glucan-Synthetase kodierenden FKS-Genen auf (13 % in FKS1, 87 % in FKS2). Vor allem die Position Ser-663 (FKS2-HS1) imponierte mit signifikant erhöhten AND MHK-Werten. 11 FKS-Wildtyp-Isolate, die ursprünglich als AND resistent klassifiziert wurden, wiesen in multiplen Nachtestungen um den Breakpoint undulierende AND MHK-Werte auf. 2 FKS-Wildtyp Isolate zeigten durchgängig hohe AND MHK-Werte und mussten daher - trotz fehlender Zielgenmutationen - als resistent eingestuft werden. Diese extremen Phänotypen wurden durch einen verblindeten nationalen Ringversuch bestätigt. Über ein Drittel der Isolate war multiresistent. Stämme aus Blutstrominfektionen und Ser-663 Mutation waren mit einer erhöhten Mortalität assoziiert. Ein weiteres Kernelement war die Detektion von Azol-resistenten C. glabrata petite-Phänotypen in der Routinediagnostik. Hier wurden innerhalb von 8 Monaten 20 relevante Isolate identifiziert.
Die Ergebnisse belegen das regelmäßige Auftreten single- / multidrug-resistenter C. glabrata Isolate in Deutschland. Phänotypische Resistenztestungen können zu Fehlklassifizierung von sensiblen Isolaten führen. FKS-Genotypisierungen hingegen sind ein nützliches Tool zur Identifizierung relevanter Resistenzen. In seltenen Fällen scheint jedoch eine Echinocandin-Resistenz ohne genotypisches Korrelat möglich zu sein.
Ältere Menschen sind gegenüber invasiven Infektionen und Sepsis besonders vulnerabel mit ungünstiger Prognose. Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae können beide invasive Infektionen verursachen. Oft geht eine asymptomatische Besiedelung einer Infektion voraus und ist ein Risikofaktor für eine invasive Infektion. Daher wurde eine bizentrische Querschnittstudie in den Regionen Aachen und Würzburg durchgeführt, um die Prävalenz von H. influenzae, S. aureus und MRSA (Methicillin resistenter S. aureus) bei asymptomatischen Senioren zu bestimmen, wie auch Risikofaktoren für eine Besiedelung. Von Oktober 2012 bis Mai 2013 wurden 677 Erwachsenen im Alter von 65 Jahren oder älter eingeschlossen, die zu Hause oder in Seniorenheimen lebten. Die Prävalenz von H. influenzae bei älteren Menschen war mit einer Trägerrate von nur 1,9% ([95% CI: 1,0 - 3,3%]; 13/677) sehr niedrig. Trägerisolate waren überwiegend nicht typisierbare H. influenzae, zeigten eine hohe clonale Diversität und waren alle Ampicillin-sensibel. Die Prävalenz von S. aureus war mit 28,5% ([95% CI: 25,1 - 32,1%]; 193/677) hoch, wie für die deutsche Allgemeinbevölkerung bekannt, während MRSA bei weniger als 1% der Teilnehmer gefunden wurde (0,7% [95% CI: 0,2 - 1,7%]; 5/677). Die Prävalenz von H. influenzae, S. aureus und MRSA unterschied sich nicht signifikant zwischen selbständig zu Hause lebenden Senioren und Pflegeheimbewohnern. Ältere, selbständig lebende Menschen mit höherem Bildungsniveau hatten signifikant höhere Kolonisierungsraten mit S. aureus (adjusted OR: 1,905 [95% CI: 1,248 - 2,908]; p = 0,003). Bei Pflegeheimbewohnern war eine Kolonisierung signifikant mit Verheiratet sein assoziiert (adjusted OR: 3,367 [95% CI: 1,502 - 7,546]; p = 0,003). Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von sozio-demographischen Faktoren für eine Kolonisierung mit S. aureus und schließen eine Lücke bei epidemiologischen Daten zu H. influenzae.
Die alveoläre Echinokokkose (AE), verursacht durch das Metacestoden- Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis (E. multilocularis), ist eine lebensbedrohliche Zoonose der nördlichen Hemisphäre mit eingeschränkten therapeutischen Möglichkeiten. Bei der Suche nach neuen Therapeutika haben Mitogen-activated Proteinkinase (MAPK) -Kaskaden als pharmakologische Zielstrukturen aufgrund ihrer essentiellen Rolle bei der Zellproliferation und -differenzierung ein großes Potenzial. In der vorliegenden Arbeit wurden durch BLAST- und reziproke BLAST-Analysen elf potenzielle MAPK Kinase Kinasen (MAP3K), fünf potenzielle MAPK Kinasen (MAP2K) und sechs potenzielle MAPK im E. multilocularis-Genom identifiziert, die teils hoch konserviert sind und in nahezu allen Entwicklungsstadien des Parasiten exprimiert werden. Diese Erkenntnisse lassen auf ein komplexes MAPK-Signaltransduktions- system in E. multilocularis mit großer Bedeutung für den Parasiten schließen. Transkriptomdatenanalysen und Whole Mount in Situ Hybridisierung (WMISH) zeigten, dass emmkkk1 (EmuJ_000389600) als einzige MAP3K neben der Expression in postmitotischen Zellen in besonderem Maße in proliferativen Stammzellen des Parasiten exprimiert wird und somit eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen spielen könnte. In Yeast-Two-Hybrid (Y2H) -Wechselwirkungsassays wurden Interaktionen von mehreren upstream- (EmGRB2) und downstream- wirkenden Signalkaskadekomponenten des JNK (EmMKK3, EmMPK3) und ERK (EmMKK3, EmMPK4) -Signalwegs gefunden. Daraus lässt sich schließen, dass EmMKKK1, analog zu seinem humanen Homolog HsM3K1, eine zentrale Rolle bei der Echinococcus-Wachstumsregulation durch Rezeptortyrosinkinasen und vielfältige weitere Funktionen im Parasiten besitzt. Anhand von Erkenntnissen an Platyhelminthes kann daher von einem großen Potenzial dieser neu charakterisierten Signalwege als chemotherapeutische Angriffspunkte ausgegangen werden, wenngleich erste RNA-Interferenz (RNAi)- und Inhibitorstudien an emmkkk1, emmpk1 und emmpk4 keine durchschlagenden Effekte auf das Überleben von Primärzellkulturen und die Bildung von Metacestodenvesikeln zeigten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit mit EmMKKK1 und neuen ERK- und JNK-Signalwegen zentrale Komponenten der komplexen MAPK-Signalkaskaden in E. multilocularis identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich einen großen Beitrag zur enormen Regenerationsfähigkeit der Echinococcus-Stammzellen leisten und vom Wirt abgeleitete Signale wie Insulin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) über EmGRB2 in Proliferationsnetzwerke des Parasiten integrieren. Arzneimittel-Screening-Assays, die auf diese Signalwege abzielen, könnten daher zu alternativen Arzneimitteln führen, die alleine oder in Kombination mit einer bestehenden Chemotherapie (Benzimidazol) die Prognose von für AE-Patienten verbessern könnten.
Die zunehmende Antibiotikaresistenz vieler Krankheitserreger ist ein weltweites Problem, welches zu einem klinischen Bedarf an neuen antimikrobiellen Substanzen führt. Sphingolipide einschließlich Ceramide stellen eine vielfältige Gruppe strukturverwandter Lipide dar und bestehen aus einem Sphingosin-Grundgerüst, welches mit einer Fettsäure verbunden ist. Sowohl das Sphingosin-Grundgerüst allein als auch Sphingolipide zeigen eine antibakterielle Wirkung gegenüber einer Vielzahl pathogener Mikroorganismen. Die Intensität der Hemmung hängt von der Sphingolipidstruktur und dem Mikroorganismus ab. Neuere Studien konnten zeigen, dass Sphingosin, Ceramide und Ceramid-Analoga in N. meningitidis aufgenommen werden und eine bakteriostatische oder bakterizide Wirkung zeigen. Jedoch ist die antibakterielle Wirkungsweise noch nicht genau bekannt. Um mehr über den Wirkmechanismus zu erfahren haben wir die ultrastrukturellen Veränderungen von N. meningitidis nach Inkubation mit azido-funktionalisierten Sphingolipiden mit elektronenmikroskopischen Verfahren (transmissionselektronenmikroskopische und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen) untersucht. Mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) konnten wir die azido-funktionalisierten Sphingolipide nach Aufnahme in N. meningitidis lokalisieren. Zum Anfärben der funktionalisierten Sphingolipide wurde die kupferfreie Azid-Alkin-Cyccloaddition verwendet.
Die Schistosomiasis ist nach wie vor eine der häufigsten parasitären Erkrankungen der Welt und verursacht erhebliche gesundheitliche und wirtschaftliche Folgen, insbesondere in ärmeren, ländlichen Regionen. Durch Immunreaktionen auf die im Wirt abgelegten Eier des Parasiten können sich chronische Verlaufsformen manifestieren. Dabei kann es zu irreversiblen Schäden kommen. Um dies zu verhindern sind eine frühe und sichere Diagnose sowie eine Behandlung mit Praziquantel (PZQ) unabdingbar. Zudem spielt der zuverlässige Nachweis der Schistosomiasis eine Schlüsselrolle bei der Überwachung, Prävention und Kontrolle der Erkrankung. In epidemiologischen Studien findet am häufigsten die mikroskopische Kato-Katz (KK)-Methode zum Nachweis von Schistosoma mansoni Eiern im Stuhl Anwendung. Dieses Verfahren ist äußerst spezifisch und bietet die Möglichkeit der Quantifizierung, wodurch die Intensität der vorliegenden Infektion bestimmt werden kann. Die Sensitivität der Testmethode ist jedoch nur moderat, insbesondere bei einer niedrigen Infektionsintensität. Zudem kann eine Infektion erst nach der Präpatenzzeit nachgewiesen werden. Der ebenfalls häufig eingesetzte urinbasierte Point-of-Care Circulating Cathodic Antigen (POC-CCA)-Test weist zwar eine höhere Sensitivität aber geringere Spezifität als das KK-Verfahren auf. Als hochsensitive und sehr spezifische Methode zur Diagnose der Schistosomiasis hat sich der Nachweis von Schistosoma-spezifischer DNA mittels Real-Time PCR herausgestellt. Allerdings wird für die Durchführung dieser Technik ein gut ausgestattetes Labor benötigt, das sich in der Regel nicht in unmittelbarer Nähe zum Patienten im Feld befindet. Daher ist es besonders wichtig, über praktikable und schnelle Konservierungsmethoden zu verfügen, die bevor die Extraktion und Amplifikation der DNA stattfindet, einen einfachen Transport und eine einfache Lagerung des Probenmaterials ermöglichen.
Das Ziel des ersten Teils der vorliegenden Arbeit war, die Sensitivität und Spezifität der klassischerweise verwendeten KK-Methode und des POC-CCA-Tests mit der
Real-Time PCR- Methode unter Verwendung von Stuhlproben, Urinproben, Serumproben sowie auf Filterpapier getrocknete Blutproben (dried blood spots – DBSs) zu vergleichen. Zudem wurde die Anwendbarkeit der Real-Time PCR aus Serum- und Urinproben zur Therapiekontrolle überprüft. Die dazu notwendigen Studien wurden alle in der Region Mwanza in Tansania durchgeführt, welche als hochendemisch für S. mansoni gilt. Für die Untersuchungen zur stuhlbasierten Real-Time PCR wurden als Studienteilnehmer Schulkinder gewählt. Aufgrund der erforderlichen Blutabnahme wurden die anderen Teilstudien nur mit erwachsenen Probanden durchgeführt. Unter Verwendung der KK-Methode als Goldstandard erzielten die Real-Time PCR aus Stuhlproben und der POC-CCA-Test sehr hohe Sensitivitäten von 99,5% bzw. 89,7%, jedoch nur geringe Spezifitäten von 29,55% und 22,73%. Die KK-Methode weist bekanntermaßen nur eine geringe bis moderate Sensitivität auf und ist daher nicht gut als Referenz geeignet. Deshalb wurde zusätzlich eine latente Klassenanalyse angewandt, um die tatsächlich Erkrankten zu ermitteln und anhand dieser die diagnostische Güte der verwendeten Tests zu bestimmen. Hier zeigte der POC-CCA-Test die höchste Sensitivität (99,5%) sowie eine Spezifität von 63,4%. Der Real-Time PCR-Test hatte eine Sensitivität von 98,7% und die höchste Spezifität (81,2%). Die Spezifität der KK-Technik betrug 72,8%, die Sensitivität war signifikant niedriger (89,7%) als bei den anderen beiden Methoden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass der POC-CCA-Schnelltest empfindlicher ist als die KK-Methode und zum Screening von S. mansoni-Infektionen eingesetzt werden kann. Die Stuhl-PCR war zwar ebenfalls hochsensitiv und zeigte unter den drei getesteten Diagnoseverfahren die höchste Spezifität, aber aufgrund der höheren Kosten und der komplizierten Anwendung sollte für epidemiologische Untersuchungen in Hochprävalenzregionen der POC-CCA-Test bevorzugt werden. Bei unklaren Diagnosen kann die Real-Time PCR-Methode als Bestätigungstest Anwendung finden.
In der Teilstudie zur serum- und urinbasierten Real-Time PCR in einer endemischen Region vor und nach der Behandlung mit PZQ wurden folgende Ergebnisse erzielt: Unter Verwendung einer kombinierten Referenz aus den Ergebnissen des parasitologischen KK-Tests und / oder der serumbasierten PCR konnte zu Studienbeginn eine Prävalenz von S. mansoni von 77,1% ermittelt werden. In Bezug auf die Sensitivität zeigte der DNA-Nachweis aus Serum (96,3%) und der POC-CCA-Assay (77,8%) die höchsten Ergebnisse. Die urinbasierte Real-Time PCR zeigte die geringste Empfindlichkeit (33,3%). Durch die Behandlung mit Praziquantel wurde eine signifikante Reduktion der S. mansoni Prävalenz erreicht. Zwanzig Wochen nach Therapie konnte durch die KK-Methode keine, mit dem POC-CCA-Test 33,3% und mit der serumbasierten Real-Time PCR 58,3% Infektionen festgestellt werden. Die Analyse der mittels der serumbasierten PCR bestimmten mittleren Ct-Werte im zeitlichen Verlauf zeigte, dass dieser eine Woche nach der Behandlung signifikant abnahm (von 30,3 auf 28) und 20 Wochen später über den Basiswert (34,9) anstieg. Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur DNA-Ausgangsmenge, die in die PCR eingesetzt wurde. Dies deutet darauf hin, dass kurz nach der Therapie ein DNA-Anstieg zu verzeichnen war und 20 Wochen später weniger DNA als zu Beginn der Studie nachweisbar war. Dieser DNA-Verlauf lässt verschiedene Interpretationsmöglichkeiten zu. Die Daten zeigen jedoch, dass die serumbasierte Real-Time PCR eine ausgezeichnete diagnostische Genauigkeit aufweist. Da die nachgewiesene DNA jedoch keine Rückschlüsse auf das Parasitenstadium zulässt und es sich hierbei auch um DNA aus im Gewebe verbliebenen Eiern oder Reinfektionen handeln könnte, ist diese Methode in Hochprävalenz- Regionen nicht zur Therapiekontrolle geeignet. Die Verwendung von Urin zum DNA-Nachweis erzielte keine vielversprechenden Ergebnisse. Die Sensitivität der Real-Time PCR aus DBSs war ebenfalls sehr gering (45,4%) und kann ohne weitere ausführliche Testung hinsichtlich Lagertemperatur, Lagerdauer, verschiedener Filterpapierarten und Extraktionsmethoden nicht empfohlen werden.
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse dieser Studien, dass sowohl die stuhl- als auch die serumbasierte Real-Time PCR bei der Erkennung und Bewertung der Infektionsprävalenz, einem wichtigen Aspekt epidemiologischer Studien, deutlich empfindlicher ist als das mikroskopische KK-Verfahren. Aufgrund des hohen Kosten- und Personalaufwandes und der Notwendigkeit eines gut ausgestatteten Labors wird sich diese Methode aber nicht zum Screening in hochendemischen Ländern durchsetzen. Sie kann jedoch einen Mehrwert bei der Diagnose der Schistosomiasis bieten, vor allem bei frühen oder leichten Infektionen. Zudem kann diese hochsensitive und spezifische Methode als Bestätigungstest bei unklaren Diagnosen herangezogen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden malakologische Untersuchungen zur Identifizierung potenzieller Übertragungsorte für die Schistosomiasis rund um die im Viktoriasee gelegene Insel Ijinga durchgeführt. Diese Analysen fanden innerhalb eines Pilotprojektes zur Eliminierung der Erkrankung auf der Insel Ijinga statt, wobei ein intensiviertes Behandlungsprotokoll, welches die gesamte Inselbevölkerung einschloss, Anwendung fand. Die Kontrolle der Praziquanteleffektivität nach mehreren Behandlungsrunden bringt eine Reihe diagnostischer Herausforderungen mit sich. Hier könnte die Beurteilung der Schistosoma-Infektion in den Zwischenwirtschnecken vor und nach der Therapie als Indikator für den Erfolg der Maßnahme dienen. Zu diesem Zweck erfolgte zunächst eine Baseline-Untersuchung, bei der Schnecken an Uferregionen gesammelt wurden, an denen die Inselbewohner häufigen Wasserkontakt hatten. Die Schnecken wurden anhand morphologischer Merkmale identifiziert und mithilfe der Real-Time PCR-Methode auf Infektionen mit S. mansoni untersucht. Insgesamt wurden 35,4% (279/788) S. mansoni- positive Zwischenwirtschnecken (Biomphalaria) detektiert. Dies verdeutlicht, dass an den meisten Wasserkontaktstellen um die Insel Ijinga ein potentielles Risiko für die Übertragung der Schistosomiasis besteht. Die mithilfe der KK-Methode ermittelte Gesamtprävalenz von S. mansoni in der humanen Bevölkerung betrug 68,9%. Nachdem die Bewohner der Insel viermal mit PZQ behandelt wurden, zeigte sich in der kontinuierlich überwachten Sentinelgruppe eine Reduktion der Prävalenz auf 28,7%. Zu diesem Zeitpunkt wurde ebenfalls die Analyse der Schnecken wiederholt und es konnten 16,8% (57/350) Schnecken mit einer S. mansoni Infektion nachgewiesen werden. Die Reduktion der Infektionshäufigkeit in den Schnecken vor und nach der viermaligen Behandlung der Bevölkerung war signifikant (χ² = 74.335, p < 0,001). Dies deutet darauf hin, dass die intermediären Wirtsschnecken zur Überwachung von Kontrollmaßnahmen verwendet werden können.
Die Innenausbauflächen von Krankentransport- bzw. Rettungswagen unterliegen dem Risiko einer Verunreinigung durch Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA). In der vorliegenden Arbeit wurden Krankentransport- bzw. Rettungswagen unmittelbar nach dem Transport von MRSA-kolonisierten oder -infizierten Patienten auf MRSA untersucht. Zu diesem Zweck wurden an 2 Stellen der Trage und an 3 Stellen der Innenausbauflächen Proben entnommen.
89 von 100 untersuchten Transporten, welche das Einschlusskriterium einer Transportzeit von weniger als 20 Minuten erfüllten, wurden weitergehend analysiert.
8 der untersuchten Kranken- bzw. Rettungswagen (7,1%) wiesen eine Kontamination auf (90% Konfidenzintervall: 4-14 %), wobei die Transportzeit keinen Einfluss auf die Kontamination hatte.
MRSA wurde nur an der Trage nachgewiesen und zwar ausschließlich am Kopfteil der Trage und an den Tragegriffen. Die beprobten Stellen der Innenausbauflächen waren nicht kontaminiert.
Bei Kurzzeittransporten von MRSA-positiven Patienten sollte daher der Fokus der Desinfektion auf die Oberflächen in unmittelbarer Patientennähe gelegt werden.
Eine weitere Untersuchung von 60 Transporten MRSA-negativer Patienten blieb ohne MRSA-Befund. In 12 dieser Krankentransportwagen wurde jedoch Methicillin-sensibler S. aureus nachgewiesen, der sich ebenfalls vorwiegend an Kopfteil und Handgriffen der Trage fand.
Auch dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung der Desinfektion patientennaher Flächen unabhängig vom MRSA-Status der transportierten Patienten.
Vergleich der Bakterienlast in vivo und Wachstumskinetik in vitro hyperletaler Meningokokkentypen
(2020)
Die invasive Meningokokkenerkrankung stellt weltweit mit einer Letalität von 5-10% trotz antibiotischer Therapie eine Herausforderung dar. Ein spezifisches Virulenzgen, welches die Schwere der Meningokokkenerkrankung bestimmt, konnte bisher nicht definiert werden. Vorangegangene Studien zeigen eine Korrelation der Letalität mit der Bakterienlast, Unterschiede bezüglich der Letalität je nach Serogruppe, eine erhöhte Letalität bei Infektionen mit sogenannten hyperletalen Feintypen (bisher nicht veröffentlichte Daten des NRZMHi) sowie einen Unterschied in der maximal in Flüssigkultur erreichten Konzentration der Bakterien zwischen invasiven Stämmen und Trägerstämmen.
In dieser Arbeit wurden mögliche Gründe für die Hyperletalität bestimmter Meningokokkentypen experimentell untersucht. Insbesondere wird die Frage analysiert, ob die hyperletalen Meningokokkentypen mit einer höheren bakteriellen Last im Blut assoziiert sind und ob sie andere Wachstumscharakteristiken im Vergleich zu ihren Kontrollstämmen in vitro zeigen.
Hierzu erfolgte mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion die Bestimmung der bakteriellen Last in 62 Blutproben von Patienten mit bestätigter invasiver Meningokokkenerkrankung über den Nachweis des ctrA-Gens. Darunter waren elf Proben des hyperletalen Feintyps B:P1.7-2,4:F1-5 und fünf Proben des hyperletalen Feintyps C:P1.5,2:F3-3.
Die Wachstumsversuche wurden mit 30 zufällig gewählten Stämmen der hyperletalen Feintypen B:P1.7-2,4:F1-5, C:P1.5-1,10-8:F3-6 und C:P1.5,2:F3-3 mit ihren jeweiligen nach Alter und Geschlecht abgeglichenen nicht zu der Gruppe der hyperletalen Feintypen gehörenden Kontrollstämmen in dem Medium PPM+ durchgeführt.
Die Wachstumsgeschwindigkeit μ sowie die Kapazität A (maximale Konzentrationszunahme als Logarithmus der gemessenen OD im Verhältnis zur Ausgangsdichte ODT0) wurden durch nicht-lineare Regression anhand der modifizierten Gompertz-Funktion ermittelt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte alle 30 Minuten über 16 Stunden bei 620nm durch das Gerät TECAN Infinite 200 Pro (Tecan Group Ltd., Männedorf / Schweiz). Die Methode wurde anhand einer publizierten Studie zwischen Trägerstämmen und invasiven Stämmen (Schoen et al., 2014) validiert und bestätigte einen marginalen Unterschied in der optischen Dichte (p=0,057, Wilcoxon-Test) zwischen den Gruppen. Es zeigte sich kein Unterschied in der Wachstumsgeschwindigkeit.
Aus den Ergebnissen dieser Arbeit können drei wesentliche Schlussfolgerungen gezogen werden:
1.) Die Bakterienlast in dieser Stichprobe ist, entgegen der Literatur, nicht abhängig von der Serogruppe und dem Feintyp, jedoch von der Krankheitsmanifestation.
2.) Die Kapazität A ist in der Gruppe der „hyperletalen“ Typen im Vergleich zu den Kontrollstämmen möglicherweise höher.
3.) Größere Stichproben (Nativmaterial, Stämme) sind erforderlich, um die Beobachtungen dieser Studie zu bestätigen.
Zahlreiche humanpathogene bakterielle Erreger können ihre Fähigkeit zur Kolonisation epithelialer Barrieren optimieren, indem sie mit dem Zellzyklus der infizierten Wirtszelle in Wechselwirkung treten und so die Abschilferung und Erneuerung des Epithels verzögern. Die hierbei wirksamen bakteriellen Effektoren sind als „Cyclomoduline“ bekannt und gelten als neue Klasse bakterieller Pathogenitätsfaktoren. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es zu untersuchen, ob durch die Infektion menschlicher pharyngealer Epithelzellen mit N. meningitidis der Zellzyklus der Wirtszelle beeinflusst wird. Mit zwei verschiedenen Untersuchungsmethoden konnte übereinstimmend gezeigt werden, dass die Infektion der Epithelzelllinie Detroit 562 mit verschiedenen Meningokokkenisolaten zu einer signifikanten Akkumulation von Epithelzellen in der G1-Phase führte. Dieser Effekt wurde sowohl von pathogenen Meningokokkenstämmen als auch von Trägerstämmen ausgelöst, jedoch nur durch Isolate, die fähig zur Adhärenz und zur Invasion in die Epithelzelle waren. Durch Hitzebehandlung der Bakterien konnte der Zellzyklusarrest vollständig aufgehoben werden. Ebenso konnte der Effekt durch Inkubation der Epithelzellen mit bakteriellen Kulturüberständen und durch Infektion der Zellen mit E. coli-Stämmen, welche die Meningokokkenadhäsine Opa und Opc überexprimieren, nicht ausgelöst werden.
Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die Infektion mit N. meningitidis in der Zielzelle zu einer signifikant gesteigerten Expression des CDK-Inhibitors p21WAF1/Cip1 führte, begleitet von einer vermehrten Lokalisation im Zellkern. Auch zeigte sich eine veränderte Proteinexpression der für die G1-Phase relevanten Cycline D und E. Diese scheint sich erst posttranslational zu ereignen, da die unterschiedliche Expression auf mRNA-Ebene nicht festgestellt werden konnte.
Zusammenfassend konnte dargestellt werden, dass die Infektion von Pharynxepithelzellen mit lebenden, zur Adhärenz und Invasion fähigen Meningokokkenstämmen in der menschlichen Zielzelle einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase verursacht, vermutlich durch veränderte Expression der Zellzyklusregulatoren p21WAF1/Cip1, Cyclin D und Cyclin E. Möglicherweise stellt die Induktion dieses Zellzyklusarrestes einen wichtigen Schritt in der Pathogenese der bakteriellen Kolonisation des oberen Atemwegsepithels durch N. meningitidis dar.
Neisseria meningitidis ist Auslöser invasiver Infektionen, die Sepsis und Meningitis hervorrufen. Bakterielle ADP-Ribosyltransferasen wurden als Toxine zahlreicher Bakterien wie E.coli, V. cholerae und B. pertussis beschrieben, die postranslationale Modifikationen bei eukaryotischen Proteinen mit pathologischer Wirkung für den Menschen hervorrufen. Die ADP-Ribosyltransferase NarE von Neisserien ist auf der Basis von Sequenzhomologien identifiziert worden. Die enzymatische Aktivität des Proteins wurde bereits in Studien gezeigt. Ziel dieser Arbeit war, NarE aus epidemiologischem und populationsbiologischem Blickwinkel zu betrachten.
Insgesamt wurden 576 Meningokokkenisolate (109 Isolate aus der Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie Würzburg und 467 Isolate der Meningococcus Genome Library der Meningitis Research Foundation) auf das Vorhandensein von narE sowie auf Sequenzvariationen untersucht. Das Ergebnis zeigte den Besitz des Gens bei insgesamt 247 Stämmen. Bis auf zwei Punktmutationen waren alle untersuchten narE-Sequenzen identisch. Die narE-positiven Isolate konnten neun klonalen Komplexen zugeordnet werden.
Zusätzlich wurde veranschaulicht, dass das Gen in Komplexen vorkommt, die verwandtschaftlich nicht eng miteinander verbunden sind.
Mittels Western Blot konnte bei allen narE-positiven Meningokokken die Proteinexpression bestätigt werden, wobei ein signifikanter Unterschied zwischen Stämmen des cc32 und cc41/44 festzustellen war. Auf Transkriptionsebene konnte mittels qRT-PCR kein Unterschied zwischen diesen Komplexen ermittelt werden, so dass der Expressionsunterschied auf einem posttranskriptionellen Mechanismus beruhen muss.
Neisseria gonorrhoeae ist ebenfalls im Besitz des Gens wie von Masignani et al. (2003) am Beispiel weniger Isolate beschrieben. In dieser Arbeit konnte für alle 29 getesteten Gonokokken die Insertion von vier Basenpaaren bestätigt werden, die zu einer Verschiebung im Leseraster führt, so dass NarE nicht exprimiert wird. Auch ein Neisseria sicca Stamm beinhaltet und exprimiert das narE-Gen.
Die alveoläre Echinokokkose ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die durch tumorartig in der Leber wachsende Larven (Metazestoden) des Fuchsbandwurms ausgelöst wird. Während Th1-dominierte Immunantworten zur Expulsion des Parasiten führen können, sind Th2-Antworten mit chronischer Infektion assoziiert. Über seine exkretorisch-sekretorischen Produkte (ESPs) nimmt Echinococcus multilocularis Einfluss auf die Polarisierung der Immunantwort. Allerdings ist bislang nur wenig über die zugrundeliegenden Mechanismen und aktiven Komponenten der ESPs bekannt.
Die Immunmodulation durch Eier des Pärchenegels Schistosoma mansoni, der wie E. multilocularis zu den Plattwürmern gehört, ist dagegen schon besser charakterisiert. Hier hat omega-1, eine Ribonuklease der T2-Familie, Aufmerksamkeit als starker Induktor von Th2-Antworten und als Hepatotoxin erregt.
Die Fragestellung dieser Arbeit war nun, ob die T2-RNase des Fuchsbandwurms (EmRNASET2) hinsichtlich ihrer Wirkungen auf Zellen des Immunsystems und der Leber Ähnlichkeiten mit omega-1 besitzt. Es konnte gezeigt werden, dass EmRNASET2 von allen Larvenstadien und auch vom adulten Wurm exprimiert wird. Der Einsatz polyklonaler Antikörper gegen rekombinant in Escherichia coli exprimierte recEmRNASET2 ermöglichte den Nachweis des Proteins in den ESPs von Primärzellen, die das frühe Stadium sich entwickelnder Metazestoden darstellen, und, wenngleich geringer ausgeprägt, in ESPs reifer Metazestoden.
Zur Untersuchung einer möglichen immunmodulatorischen Wirkung wurden dendritische Zellen (DCs) aus murinem Knochenmark generiert und mit Überständen recEmRNASET2-produzierender HEK-Zellen exponiert. Diese zeigten im Vergleich zu Überständen von mit leerem Transfektionsvektor behandelten HEK-Zellen keine signifikante Inhibition der LPS-induzierten Reifung und Interleukin-12-Produktion von DCs, wie sie für omega-1 beschrieben ist. Auch ein Pilotexperiment mit der Leberzelllinie Hep3B lieferte keinen Anhalt für eine hepatotoxische Wirkung von EmRNASET2. Somit sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit gegen eine funktionelle Verwandtschaft von EmRNASET2 und omega-1. Unterstützt wird diese Beobachtung durch eine orientierende phylogenetische Untersuchung, in der sich EmRNASET2 näher verwandt zu einer zweiten T2-RNase von S. mansoni zeigte. Omega-1 könnte also das Resultat einer Genduplikation mit anschließender Akquirierung immunmodulatorischer Funktionen sein.
Das Opc-Protein ist ein Außenmembranprotein von Meningokokken, das über extrazelluläre Matrixproteine mit Integrinen der Wirtszelle interagiert. Opc ist in Menschen immunogen und induziert bakterizide Antikörper. Das Opc-Protein wurde daher als aussichtsreicher Impfstoff-Kandidat angesehen, da es außerdem relativ gut konserviert ist. Allerdings wird das Opc-Protein nicht von allen Meningokokkenstämmen exprimiert. Einerseits fehlt das opc-Gen in einigen klonalen Komplexen (z.B. ST-8, ST-11, ST-53), andererseits ist die Opc-Expression nicht konstitutiv wegen einer phasenvariablen Transkription, die auf einem Poly-Cytidin-Bereich im Promotor des opc-Gens beruht.
In dieser Arbeit wurde die Präsenz des opc-Gens und die Opc-Expression in zwei großen Sammlungen deutscher Meningokokkenisolate von invasiven Erkrankungen (n=1141) und gesunden Trägern (n=792) untersucht.
Das opc-Gen war bei 71% der invasiven und 77% der Trägerstämme nachweisbar. Der größte Teil der opc-Gen negativen Stämme gehörte zu den klonalen Komplexen ST-8, ST-11, ST-213, ST-231, ST-334 und ST-53.
Der Anteil opc-positiver Stämme, die Opc in vitro exprimieren, war bei den invasiven Stämmen kleiner als bei den Trägerstämmen (13% vs. 29%, p<0,001, Chi-square-Test).
Der größere Anteil Opc-exprimierender Trägerstämme ist u.a. am ehesten mit der Überrepräsentation von wenig pathogenen klonalen Komplexen (ST-23, ST-35, ST-198) mit einer hohen Opc-Expressionsrate zu erklären.
24 von den 176 invasiven Stämmen mit einer Anzahl von 11 - 14 Cs in der Promotor-Region, die die Opc-Expression begünstigt, zeigten weder im ELISA noch im Westernblot eine Opc-Expression. Bei 14 dieser 24 Stämme wurde als Ursache ein phasenvariabler, intragenischer Poly-Adenin-Bereich identifiziert, der zu einer Leserasterverschiebung führte.
Die Vermutung mehrerer Autoren, dass die Opc-Expression mit dem klinischen Bild der Meningitis verknüpft ist, konnte mit der hier genutzten großen Stammsammlung nicht bestätigt werden. Invasive Stämme, die das Opc-Protein exprimierten, wurden genauso häufig von Patienten mit dem klinischen Bild der Meningitis isoliert wie Stämme, die das Opc-Protein nicht exprimierten (46% vs. 47%, Chi-square-Test: p<0,9). Allerdings gibt es eine starke Assoziation der Gegenwart des opc-Gens mit dem klinischen Merkmal Meningitis. Dieser Befund gibt Anlass zu der Hypothese, dass in vitro und in vivo Expression von Opc sich unterscheiden.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das Opc-Protein nur in 19,8% aller Isolate (invasive und Trägerstämme zusammengenommen) exprimiert wurde. Es zeigte sich eine Tendenz zu häufigerer Opc-Expression in apathogenen Trägerisolaten. Das Vorhandensein des opc-Gens, nicht aber die in vitro Expression konnten mit dem klinischen Merkmal Meningitis assoziiert werden. Zusätzlich wurde ein weiterer Mechanismus der intragenischen Phasenvariation beschrieben.
Einfluss des Komplementsystems und der neuartigen Meningokokken-Vakzine 4CMenB auf cnl-Meningokokken
(2016)
In dieser Arbeit wurden verschiedene Vakzine-relevante Oberflächenantigene von cnl-Meningokokken typisiert und die Interaktion von cnl-Meningokokken mit dem Komplementsystem, v.a. mit dessen Hauptregulatoren fH und C4bp, analysiert. Mit den gewonnenen Daten sollten Schlussfolgerungen bzgl. der erwarteten Wirkung von 4CMenB, einem 2013 in Deutschland eingeführten und auf Meningokokken der Serogruppe B abzielenden Impfstoff, auf cnl-Meningokokken gezogen werden. Des Weiteren sollte die Interaktion der natürlicherweise unbekapselten cnl-Meningokokken, die als apathogen und möglicherweise günstig für die Entwicklung einer natürlichen Immunität eingeschätzt werden, untersucht werden.
Eine Auswahl von cnl-Meningokokken-Stämmen, die die genetische Variabilität dieser Bakterienpopulation abbilden, wurde mittels PCR (porA, porB, fetA, opc, fHbp, nhba und nadA) oder Western Blot-Analyse (Opc) typisiert. Hierbei konnte eine deutliche Assoziation einzelner Allele zu klonalen Komplexen gezeigt werden. Allerdings lässt die Analyse bezweifeln, dass cnl-Meningokokken durch Bexsero-induzierte Antikörper erkannt werden,
da ihr Antigenmuster stark von den Vakzineantigenen abweicht. Unklarheit herrscht lediglich bzgl. des Antigens NhbA.
In der Folge wurde die fH- und C4bp-Bindung bei cnl-Meningokokken mittels Durchflusszytometrie untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass im Vergleich zu fH bzw. C4bp bindenden Kontrollstämmen die Bindung der Hauptregulatoren des Komplementsystems an cnl-Meningokokken sehr gering ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass cnl-Meningokokken eine sehr geringe Serumresistenz in vitro haben, was ebenfalls für eine schwache Akquirierung der Komplementregulatoren spricht. Dieser Befund unterstreicht die apathogene Natur der Bakterien. Er zeigt aber auch, dass mit herkömmlichen Methoden wie dem Serumbakterizidietest, der bei bekapselten Stämmen angewendet wird, funktionelle Aussagen bzgl. der Wirkung bakterizider Antikörper, die durch Impfstoffe auf Proteinbasis induziert werden, nur schwer zu tätigen sein werden. Sehr geringe Komplementmengen müssten eingesetzt werden oder alternative Verfahren wie die Opsonophagozytose Anwendung finden.
Die Interaktion mit Gehirnendothelzellen stellt ein zentraler Schritt in der Infektionspathogenese von Neisseria meningitidis dar. In dieser Promotionsarbeit konnte gezeigt werden, dass die Infektion von menschlichen Gehirnendothelzellen mit N. meningitidis zu einer transienten Aktivierung der sauren Sphingomyelinase (ASM) gefolgt von einer vermehrten Ceramidproduktion führt. Als Antwort auf die Infektion mit N. meningitidis kommt es zu einer vermehrten Präsentation der ASM und von Ceramiden an der äusseren Seite der Plasmamembran und zu einer Ausbildung von großen Ceramid-reichen Membran-Domänen, welche mit cortical plaque assoziierten Proteinen kolokalisieren. Bei dieser N. meningitids vermittelten Aktivierung der ASM spielt das bakterielle Aussenmembranprotein Opc sowie die Aktivierung der Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase C über die Interaktion von Opc mit Heparansulfat-Proteoglykane eine entscheidende Rolle. Die pharmakologische oder genetische Inhibition der ASM Funktion führt zu einer geringeren Invasivität der Meningokokken ohne dabei die Adhärenz zu beeinflussen. Im Einklang mit diesen Ergebnissen steht die Beobachtung, dass die geringere Invasivität von ausgewählten Isolaten des ST-11/ST-8 Komplex in menschlichen Gehirnendothelzellen direkt mit ihrer eingeschränkter Fähigkeit korreliert, die ASM zu aktivieren bzw. eine Ceramidproduktion zu induzieren. Schlussfolgernd ist die ASM Aktivierung und eine nachfolgende Ceramidproduktion essenziell für die Internalisierung von Opc-exprimierende Meningokokken in Gehirnendothelzellen und bietet einen Erklärungsansatz für die unterschiedliche Invasivität von verschiedenen N. meningitidis Stämmen.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der häufigsten Erreger schwerer endovaskulärer Infektionen, die häufig mit einer Dissemination des Erregers in andere Organe und lebensbedrohlichen Komplikationen wie Endokarditis, Osteomyelitis oder Abszessen assoziiert sind. Entscheidender Schritt in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen ist die Schädigung und Überwindung der Endothelbarriere. Für deren Integrität ist die Intaktheit von Zell-Zell-Verbindungen elementar, diese werden unter anderem durch Src-Kinasen reguliert. Es ist bekannt, dass S. aureus Fibronektin-Bindeproteine (FnBPs) maßgeblich für die Adhärenz und Invasion des Erregers in Endothelzellen sind. Die Invasion erfolgt über eine indirekte Bindung an α5β1-Integrine, invasive Eigenschaften finden sich in nahezu allen klinischen Isolaten. In verschiedenen Tiermodellen konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen der Expression von FnBPs und der Dissemination von S. aureus in andere Organe gezeigt werden. Bislang ist jedoch nicht untersucht, welche Auswirkung die S. aureus-Infektion auf die Endothelbarriere hat und welche Mechanismen für die Translokation des Erregers verantwortlich sind.
In dieser Arbeit wurde analysiert, ob die Infektion mit S. aureus- und S. carnosus-Stämmen in vitro zu einer Schädigung der endothelialen Integrität von EA.hy926-Zellen führt. Hierzu wurden Änderungen der transendothelialen Impedanz und der Endothelpermeabeabilität nach Infektion im xCELLigence- bzw. Transwell-System erfasst. Zytotoxische Effekte wurden durch Kristallviolettfärbungen, immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen der Mitochondrien und Nuklei sowie die Erfassung der hypodiploiden Zellkerne mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Zur Entschlüsselung des molekularen Mechanismus wurden Veränderungen der Adherens und Tight Junction-Proteine ZO-1 und VE-Cadherin in der Immunfluoreszenz untersucht. Die Rolle von Src-Kinasen wurde durch pharmakologische Inhibition analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass FnBP-exprimierende S. aureus-Stämme eine Abnahme der transendothelialen Impedanz verursachen und dass es 4 und 24 Stunden nach Infektion zu einer signifikanten Zunahme der Endothelpermeabilität kommt. Zytotoxische Effekte auf die Endothelzellen durch die Infektion traten nach 24 Stunden auf, jedoch nicht nach 4 Stunden. VE-Cadherin und ZO-1 zeigten 4 Stunden nach Infektion eine FnBP-abhängige Konformationsänderung und Reduktion der Signalintensität. Außerdem konnte demonstriert werden, dass die Inhibition von Src-Kinasen den Anstieg der Endothelpermeabilität signifikant reduziert.
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal belegt, dass S. aureus FnBPs eine Erhöhung der Endothelpermeabilität bewirken. Während hierfür zu späten Zeitpunkten Apoptose verantwortlich ist, muss nach 4 Stunden ein anderer Mechanismus ursächlich sein. Da es zu einer Abschwächung der ZO-1- und VE-Cadherin-Signalintensität in der Immunfluoreszenz kam, ist anzunehmen, dass Adherens und Tight Junctions durch die Infektion geschädigt werden. Es ist bekannt, dass Src-Kinasen durch die Infektion mit S. aureus aktiviert werden. Außerdem sind sie elementar für die Regulation der Endothelpermeabilität und vermitteln diesen Effekt unter anderem über eine Phosphorylierung von Adherens und Tight Junction-Proteinen. Eine Src-vermittelte Phosphorylierung von Zell-Zell-Verbindungsproteinen wäre daher eine mögliche Erklärung für die beobachteten Veränderungen von ZO-1 und VE-Cadherin. Dieser Mechanismus könnte Wegbereiter für die parazelluläre Passage über die Endothelbarriere sein. Darüber hinaus könnte die erhöhte Endothelpermeabilität den Zugang zur Extrazellulärematrix und zum größten Pool an Fibronektin und Integrinen ermöglichen und so die Invasion und Transzytose begünstigen. Die hier gewonnenen Ergebnisse tragen dazu bei, die komplexe Interaktion zwischen S. aureus und dem Endothel und somit wichtige Schritte in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen besser zu verstehen und neue Zielstrukturen für therapeutische Interventionen zu identifizieren.
Neisseria meningitidis ist ein wichtiger Erreger von Meningitis und Sepsis insbesondere bei jungen Menschen, gleichzeitig sind hohe Raten asymptomatischen Trägertums bekannt. Als die Virulenz begünstigende Faktoren wurden unter anderem die Kapsel, Pili, äußere Membranvesikel (OMV) und Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert, die es dem Erreger erleichtern, das menschliche Immunsystem zu überwinden.
Dabei war bisher die Rolle von Neutrophil Extracellular Traps (NETs) als neu beschriebene Komponente der angeborenen Immunantwort nicht untersucht worden. NETs stellen spinnennetzartige DNA-Strukturen mit globulären Proteindomänen dar, die aus neutrophilen Granulozyten entstehen und als antimikrobiell gelten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von NETs auf Meningokokken zu charakterisieren und mögliche Resistenzmechanismen der Bakterien zu identifizieren.
In den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass Meningokokken an NETs binden und durch diese in ihrer Proliferation gehemmt werden. Eine Lokalisation der Bakterien an die NETs konnte dargestellt werden, LPS und Pili wurden als wichtige Strukturen für die Vermittlung der NET-Bindung identifiziert. OMVs zeigten sich als protektiv gegenüber dem Einfluss der NETs, indem sie die Bindung der Erreger an die NETs blockierten.
Wenig empfindlich zeigten sich die Bakterien gegenüber Histonen als den quantitativ bedeutsamsten NET-Proteinen. Meningokokken schützen sich gegenüber dem Einfluss der NETs durch Ausbildung von Kapsel und LPS mit intakter Phosphoethanolamin-Modifikation. Ebenso vermitteln zwei Cathelicidin-Resistenzgene den Bakterien einen Überlebensvorteil. Keine Rolle bei der NET-Resistenz spielten die untersuchten Effluxmechanismen.
Neuere Untersuchungen von Lappann et al. indentifizierten Meningokokken und OMVs als potente NET-Induktoren. Damit könnten durch die relativ NET-resistenten Mikroorganismen andere Abwehrmechanismen der Neutrophilen konterkariert werden und eine Immunevasion begünstigt werden. Genauere Untersuchungen diesbezüglich stehen noch aus.
Neisseria meningitidis, Auslöser der Meningokokken-Meningitis und Sepsis, trägt auch heute noch zur hohen Kindersterblichkeit in Entwicklungsländern bei und sorgt, vor allem im afrikanischen Meningitis-Gürtel, immer wieder für Epidemien mit gravierenden Folgen für die Betroffenen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei an der Pathogenität von N. meningitidis beteiligte Proteine, der Transkriptionsregulator FarR und der Transportkanal HrpB, näher charakterisiert, um weitere Einblicke in die immer noch nicht vollständig entschlüsselte Pathogenese der Meningokokken-Meningitis zu erhalten. Das Neisseria adhesin A NadA ist Bestandteil der sich aktuell in der Entwicklung befindenden Impfung gegen Meningokokken der Serogruppe B. Im dem bekapselten B-Stamm MC58 wurde gezeigt, dass nadA unter der negativen Kontrolle des Transkriptionsregulators FarR steht (Schielke et al., 2009). In den ebenfalls zur Gattung Neisseria gehörenden Neisseria gonorrhoeae (Ng) wurde bereits 2001 ein FarR-Homolog beschrieben (Shafer et al., 2001). NgFarR ist an der Resistenz gegenüber antimikrobiellen, langkettigen Fettsäuren beteiligt, indem es die Expression des FarABEffluxpumpen-Systems reguliert, welches eingedrungene Fettsäuren wieder nach extrazellulär befördert. Dagegen zeigten Palmitinsäure-Resistenztests, dass FarR nicht an der intrinsischen Fettsäure-Resistenz der Meningokokken beteiligt ist. Die Deletion und die Komplementierung von farR hatten weder in bekapselten noch in unbekapselten Meningokokken Einfluss auf das normale Wachstumsverhalten. Ein Western Blot- Nachweis des FarR-Proteins in der frühen, mittleren und späten exponentiellen Wachstumsphase von Wildtyp, Kapsel-Deletionsmutante und farR-Komplementante zeigte, dass die Menge an FarR im zeitlichen Verlauf kontinuierlich zunimmt und FarR damit Wachstumsphasen-abhängig exprimiert wird. Dabei scheint es einer posttranskriptionalen oder posttranslationalen Regulation zu unterliegen, da auch in dem farRkomplementierten Stamm unabhängig vom farR-Promotor eine entsprechende Hochregulation stattfindet. In Infektionsversuchen wurde die Interaktion zwischen Meningokokken und humanen polymorphkernigen Granulozyten untersucht. In den Infektionsassays wurde die farRDeletionsmutante innerhalb des dreistündigen Versuchsrahmens deutlich stärker durch die Granulozyten abgetötet als der Serogruppe B-Wildtyp. Als Mitglied der in Bakterien und Archaeen weit verbreiteten Familie der MarR-Transkriptionsregulatoren (Multiple antibiotic resistance Regulator, MarR) bindet FarR mit hoher Wahrscheinlichkeit auch als Homodimer an seine Bindesequenz auf der DNA. FarR erkennt eine 16 bp lange, palindromische Sequenz in der Promotorregion von nadA (NMB1994), wodurch die nadA-Expression verhindert wird. Außerdem erkennt FarR eine ähnliche Bindesequenz im Promotorbereich von farAB (NMB0318/0319), wobei es aber keinen regulatorischen Einfluss ausübt. Mit einer aus diesen beiden Bindestellen berechneten minimalen Bindesequenz wurde im Genom von MC58 weitere mögliche Bindepartner detektiert. Eine Auswahl dieser möglichen Bindestellen wurde in Electrophoretic Mobility Shift Assays auf eine direkte Interaktion mit dem FarR-Protein hin untersucht, wobei sich allerdings keine direkte Bindung nachweisen ließ. Diese Ergebnisse darauf hin, dass der Transkriptionsregulator FarR hoch spezifisch bestimmte DNA-Bindesequenzen erkennt und die entsprechenden Gene reguliert. In der Promotorregion des TpsB-Proteins HrpB wurde in den sequenzierten Referenzstämmen Z2491, MC58, FAM18 und α14 eine mit der minimalen FarR-Bindesequenz kompatible Sequenz gefunden. In Electrophoretic Mobility Shift Assays konnte allerdings gezeigt werden, dass FarR nicht direkt daran bindet. Um das Transport-Protein HrpB näher zu charakterisieren, wurde das entsprechende Gen in 22 N. meningitidis-Isolaten sequenziert. Dabei zeigte sich, dass das Transportprotein hrpB in allen untersuchten invasiven und nicht-invasiven Stämmen vorhanden ist. Dieses äußerst konservierte Protein weist nur im seinem C-terminalen Bereich eine relativ variable Region auf, was vermutlich auf Rekombinationsereignisse zurückzuführen ist. Ein Alignment der Aminosäure-Sequenz des Serogruppe C-Stamms FAM18 mit der des homologen Bordetella pertussis TpsB-Proteins FhaC zeigte, dass die dreidimensionale Struktur des HrpB ebenfalls eine α-Helix, eine transmembranöse Domäne und variable extrazelluläre Loops enthält. Zusammengenommen erfüllt HrpB somit wichtige Bedingungen, um als Vakzine-Bestandteil in Betracht gezogen zu werden.
Durch die Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation erhöht sich das Risiko für opportunistische Infektionen wie invasive Aspergillose (IA). IA wird hauptsächlich durch den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus, der durch die Luft übertragen wird, verursacht. Deshalb haben Erkennung und Therapie von IA in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung erlangt. Für eine erfolgreiche Behandlung sind die Mechanismen des Immunsystems nach Kontaktaufnahme mit dem Pathogen von zentraler Bedeutung. Die Erstinfektion mit A. fumigatus findet in der Lunge statt. Als Bewohner der Alveolen wurden deshalb dendritische Zellen (DCs) auf ihre Fähigkeiten hin untersucht, das Immunsystem anzuregen. DCs besitzen vor allem die wichtigen Aufgaben, das Immunsystem zu modulieren und T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen. Ein Großteil dieser Arbeit befasst sich mit der Analyse des Einflusses des Immunsuppressivums 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf neutrophile Granulozyten und auf die in vitro Generierung von moDCs sowie deren Fähigkeit mit dem Pathogen A. fumigatus zu interagieren. RAD bindet an das zytosolische FK506 bindende Protein (FKBP12), wodurch die Kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibiert und somit die T-Zellantwort unterdrückt wird. Klinische Anwendung findet RAD bereits, um eine Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation zu erhalten. Der oxidative Burst neutrophiler Granulozyten war nach RAD-Behandlung und Konfrontation mit A. fumigatus signifikant verringert. Die Generierung der moDCs aus Monozyten erfolgte über 7 Tage, wobei ab dem Tag der Isolation der Monozyten 10 nM RAD oder EtOH zur Kontrolle hinzugegeben wurde. RAD zeigte vielfältige Effekte auf die Immunfunktion dendritischer Zellen. Obwohl sich keine Änderung in der Differenzierung der moDCs fand, was durch die Oberflächenmarker CD1a+, CD14- und HLA-DR+ überprüft wurde, zeigte sich eine signifikante Reduktion der Rezeptoren TLR4 und Dectin-1 sowie der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD83 und CD86. Nach Konfrontation mit A. fumigatus verblieb CD40 unter RAD Behandlung signifikant reduziert, während CD83 genau dieses Schema als Trend aufwies. Ferner wies CD86 sowohl in der Kontrolle als auch mit RAD-Behandlung die gleiche Expression auf. Nach 6 h Konfrontation der moDCs mit A. fumigatus waren die Zytokine IL-12, TNF-α und CCL20 auf Genexpressionsebene unter RAD reduziert, was sich auf Proteinebene teilweise bestätigen ließ, da sich hier erst nach 12 h eine signifikante Reduktion von IL-12, TNF-α und CCL20 in RAD-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zeigte. Des Weiteren war das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 signifikant reduziert. Die Phagozytose sowohl von FITC-Dextran-Beads als auch von A. fumigatus Konidien und zugleich die Schädigung von A. fumigatus Keimschläuchen war in unreifen RAD-behandelten moDCs signifikant reduziert. Ob moDCs, die mit RAD behandelt wurden, schlechter in der Lage waren, CD8+-T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, geht nicht mit Sicherheit aus dieser Studie hervor, da große spenderabhängige Unterschiede auftraten. Es wurde zudem ein Vergleich von in vitro aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) und myeloiden DCs (mDCs) angefertigt. Mittels eines home-made Microarrays, der vor allem Gene mit einschloss, die für Zytokine und Rezeptoren von Immunzellen kodieren, konnten in einem Modell der frühen IA in der Lunge differentiell regulierte Gene nach Konfrontation mit A. fumigatus identifiziert werden. Es wurden insgesamt 30 Gene mehr als 2-fach reguliert, wie zum Beispiel die Interleukine und Chemokine IL-1β, IL-8, CXCL2, CCL3, CCL4 und CCL20, der Immunrezeptor PTX3 und der Transkriptionsfaktor Nf-κB. Generell konnte beobachtet werden, dass moDCs mehr regulierte Gene aufwiesen als mDCs. Zuletzt wurde betrachtet, ob der Knock-down von CXCL10, dessen Fehlen ein erhöhtes Risiko für IA nach sich zieht, einen Einfluss auf moDCs hat, so dass sie schlechter auf A. fumigatus reagieren können. Diese Hypothese konnte in dieser Studie nicht bestätigt werden, da kein Unterschied in der Zytokinproduktion oder Expression kostimulatorischer Moleküle zwischen Kontroll-moDCs und moDCs, in denen das CXCL10-Gen ausgeschaltet wurde, festgestellt werden konnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die Microarray-Analyse wichtige Gene in moDCs und mDCs identifizierbar waren, die nach Konfrontation mit A. fumigatus reguliert wurden. Zudem fanden sich lediglich minimale Unterschiede zwischen artifiziellen DCs und myeloiden DCs, die direkt aus dem Körper isoliert wurden. Eine Behandlung mit RAD erhöht das Risiko eines Patienten an invasiver Aspergillose zu erkranken unabhängig von der Eigenschaft des RAD, die Proliferation von T-Lymphozyten zu inhibieren.
Wie das pathogene Bakterium Neisseria meningitidis kolonisiert auch Neisseria lactamica als Kommensale den oberen Nasopharynx des Menschen. Penicillin G ist ein first-line-Therapeutikum gegen Meningokokkeninfektionen. Reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin wird bei Meningokokken durch Mutationen im penA-Gen verursacht. Horizontaler Gentransfer zwischen den verschiedenen Neisseria spp. wurde auch für das penA-Gen beschrieben. Ziel dieser Arbeit war daher eine phänotypische und genotypische Analyse der Penicillinresistenz von N. lactamica. Aus den Versuchen sollten Prognosen über die zukünftige Resistenzentwicklung von Meningokokken abgeleitet werden. Die phänotypische Analyse von 123 N. lactamica-Stämmen (MIC [Minimum inhibitory concentration]-Bereich: 0,064 – 2,0 µg/ml, Median: 0,38 µg/ml) und 129 N. meningitidis- Stämmen (MIC-Bereich: 0,016 – 0,25 µg/ml, Median: 0,064 µg/ml) zeigte signifikant höhere MIC-Werte gegenüber Penicillin G bei den N. lactamica-Stämmen als bei den untersuchten Meningokokken. Bei Meningokokken sind Polymorphismen (fünf spezifische Mutationen betreffend) im penA-Gen (kodiert für das PBP2 (penicillin binding protein 2)) für verminderte Penicillinsensibilität verantwortlich, weshalb der betroffene Abschnitt des penA-Gens in allen N. lactamica-Stämmen und N. meningitidis-Stämmen untersucht und mit den bekannten Allelen der penA-Datenbank verglichen wurde. Bei den 123 N. lactamica-Stämmen konnten 60 verschiedene penA-Allele nachgewiesen werden, wovon 51 neu in die internationale penA-Datenbank eingefügt werden konnten. Im Gegensatz zu Meningokokken trugen die N. lactamica-Stämme entweder drei oder fünf der für intermediär resistente Meningokokken charakteristischen Mutationen im penA-Gen. N. lactamica-Stämme mit fünf Mutationen (MIC-Bereich: 0,25 – 2,0 µg/ml, Median: 0,5 µg/ml) zeigten signifikant höhere MIC-Werte als Stämme mit drei Mutationen (MIC-Bereich: 0,064 – 0,38 µg/ml, Median: 0,125 µg/ml), aber auch als Meningokokken mit fünf Mutationen (MIC-Bereich: 0,064 – 0,25 µg/ml, Median: 0,125 µg/ml). Eine phylogenetische Analyse aller in der penA-Datenbank hinterlegten Allele zusammen mit den 51 neuen dieser Studie ergab, dass die Allele mit fünf Mutationen unabhängig von der Spezies eine gemeinsame phylogenetische Linie bildeten, während sowohl die Allele mit drei Mutationen (N. lactamica) als auch die ohne Mutationen (N. meningitidis) jeweils eine separate phylogenetische Gruppe formten. Im Rahmen von in vitro-Transformationen mit chromosomaler DNA von N. lactamica konnte der MIC-Wert des Penicillin-sensiblen Meningokokkenstamms 14 in einem single-step-Ereignis durch Übernahme des betreffenden penA-Gens von N. lactamica erhöht werden. Allerdings konnten nur MIC-Werte erreicht werden, die mit intermediär-sensiblen Meningokokken vergleichbar waren und somit weit unter den MIC-Werten der benutzten N. lactamica-Stämme lagen. Dieser Befund legt nahe, dass erhöhte MIC-Werte bei N. lactamica wie auch bei Meningokokken mit Mutationen in der Transpeptidaseregion des PBP2 assoziiert sind. Jedoch sind die im Vergleich zu Meningokokken generell höheren MIC-Werte bei N. lactamica auf andere Faktoren zurückzuführen, die bei N. lactamica eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin bedingen. In den in vitro-Experimenten der vorliegenden Studie konnten diese Faktoren nicht auf Meningokokken übertragen werden. Demnach kann eine Co-Kolonisation mit N. lactamica zwar die MIC-Werte von Meningokokken erhöhen, das Erreichen von bei N. lactamica beobachteten Resistenzniveaus ist allerdings auf diesem Wege nicht möglich. Es ist somit nicht zu befürchten, dass Meningokokken – wie bei Pneumokokken beobachtet – über kommensale Spezies der gleichen Gattung eine massive Reduktion der Empfindlichkeit gegenüber Penicillin entwickeln werden.
Neisseria meningitidis ist mit jahrlich etwa 700.000 Erkrankungsfallen weltweit und einer Mortalitat von circa 7% einer der häufigsten Ausloser der bakteriellen Hirnhautentzündung. Der entscheidende Schritt zur Auslosung einer Meningitis ist die Uberwindung der Blut-Hirn-Schranke. Diese im menschlichen Korper einmalig dichte Barriere wird maßgeblich durch Tight-Junctions spezialisierter Endothelzellen der Hirnkapillaren aufrecht erhalten. Ob N. Meningitidis diese Barriere auf einem parazellulären oder transzellulärem Weg uberwindet, ist nicht vollstandig geklart. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von N. meningitidis auf die Tight-Junction Proteine Occludin und ZO-1 unter Nutzung des HBMEC Zellkulurmodelles untersucht. Neben einer verminderten Genexpression von Occludin zeigte sich dabei eine Abspaltung eines 50 kDa Fragmentes von Occludin. Gleichzeitig konnte eine Umverteilung von Occludin von den Zellgrenzen in das Zytoplasma beobachtet werden. ZO-1 hingegen wurde weder in seiner Exprimierung, noch in seiner intrazellularen Verteilung beeinflusst. Mittels eines in dieser Arbeit etablierten Assays zur Bestimmung der Permeabilitat eines HBMEC-Monolayer als vereinfachtes in-vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke konnte bestatigt werden, dass durch die Beeinflussung von Tight-Junction Proteinen die parazellulare Permeabilitat steigt. In weiteren Analysen konnten diese Prozesse auf eine gesteigerte Aktivitat von Matrixmetalloproteinase 8 zurückgefuhrt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuen Mechanismus auf, durch den N. meningitidis im Stande ist, die-Hinr-Schranke auf einem parazellulärem Weg zu überwinden.
Hintergrund: Zunehmend wird der Eigenschaft von Staphylococcus aureus als fakultativ intrazellulärem Erreger Bedeutung zugemessen. Ein direkter Nachweis der in vivo Relevanz von fakultativ intrazellulärem S. aureus bleibt allerdings bisher aus. Der Mechanismus zellulärer Invasivität ist bekannt und korreliert mit verschiedenen molekularen Markern (spa-Typ, SCCmec-Typ und pls/Pls). In dieser Studie wurde die Zuverlässigkeit und Ausweitbarkeit dieser Marker getestet. Des Weiteren wurde überprüft, ob sich die zelluläre Invasivität von kolonisierenden und Infektions-assoziierten MRSA-Isolaten unterscheidet und, ob die alleinige Bestimmung molekularer Marker in vitro die Virulenz eines Isolats in vivo abzuschätzen vermag. Methoden:Insgesamt wurden 109 MRSA-Isolate gesammelt, molekular charakterisiert (spa-Typ, BURP-Analyse, SCCmec-Typ, pls, agr-Typ, Hämolyseverhalten) und das Potential zellulärer Invasivität in vitro ermittelt. Die Assoziation eines Isolates mit einer Infektion in vivo wurde nachverfolgt (93 Kolonisierer versus 16 Infektions-assoziierte-Isolate). Zusätzlich wurde eine Referenzgruppe aus 13 S. aureus-Isolaten etabliert, die klinisch mit vergleichsweise invasiven Infektionen assoziiert waren (12 Osteomyelitis-Isolate und 1 Endokarditis-Isolat). Ergebnisse: Die bekannten molekularen Marker zellulärer Invasivität korrelieren zuverlässig in einer Population klinischer MRSA-Isolate und lassen sich auch auf bisher nicht bekannte (spa- und SCCmec-) Typen ausweiten. Das Hämolyseverhalten korrelierte nicht mit der zellulären Invasivität. Der agr-Typ wurde als weiterer molekularer Marker identifiziert. Die zelluläre Invasivität war unabhängig von der Etablierung einer Infektion in vivo (mediane Invasivität der Kolonisierer 100% versus 108% der Infektions-assoziierten Studienisolate und 110% der externen Referenzisolate). Des Weiteren waren die molekularen Marker spa- und agr-Typ nicht in der Lage, die Virulenz eines MRSA-Isolats in vivo abzuschätzen. Diskussion: Die zelluläre Invasivität klinischer MRSA-Isolate korreliert zuverlässig mit molekularen Markern. Allerdings vermögen weder die zelluläre Invasivität, noch mit ihr assoziierte molekulare Marker die Etablierung einer Infektion in vivo vorherzusagen. Beide scheinen also als Surrogat-Parameter zur Abschätzung der klinischen Virulenz eines Isolats ungeeignet. Zur Klärung der Frage, ob molekulare Marker zellulärer Invasivität in anderen Abschnitten der Pathogenese von S. aureus- Infektionen eine Rolle spielen, bedarf es weiterer Studien.
Echinococcus multilocularis besitzt als Lebergewebe - infiltrierender Parasit und Erreger der Alveolären Echinokokkose evolutionär konservierte Faktoren des TGF-β / BMP Signalsystems, die im Konzept der hormonellen Wirt - Parasit Kreuzkommunikation nicht nur hinsichtlich des Wirts - Einflusses auf die Entwicklung des Parasiten sondern auch umgekehrt in Bezug auf Immunantwort und Physiologie des Wirts eine mögliche regulierende Funktion besitzen. Die vorliegende Arbeit befasst sich primär mit den Auswirkungen von TGF-β / BMP Signaling auf den Fuchsbandwurm E. multilocularis. Dazu wurde zunächst durch Immunlokalisation das Vorliegen aller Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren während einer natürlich aufgetretenen Alveolären Echinokokkose überprüft, sowie die funktionelle Interaktion von EmRSK3 und EmRSK4 mit humanem TGF-β1 in vitro nachgewiesen. Mit Hilfe von humanen Zytokinen (BMP2 und TGF β1) und Rezeptor - spezifischen Inhibitoren (SB431542, Dorsomorphin und LY364947) wurde die Rolle von TGF β / BMP Signaling in Bezug auf Vitalität, Wachstum, Differenzierung und Regeneration von E. multilocularis in verschiedenen Stadien untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von humanem BMP2 und von SB431542 auf die Genexpression in E. multilocularis analysiert. Die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation durch Echinokokken Faktoren des TGF-β / BMP Signaling wurde ebenfalls adressiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren in vitro durch sekretierte Faktoren aus Metazestoden aktiviert werden können. Auf Basis von Genomsequenzierungsdaten wurden zudem weitere Komponenten des TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis, wie die bisher unbekannten TGF β / BMP Homologe EmBMP2 und EmAct, die Noggin-like Homologe EmNlg1 und 2, ein I-Smad (EmSmadF) sowie ein zweiter BR-Smad (EmSmadE) identifiziert, strukturell charakterisiert und die jeweilige Genexpression in verschiedenen Stadien überprüft. EmSmadE wurde zudem in weiterführenden Studien funktionell charakterisiert. Fragestellungen bezüglich der Spezifität, Funktionalität und Möglichkeit der konstitutiven Aktivierung von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis wurden auf Basis von EmSmadA, EmRSK3 und EmRSK3b in weiteren molekularbiologischen Studien untersucht und dienen dem tieferen Verständnis von TGF-β / BMP Signaling. In der vorliegenden Arbeit konnten damit alle grundlegenden Faktoren von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis identifiziert werden und es wurden erstmals die eindeutige Sensierung von Wirts TGF-β / BMP Zytokinen durch Metazestoden sowie die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation über Echinokokken TGF-β / BMP Faktoren belegt. Zusätzlich deuten die neu identifizierten potenziell sekretierten TGF-β / BMP Faktoren auf eine mögliche Beeinflussung von Physiologie und Immunantwort des Wirts durch Echinokokken TGF-β / BMP Zytokine hin.
In dieser Arbeit wurde das in vitro Wachstumsverhalten ausgesuchter MRSA in Konkurrenz zu Bakterien der Standortflora unter Optimalbedingungen und unter Mangelbedingungen getestet. Es lässt sich für alle getesteten MRSA-Stämme zusammenfassend sagen, dass ihre klinische Prävalenz nicht mit dem Wachstum in vitro korreliert, d.h. das häufige Spa-Typen nicht besser unter unseren Versuchbedingungen gewachsen sind als seltene. In vitro konnte kein verdrängendes Wachstum des Methicillin sensiblen S. aureus gegenüber den resistenten Stämme beobachtet werden. Vielmehr gelingt es den MRSA-Stämmen, ein Wachstumsgemisch zu ihrem Vorteil zu beeinflussen, indem sie die getesteten anderen Mikroorganismen (S. epidermidis, S. cerivisiae) im Wachstum hemmen, mit Ausnahme von E. faecium. Die Arbeit beleuchtet die Schwierigkeiten der Identifizierung von probiotischen Arten zur Verdrängung eines MRSA. In Zukunft sollte vielleicht an der Optimierung von in vitro Systemen gearbeitet werden (in vitro Organkulturen) oder Tiermodelle verwendet werden. Den Transmissionsunterschieden und der Tenazität sind weiterhin Aufmerksamkeit zu widmen. Wie in der Literatur beschrieben ist es zum Verständnis des Wachstumsverhal-tens der resistenten Stämme wichtig zu wissen, auf welchen molekularbiologischen Grundlagen die Resistenz beruht, da eine einzelne Site-Mutation zusätzliche Resistenzen bedeuten und einen eventuellen Wachstumsnachteil wieder ausgleichen kann. Im Klinikalltag scheinen sich die MRSA-Stämme auszubreiten, die den Wachstumsnachteil bereits ausgeglichen haben, beziehungsweise deren Methicillinresistenz keinen Wachstumsnachteil bedeutet.
OatC ist die O-Acetyltransferase von Serogruppe C Meningokokken. Sie katalysiert die O-Acetylierung der Sialinsäurekapsel. Das Enzym konnte vor Beginn dieser Arbeit keiner bekannten Gruppe von Enzymen zugeordnet werden. Durch in vivo-Versuche und in vitro-Studien sollten weitere Erkenntnisse zu Lage und Struktur des aktiven Zentrums von OatC gewonnen werden. Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Teilen: 1. Es sollte eine Meningokokken-Mutante mit einer Deletion des oatC -Gens hergestellt werden. 2. Das oatC -Gen sollte schrittweise verkürzt und in trans auf dem pAP1His Vektor in die oatC-Deletionsmutante eingebracht werden. 3. Gerichtete Mutagenese von Histidinresten, Serin 286 und Aspartat 376 sollte Aussagen über die in vivo-Relevanz der Aminosäuren ermöglichen. Die Mutanten wurden im ELISA auf Ihren O-Acetylierungsstatus hin überprüft. Die oatC -Deletionsmutante war erwartungsgemäß negativ. Bereits die erste Verkürzung von OatC um 16 Aminosäuren führte zu einem vollständigen Verlust der O-Acetylierung, der Austausch der Aminosäuren Histidin 399, Serin 286 und Aspartat 376 durch gerichtete Mutagenese ebenfalls. Wir spekulieren, dass der Verlust des C-Terminus zu einer veränderten Proteinfaltung führt oder eine katalytische Funktion des Histidin 456 eliminiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass OatC der Gruppe der α/β-Hydrolasen zugeordnet werden kann (s. a. Bergfeld et al. 2009). Das katalytische Zentrum besteht aus Serin 286, Aspartat 376 und Histidin 399. Der Bereich um Histidin 456 beeinflusst die Funktion erheblich.
Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Trägertum im Nasenrachenraum ist entscheidend für die Übertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Frühere Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilmähnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell für das Trägertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, während bisher keine Proteomanalysen durchgeführt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschläuchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse über 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse über 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit überwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verstärkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn möglich, mit spezifischen Antikörpern abgesichert. Die Expression von ungefähr 2 % aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Veränderungen beobachtet, die mit einem Nährstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden können. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erhöht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zurückzuführen ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell für Biofilmwachstum, nicht aber für planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator für metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte über die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adhäsine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden.
Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen.
Die Bedeutung des Zwei-Partner-Sekretionssystems für die Adhärenz von Meningokokken an Epithelzellen
(2009)
Das two-partner secretion-system (TPS-System) ist ein unter Gram-negativen Bakterien weit verbreiteter Weg der Proteinsekretion. Die als TpsA bezeichneten Exoproteine des TPS Systems benötigen ein spezifisches Partnerprotein (genannt TpsB) in Form eines kanalbildenden Transporters. Im sequenzierten Genom des Meningokokkenstammes MC58 finden sich fünf putative tpsA Gene, die als hemagglutinin/hemolysin-related protein (hrps) bezeichnete werden. Neben MC58 finden sich auch in den anderen sequenzierten Meningokokkenstämmen (FAM18, Z2491, alpha14) hrps. Diese weisen N-terminal Homologien zum filamentösen Hämagglutinin (FHA) von B. pertussis auf, das als TpsA-Protein des two-partner-secretion-system (TPS) aus der Zelle transportiert wird. In dieser Arbeit werden die hrps als hrpA Gene bzw. HrpA-Proteine bezeichnet. Alle sequenzierten Meningokokkenstämme verfügen über tpsB homologe Gene (hrpB), die jeweils in enger Nachbarschaft zu den hrpA Genen zu finden sind. Das Vorhandensein von hrpA und hrpB Genen deutet darauf hin, dass auch Meningokokken über ein funktionales TPS-System verfügen. Bei einer Dot-Blot-Analyse von 830 Meningokokkenstämmen aus einer bayerischen Trägerstudie mit Sonden spezifisch für die C-terminalen Bereiche der im Stamm MC58 gefundenen hrpA Gene hybridisierten 80% der ausgewerteten Stämme mit mindestens einer der Sonden. Stämme der hypervirulenten klonalen Komplexen (ST-8, ST-11, ST32, ST-44) zeigten sogar in über 99% eine positive Reaktion. Dagegen wiesen die nicht-hypervirulenten klonalen Komplexe zu 29% im Dot Blot kein hrpA auf, das homolog zu den hrpA Genen von Stamm MC58 ist, wobei es sich hierbei mehrheitlich (82%) um cnl Stämme handelte, so dass sich nur in 10% der untersuchten Kapsel-null-locus-Stämme (cnl) ein zu den hrpA Genen von MC58 homologes Gen nachweisen ließ. Mit der Hypothese, dass auch diese Stämme ein hrpA besitzen, welches sich im C-terimalen Anteil von denen des MC58 unterscheidet wurden in dieser Arbeit Dot Blots durchgeführt, deren Sonde spezifisch für das hrpB NMC0443 war. 97,6% der mit dieser Sonde untersuchten Stämme zeigten die Anwesenheit eines hrpB Homologs. Um die Vermutung zu bestätigen, dass allen hrpB Genen ein zugehöriges hrpA Gen benachbart liegt, wurden repräsentativ PCRs von häufigen klonalen Komplexen durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass ein TPS-System sowohl in den hypervirulenten als auch den nicht-hypervirulenten klonalen Komplexen der Meningokokken vorkommt. Die vielfältigen Funktionen von bereits untersuchten TpsA Proteinen sind zumeist mit der Pathogenität der Bakterien assoziiert. In dieser Arbeit wurde ein möglicher Einfluss der HrpA Proteine auf die Adhäsion der Bakterien an humane Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl eine kapsellose, als auch eine kapsellose, LPS-trunkierte hrpA Deletionsmutante signifikant schlechter an Epithelzellen adhäriert als die parentalen Vergleichsstämme. Ebenso zeigten die analog durchgeführten Infektionsversuche mit der hrpB Deletionsmutante einen Adhärenzverlust, der jedoch nur für die unbekapselte und LPS trunkierte hrpB Deletionsmutante signifikant war. In dieser Arbeit ist es gelungen das HrpB Protein des Stammes 2120 in E. coli zu exprimieren und aufzureinigen, sodass die Entwicklung eines gegen HrpB gerichteten Antikörpers in Auftrag gegeben werden konnte. Mit Hilfe dieses Antikörpers sollen noch offene Fragen zur Synthese und dem Transport des HrpB Transportproteins beantwortet werden. Außerdem können weitere Untersuchungen zur Lage und Verteilung der HrpBs in der Meningokokkenmembran dazu beitragen, weiteren Aufschluss über die Komplexität von Pathogenität und Virulenz von N. meningitidis zu geben.
Staphylococcus aureus reagiert auf veränderte Umweltbedingungen wie Hitze, pH und Chemikalien mit Hilfe globaler Regulatoren wie dem Sae (S. aureus exoprotein expression) Zweikomponenten-System. Subinhibitorische Konzentrationen einiger Antibiotika können die Expression von Virulenzfaktoren erhöhen. In dieser Arbeit wurde die Stressantwort von S. aureus auf subletale Konzentrationen des geläufigen Desinfektionsmittels Perform® untersucht. Dazu wurden biochemische Methoden wie SDS-PAGE und Massen-Spektrometrie sowie molekularbiologische Methoden wie qRT-PCR und Promotoraktivitäts-Assays eingesetzt. Davon abhängige, funktionelle Veränderungen wurden in durchfluss-zytometrischen Invasions-Assays analysiert. Perform wirkt durch die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Das Wachstum von S. aureus in Medien mit subletalen Konzentrationen von Perform verringerte in den Stämmen 6850, COL und ISP479C die Expression mehrerer Proteine, wohingegen im Stamm Newman eine gesteigerte Expression mehrerer Proteine festgestellt werden konnte. In der Literatur werden diese vermehrt exprimierten Proteine als sae-abhängig beschrieben. Der Effekt von Perform konnte durch das im Desinfektionsmittel enthaltene Detergenz SDS nachgeahmt werden, jedoch nicht durch Paraquat oder weitere Detergenzien wie Triton X-100 oder Tween 20. Eine Solubilisierungsreaktion durch die Detergenz-Wirkung konnte ausgeschlossen werden, da der beobachtete Effekt von lebenden Bakterien abhängt. Für Eap (extracellular adherence protein) konnte die deutlichste Steigerung der Proteinexpression festgestellt werden und eine Transkriptionsanalyse bestätigte die gesteigerte Eap-Expression. Die Promotoraktivität des sae Promotors P1 wurde sowohl durch Perform als auch durch SDS verstärkt. Die Anwesenheit von Perform und SDS hatte auch funktionelle Änderungen zur Folge: In durchflusszytometrischen Experimenten erhöhte sich beispielsweise die Invasivität auf das 2,5- bzw. 3,2-fache und die beobachteten Unterschiede konnten durch Lysostaphin Protektions Versuche bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Invasivität in Stamm Newman von Eap und dem sae-System abhängig war, während agr, sarA, sigB und FnBPs keinen entscheidenden Einfluss auf die Invasivität hatten. In dieser Arbeit wurde außerdem aufgedeckt, dass die Besonderheit des Stammes Newman durch eine Mutation in saeS (Sensor-Histidinkinase) bedingt war. Obwohl postuliert wird, dass diese Punktmutation ein konstitutiv aktiviertes sae System zur Folge hat, konnte die hohe sae Aktivität durch Perform und SDS jedoch noch weiter gesteigert werden. Durch den Austausch des gesamten sae-Operons konnte gezeigt werden, dass sich der Stamm Newman saeISP479C wie der Stamm ISP479C, und der Stamm ISP479C saeNewman sich analog zu Stamm Newman verhielt. Zusammenfassend kann aus den vorliegenden Ergebnissen geschlussfolgert werden, dass ein Aminosäurenaustausch in der Sensor-Histidinkinase SaeS des Stammes Newman verantwortlich für die gesteigerte Expression von Eap und die daraus resultierende gesteigerte Invasivität nach der Inkubation mit subletalen Konzentrationen von Perform und SDS ist. Diese Daten können dazu beitragen, die Virulenzmechanismen im Stamm Newman, speziell die Rolle des Sae-Systems, aber auch die der generellen Regulation, besser verstehen zu können.
Parodontitis ist eine Erkrankung des Zahnhalteapparates, die durch einen komplexen bakteriellen Biofilm unterhalten wird. Neben Mikroorganismen wie A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. denticola und T. forsythensis werden Keime unbekannter Spezies in parodontalen Taschen ausfindig gemacht. Durch die Entschlüsselung von 16S rRNA-Gensequenzen konnte die orale Flora nahezu vollständig katalogisiert werden. Allerdings fehlen bei vielen Phylotypen die entsprechenden Typstämme für weitergehende phänotypische Analysen. Grundlage dieser Arbeit bildeten 59 Patientenisolate der Parodontitis-Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie bei denen partielle 16S rRNA Sequenzen keine Spezieszuordnung ermöglichten. Nahezu vollständige 16S rRNA-Sequenzen wurden erstellt und mit Datenbankeinträgen verglichen. Bei mehr als der Hälfte der Stämme konnte keine taxonomische Zuordnung auf Sequenzierebene getroffen werden. 43 Isolate wuchsen unter aerober Atmosphäre, 16 benötigten eine anaerobe Umgebung. Alle Kulturmorphologien und nach Gram gefärbten mikroskopischen Präparate wurden fotografisch dokumentiert und katalogisiert. Die hier untersuchten Stämme, die zufällig auf der Basis taxonomischer Fragestellungen ausgewählt wurden, waren zum überwiegenden Teil auf Amoxicillin und Metronidazol empfindlich. Diese Antibiotika finden alle ihre Verwendung bei der Parodontitistherapie. Ciprofloxacin, das wegen seiner intrazellulären Wirkung ein interessantes Agens ist, wies v.a. bei Actinomyceten und Streptokokken Wirkungslücken auf. Es bleibt zu diskutieren, ob dieser Umstand nachteilig ist, da auf der einen Seite diese Genera ein orales Reservoir für Gyrasehemmer-Resistenzen ausbilden können, auf der anderen Seite diese grampositiven Keime möglicherweise parodontalprotektiv wirken könnten. In dieser Studie konnte eine Stammsammlung charakterisiert werden, die zukünftig insbesondere angesichts der zu erwartenden Entschlüsselung des oralen Metagenoms für weitere funktionelle Untersuchungen von Interesse sein dürfte.
Die Alveoläre Echinokokkose ist eine bedeutende, gefährliche Parasitose des Menschen. Über die molekularen Grundlagen und Mechanismen der Wirt-Parasit- Interaktion ist bislang nur wenig bekannt. In den letzten Jahren konnten Hinweise erlangt werden, dass Wirt und Parasit über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme kommunizieren. Eines dieser Systeme ist das TGF-b/BMP-Signaltransduktionssystem. TGF-β-Signaltransduktionskomponenten steuern grundlegende Prozesse der Entwicklung und Differenzierung in allen Tieren. Über dieses Signalsystem wird ein weites Spektrum von zellulären Prozessen wie Proliferation, Apoptose und Differenzierung reguliert. Dieses System besteht aus strukturell verwandten Zytokinen der TGF-β (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, membranständigen Rezeptoren der TGF-β-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) sowie intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie. Bislang konnten verschiedene Echinokokken Smad-Faktoren (EmSmadA, EmSmadB, EmSmadC und EmSmadD) sowie drei Echinokokken Rezeptoren der Typ I Familie (EmRSK1, EmRSK2, EmRSK3) in E. multilocularis identifiziert werden. Ein Mitglied der TGF-β Typ II-Rezeptorfamilie war bislang noch nicht beschrieben. In dieser Arbeit wird ein solches Molekül vorgestellt, EmRSK4 (=TGF-b Typ IISerin/ Threonin Kinase Rezeptor aus Echinococcus multilocularis). Genexpressionsanalysen und immunhistochemische Untersuchungen zeigen an, dass EmRSK4 in der Germinalschicht des E. multilocularis Metacestoden zusammen mit EmRSK1 (=BMP Typ I-Serin/Threonin Kinase Rezeptor) exprimiert wird. Studien an heterolog exprimierten Rezeptoren zeigten, dass EmRSK4 funktionell aktiv ist und mit humanen Typ I-Rezeptoren einen Komplex bilden kann. Diese Studien zeigen auch, dass EmRSK4 mit EmRSK1 einen aktiven heterologen Typ I-/Typ II-Rezeptorkomplex in HEK293-T Zellen bildet, der durch Wirts-BMP2 stimuliert wird und EmSmadB aktiviert. In Untersuchungen mit EmRSK2 (= TGF-β Typ ISerin/ Threonin Kinase Rezeptor) konnte gezeigt werden, dass bei Anwesenheit beider Rezeptoren, EmRSK2 und EmRSK4, eine Phosphorylierung von EmSmadC nachweisbar ist, während eine Phosphorylierung von EmSmadA auch ohne die Anwesenheit von EmRSK4 stattfindet. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass der Inhibitor SB-431452 die Kinaseaktivität von EmRSK2 hemmt. Nach Zugabe von exogenem BMP2 zu Metazestodenvesikel konnten Hinweise erhalten werden, dass ein bislang noch nicht charakterisiertes, zusätzliches EmSmad aktiviert wird. Zusammengenommen lässt die Co-Expression von EmRSK1 mit EmRSK4 in der Germinalschicht, die Bildung eines BMP-responsiven Komplexes aus beiden Rezeptoren und die Phosphorylierung mindestens eines zellulären Faktors nach exogener Zugabe von Wirts-BMP2 zu Metacestodenvesikeln darauf schließen, dass beide Rezeptoren während einer Infektion an der Sensierung von BMP Signalen des Wirts beteiligt sein könnten
Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.
Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe.
Meningokokken gehören zu den wichtigsten Erregern bakterieller Sepsis und Meningitis. Der Schweregrad des Krankheitsverlaufs bei Meningokokkenerkrankungen korreliert mit der Konzentration an proinflammatorischen Zytokinen im Serum. Dendritische Zellen (DZ) bilden die erste Abwehr am humanen Epithel des Nasopharynx, welches die Eingangspforte von Neisseria meningitidis darstellt und sind eine wichtige Quelle proinflammatorischer Zytokine. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bekapselte Meningokokken-Stämme bei DZ signifikant weniger proinflammatorische Zytokine als isogene Kapsel-defiziente Stämme oder obligat unbekapselte Stämme induzieren. Dieser Effekt ist unabhängig von der chemischen Zusammensetzung der Kapsel, da aufgereinigtes Kapselpolysaccharid der Serogruppe B nicht den reduzierenden Effekt der Zytokininduktion beeinflusste. Darüber hinaus spielt die Kapsel-O-Acetylierung bei Serogruppe C, W-135 und Y nur eine untergeordnete Rolle bei der Erkennung von Meningokokken durch DZ. Microarray Versuche zum Transkriptionsprofil von DZ, die mit dem konstitutiv unbekapselten Trägerisolat alpha 14, dem bekapselten MC58 oder dem isogenen unbekapselten Stamm MC58siaD durchgeführt wurden, zeigten nach 4 h ein identisches Profil von proinflammatorischen Zytokinen. Nur der phagozytierte unbekapselten Stamm MC58siaD zeigte eine differentielle Regulation von weiteren Zytokinen. Jedoch glich sich das Profil nach 18 h Infektion durch alle drei Stämme an. Der Scavenger Rezeptor der Klasse A (SR-A) wurde als Hauptrezeptor identifiziert, der die Erkennung und Phagozytose von Meningokokken durch DZ initialisiert. Eine Assoziation phagozytierter Meningokokken mit SR-A konnte mittels Elektronenmikroskopie bestätigt werden. Nach Infektion von THP-1 Makrophagen mit bekapselten Serogruppe B und C Stämmen, den isogenen Kapsel-defizienten Stämmen und dem obligat unbekapselten Stamm alpha 14 wurde auf Transkriptionsebene keine differentielle Regulation der SR-A nachgewiesen. Lediglich eine minimale Hochregulation des SR-A auf der zellulären Oberfläche konnte nach einer Stunde Infektion verzeichnet werden. Nach Infektion von DZ oder THP-1 Makrophagen mit MC58siaD kommt es zur Dephosphorylierung des SR-A. Unter Verwendung von globalen Phagozytose-Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass für die maximale Induktion der proinflammatorischen Zytokine TNF-alpha, IL-6 und IL-1 Phagozytose von N. meningitidis benötigen wird, dies ist jedoch für die IL 8 Produktion nicht notwendig. Außerdem konnte gezeigt werden, dass mit dem spezifischen SR-A Inhibitor poly G eine Reduktion von TNF-alpha, IL-6, IL-1 und IL-8 zu verzeichnen war. Folglich ist die Phagozytose über SR-A nötig, um TNF-alpha, IL-6 und IL-1 zu induzieren, jedoch nur die Erkennung aber nicht die Phagozytose via SR-A die IL-8 Produktion initiiert. Die Aufnahme von Neisseria meningitidis über den SR-A durch DZ ist damit nicht nur für die Phagozytose und Abtötung verantwortlich sondern auch für die Zytokininduktion wichtig ist. Es gibt jedoch auch Meningokokken Stämme, die nicht vom SR-A erkannt werden. Mit alpha 14 konnte erstmals ein Meningokokken-Stamm identifiziert werden, der nicht an SR-A bindet. Die Induktion von Zytokinfreisetzung durch alpha 14 erfolgt dementsprechend unabhängig von SR-A und nach Kontakt von alpha 14 mit humanen DZ ist keine Veränderung der Phosphorylierungsstatus dieses Rezeptors zu beobachten. Die erhobenen Daten legen eine zentrale Rolle von SR-A in der Induktion von Immunität gegen N. meningitidis nahe.
Die afrikanische Schlafkrankheit füht unweigerlich zum Tod wenn sie unerkannt und somit unbehandelt bleibt. Zur Therapie stehen nur sehr wenige Medikamente zur Verfügung, wovon die meisten bereits seit mehr als 50 Jahren im Einsatz sind. Unter der Therapie treten in ca. 5-10% der Fälle Enzephalopathien auf, die in vielen Fällen tödlich verlaufen. Bisher ist nicht sicher, wie der dahinterstehende Pathomechanismus verläuft. Zu dieser Frage wurden Untersuchungen des Glukosemetabolismus an Patienten im 2. Stadium der Schlafkrankheit durchgeführt. Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg des durchschnittlichen Glukoseniveaus im Verlauf der Therapie. Des weiteren wurden unterschiedliche Verläufe von arzneimittel-induzierter Enzephalopathie klinisch beobachtet und beschrieben.
Vibrio cholerae, der Erreger der gastrointestinalen Erkrankung Cholera, ist ein Gram- negatives, fakultativ anaerobes gekrümmtes Stäbchenbakterium und zugleich der wohl bekannteste Vertreter der Familie Vibrionaceae. Es persisitiert die meiste Zeit in aquatischen Ökosystemen wie Flüssen, Seen oder Meeresküsten, wo das Bakterium meist mit Crustaceen oder anderen Organismen mit Chitin-haltigen Oberflächen assoziiert vorliegt. Über orale Aufnahme kontaminierter Lebensmittel oder von Wasser kann das Bakterium in den menschlichen Organismus gelangen und dort den oberen Dünndarmbereich kolonisieren, wo letztlich durch verschiedene Virulenzfaktoren, aber hauptsächlich durch das Cholera-Toxin, die Symptomatik der Cholera ausgelöst wird. V. cholerae ist somit sowohl in seiner natürlichen Umgebung, als auch im humanen Wirt höchst unterschiedlichen Umweltbedingungen ausgesetzt. Diese alternierenden Umweltreize stellen verschiedene Anforderungen an die Expressions- und Regulationsfähigkeiten von Proteinbiosynthesen des Bakteriums dar. Die Notwendigkeit einer raschen Adaption setzt daher vielfältige und komplexe Genregulationsmechanismen voraus. Im ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit sollte die Genregulation des chs-Operons untersucht werden. Als Grundlage dienten hierbei Hinweise, nach welchen dieses Operon als putatives PTS eine Rolle für den Metabolismus von dem Chitin-Derivat Chitobiose spielen könnte. Zudem sollte der Einfluss des aus Escherichia coli bekannten Repressors Mlc auf die Expression des Operons tiefer gehend untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit war es gelungen, das als ChsR benannte Protein eindeutig als spezifischen LacI-ähnlichen Repressor für das chs-Operon zu bestätigen. Weiter konnte auch eine cAMP-abhängige Expressionsinduktion bestätigt werden, welche sich allerdings nur bei inaktiven ChsR durchsetzen kann. Als spezifischer Induktor für den Repressor ChsR konnte Chitobiose (GlcN)2 identifiziert werden, welches zwar bei dem in dieser Arbeit verwendeten O1-Stamm SP27459-S nicht als alleinige Kohlenstoffquelle dienen kann, aber unter induktiven Konzentrationen die Repressoreigenschaft von ChsR inhibiert. Zugleich konnte ChsC als für den Import des Induktors Chitobiose verantwortliches Protein identifiziert werden. Weiter nicht eindeutig zu klären blieb der Einfluss von Mlc auf das chs-Operon. Zwar konnte der aktivierende Effekt von Mlc auf die chs-Expression durch Komplementation bestätigt werden, der genaue Mechanismus bleibt jedoch weiterhin unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen. Einzig der Einfluss von Mlc auf den Chitobiose-Import konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte der weitaus komplexere Mechanismus der Virulenzgenregulation untersucht werden. Im Fokus stand hierbei der Hauptvirulenz-genregulator ToxR und dessen Abhängigkeit von der periplasmatischen Protease DegS. Anhand unterschiedlicher Experimente auf Promotoraktivitäts-, mRNA- und Proteinebene konnte eine Abnahme der ToxR-Aktivität in der degS-Knockout Mutante beobachtet werden, was auf eine Aktivierung von ToxR durch DegS schließen lässt. Weiter konnte eine Abhängigkeit der Aktivität von ToxR von der ebenfalls DegS-abhängigen RpoE-Signalkaskade ausgeschlossen werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Integrität von ToxR durch ToxS, nicht aber durch DegS bestimmt wird. Der exakte Mechanismus der DegS-induzierten ToxR-Aktivierung konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr ermittelt werden. Es wurden jedoch Hinweise darauf gewonnen, dass eine direkte ToxR-DegS-Interaktion im periplasmatischen Raum stattfinden könnte. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse hinsichtlich der ToxR-Regulation durch DegS bieten sowohl eine interessante neue Perspektive der Funktionsweise der periplasmatischen Protease DegS, als auch eine breite Grundlage für weitergehende Untersuchungen bezüglich der Aktivierung des wichtigsten Virulenzregulators ToxR in V. cholerae.
Das RpoS-Protein aus Vibrio cholerae : Funktionsanalyse und Charakterisierung der Proteolyse-Kaskade
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Konservierung bekannter RpoS-assoziierter Funktionen für das V. cholerae Homolog untersucht. Dabei ergab die phänotypische Analyse der rpoS-Deletionsmutante, dass analog zu der Bedeutung als Regulator des Stationärphasen-Wachstums in E. coli, definierte Zelldichte-abhängige Eigenschaften in V. cholerae gleichermaßen der Kontrolle von RpoS unterliegen. In weiterführenden Experimenten konnte daraufhin die Konservierung der entsprechenden Promotorstrukturen über die funktionelle Komplementierung rpoS-abhängiger Gene durch das jeweils speziesfremde Protein aufgedeckt werden. Dahingegen konnte die Bedeutung von RpoS bei der Ausprägung der generellen Stress-Resistenz u. a. in E. coli für das V. cholerae Homolog über den gewählten experimentellen Ansatz nicht belegt werden. So wurden in Survival-Assays für keine der getesteten Stress-Bedingungen signifikante Unterschiede zwischen rpoS-Mutante und Wildtyp ermittelt. Die in E. coli gezeigte intrazelluläre Anreicherung des Sigmafaktors unter diversen Stress-Situationen konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Hinsichtlich der potentiellen Stellung von RpoS als globaler Regulator für Virulenz-assoziierte Gene, unterstützen und ergänzen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die gegenwärtige Theorie, wonach RpoS das Ablösen der V. cholerae Zellen vom Darm-Epithel fördert. Die postulierte Bedeutung des alternativen Sigmafaktors in der letzten Phase der Pathogenese wurde über die RpoS-abhängige Sekretion der Mukin-degradierenden Protease HapA und die hier unabhängig nachgewiesene Transkriptionskontrolle von Chemotaxis-Genen bestätigt. In E. coli gilt als entscheidender Parameter für die dargelegten RpoS-Funktionen die intrazelluläre Konzentration des Masterregulators. Deshalb war ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit die Regulation des RpoS-Levels in V. cholerae. Neben der Identifizierung von Bedingungen, welche die RpoS-Expression beeinflussen, wurde vorrangig der Mechanismus der Proteolyse analysiert. Dabei wurden als RpoS-degradierende Komponenten in V. cholerae die Homologe des Proteolyse-Targetingfaktors RssB und des Protease-Komplexes ClpXP identifiziert. Die weitere Untersuchung der RpoS-Proteolyse ergab außerdem, dass bestimmte Stress-Signale den Abbau stark verzögern. Interessanterweise resultierten die gleichen Signale jedoch nicht in der Akkumulation von RpoS. Als weiterer Unterschied zu der bekannten Proteolysekaskade in E. coli zeigte sich, dass das V. cholerae Homolog der RssB-aktivierenden Kinase ArcB (FexB) an der RpoS-Proteolyse nicht beteiligt ist. Indessen deuten die Ergebnisse weiterführender Experimente auf den Einfluss der Kinasen CheA-1 und CheA-3 des V. cholerae Chemotaxis-Systems auf die RpoS-Degradation. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein zu E. coli abweichendes Modell der RpoS-Proteolyse postuliert, in welchem die aktiven CheA-Kinasen den Targetingfaktor RssB phosphorylieren und somit den Abbau einleiten. Die Beteiligung von MCP-Rezeptoren an der Kontrolle der intrazellulären RpoS-Konzentration und damit an der Transkription der Chemotaxisgene selbst, beschreibt erstmalig ein Regulationssystem, wonach innerhalb der Chemotaxis-Kaskade die Rezeptoraktivität wahrscheinlich über einen positiven „Feedback-Loop“ mit der eigenen Gen-Expression gekoppelt ist. Darüber hinaus deutete sich die Beteiligung der ATP-abhängigen Protease Lon an der RpoS-Proteolyse-Kaskade in V. cholerae an. Die Inaktivierung der in E. coli unter Hitzeschock-Bedingungen induzierten Protease resultierte in einem extrem beschleunigten RpoS-Abbau. Ein letztes Teilprojekt dieser Arbeit adressierte die Regulationsmechanismen der V. cholerae Osmostress-Adaptation. Während in E. coli der alternative Sigmafaktor dabei eine zentrale Rolle spielt, konnte die Beteiligung des V. cholerae RpoS an der Osmostress-Regulation jedoch nicht aufgedeckt werden. Dafür ergab die Funktionsanalyse eines neu definierten Osmostress-Sensors (OsmRK) die Kontrolle von ompU durch dieses Zwei-Komponentensystems unter hypertonen Bedingungen. Dieses Ergebnis überraschte, da bislang nur der Virulenzfaktor ToxR als Regulator für das Außenmembranporin beschrieben wurde. Die nachgewiesene ompU-Transkriptionskontrolle durch zwei Regulatoren führte zu der Hypothese eines unbekannten regulativen Netzwerkes, welchem mindestens 52 weitere Gene zugeordnet werden konnten. Insgesamt ist festzuhalten, dass die in dieser Arbeit durchgeführte molekulare Charakterisierung der RpoS-Proteolyse in V. cholerae Beweise für eine mögliche Verbindung zwischen der Transkriptionskontrolle für Motilitäts- und Chemotaxisgene mit der Chemotaxis-Reizwahrnehmung erbrachte. Eine derartige intermolekulare Verknüpfung wurde bislang für keinen anderen Organismus beschrieben und stellt somit eine neue Variante der Signaltransduktion innerhalb der Virulenz-assoziierten Genregulation dar.
Meningokokken sind nach wie vor eine wichtige Ursache für Gehirnhautentzündungen und Sepsen weltweit, vor allem bei Kindern und Jugendlichen. Weil viele Pathomechanismen dieses Erregers bislang noch unvollständig verstanden sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit populationsbiologische und pathogenetische Aspekte von Neisseria meningitidis untersucht. Die Kapsel ist der hauptsächliche Pathogenitätsfaktor von Meningokokken und wichtig für die Besiedelung von neuen Wirten. Isolate von symptomfreien Trägern sind allerdings häufig unbekapselt. Um Ursachen oder Mechanismen für den Verlust der Kapselexpression aufzudecken, wurden insgesamt 166 Isolate der Bayerischen Meningokokkenträgerstudie untersucht. Alle Isolate besaßen sämtliche zur Kapselsynthese notwendigen Gene, exprimierten aber keine Kapsel. Bei 39 Isolaten fanden sich Längenvariationen in homopolymeren Sequenzen (slipped strand mispairing, SSM) in den Genen siaA und siaD. 46 Isolate enthielten Insertionselemente (IS1301, IS1016 und IS1106) in den Genen der Kapselsynthese. Irreversible Mutationen (Deletionen, Insertionen, Basensubstitutionen) wurden bei 47 Isolaten gefunden. Veränderungen der Promotorregion schienen keine Rolle zu spielen. Es wurden bei insgesamt sechs Isolaten zwei nicht-synonyme Mutationen in unmittelbarer Nähe zum putativen aktiven Zentrum der UDP-N- Acetylglukosamin-2-Epimerase entdeckt, die einen Verlust der Kapselsynthese erklären könnten. Insgesamt wurden keine Akkumulationen von Mutationen in defekten Genen gefunden und es gab auch keine Korrelationen zwischen den verschieden Ursachen und bestimmten klonalen Linien. Die erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass die meisten der zur Blockierung der Kapselexpression führenden Ereignisse erst im aktuellen Wirt aufgetreten sind und dass zumindest bei bestimmten klonalen Linien die Verbreitung von der Expression einer Kapsel abhängig ist. Viele pathogene Bakterien nutzen zur Infektion des Menschen die ubiquitär im Körper vorkommende Protease Plasmin. Dazu binden diese Plasmin oder das Proenzym Plasminogen. Auch Meningokokken interagieren mit Plasmin und Plasminogen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten drei Rezeptormoleküle für Plasminogen identifiziert werden. Die drei Proteine Enolase, DnaK und Peroxiredoxin konnten mit verschiedenen Methoden auf der Oberfläche der Erreger nachgewiesen werden. Die Bindung des Plasminogens ist bei Meningokokken ausschließlich über Lysinreste der Rezeptoren vermittelt, die C-terminalen Lysinreste der hier identifizierten Rezeptormoleküle spielen aber, wenn überhaupt, nur eine untergeordnete Rolle. Die Bindung von Plasminogen war durch rekombinante Rezeptorproteine konzentrationsabhängig inhibierbar. Plasminogen konnte von Meningokokken auch aus dem Serum rekrutiert werden. Gebundenes Plasminogen war mit uPA (Urokinase Plasminogen Aktivator) aktivierbar und physiologisch aktiv, was durch die Degradation von Fibrinogen nachgewiesen wurde. Das gebundene Plasmin wurde durch die Bakterien vor der Desaktivierung durch α2- Antiplasmin geschützt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Meningokokken auch mit weiteren Faktoren des Fibrinolyse-Systems (uPA) interagieren. Sie rekrutierten uPA an ihre Oberfläche und gebundenes uPA war physiologisch aktiv. Die erhaltenen Ergebnisse bestärken die These, dass Meningokokken die Faktoren des Fibrinolyse-Systems für ihre Pathogenese nutzen.
1. Zusammenfassung Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger invasiver Infektionen bei Kindern und Heranwachsenden. Der in vielen Ländern niedrigen Inzidenz stehen hohe Raten asymptomatischer Kolonisation des menschlichen Nasopharynx mit Meningokokken gegenüber. Während die Pathogenese durch Meningokokken ausführlich untersucht ist, wurde dem Trägertum von Meningokokken bisher wenig Aufmerksamkeit geschenkt, nicht zuletzt auch wegen des Fehlens eines geeigneten Tiermodells. Kürzlich publizierte Daten lassen die asymptomatische Persistenz von Meningokokken in einem Biofilm-ähnlichen Stadium auf und innerhalb des Tonsillengewebes vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines Biofilmmodells für Meningokokken als ein Modell für asymptomatisches Trägertum. Es wurde zudem die Biofilmbildung von Meningokokken unterschiedlichster klonaler Linien mit dem Ziel untersucht, auf molekularer Ebene die Biofilmbildung bei Meningokokken zu verstehen. In statischen Biofilmtests konnte gezeigt werden, dass Biofilmbildung eine ubiquitäre Eigenschaft von Meningokokken ist, solange diese keine Kapsel exprimieren. Hierbei war es unerheblich, ob Trägerisolate oder Isolate aus invasiven Meningokokkenerkrankungen untersucht wurden. Durch die Konstruktion fluoreszierender Meningokokkenstämme und die Etablierung eines Minimalmediums konnte für Meningokokken ein standardisiertes Biofilmmodell unter Flussbedingungen erstellt werden. Das Flussmodell für Meningokokkenbiofilme erwies sich als äußerst robust und reproduzierbar. Es wurde deutlich, dass Meningokokken Biofilme unterschiedlicher Struktur ausbildeten, die teilweise über 120 Stunden in vitalem Zustand gehalten werden konnten. Die Mehrzahl der Stämme bildete heterogene Biofilme mit distinkten Mikrokolonien aus, während andere Stämme homogene Biofilme ohne Mikrokolonien ausbildeten. Diese strukturellen Unterschiede hatten keinen Effekt auf die Antibiotika-Empfindlichkeit der Biofilme. Es konnte gezeigt werden, dass Meningokokkenbiofilme durch Ciprofloxacin und Rifampicin, nicht aber durch Penicillin im Wachstumsmedium abgetötet werden konnten. Diese Ergebnisse passen zu in vivo-Befunden, die zeigen, dass Ciprofloxacin und Rifampicin im Gegensatz zu Penicillin sehr zuverlässig das Trägertum von Meningokokken eradizieren können. Durch die Untersuchung der Biofilmbildung von PilX- und PilE-Mutanten konnte die Bedeutung der Twitching Motility für die Mikrokoloniebildung im Meningokokkenbiofilm aufgezeigt werden. Ausgeprägte Motilität führte zu Mikrokoloniebildung, während weitgehend unbewegliche Stämme flache unstrukturierte Biofilme bildeten. In der vorliegenden Arbeit konnte der Verlust der Mikrokoloniebildung bei der PilX-Mutante durch Reduktion der Piliierung, die zu verminderter Motilität führte, erklärt werden. Autoaggregation der Zellen spielte für die Mikrokoloniebildung keine Rolle, was im Widerspruch zur kürzlich publizierten Rolle von PilX steht. Initiale Schritte der Biofilmbildung bei Meningokokken könnten von extrazellulärer DNA (exDNA) abhängen, da die Zugabe von DNase zur Vorkultur die Biofilmbildung verhinderte, jedoch bestehende reife Biofilme nicht auflöste. Die Funktion, der Mechanismus der Freisetzung, sowie die Menge und Verteilung dieser exDNA in Meningokokkenbiofilmen wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
Neisseria meningitidis kann rasch tödlich verlaufende Erkrankungen wie die Meningokokken-Meningitis und –Sepsis hervorrufen. In den Industriestaaten werden diese Infektionen meist durch Meningokokken der Serogruppen B und C hervorgerufen. Während für die Serogruppe C bereits ein suffizienter Polysaccharidimpfstoff existiert, konnte ein solcher für Stämme der Serogruppe B aufgrund der Immuntoleranz gegen deren N-acetylneuraminsäure noch nicht gefunden werden. Eine Lebendvakzine könnte dieses Problem lösen, da hier viele verschiedene Antigene, welche eine Immunantwort im menschlichen Körper induzieren, zur Verfügung stünden. Die Voraussetzung für eine Lebendvakzine ist Attenuierung eines B-Meningokokken-Stammes durch die Deletion verschiedener Gene. In früheren Untersuchungen ergaben sich Hinweise darauf, dass die LOS-Sialylierung einen Virulenzfaktor darstellt. Das lst-Gen codiert für die α-2,3-Sialyltransferase, deren Aufgabe es ist, die Sialinsäurereste an die Lacto-N-Neotetraose des LOS zu binden. In unserer Arbeit konnten wir zeigen, dass eine lst-Deletionsmutante des Serogruppe-B-Stammes MC58 herstellbar ist. Das Wachstumsverhalten der Mutante in PPM+-Medium unterschied sich nicht von dem des Wildtyps. Auch die Resistenz der Bakterien gegenüber humanem Serum (bis 80%) blieb von der Deletion des lst-Gens unbeeinflusst. Bei der Interaktion mit Epithel- und Endothelzellen allerdings zeigte sich bei der Mutante eine erhöhte Invasivität. Da die Invasion durch Oberflächenproteine wie Opa und Opc vermittelt wird, wäre eine mögliche Begründung für diese Veränderung die bessere Zugänglichkeit dieser Proteine durch das Fehlen der LOS-Sialylierung. Meningokokken mit nicht sialyliertem LOS wurden außerdem von dendritischen Zellen signifikant besser phagozytiert als Wildtyp-Bakterien. Besonders deutlich zeigte sich dies bei fehlender Kapsel. Auch hier ist sicherlich die Maskierung von Bindungsstellen durch Sialinsäuregruppen ein Grund für diese Beobachtung. Weiterhin wurde die Interaktion von Meningokokken verschiedener Serogruppen mit dendritischen Zellen unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses der Polysaccharidkapsel untersucht. Die Meningokokken der untersuchten Serogruppen A, B und C wurden von dendritischen Zellen gut phagozytiert und abgetötet. Allerdings waren sowohl die Adhärenz als auch die Phagozytose bei Vorhandensein einer Polysaccharidkapsel stark inhibiert. Neisseria meningitidis-Stämme aller drei getesteten Serogruppen induzierten eine starke Ausschüttung der Zytokine TNF-α, IL-6 und IL-8. Als ein Induktor dieser Substanzen erwiesen sich die Lipooligosaccharide der Meningokokken. Allerdings zeigte sich in den Versuchen auch, dass noch weitere Bakterienbestandteile eine Zytokinausschüttung hervorrufen können. Die Sialylierung der Lipooligosaccharide hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Menge der produzierten Zytokine. Mit dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass dendritische Zellen mit der Ausschüttung von Zytokinen und der Phagozytose von Bakterien eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Erkrankungen durch Meningokokken spielen könnten. Auch beim Zusammenspiel mit DC-s wirkt die Kapsel als Schutzfaktor vor dem Angriff des menschlichen Immunsystems. Dieser Schutz kann durch die LOS-Sialylierung zusätzlich gesteigert werden. Die Deletion des lst-Gens könnte also als ein Baustein für die Konstruktion eines attenuierten Lebendvakzine-Stammes fungieren.
Haemophilus influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium aus der Familie der Pasteurellacaea. Das physiologische Merkmal von H. influenzae ist die essentielle, aber defiziente Hämin- und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) Biosynthese. Während Hämin für aerobes Wachstum benötigt wird, ist NAD+ sowohl für aerobes, als auch für anaerobes Wachstum essentiell. Als NAD+-abhängiger Organismus fehlen H. influenzae die meisten Enzyme für die NAD+-Biosynthese. Daher kann dieses Bakterium nur eine begrenzte Anzahl an Vorläufermolekülen, wie NAD+(P), Nikotinamid-Mono-Nukleotid (NMN) und Nikotinamid-Ribosid (NR) aus der Umwelt zur NAD+-Synthese nutzen. Andere NAD+-unabhängige Pasteurellacaea-Spezies, wie Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida und Actinobacillus actinomycetemcomitans, können auch kein NAD+ aus der de novo Biosynthese bereitstellen, diese Arten können aber zusätzlich auf Nikotinamid (NAm) wachsen. Die Erforschung des NAD+-Aufnahmesystems kann für die Entwicklung antimikrobieller Therapeutika von großem Interesse sein. Von unserer Arbeitsgruppe wurde die NAD+-Aufnahmeroute aufgeklärt; so werden NAD+(P) und NMN von e(P4) und NadN zu NR degradiert, nachdem NAD+ und NMN durch OmpP2 in das Periplasma gelangt sind. NR wird schließlich, als einziges Substrat, durch einen putativen Transporter in das Zytoplasma aufgenommen. In dieser Arbeit wurde der putative NR-Transporter als das hypothetische Gen HI1077.1 im Genom von H. influenzae identifiziert, welches nur 13,8% Identität zu Escherichia coli pnuC und 43,6% Identität zu P. multocida pnuC aufwies. Es konnten zwei Sequenzierungsfehler im original-annotierten Genom von H. influenzae gefunden werden, die zu einer Leserasterverschiebung geführt haben. HI1077.1 wurde zu pnuCHi reannotiert und weist nun eine 19,7% Identität zu pnuCEc und 71,4% Identität zu pnuCPm auf. Es wurde eine HI1077.1 Mutante konstruiert, die ein Wachstumsdefizit auf BHI-Platten bis zu einer NAD+-Konzentration von 15 mM bzw. unterhalb einer NR-Konzentration von 0,1 mM zeigte. Im Transport-Assay transportierte die HI1077.1 Mutante nur noch etwa 1% des eingesetzten NAD+- bzw. NR-Labels. Im Rattenversuch konnte gezeigt werden, dass das in vitro nicht essentielle pnuC in vivo sehr wohl essentiell ist. Die HI1077.1 Mutante verursachte, im Gegensatz zum Wildtyp und zur pnuC-Komplementante keine Bakteriämie mehr. Bei einer Komplementation mit NadV, kodierend für eine Nikotinamid-Phosphoribosyltransferase von H. ducreyi, wurde ebenfalls eine mit dem Wildtyp vergleichende Bakteriämie verursacht. Da bisher noch keine H. influenzae Isolate bekannt sind, die nadV besitzen, würde sich der hier identifizierte NR-Transporter von H. influenzae gut als antimikrobielles Ziel eignen. Die Protein-Topologie von PnuC wurde hinsichtlich der Membranlokalisation analysiert und PnuC konnte als ein Transmembranprotein bestätigt werden, das in der cytosolischen Membran lokalisiert ist. Durch PhoA und LacZ Analysen konnte die Topologie von PnuC aufgeklärt werden. Demnach besitzt PnuC acht Transmembrandomänen (TMD), wobei die N- und C-Termini im Cytosol lokalisiert sind. Die Analyse der strukturellen Funktion ergab, dass PnuC nur eine Unterbrechung der sechs letzten C-terminalen Aminosäuren (AS) toleriert, während die Proteinfunktion durch einen fusionierten C- und N-terminaler His-Tag nur mäsig beeinflusst wird. Des Weiteren wurde die Substratspezifität von PnuC untersucht. Dabei zeigte sich, dass der lange geglaubte NMN-Transporter von E. coli ebenfalls als NR-Transporter fungiert. Die Substratspezifität wurde auch bei A. actinomycetemcomitans und P. multocida untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass A. actinomycetemcomitans und P. multocida ebenfalls als einziges Substrat NR transportieren können, aber im Gegensatz zu H. influenzae NAD+ und NMN nicht als NR-Quellen verwerten können, was wahrscheinlich auf das Fehlen von e(P4) und NadN zurückzuführen ist. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit das Gen HI0308 untersucht. Um dem Aspekt der Energetisierung des PnuC-Transporters näher zu kommen, sind die Gencluster HI1078-HI1080 und HI0164-HI0171 in die Untersuchung mit einbezogen worden. Die Na+-NQR-Oxidoreduktase wurde im Hinblick ihrer Dehydrogenase-Aktivität genauer charakterisiert. Die Suche nach möglichen Inhibitoren von PnuC führte zu 3-Aminopyridin-Analoga. Durch eine Mutantenanalyse konnte gezeigt werden, dass 3-AADP, 3-AAD und 3-AmPR der selben Aufnahmeroute folgen wie NADP+, NAD+ und NR, und via PnuC in die Zelle aufgenommen werden. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass NadR aus 3-AmPR und ATP das 3-AAD synthetisiert, welches als kompetitiver Inhibitor mit NAD+ in den zellulären Redoxreaktionen konkurriert und dadurch den Stoffwechsel hemmt. Des Weiteren wurden mehrere spontan 3-Aminopyridin-resistente H. influenzae Mutanten isoliert.
Im Rahmen der Etablierung eines Bettnetzprojektes zur Prävention der Malaria wurden eine städtische (n=60) und eine ländliche Probandengruppe (n=60) in Nigeria im Großraum Abeokuta vor und ein Jahr nach Einführung von mit Insektizid behandelten Bettnetzen (ITN) untersucht. Dabei war das Ziel dieser Arbeit (1) die epidemiologische Malariasituation im Untersuchungsgebiet zu erfassen; (2) Wissen durch Informationsgespräche zu den Themen Prävention, Diagnostik und Therapie der Malaria zu vermitteln; (3), Akzeptanz und Gebrauch der ITN zu dokumentieren; (4), den Effekt von ITN am Verlauf klinischer und labortechnischer Parameter zu verfolgen und (5) die Prävalenz und Höhe von Antikörpern (NANP19) gegen das Circumsporozoiten (CS) Protein, ein Hauptoberflächenprotein der Sporozoiten vor Projektbeginn zu erfassen, sowie ihre Veränderung ein Jahr nach Einführung von ITN. Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass Malaria eines der wichtigsten Gesundheitsprobleme der Region ist. Wissensvermittlung förderte die Akzeptanz und den regelmäßigen Gebrauch von ITN. Die klinischen und labortechnischen Untersuchungen bestätigen den protektiven Effekt durch Benutzung von ITN. Fast alle Parameter (Anzahl der Fieberepisoden/Jahr, Anzahl der arbeitsunfähigen Tage, Milzuntersuchung, Ausstrichuntersuchungen und Untersuchung auf Ak) zeigten für die Bettnetzbenutzergruppen Verbesserungen, von denen einige im Vergleich zum Vorjahr hochsignifikant waren. Die Resultate dieser Arbeit weisen darauf hin, dass im hochendemischen Südwesten Nigerias ITN effektiv zur Prävention der Malaria eingesetzt werden können. Der schwere Zugang zu medizinischer Versorgung für ländliche Bevölkerungsgruppen empfiehlt ihren Einsatz besonders in diesen Regionen. Hohe Infektionsraten mit der Gefahr rezidivierender Infektionen, besonders für Kinder, könnten dadurch gesenkt werden. Durch die gezeigte signifikante Reduktion der Krankeheitstage bei regelmäßiger ITN-Benutzung könnte ein zusätzlicher ökonomischer Benefit für Familien sein.
Untersuchungen zur Pathogenität von Helicobacter hepaticus : genomische und funktionelle Aspekte
(2006)
Helicobacter hepaticus stellt den Prototyp der enterohepatischen Helicobacter dar und führt zu einer persistenten Infektion von Mäusen. In immundefizienten Tieren kann er eine chronische Entzündung des Darmtraktes auslösen, welche den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen, Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa, ähnelt. Deshalb wird H. hepaticus bevorzugt als Modellorganismus zur Untersuchung der immunologischen Ursachen von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Tiermodell eingesetzt. Ebenfalls kann eine Infektion mit H. hepaticus in suszeptiblen Mäusestämmen (z.B. Balb/c, C3H/An) zu Entzündungen der Leber und Gallengänge führen, welche sich bis zu einer Hepatitis und Leberkarzinomen ausweiten können. In den meisten Studien wurde H. hepaticus bisher aber hauptsächlich als Auslöser dieser Erkrankungen eingesetzt, während die bakterielle Seite kaum betrachtet wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in einer Kooperation mit MWG Biotech, GeneData und dem Massachusetts Institute of Technology (MIT) die Gesamtgenomsequenz des H. hepaticus Referenzstammes ATCC 51449 bestimmt und annotiert. Das Genom hat eine Größe von 1.799.146 bp und kodiert für 1.875 Proteine. Die globale Ähnlichkeit des Genoms von H. hepaticus ist etwa gleich groß zu den sequenzierten Genomen von H. pylori und C. jejuni. Es fehlen H. hepaticus aber die meisten Virulenzfaktoren von H. pylori wie Adhäsine (SabA, BabA, AlpA), VacA und die meisten Proteine der cag-Pathogenitätsinsel, während Homologe zu Pathogenitätsfaktoren von C. jejuni wie CDT und Peb1 vorhanden sind. Das Genom von H. hepaticus enthält neben vielen kleineren genomischen Inseln eine Genominsel mit einer Größe von 71 kb, welche als HHGI1 benannt wurde. Sie kodiert mutmaßlich für ein TypIV-Sekretionssystem und enthält weitere Virulenzfaktoren. In Microarray- basierten Gesamtgenomvergleichen konnte gezeigt werden, dass die Insel in sieben von 13 untersuchten Stämmen großteils oder komplett fehlt. Während Mäuse, aus denen HHGI1-positive Stämme isoliert wurden, pathologische Veränderungen der Leber aufwiesen, wies keine von den Mäusen, aus denen HHGI1-negative Stämme isoliert wurden, Auffälligkeiten in der Leber oder dem Gallentrakt auf. In einem Tiermodell wurde in Kooperation mit dem MIT gezeigt, dass zwei Insel-negative Stämme zu einer geringeren Besiedlung und einer schwächeren Entzündung der Leber als der Insel-positive Referenzstamm ATCC 51449 führen. Durch die Genomvergleiche konnte auch gezeigt werden, dass verschiedene H. hepaticus-Stämme trotz einer niedrigen Sequenzvariabilität eine hohe Variation des Genomgehalts aufweisen und dass neben der HHGI1-Insel weitere kleinere Inseln in einzelnen Stämmen fehlen. Es wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals verschiedene isogene Mutanten von H. hepaticus in der HHGI-1-Insel hergestellt, die in vitro eine verringerte Immunstimulation in Makrophagen zeigten. Der Mechanismus dieser Immunsuppression konnte noch nicht vollständig aufgeklärt werden, sie werden jedoch derzeit in Mausmodellen weiter auf ihre krankheitsauslösenden Eigenschaften untersucht. Da bisher keine gut charakterisierten Zellkulturmodelle für die in vitro-Untersuchung von H. hepaticus vorlagen, wurden solche im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Dazu wurden die intestinale murine epitheliale Zelllinie m-ICcl2, welche das primäre Habitat von H. hepaticus (Krypten im Dünndarm) imitiert, die murine Hepatozytenzelllinie NCTC Klon 1469, welche ein mögliches sekundäres Habitat (Lebercanaliculi) imitiert und die murine Makrophagenzelllinie J774 benutzt. Während J774 und NCTC Klon 1469 durch die meisten Liganden für Mustererkennungsrezeptoren stimuliert werden konnten, reagierten m-ICcl2- Zellen substantiell nur auf den TLR4-Liganden E. coli-LPS. Dementsprechend induzierte H. hepaticus in J774 und NCTC Klon 1469 eine starke proinflammatorische Antwort, während m-ICcl2 trotz guter Adhärenz nur schwach von H. hepaticus stimuliert wurde. Es wurde gezeigt, dass LPS und Flagelline von H. hepaticus nur eine geringe immunstimulatorische Wirkung besitzen, während Lipoproteine und vermutlich auch Peptidoglykan die wichtigsten PAMPs von H. hepaticus darstellen. Durch die Analyse der durch H. hepaticus ausgelösten globalen Genregulation in J774 und NCTC Klon 1469 wurde nachgewiesen, dass H. hepaticus nicht primär über NF-κB, sondern über MAP-Kinasen eine proinflammatorische Antwort auslöst. Außerdem wurde gezeigt, dass H. hepaticus untypisch für extrazelluläre Bakterien eher eine Wirtsantwort auslöst, welche der durch intrazelluläre Bakterien ähnelt. In diesen Modellen führten HHGI1-negative Stämme oder Mutanten der HHGI1-Insel zu einer leicht verringerten proinflammatorischen Antwort. Dies spiegelte sich auch in der transkriptionellen Regulation von Schlüsselfaktoren der angeborenen Immunantwort wie TLR2, IL-12, NOD2 oder Tollip wieder. In m-ICcl2-Zellen führte eine Koinkubation mit lebenden H. hepaticus oder Lysaten zu einer verringerten durch E. coli-LPS ausgelösten Induktion von MIP-2. Darauf basierend wurde gezeigt, dass LPS von H. hepaticus einen wesentlichen Faktor für diese Inhibierung der proinflammatorischen Antwort darstellt, nicht jedoch die HHGI-1-Insel oder andere vermutete Virulenzfaktoren. Zumindest auf mRNA-Ebene wurde durch H. hepaticus auch die Induktion anderer Cytokine wie TNF-α oder MIP-1α gehemmt. Eine primäre Koinkubation von m-ICcl2 mit E. coli-LPS führte zu einer Toleranzinduktion gegenüber einer zweiten Stimulation. Diese Toleranzinduktion wurde durch eine Inkubation mit H. hepaticus ebenfalls gehemmt. Die Hemmung der proinflammatorischen Antwort durch H. hepaticus-LPS konnte auch in NCTC Klon 1469 und unter serumfreien Bedingungen für die durch S. typhimurium- Flagellin induzierte IL-8 Sekretion in der humanen Kolonkarzinomzelllinie Caco2 nachgewiesen werden. Damit war diese Hemmung weder zellspezifisch noch spezifisch für die TLR4-abhängige Stimulation. Basierend auf dieser Arbeit wurde ein Modell für die Entstehung einer chronischen Entzündung im Intestinaltrakt entwickelt, welches Erklärungsansätze für die Entwicklung einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung im Menschen liefern könnte.
Es wird angenommen, dass die invasiven Stadien parasitärer Helminthen zur Organfindung und zur Weiterentwicklung auf die Sensierung spezifischer Wirts-Signale angewiesen sind, wobei die molekulare Natur dieser Signale bislang weitgehend ungeklärt ist. Vorangegangene Untersuchungen am Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis, dem Erreger der alveolären Echinokokkose, hatten bereits ergeben, dass dessen Metacestoden-Larvenstadium zur Weiterentwicklung kleine, lösliche Wirtsmoleküle benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein axenisches (Wirtszell-freies) Kultursystem für das Metacestoden-Stadium entwickelt, mittels dessen sich diese Fragestellungen in vitro angehen lassen. Mit Hilfe dieses Kultursystems konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die drei Wirts-Hormone/Zytokine, Insulin, epidermal growth factor (EGF) und bone morphogeneic protein 2 (BMP2), einen Einfluss auf die Proliferation und die Differenzierung von E. multilocularis haben. Während für Insulin und EGF Wachstums-stimulierende Effekte gezeigt werden konnten, förderte BMP2 die Differenzierung des Metacestoden zum nächsten Larvenstadium, dem Protoscolex. In Modellorganismen wie Säugern, Drosophila und Caenorhabditis elegans verlaufen die durch Insulin- und EGF-ähnlichen Zytokine induzierten Signalmechanismen über die sogenannte mitogen activated protein (MAP)-Kinase-Kaskade. Um zu untersuchen, ob die externe Zugabe von Wirts-Insulin bzw. -EGF in einer Stimulierung der MAPK-Kaskade des Parasiten führt, wurden in dieser Arbeit zunächst die Komponenten dieses Signalweges bei E. multilocularis auf molekulargenetischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die Arbeiten umfassten Studien zu kleinen GTPasen des Parasiten (EmRas, EmRap1, EmRap2, EmRal), zu einem Orthologen der Kinase Raf (EmRaf), sowie Orthologen der Kinasen MEK (EmMKK) und ERK (EmERK). Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren in E. multilocularis Teil einer MAP-Kinase-Kaskade sind. Zudem wurde nachgewiesen, dass diese Faktoren stromabwärts eines EGF-Rezeptor-Orthologen (EmER) des Parasiten fungieren, welches ebenfalls in der vorliegenden Arbeit analysiert wurde. Damit wurden die Voraussetzungen geschaffen, den Einfluss exogen zugegebenen Insulins bzw. EGFs auf die Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade im Parasiten zu untersuchen. Erste Analysen zeigten bereits, dass die zentrale Komponente dieser Kaskade, EmERK, durch die genannten Wirts-Zytokine aktiviert wird. Dies legt nahe, dass Wirt-Parasit-Kommunikationsmechanismen über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen der alveolären Echinokokkose spielen. Aufbauend auf dem axenischen Kultursystem ist es in dieser Arbeit auch erstmals gelungen, Primärzellkulturen für E. multilocularis anzulegen und die Parasitenzellen zur in vitro Neubildung von Metacestoden-Vesikeln anzuregen. Erste Experimente zur genetischen Manipulation dieser Primärzellen konnten erfolgreich durchgeführt werden. Aufbauend auf der hier vorgestellten Methodik sollte es in künftigen Untersuchungen möglich sein, stabil transfizierte Echinococcus-Zellen zu generieren und diese zur Herstellung vollständig transgener Parasiten-Stadien zu nutzen. Dies würde die zur Untersuchung der E. multilocularis-Entwicklung und der Wirt-Parasit-Interaktionsmechanismen bei einer Infektion zur Verfügung stehenden Methoden entscheidend erweitern und könnte u.a. zur weiteren biochemischen Analyse der in dieser Arbeit dargestellten Signalmechanismen des Parasiten herangezogen werden.
Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein.
C.dubliniensis kann, wie auch die nahe verwandte Spezies C.albicans, als Antwort auf eine Reihe von Umweltfaktoren von der Hefeform in echtes filamentöses Wachstum übergehen. Bei der Regulation des pH-abhängigen Dimorphismus von C.dubliniensis spielt, wie bei verschiedenen anderen Pilzspezies der Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Rim101 eine zentrale Rolle. Dieser weist mit 85% zwar eine im Speziesvergleich geringe Aminosäure-identität zu C.albicans-Rim101 auf, zeigt jedoch die gleiche pH-abhängige Expression wie C.albicans-RIM101, ist in C.albicans funktionell aktiv und kann die typischen Defekte einer C.albicans-rim101-Nullmutante komplementieren. C.dubliniensis-Rim101 ist zudem beteiligt an der Regulation des Wachstums bei 45°C und der Koloniefärbung auf CHROM agar-Candida, zwei Eigenschaften, in denen sich C.albicans und C.dubliniensis unterscheiden. Ursache für diese speziesspezifische Merkmalsausprägung ist die bei C.dubliniensis deutlich stärkere Expression von RIM101. Ein weiterer phänotypischer Unterschied zwischen C.albicans und C.dubliniensis betrifft mit der Fähigkeit zu Filamentierung und invasivem Wachstum zwei für C.albicans nachgewiesenermaßen wichtige Virulenzfaktoren. Auf Kochblutagar, nach 24 - 48-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO2, bildet C.dubliniensis glatte, weiß-glänzende, scharf begrenzte halbkugelförmige Kolonien, während C.albicans-Kolonien eine rauhe, grau erscheinende Oberfläche aufweisen und mit Ausläufern in den umgebenden Agar einwachsen. Auslösend für die ausgeprägte Filamentierung von C.albicans ist das additive Zusammenwirken von erhöhtem CO2-Gehalt, erhöhter Temperatur und einem noch nicht endgültig identifizierten Bestandteil des Kochblutagars. Mit einer Sensitivität von 95,8% und einer Spezifität von 100% eignet sich dieses Verfahren auch als einfacher diagnostischer Test. Auf molekularer Ebene sind Efg1 und Cph1 an der Filamentierungsauslösung beteiligt, wobei Efg1 aber eine wesentlich größere Bedeutung zukommt. Rim101 scheint keinen Einfluss zu haben.
Molekulare Identifizierung von Neisseriaceae und Moraxellaceae mittels ribosomaler DNA-Sequenzierung
(2005)
Die schnelle und verlässliche Identifizierung mikrobiologischer Isolate ist ein fundamentales Ziel der klinischen Mikrobiologie. Bei einigen gram–negativen Spezies ist die klassische phänotypische Identifizierung, basierend auf metabolischen, enzymatischen oder serologischen Methoden erschwert, zeitraubend oder nicht suffizient. Durch die Sequenzierung partieller Abschnitte der 16S- oder 23S-rDNA können Bakterien meist exakt spezifiziert werden. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, hypervariable rDNA Abschnitte zu finden, die von stark konservierten Regionen flankiert werden, um auf molekularer Ebene Mitglieder der Familie Neisseriaceae und Moraxellaceae zu diskriminieren. Die inter- und intragenetischen Beziehungen von insgesamt 94 Stämmen wurden untersucht. Im Vergleich zu den Referenzstämmen der Genera waren bei der partiellen 16S-rDNA (E. coli Position 54 – 510) je Spezies durchschnittlich 30 polymorphe Positionen vorhanden. Die partiellen 23S-rDNA Abschnitte (E. coli Position 1400 – 1600) zeigten durchschnittlich 11 polymorphe Positionen. Neisseria macacae und N. mucosa subsp. mucosa (ATCC 19696) zeigten identische 16S- und 23S-rDNA Sequenzen. Die Gruppierung verschiedener Isolate war bei Acinetobacter lwoffii, Moraxella lacunata und Neisseria mucosa an beiden untersuchten Genabschnitten heterogen. Im Fall von N. meningitidis konnte mit Hilfe der 23S-rDNA Daten nicht suffizient gruppiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine Überlegenheit der untersuchten partiellen 16S-rDNA zur Diagnostik der Neisseriaceae und Moraxellaceae. Eine Referenzdatenbank zur Diagnostik von Mikroorganismen sollte mehr als ein Isolat einer Spezies enthalten und zudem einen polyphasischen Ansatz verfolgen. Die Sequenz–Chromatogramme und weitere diagnostisch relevante Informationen wurden mit der „offline“-Datenbank RIDOM_Tool gesammelt und sind ein Teil des Internet-basierenden Service von RIDOM (www.ridom-rdna.de). Eine eingegebene Sequenzfolge kann online eingefügt und damit ein direkter Vergleich mit den in der RIDOM Referenzdatenbank existierenden Datensätzen initiiert werden.
Invasive Pilzinfektionen haben in den letzten Jahren stetig zugenommen und bedrohen insbesondere immunsupprimierte Patienten. Nach der Zulassung von neuen antimykotisch wirksamen Substanzen hat sich das verfügbare Spektrum an therapeutischen Optionen deutlich erweitert. Demgegenüber steckt die verfügbare Technik zur Resistenztestung humanpathogener Pilze noch weitgehend in den Kinderschuhen. Die Analyse zur Verfügung stehender Techniken ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zu diesem Zweck werden zunächst die Daten von 728 klinischen Isolaten von Candida spp., die zwischen April 2000 und November 2002 am Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg unter Anwendung des Mikrodilutionsverfahrens nach DIN getestet wurden, unter epidemiologischen Aspekten ausgewertet. Es zeigt sich ein deutliches Überwiegen von Candida albicans (53%), gefolgt von Candida glabrata (26%). Candida parapsilosis und Candida tropicalis hatten jeweils einen Anteil von ca. 7%. Sowohl Candida albicans wie auch Candida glabrata verhielten sich gegen Fluconazol, Amphotericin B und 5-Flucytosin in hohem Maße sensibel. Candida krusei und Candida tropicalis wurden zu einem nennenswerten Anteil resistent, vor allem gegen Fluconazol und 5-Flucytosin, getestet. Im zweiten Teil der Arbeit wird anhand von 56 Candida spp. ein Vergleich des Mikrodilutionsverfahrens nach DIN und des internationalen Standardverfahrens nach NCCLS durchgeführt. Es zeigen sich sowohl hinsichtlich Reproduzierbarkeit, Ablesezeitpunkt der minimalen Hemmkonzentration sowie Stabilität der Testergebnisse über den angestrebten Ablesezeitpunkt hinaus deutliche Vorteile des NCCLS- gegenüber dem DIN-Verfahren. Der wesentliche Unterschied zwischen beiden Protokollen liegt im verwendeten Wachstumsmedium. Ein Problem beider Verfahren besteht im großen Zeitaufwand, weshalb das YeastOne-Testverfahren, ein kommerziell erhältliches Mikrodilutionsverfahren, das den Farbindikator Alamar Blue zur Erleichterung der visuellen Endpunktbestimmung beinhaltet, im dritten Teil der Arbeit für die Anwendung am Institut in Würzburg gegenüber der NCCLS-Methode evaluiert wird. Es zeigt sich eine hohe Reproduzierbarkeit mit ca. 96% bei Fluconazol, Amphotericin B und 5-Flucytosin und eine gute Korrelation zum Standardverfahren nach NCCLS. Entscheidende Vorteile gegenüber dem NCCLS-Protokoll sind eine frühere Endpunktbestimmung für Azole, die bereits nach 24 Stunden erfolgen kann, sowie in der Zeitersparnis zwischen 64% und 94%. Ergänzend werden einige Schimmelpilze sowohl mit dem NCCLS- als auch mit dem YeastOne-Verfahren getestet, wobei sich eine hohe Korrelation der YeastOne- mit den NCCLS-Ergebnissen zeigt und sich für beide Vorgehensweisen der Ablesezeitpunkt bei gutem Wachstum nach 48 Stunden festlegen lässt. Die Resistenztestung klinischer Isolate wurde daraufhin im Institut für Hygiene und Mikrobiologie auf das YeastOne-System umgestellt. In ersten Anwendungen wurden dabei gute Ergebnisse erzielt.
Neisseria meningitidis ist einer der wichtigsten Erreger bakterieller Meningitiden und gefürchtet für das Potential Epidemien auszulösen. Die Meningokokken-Meningitis bleibt bis heute auch in Industrieländern mit hoher Mortalität verbunden. Um eine Meningitis verursachen zu können, müssen Meningokokken die Blut-Hirn/Liquor-Schranke überqueren. Dies erfolgt vermutlich über den transzellulären Weg durch die Endothelzellbarriere der Gehirnkapillare. Ereignisse unmittelbar vor der bakteriellen Internalisierung sind vielfach untersucht, noch wenig erforscht sind jedoch die in der Endothelzelle durch den initialen Kontakt des Erregers ausgelösten Signalkaskaden. Die Rolle des für eine ADP-Ribosyltransferase kodierenden narE Gens in der Pathogenese der Meningokokken-Infektion und die mögliche Bedeutung in der Aktivierung von Signaltransduktionsmechanismen wird diskutiert. Eine narE Insertionsmutante wurde hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurde die Aktivierung der extracellular signal regulated kinase (ERK) im Verlauf von Infektionsassays in HBMEC (human brain microvascular endothelial cell) mittels Western Blot untersucht. Eine Zu- oder Abnahme in der Phosphorylierung von ERK und folglich eine Aktivierung oder Deaktivierung der ERK-vermittelten Signalkaskaden in HBMEC konnte jedoch im Laufe der Infektion bei der narE Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm nicht festgestellt werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen Meningokokken intrazellulär einzeln aber auch zu mehreren in phagosomenähnlichen membranumgebenen Strukturen. Die Fähigkeit von N. meningitidis sich intrazellulär zu replizieren wurde mittels Infektions-assay untersucht. Bekapselte Meningokokken waren in der Lage, sich sowohl in Epithel- als auch in Endothelzellen zu replizieren, während unbekapselte Erreger intrazellulär abgetötet wurden. Bei Meningokokken wie auch beim Erreger neonataler Meningitiden E. coli K1 wird eine O-Acetylierung des Kapselpolysaccharids beobachtet. Die biologische Bedeutung der O-Acetylierung der Sialinsäure wurde in Infektionsassays mit einem nicht acetylierten E. coli K1 Stamm und einer isogenen konstitutiv acetylierten Mutante untersucht. In der Adhärenz an und Invasion in HBMEC konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Eine stärker ausgeprägte intrazelluläre Replikation wurde jedoch nach einer Verzögerung von mehreren Stunden bei dem nicht acetylierten Isolat beobachtet. Um die Neisseria containing Vacuole (NCV) näher zu charakterisieren und mögliche Interaktionen mit dem Endozytoseweg in HBMEC zu untersuchen, wurde eine dreifache Immunfluoreszenzfärbung zur simultanen Darstellung intrazellulärer Meningokken und spezifischer Marker des frühen bzw. späten Endosoms und Lysosoms etabliert. Eine Akquirierung des Transferrinrezeptors als Marker für das frühe Endosom und des Lamp-1 (lysosomal associated membrane protein 1) als Marker für das späte Endosom konnte durch Kolokalisationsstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt werden.
Interaktion von Neisseria meningitidis mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke
(2005)
Ein zentrales Ereignis in der Pathogenese einer bakteriellen, durch Neisseria menigitidis verursachten Meningitis stellt die Interaktion der Bakterien mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke dar. In der vorliegenden Arbeit konnten in Infektionsversuchen mit immortalisierten HBMEC-Zellen als etabliertem in-vitro Modell des okklusiven menschlichen Hirnendothels und N. meningitidis Isolaten unterschiedlicher klonaler Linien Pathomechanismen für die Interaktion von Meningokokken mit dem Endothel der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke identifiziert werden. Diese unterscheiden sich von jenen Pathomechanismen, die die Interaktion von Meningokokken und Epithelzelllinien bzw. peripheren Endothelzellen bestimmen. Die untersuchten hypervirulenten klonalen Linien ST-32, ST-11 und ST-1 zeigen in-vivo signifikante Unterschiede in ihrem Ausbreitungsverhalten und meist unterschiedliche Krankheitsverläufe. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen vermuten, dass die molekularen Mechanismen der Adhärenz und Invasion von N. meningitidis Serogruppe A, B und C Isolaten in ihrer Abhängigkeit von Außenmembrankomponenten und externen Faktoren differieren. Die Invasion von Serogruppe B Meningokokken konnte in Infektionsversuchen mit dem Serogruppe B Stamm MC58 als repräsentativem Vertreter der hypervirulenten klonalen Linie ST-32 als Folge einer trifaktoriellen Interaktion mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke identifiziert werden: (I) Die Internalisierung der Serogruppe B Isolate in HBMEC-Zellen ist von der Expression des Außenmembranproteins Opc sowie (II) von der Anwesenheit des Serumglykoproteins Fibronektin abhängig, das als invasionsfördernde Komponente humanen Serums die Bindung von Meningokokken an spezifische Rezeptoren auf HBMEC-Zellen vermittelt. Fibronektin bindet (III) als Brückenmolekül an RGD-Bindungsmotive der 51-Integrine auf HBMEC-Zellen. Diese stellen spezifische Rezeptoren der Fibronektin-vermittelten Invasion Opc-exprimierender Serogruppe B Meningokokken in zerebrale menschliche Hirnendothelzellen dar. Weder für Serogruppe A noch für Serogruppe C Meningokokken konnte in der vorliegenden Arbeit eine Serum-vermittelte Invasion in HBMEC-Zellen beschrieben werden. Als ursächlich können die natürlicherweise fehlende Opc-Expression durch Isolate des ST-11 Komplexes sowie eine ausgeprägte Variabilität der Opc-Expression durch die analysierten ST-1 Isolate diskutiert werden. Die wesentliche Bedeutung der Zytoskelettfunktion für die Invasion von N. meningitidis in HBMEC-Zellen konnte in Infektionsversuchen mit eukaryontischen Zytoskelettinhibitoren nachgewiesen werden. Mikrofilamente und Mikrotubuli als Elemente des Zytoskeletts wurden als essentielle Komponenten einer effizienten Internalisierung Opc-exprimierender Serogruppe B Meningokokken in HBMEC-Zellen identifiziert.
Charakterisierung von NadR : das essentielle Enzym der NAD-Synthese bei Haemophilus influenzae
(2005)
I Zusammenfassung Haemophilus influenzae, ein Gram-negatives, Bakterium der Familie Pasteurellaceae, kann beim Menschen eine Vielzahl an Erkrankungen auslösen: Die bekapselte Stämme, v. a. mit Typ b Kapsel können Cellulitis, septische Arthritis, Epiglottitis und Meningitis verursachen. Die nicht-bekapselte Stämme können Otitis media, Sinusitis, Pneumonie und in selteneren Fällen Bakterämie verursachen. Ein besonderes Merkmal des Metabolismus von H. influenzae ist dessen Unfähigkeit Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) de novo zu synthetisieren. Daher sind die Enzyme bzw. Transporter, die an NAD+ Aufnahme und Resynthese beteiligt sind, als putative antimikrobielle Ziele von Interesse. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass NAD+ zu Nikotinamidribosyl degradiert werden muss, bevor es in die Zelle aufgenommen werden kann. Auch Proteine, die an der Degradation des exogenen NAD+ zu Nikotinamidribosyl und dessen anschließender Aufnahme in die Zelle verantwortlich sind, konnten identifiziert und charakterisiert werden. Wie Nikotinamidribosyl im Cytoplasma wiederum zu NAD+ synthetisiert wird, ist auch erst kürzlich geklärt worden: für NadR konnte sowohl eine Ribosyl-Nukleotid-Kinase (RNK) Aktivität als auch eine Nikotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase (NMNAT) Aktivität in vitro gezeigt werden. Die Kristallstruktur von hiNadR im Komplex mit NAD+ wurde auch aufgeklärt. In dieser Arbeit sollte NadR, insbesondere dessen RNK Domäne, in vivo und in vitro näher charakterisiert werden. Um zu untersuchen, ob beide Domänen in vivo essentiell sind, wurden Deletionsmutanten erzeugt, bei welchen die komplette bzw. der C-terminale Teil der RNK Domäne fehlten. Diese Deletionen konnten im nadV+ Hintergrund erzeugt werden. Die Deletionen konnten in H. influenzae nur zusammen mit dem nadV-Gen transferiert werden oder alternativ nur in die Zellen, die mit pNadRKan Plasmid transformiert wurden. Dies verdeutlicht, dass nicht nur die NMNAT Domäne sondern auch die RNK Domäne bzw. sogar nur wenige C-terminal fehlende Aminosäuren des NadR Proteins essentiell für die Lebensfähigkeit von H. influenzae sind. Gleichzeitig zeigen diese Experimente, dass die RNK-Domäne in Anwesenheit von NadV redundant ist. Ein weiterer Phänotyp der RNK-Deletionsmutante zeigte sich beim Nikotinamidribosyl-Transport. Im Gegensatz zum Wt, welcher ca. 60-80% des 14C-Nikotinamidribosyls aufnahm, konnte für die RNK-Deletionsmutante nur 2-5% Aufnahme gemessen werden. Dies konnte durch das pNadRKan Plasmid komplementiert werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass spontan Aminopyridin-resistente H. influenzae Zellen Mutationen im nadR Gen haben, insbesondere im Walker A-Motif (P-Loop) der RNK Domäne. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass NadR aus Aminopyridin und ATP Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid synthetisieren kann. Somit konnte gezeigt werden, dass die wachstumshemmende Wirkung eigentlich durch das aus Aminopyridin synthetisierte Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid entsteht, welches NAD+ in Redox-Reaktionen verdrängt, wodurch es letztendlich zum Stillstand des Metabolimus kommt. Durch Einführen von gezielten AS-Substitutionen im Walker A und B Motif und in der LID-Domäne von NadR, konnten einige Aminosäuren identifiziert werden, welche essentiell für die Aktivität der RNK Domäne sind. Alle Aminosäuren-Substitutionen führten zum Verlust der RNK Aktivität, die NMNAT Aktivität jedoch war nicht beeinträchtigt. Desweiteren wurden diese NadR Punktmutanten in vivo untersucht. Für alle konnte eine signifikante Defizienz in der Nikotinamidribosyl-Aufnahme beobachtet werden, die gemessene Aufnahme lag im Bereich der RNK-Deletionsmutante. Dadurch konnte eine direkte Korrelation zwischen der RNK Aktivität und der Nikotinamidribosyl-Aufnahme gezeigt werden. In weiteren in vitro Experimenten konnte für NadR eine Feedback-Inhibition durch das NAD+ gezeigt werden, wobei NAD+ in erster Linie die RNK Domäne von NadR inhibiert. Eine graduelle Erhöhung der NAD+ Konzentration führte in den in vitro Assays zu einer graduellen Abnahme der RNK. Bei der NMNAT Aktivität jedoch zeigte sich keine signifikante Inhibition in Anwesenheit von NAD+. Begleitende in vivo Experimente, zeigten eine 2/3 Reduktion der Nikotinamidribosyl-Aufnahme bei den Zellen, die mit NAD+ inkubiert wurden, d. h. höhere intrazelluläre NAD+ Konzentration hatten. Für die genauere Analyse der Feedback-Inhibition durch NAD+ wurden weitere Punktmutanen hergestellt. Bei zwei der Punktmutanten wurde eine Beeinträchtigung der NadR-Aktivität beobachtet, daher wurden diese Punktmutanten von weiteren Analysen im Bezug auf NAD+-Feedback Inhibition ausgeschlossen. Eine Mutante (NadRW256F) jedoch, zeigte ähnliche Aktivität wie das Wt-NadR. In Anwesenheit von NAD+ wurde die RNK Aktivität dieser Punktmutante, im Gegensatz zum Wt-Protein, kaum gehemmt. Dadurch konnte W256 als eine der Aminosäuren identifiziert werden, die an der Vermittlung der NAD+-bedingten Inhibition der RNK-Domäne beteiligt ist.
Neisseria meningitidis (Meningokokken) stellen einen häufigen Erreger von bakterieller Meningitis und generalisierter Sepsis bei Kleinkindern und Jugendlichen dar. Diese Bakterienspezies ist sehr kompetent für horizontalen DNA-Austausch durch Transformation, was zur einer sehr heterogenen Populationsstruktur führt. Innerhalb der Population gibt es wenige klonale Linien, die für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich sind, aber bei gesunden Trägern relativ selten gefunden werden. In den Achtziger Jahren trat ein hypervirulenter Klon in Kanada auf und war dort für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich. Dieser Klon wird als Elektrophoretischen Typ 15 (ET-15) bezeichnet und führt zu besonders schweren Erkrankungsverläufen, und einer hohen Letalität. In den Neunziger Jahren breitete sich dieser Klon in der Tschechischen Republik aus und trat 1998 im bayerischen Landkreis Rottal/Inn bei einem Ausbruch in Erscheinung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verbreitung von ET-15-Meningokokken unter 8000 Kindergartenkindern, Schülern und Bundeswehrsoldaten in elf Landkreisen und kreisfreien Städten sowie in sechs Bundeswehrkasernen untersucht. Die allgemeine Trägerrate an Meningokokken betrug 10,3%. Bei vier Probanden aus zwei Orten wurden ET-15-Meningokoken isoliert, was einer Trägerrate von 0,05% entspricht. Im Landkreis Rottal/ Inn wurden keine ET-15-Meningokokken gefunden. Während des Beobachtungszeitraumes ereigneten sich in Bayern vier Erkrankungsfälle durch diesen Bakterienklon. Der anschließende Vergleich der chromosomalen DNA mittels Pulsfeldgelelektrophorese nach SpeI-Verdau legte nahe, dass es sich bei den Trägerstämmen nicht um vier identische Klone handelte. Ebenso war kein gemeinsames Bandenmuster zwischen den vier Trägerisolaten und den vier Erkrankungsstämmen zu erkennen. Parallel dazu wurden die Träger- und Erkrankungsstämme mit identischen Referenzstämmen aus der Tschechischen Republik und aus Rottal/Inn verglichen, wobei sich auch hier kein gemeinsames DNA-Muster zeigte. Bei den Träger- als auch bei den Erkrankungsisolaten aus dem Untersuchungszeitraum in Bayern handelt es sich um neue Varianten des ET-15-Klones, die in Folge klonaler Expansion entstanden sein könnten. Die Inzidenz des ET-15-Trägertums in Bayern im Beobachtungszeitraum ist als niedrig einzuschätzen.
Ich praesentiere hier die Klonierung und Funktion eines ACAT-aehnlichen Enzyms von Toxoplasma gondii (T. gondii), das lebensnotwendig fuer T. gondii zu sein scheint. Medikamente, die gegen die menschliche ACAT gerichtet sind, erhoehen in geringen Konzentrationen die ACAT-Aktivitaet von T. gondii. In hoeheren Konzentrationen schraenken sie jedoch die Vitalitaet von T. gondii ein.
In der vorliegenden Dissertation wurde für die Entwicklung eines Lebendimpfstoffs zum Schutz vor Infektionen durch Neisseria meningitidis Serogruppe B zunächst ein geeigneter Impfstamm aus mehreren Neisserienstämmen der Serogruppe B, ST-32 Komplex, ausgewählt. In diesem sollte anschließend die Sicherheit für den Impfstoff-Empfänger durch die unabhängige Deletion sowohl eines Virulenzgens als auch eines Gens, das die homologe Rekombination der Neisserien bedingt, garantiert werden. Als Virulenzgen wurde siaD deletiert, das für ein essentielles Enzym der Kapselbiosynthese kodiert (Edwards et al., 1994). Dabei wurde eine neue Transformationsmethode eingesetzt (modifiziert nach Gunn und Stein; Gunn und Stein, 1996). Die kapsellose siaD-Deletionsmutante wurde dann genotypisch und phänotypisch anhand verschiedener Adhärenz- und Invasionsassays an humanen Epithel-, Endothel- und Dendritischen Zellen geprüft. Dabei fanden sich Unterschiede im Adhärenz und Invasionsverhalten im Vergleich zu einer anderen siaD-Mutante des gleichen Wildtyps. Diese Unterschiede wurden durch eine im Westernblot nachgewiesene, bei beiden siaD-Mutanten unterschiedliche Opa-Expression begründet, da das Opa-Protein als Protein der äußeren Bakterienmembran Oberflächenproteine von humanen Epithel- und Endothelzellen bindet und so zur Adhärenz an die Zielzellen führt (Virji et al., 1993, 1995). Weiterhin sollte in der siaD-Deletionsmutante das für die homologe Rekombination essentielle recA-Gen deletiert werden (Koomey und Falkow, 1987; Miller und Kokjohn, 1990). Der Nachweis einer recA-Deletion gelang trotz mehrfacher Ansätze mit der neuen Transformationsmethode nicht, da die Deletionsrate von recA wahrscheinlich unter der Sensitivität der hier verwendeten Analysemethoden lag.
Die Anwendbarkeit eines Oligonukleotid-basierten Microarray-Systems zur Transkriptomanalyse von Neisserie meningitidis Serogruppe B wurde im Vergleich mit einem cDNA-basierten System demonstriert. Hierzu wurde für ein Subset von 60 Genen die Eigenschaften anhand von Parallelhybridisierungen sowie eines vormals etablierten Hitzeschock Modells untersucht. Aufgrund der Vergleichsdaten wurde ein Gesamtgenmom-Array auf Oligonukleotidbasis etabliert und zur Analyse der Hitzeschock-Reaktion verwendet. Schließlich wurde mit diesem Array-System ein Modell zur Untersuchung der Transkriptomänderung nach Konfrontation mit humanem Serum realisiert. Insgesamt zeigten 284 Gene (13% des Genoms) eine differentielle Regulation mit ebenmäßigem Verhältnis von Hoch- und Herunterregulation. Die Anwendbarkeit im Hinblick auf die Suche nach potentiellen Vakzinekandidaten wurde diskutiert.
Neisseria meningitidis ist Auslöser der Meningokokkenmeningitis und der gefürchteten Meningokokkensepsis, die mit einer hohen Letalität belastet sind. Meningokokken lassen sich anhand ihrer Polysaccharidkapsel in verschiedene Serogruppen einteilen, wobei die Serogruppen A, B, C, W135 und Y mit Krankheit assoziiert sind. Krankheitsisolate aus Serum oder Liquor sind fast ausnahmslos bekapselt, während Trägerisolate, die aus dem Nasopharynx von ca. 10% der gesunden Bevölkerung isoliert werden können, häufig unbekapselt sind. Das Komplementsystem, das einen wichtigen Abwehrmechanismus gegen Meningokokken darstellt, ist Teil der unspezifischen angeborenen Immunabwehr und besteht aus mehreren Serumproteasen, die in einer Kaskade der Reihe nach aktiviert werden, um am Ende eine Pore (MAC) in der Membran des Pathogens zu bilden. In dieser Arbeit wurden Faktoren untersucht, die Neisseria meningitidis dazu befähigen, im Serum zu überleben und der Lyse durch das Komplementsystem zu entgehen. Ein Schwerpunkt lag dabei auf den Serumresistenzmechanismen von Serogruppe A Meningokokken, vergleichend wurden anschließend die Mutanten der Serogruppen B, C, W135 und Y untersucht. Um den Einfluss verschiedener Pathogenitätsfaktoren auf die Serumresistenz zu beurteilen, wurden isogene knock-out Mutanten verwendet, die durch ELISA und Tricingel auf ihre Kapsel- und LPS Struktur überprüft wurden. Die Serumresistenz der Mutanten wurde durch Bakterizidietests bestimmt; zur Detektion der Bindung von Komplementkomponenten, Immunglobulinen und regulatorischen Proteinen wurden FACS Analysen, Western Blot und ELISA benutzt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kapsel der Serogruppe A Meningokokken essentiell für das Überleben im Serum ist. Die Expression der Polysaccharidkapsel führte auch bei den übrigen Serogruppen zu einer verminderten Deposition von Komplementkomponenten (C3, C4 und MAC) auf der Bakterienoberfläche. Die verminderte Komplementdeposition war nicht durch veränderte Antikörperbindung bedingt. Die bekapselten und unbekapselten Bakterien zeigten die gleichen Bindungsmuster von IgG und IgM. Auch Faktor H, ein wichtiger Regulator des Komplementsystems, ist an der Vermittlung der Serumresistenz durch die Kapsel nicht beteiligt. Die serumsensiblen unbekapselten Mutanten banden mehr Faktor H, als die entsprechenden bekapselten Meningokokken. Aus der Literatur ist bekannt, dass LPS Immunotyp und LPS Sialysierung die Serumresistenz pathogener Neisserien beeinflussen kann. Für den Serogruppe A Stamm konnte nur dann ein Überlebensvorteil durch LPS Sialysierung gezeigt werden, wenn die unbekapselte Mutante untersucht wurde. Die Expression eines verkürzten L8 LPS hingegen führte bei diesem Stamm unabhängig von der Kapselexpression zu einer erhöhten Serumresistenz. Besonders auffällig bei den entsprechenden Kontrollexperimenten mit Derivaten anderer Serogruppen war die außergewöhnliche Komplementdeposition durch den Serogruppe Y Stamm. In weiterführenden Experimenten konnten wir in Kooperation mit Dr. Sanjay Ram, Boston, zeigen, dass besondere Phosphoethanolamin Substitutionen des LPS für dieses Phänomen verantwortlich waren. Die vorliegende Arbeit beleuchtet die Komplexität der Auseinandersetzung von Meningokokken mit dem Komplementsystem. Sie zeigt auf, dass Klon spezifische Unterschiede für das Verständnis der Serumresistenz von Bedeutung sind. Die Experimente belegen, dass bei Serogruppe A Meningokokken neben der Kapsel auch das LPS einen modulierenden Einfluss auf die Serumresistenz hat.
Neisseria meningitidis, ein pathogenes Bakterium, das schwere Fälle von Sepsis und Meningitis verursacht, interagiert während der Infektion mit verschiedenen Oberflächen des Wirtes. Die schnellstmögliche Anpassung an die spezifischen Milieubedingungen im Wirtsorganismus ist daher ein essentieller Schritt in der Pathogenese. Durch Verwendung von DNA-Mikroarrays, die auf gespotteten Oligonukleotiden basieren, wurde das Transkriptionsprofil von N. meningitidis während der Infektion von Epithel- und Endothelzellen analysiert. Zur Analyse wurde die isogene kapseldefiziente siaD-Mutante des N. meningitidis Stammes MC58 verwendet. 72 Gene konnten nach Kontakt mit Epithelzellen und 48 Gene nach Kontakt mit Endothelzellen als differential reguliert identifiziert werden. Darunter auch eine große Anzahl von Virulenzgenen. Während ein Teil der detektierten Gene in beiden Systemen als differentiell reguliert galt, gab es doch eine Anzahl von ORF´s, die nur für ein Zellkulturmodell spezifisch reguliert waren (59 spezifische Gene für HEp-2 und 35 spezifische Gene für HBMEC). Für einige ausgewählte Gene wurde die im Mikroarray detektierte Regulierung durch Quantitative RT-PCR nochmals bestätigt. Die Funktion von den als induziert identifizierten Genen rfaF, hem und NMB1843 wurde im Anschluß durch die Konstruktion von Mutanten näher untersucht. Das rfaF-Gen, eine in der LPS Biosynthese involvierte Heptosyl-II-transferase, wurde in beiden Zellkultursystemen als differentiell reguliert identifiziert. Die Deletion des Gens führte speziell für den bekapselten Stamm MC58 zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasion nach Infektion von Epithelzellen. Untersuchungen des Infektionspotential für HBMEC Zellen ergaben keine signifikant veränderte Adhärenz und Invasion. Bei zusätzlicher Deletion von rfaF in einem opc negativen Stamm konnte eine Abnahme der bakteriellen Aufnahme im Zellkulturmodell HBMEC beobachtet werden. Dagegen zeigten die opc, rfaF negativen Mutanten nach Kontakt mit HEp-2 Zellen keine verminderte Invasion. Weiterhin führte die Deletion des rfaF-Gens zu einer verstärkten Sensibilität gegenüber humanen Serum. Diese Daten deuten daraufhin, dass die LPS-Struktur eine Rolle in der bakteriellen Zellinteraktion spielt, speziell wenn eine für die Adhäsion wichtige Komponente nicht mehr exprimiert wird. Der ORF NMB1843, der für einen Transkriptionsregulator aus der MarR-Familie kodiert, ebenso wie das Hämolysin Gen konnten nur nach Kontakt mit HBMEC Zellen als differentiell reguliert identifiziert werden. In Infektionsstudien zeigten die hem-Mutanten keine veränderte Adhärenz und Invasion. Weiterhin war die Zytotoxizität der Mutanten nicht eingeschränkt. Ob der ORF NMB1646 daher als Hämolysin fungiert bleibt zu klären. Durchgeführte Mikroarraystudien mit den NMB1843-Mutanten, führten zur Identifizierung einiger ORF´s, die möglicherweise unter der Kontrolle dieses Regulators stehen. Dazu gehören die Virulenz assoziierten Gene sodC, iga und nadA sowie das für ein Hämolysin kodierende Gen NMB1779. Die Untersuchung des Expressionsprofils mittels SDS-PAGE Analyse führte zur Identifizierung einer Proteinbande bei 210 kDa, die spezifisch für die NMB1843 negativen Stämme ist. Dieses Protein wurde als nadA identifiziert. NadA induziert im Tiermodell bakterizide Antikörper und gilt daher als möglicher Impfstoffkandidat. Die in dieser Arbeit vorgelegten Daten liefern neue Einblicke in die Pathogenitätsmechanismen von N. meningitidis und belegen die Bedeutung der transkriptionellen Genregulation in den einzelnen Stadien der Meningokokkeninfektion.
Neisseria meningitidis ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen. Die Typisierung ist die Grundlage für die epidemiologische Überwachung der Erkrankung durch Meningokokken. Die Endonuklease NmeDI ist spezifisch für die klonalen Linien des ST-8 und ST-11 Komplex Meninkokken, die mit Erkrankungen der Serogruppe C assoziiert sind. Deshalb wurde für die rasche Identifizierung von Stämmen dieser Linien ein monoklonaler Antikörper entwickelt. Der Antikörper erkennt spezifisch die ST-8 und ST-11 Komplex Meningokokken in Western-Blot und Dot-Blot. Er wird mitlerweile routinemäßig im Nationalen Referenzzentrum für Meningokokken zur Identifizierung der Linien ohne zusätzliche Anwendung der Multilokus Sequenz Typisierung (MLST) eingesetzt.
Obwohl inzwischen über 200 verschiedene Serogruppen von V. cholerae bekannt sind, wurden Ausbrüche der Cholera hauptsächlich von Stämmen der unbekapselten Serogruppe O1 und der bekapselten Serogruppe O139 verursacht. Die Komponenten des Lipopolysaccharids (LPS) von O1 und O139, sowie die Kapsel von O139 tragen zur Kolonisierung im Gastrointestinaltrakt bei. Um die Funktion des LPS und der Kapsel als Virulenzfaktor näher zu untersuchen, wurden Adhäsionsstudien mit definierten LPS- und/ oder Kapsel-Mutanten beider pathogener Serogruppen durchgeführt. Dazu wurde die Mukus-produzierende humane Darmzelllinie HT-29-Rev MTX verwendet. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (Wt) konnte für eine O Antigen-Mutante von O1 eine Reduktion um 85%, für eine O Antigen/ Kapsel-Mutante von O139 eine Reduktion um 70% in der Adhäsionsrate festgestellt werden. Ein Beitrag von ToxR regulierten Genprodukten ist ebenfalls möglich. Weiterhin wurden mit WavJ und WavD zwei Genprodukte der Kernoligosaccharid -Biosynthese charakterisiert, welche bislang nur in dem wa*-Genclustertyp 1 der klinischen Isolate nachgewiesen worden sind. Es konnte gezeigt werden, dass beide Genprodukte an der Biosynthese des Kern OS beteiligt sind, wobei WavJ mit hoher Wahrscheinlichkeit die Heptosyl-IV-Transferase darstellt. Die wavDJ-Doppelmutanten beider Serogruppen wiesen eine erhöhte Sensitivität gegenüber Novobiocin auf. Dagegen konnte eine Attenuation der Mutanten im Mausmodell nur für die Serogruppe O139 demonstriert werden. Ein Schlüsselenzym der LPS-Biosynthese stellt die Oberflächenpolymer:Lipid A-Kern OS-Ligase (WaaL), kurz O Antigen-Ligase genannt, dar. In dieser Arbeit wurden die in der Primärstruktur stark unterschiedlichen Ligasen aus einem pathogenen (P27459) und apathogenen (V194) V. cholerae Isolat strukturell und funktionell analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität beider Ligasen von der Anwesenheit eines N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Kernoligosaccharid abhängig ist. Dieser Zucker wird durch das Genprodukt WavL transferiert, welchem in dieser Arbeit die Aktivität einer N-Acetylglucosaminyltransferase zugeordnet werden konnte. Das Gen wavL wurde in allen zur Verfügung stehenden V. cholerae Isolaten nachgewiesen und stellt wahrscheinlich eine generelle Voraussetzung des Kern OS für eine O Antigen-Anheftung dar. Im Gegensatz dazu, diskriminiert die An- bzw. Abwesenheit einer Galaktose (Gal) im Kern OS die Spezifität der Ligasen von V. cholerae P27459 bzw. V194. Dabei ist die Aktivität der Galaktosyltransferase WavM, essentiell für die Aktivität der Gal-abhängigen Ligase von V194. Die Gal-unabhängige Ligase von P27459 wird hingegen durch die Anwesenheit von Gal im Kern OS inhibiert. Hybridfusionen der beiden Ligasen deuten an, dass die Erkennungsdomäne für Gal in der C-terminalen Hälfte lokalisiert ist. Erstmals wurde die Topologie einer Ligase durch PhoA- und LacZ-Fusionen analysiert. Die Suche nach konservierten Aminosäuren (AS) in verschiedenen Ligasen führte zur Identifizierung der Motive R(X3)L und H(X10)G in zwei periplasmatischen Schleife. Ein Austausch des R oder des H in diesen Motiven führte zum Verlust der Ligase-Aktiviät von WaaL aus V. cholerae und S. enterica. Damit geben diese Motive einen ersten Hinweis auf das aktive Zentrum des Enzyms. Desweiteren wurde nach möglichen O Antigen-Transportern bei V. cholerae gesucht, welche bislang noch nicht identifiziert worden waren. Über die Anpassungen von V. cholerae an aquatische Ökosysteme, insbesondere hinsichtlich der wechselnden Osmolarität, ist nahezu nichts bekannt. Durch ein in dieser Arbeit konstruiertes und etabliertes Transposonsystem konnten 3600 Mutanten erzeugt und auf Wachstumsdefekte unter hypertonischen Bedingungen untersucht werden. Eine dieser osmosensitiven Mutanten wies eine Insertion in dem Locus VCA0565 auf, welcher für eine putative Sensor-Histidinkinase kodiert. Mit dem Regulator, kodiert durch VCA0566, stellt VCA0565 das putative Zwei-Komponentensystem OsmRK dar. Transkriptomanalysen von osmR/ K-Mutanten lieferten keine Erklärung des Wachstumsdefekts unter hypertonischen Bedingungen, zeigten aber eine Vernetzung der durch OsmR/ K regulierten Gene mit dem ToxR-Regulon auf. Analysen der Außenmembran demonstrierten, dass eine Mutation von osmR/ K zu einer Repression von OmpU unter hohen Salzkonzentrationen führt. Vergleichende Experimente mit weiteren Mutanten deuteten an, dass es in osmR/ K- und toxS-Mutanten unter erhöhten Salzkonzentrationen zur Degradation von ToxR kommt. Während die Deregulation von OmpU in osmR/ K-Mutanten nur unter Salzstress zu beobachten war, führte in der toxS-Mutante auch ein Membranstress durch Zugabe von Protamin zu einer Repression von OmpU. Die zu OsmR/ K nah verwandten putativen Zwei-Komponentensysteme EnvZ/ OmpR und VCA0257/ VCA0256 hatten unter keiner der getesteten Bedingungen einen Einfluss auf die Proteine der AM. Weiterhin wurde eine C-terminale Degradation von HutA unter hypertonischen Bedingungen aufgedeckt.
Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren.
Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten.
Im Rahmen der von November 1999 bis März 2000 durchgeführten bayerischen Meningokokkenträgerstudie wurden in zahlreichen Kindergärten und Schulen der bayerischen Gemeinden Ansbach, Augsburg, Erlangen, Griesbach, Ingolstadt, München, Pfarrkirchen, Sonthofen und Weiden insgesamt 287 Neisseria lactamica-Stämme isoliert. 26 ausgewählte, aus den benachbarten Städten Augsburg, Ingolstadt und München stammende Isolate wurden einer Multi-Lokus-Sequenztypisierung (MLST) zur Untersuchung ihrer genetischen Diversität unterzogen. Dabei wurden sowohl Sequenzen der 3 Stoffwechselgene argF, recA und rho, als auch Sequenzen des 16S rRNA-Gens analysiert. Für das 16S rRNA-Gen fanden sich zehn, für argF fünf, für recA acht und für rho neun differente Allele. Auf Basis der vier analysierten Gene konnten 17 verschiedene Genotypen definiert werden, von denen zwölf nur einmal, fünf hingegen mehrmals vorkamen. Es ist anzunehmen, dass durch Sequenzierung der vier in dieser Studie verwendeten Gene bereits eine ausreichende Diskriminierung von Neisseria lactamica erfolgte, da Versuche eine weiterführende Diskriminierung durch Sequenzierung des porB-Gens zu erreichen, keine wesentlichen zusätzlichen Informationen erbrachten. Durch visuelle Inspektion der Sequenzen konnte bei allen vier Genloci das Überwiegen von Rekombinationsereignissen gegenüber Punktmutationen bestätigt werden, so dass für die Spezies Neisseria lactamica horizontaler Gentransfer anzunehmen ist. Da nur ein einziger Genotyp in zwei verschiedenen Städten beobachtet wurde, zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass eine klonale Ausbreitung von Neisseria lactamica nur dann nachweisbar ist, wenn eine epidemiologische Verknüpfung zwischen Trägern besteht.
Helicobacter pylori ist ein pathogenes Bakterium, das verantwortlich gemacht wird für verschiedene Erkrankungen des Magens und Duodenums, wie beispielsweise chronische Gastritis, peptische Ulzera und maligne Lymphome. Das Bakterium zeichnet sich durch eine hohe Rekombinationsrate aus und besitzt ein hohes Maß an genetischer Allelvielfalt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rekombinationsrate und die Länge der rekombinerten DNA-Importe anhand von sequentiellen Isolaten, die zu definierten Zeitpunkten aus dem selben Patienten isoliert wurden, untersucht. Es wurden zehn Gene, darunter sieben 'housekeeping' Gene und drei virulenzassoziierte Gene, amplifiziert und sequenziert. Die Ergebnisse zeigten eine bis dahin noch nicht für Bakterien beschriebene Fragmentlänge der DNA-Importe von durchschnittlich lediglich 417 Basenpaaren. Die Rekombinationsrate war außergewöhnlich hoch. DNA-Microarray-Analysen konnten zeigen, dass es trotz dieser hohen Rekombinationsrate nur wenige Veränderungen in der genomischen Genausstattung gab. Jedoch hing das Auftreten von Rekombinationsereignissen direkt mit Veränderungen der Genausstattung zusammen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein neues in vitro-Transformationsmodell entwickelt, das die in vivo ermittelten Resultate nachvollziehen sollte. Das Modell konnte sowohl die in vivo gefundene Rekombinationsrate als auch den Import von kurzen DNA-Fragmenten bestätigen, die zu einem Allelmosaik zwischen DNA-Rezipient und Donor führten. Auffällig war eine stark verminderte Transformierbarkeit mit Donor-DNA aus asiatischen H. pylori-Stämmen. Um eine mögliche Beteiligung des Nukleotid-Excisions-Reparatur (NER) Mechanismus an der Rekombination zu ermitteln, wurden zwei Gene des Mechanismus ausgeschaltet. Die Ergebnisse der NER--Mutanten (uvrA-, uvrD-) zeigten eine starke Verminderung der Transformierbarkeit. Diese Verminderung hatte jedoch keinen Einfluss auf die Länge der rekombinierten DNA-Importe. Das Ausschalten des uvrA-Gens führte zudem zu einer erhöhten Sensibilität gegenüber UV-Licht. Der NER-Mechanismus ist bei H. pylori in einer noch nicht aufgeklärten Weise an der Rekombination beteiligt. In einem Rhesusaffen-Tiermodell wurde die initiale Besiedlung mit H. pylori untersucht. Die Tiere stellen einen natürlichen Wirt dar und zeigen ähnliche Krankheitssymptome wie menschliche Patienten. Die Rhesusaffen wurden experimentell mit zwei klinischen H. pylori-Isolaten infiziert. Die Reisolation zu bestimmten Zeitpunkten zeigte, dass sich nur einer der beiden Stämme im Affenmagen etablieren konnte und der zweite Stamm verdrängt worden war. In einem zweiten Versuchsansatz wurden die persistent infizierten Affen mit vier weiteren H. pylori-Stämmen infiziert, um eine transiente Koinfektion zu simulieren. Diese Stämme verdrängten jedoch den bereits etablierten Stamm, und es konnte keine in vivo-Rekombination festgestellt werden. Dennoch ist dieses Modell das Erste, in dem eine persistierende experimentelle H. pylori-Infektion in Rhesusaffen über einen Zeitraum von mehr als vier Jahren nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf den beim Menschen meist unentdeckten Anfang der H. pylori-Infektion. Die Untersuchungen an weiteren Spezies des Genus Helicobacter zeigten, dass die beschriebene Spezies Heelicobacter nemestrinae keine eigene Spezies darstellt, sondern der Spezies H. pylori zugeordnet werden konnte. Den damit nächsten 'Verwandten' stellt die Spezies H. acinonychis dar, deren Stämme sich untereinander wesentlich weniger stark unterscheiden als H. pylori-Stämme. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Daten zum Verständnis der Evolution und Mikroevolution innerhalb eines Wirtes von H. pylori, die zu besseren Strategien in der Bekämpfung dieses pathogenen Bakteriums führen können.
Das Gram negative Bakterium Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger der bakteriellen Meningitis. Obwohl das ausschließlich humanpathogene Bakterium in bis zu 25% der Europäischen Bevölkerung die oberen Atemwege als harmloser Kommensale besiedelt, kommt es unter bestimmten, noch nicht ganz verstandenen Bedingungen zu einer klinisch manifesten Infektion. In dieser Arbeit wurde die neue Technologie der DNA Mikroarray Technologie für die Untersuchung des Transkriptoms bei Neisseria meningitidis etabliert. Untersucht wurde die Reaktion von N. meningitidis auf einen Hitzeschock, eine plötzliche Steigerung der Temperatur. Während einer Infektion wird das Bakterium durch induziertes Fieber sehr ähnlichen Bedingungen ausgesetzt. Im Ergebnis erlaubten die RNA Expressionsanalysen nicht nur eine sichere Unterscheidung deregulierter Gene von Genen mit konstanter Expression, sondern es konnte auch das Ausmaß der Deregulation exakt bestimmt werden. Die Daten der DNA Mikroarray Experimente wurden mit der etablierten Technik der RT-PCR exakt bestätigt. Bei den Hitzeschock-Versuchen mit Neisseria meningitidis konnten zahlreiche ORFs als Hitzeschock-Gene identifiziert werden. Die Funktion dieser Gene, darunter groEL/groES und dnaJ/dnaK, war bereits bei anderen Organismen beschrieben worden, was die Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unterstreicht. Es konnte gezeigt werden, dass die Intensität des Hitzeschocks und damit die Deregulation der Hitzeschock-Gene mit steigender Temperatur zunimmt. Eine Erklärung für dieses interessante Ergebnis wäre, dass mit Steigerung der Temperatur der Schaden im Bakterium zunimmt und dadurch auch mehr Hitzeschock Proteine zur Reparatur benötigt werden. Daneben wurde erstmals die transkriptionelle Beeinflussung von Genen aus dem Bereich der Transformation durch einen Hitzeschock gefunden. Diese Daten konnten durch einen phänotypischen Nachweis der Verminderung der Transformationsaktivität von Meningokokken nach einem Hitzeschock bestätigt werden. Diese neue Technik wird eine der Schlüsseltechnologien für die Forschung in der postgenomischen Ära sein. Viele Fragen in dem noch lückenhaften Wissen über die Pathologie von Neisseria meningitidis sollen sich in Zukunft mit Hilfe der DNA Mikroarrays beantworten lassen.
Die opportunistische humanpathogene Hefe Candida glabrata ist zum zweithäufigsten Erreger einer Candidose avanciert. Infektionen mit Candida glabrata sind schwierig zu behandeln und bergen eine hohe Sterblichkeit bei Risikopatienten in sich. Dies liegt vor allem in der geringen Sensitivität von C. glabrata gegenüber den etablierten Azol-Derivaten begründet. Deswegen ist man bei C. glabrata, wie auch bei anderen pathogenen Pilzen, auf der Suche nach geeigneten Zielstrukturen für neue Antimykotika. Dabei rückte die Hemmung der 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase in den Brennpunkt wissenschaftlichen Interesses. Die 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase ist ein pilzspezifisches Enzym, welches beim Menschen nicht vorkommt. Sie ist am Zellwandaufbau der Hefen beteiligt und wird durch die FKS Gene codiert. Die 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase-Hemmer sind wirksam gegenüber Pilzen, die gegenüber anderen Antimykotika resistent sind. Dies führte zur Entwicklung der Echinocandine, echinocandin ähnlicher Lipopeptide und Pneumocandine, wovon einige in klinische Versuche aufgenommen wurden. In dieser Arbeit wurde ein FKS homologes Gen von C. glabrata identifiziert, kloniert und sequenziert. Die erhaltene Gensequenz des gefundenen FKS-Homologs von Candida glabrata wurde in der GenBank des National Center for Biotechnological Information veröffentlicht.
Die vorliegende Untersuchung konnte die Hypothese einer klonalen Entwicklung von EHEC O103:H2 bestätigen. Die in Clustern angeordnete Übereinstimmungsrate der RAPD-Fragmentierungsmuster und der Plasmidrestriktionen zeigen diese Ähnlichkeit innerhalb der Serogruppe auf, während Gemeinsamkeiten mit dem O157-Referenzstamm sich auf das Vorhandensein ähnlicher Virulenzfaktoren beschränken. Diese Varianz der phänotypischen und genotypischen Eigenschaften zeigte bei der Untersuchung hinsichtlich ihrer Bedeutung für diagnostische, phylogenetische und epidemiologische Fragestellungen unterschiedliche Wertigkeiten. Die ständig fortschreitende Differenzierung der Virulenzdeterminanten kann dabei nicht nur Ansätze zur Diagnostik sondern auch zur Therapie liefern und muss daher weiter verfolgt werden. Dennoch ist weiterhin der Nachweis des krankheitsauslösenden Shiga Toxins in der Routinediagnostik vermuteter EHEC-Erkrankungen erforderlich, mittels differenzierter Multiplex-PCR-Methoden können dabei auch Kombinationen relevanter Pathogenitätsfaktoren in einem Arbeitsgang erfasst werden. EHEC O103 traten mehrere Jahre nach E. coli O157:H7 als HUS-Erreger in Erscheinung und haben wahrscheinlich die dazu erforderliche Kombination von Pathogenitätsfaktoren erst später erworben. EHEC-Erkrankungen weisen eine steigende Inzidenz auf, können beim Menschen zu lebensbedrohlichen Krankheitsbildern führen, besitzen aber auch in der Veterinärmedizin eine hohe Relevanz. Da bisher kausale Therapien klinisch noch nicht verfügbar sind, muß aktuell vor allem die Prävention durch Infektionsprophylaxe und rasche Erkennung von Erkrankungsfällen im Vordergrund stehen.
Vergleichende Proteomanalyse eines avirulenten und virulenten Stammes von Legionella pneumophila Sg1 Subgruppe OLDA unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die Stämme unterliegen einer spontanen LPS-Phasenvariation und unterscheiden sich phänotypisch in multiplen Eigenschaften. Es zeigten sich different exprimierte Proteine der Membranoberfläche, der LPS-Biosynthese und des Bakterienstoffwechsels.
Kurzfassung in deutsch Ziel dieser Studie war die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque bei einem Hypophosphatasiepatientenkollektiv durch Anwendung der 16S rRNA Technologie. Das Kollektiv bestand aus sieben männlichen Patienten mit einer infantil-juvenilen Hypophosphatasie. Es sollten mikrobiologische Evidenzen für oder gegen die Hypothese einer frühen Parodontitis bei Hypophosphatasiepatienten gewonnen werden. Subgingivale Plaqueproben wurden von jedem Patienten entnommen. Anschließend folgte die DNA Extraktion aus den Plaqueproben und die Amplifikation der 16S rRNA Gene mittels zweier verschiedener universeller Primer-Paare: 27f/519r; 515f/1525r. Die PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Dann folgte ein Vergleich der Sequenzen mit der Genbank Database durch den BLAST-Server des National Center for Biotechnology Information (NBCI, Bethesda, MD, USA). Insgesamt wurden zwei verschiedene 16S rRNA Genbanken erstellt und 101 Klone pro Genbank identifiziert. Mit der 27f/519r PCR wurden 15 bakterielle Familien, mit der 515f/1525r PCR 10 bakterielle Familien identifiziert. 66 Phylotypen wurden in der 27f/519r Genbank identifiziert, 41 in der 515f/1525r Genbank. Der Coverage war 50% in der 27f/519r Genbank und 73% in der zweiten Genbank. In allgemeinen zeigte sich ein hoher Anzahl der Keime der physiologischen Plaqueflora (Streptococcus sp. und Actinomyces sp.), dagegen kamen putative Parodontalpathogene wie Porphyromonas gingivalis, Filifactor alocis, Tannerella forsythensis, Campylobacter rectus niemals vor. Die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque erbrachte eine deutlich andere Zusammensetzung im Vergleich zu Padodontitispatienten. Es zeigte sich somit keine mikrobiologische Evidenz für eine Parodontitis bei dem Hypophosphatasiepatientenkollektiv.
128 Meningokokkenstämme unterschiedlicher klonaler Linien und Serogruppen aus verschiedenen Ländern wurden im Rahmen eines Screenings auf die Präsenz von Plasmiden untersucht. Aus 66% der Stämme konnten Plasmide isoliert werden. Diese waren innerhalb der verschiedenen klonalen Linien spezifisch verteilt. Das 1,986 kb große Plasmid pJS-A (EMBL Accession Number AJ238491) fand sich ausschließlich in Serogruppe A Stämmen der Subgruppe VI. Das 7,245 kb große Plasmid pJS-B (EMBL Accession Number AJ277475) wurde in 91% der untersuchten ET-37 Stämme und in 67% der nahe verwandten Cluster A4 Stämme gefunden. Es ist ein hochspezifischer Marker für diese klonalen Linien. Aus Vertretern des ET-5 Komplexes konnten keine Plasmide isoliert werden. Die Plasmide pJS-A und pJS-B wurden vollständig sequenziert. Beide zeichnen sich durch einen für Meningokokken untypisch hohen AT-Gehalt aus (pJS-A: 55,4%, pJS-B: 57,9%). Auf pJS-A befinden sich zwei, auf pJS-B acht offene Leseraster. Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergab für beide Plasmide keine signifikanten Homologien zu Datenbankeinträgen. Für pJS-B wurde an Position 20 bis 307 eine 93%ige Identität mit einer für das Genom des Gonokokkenstammes MS11-A beschriebenen Region festgestellt, welche die beiden Inverted Repeats IR1 und IR2 enthält und dem Gen pivNG benachbart ist, das für eine Rekombinase kodiert. Bei der Repeat-Region des Gonokokkenstammes MS11-A handelt es sich nach Carrick et al. möglicherweise um eine Rekombinationsstelle. Es konnte gezeigt werden, dass pJS-B über seine homologe Repeat-Region chromosomal integriert. Ob es jedoch als wirkliches Plasmid eigenständig replizieren kann, bleibt zweifelhaft. pJS-A und pJS-B stellen Beispiele für die spezifische und stabile Verteilung von DNA-Elementen in einer Bakterienpopulation dar, die sich grundsätzlich durch genetische Vielfalt und regen Austausch von DNA auszeichnet. pJS-B ist eines von vielen DNA-Elementen, die für den ET-37 Komplex und den Cluster A4 spezifisch sind. Dies unterstützt das Konzept der genetischen Isolierung dieser hypervirulenten Linien.
Charakterisierung und Lokalisation der Toxoplasma gondii Katalase: Peroxisomen in Apicomplexa?
(2002)
Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer, einzelliger Parasit aus dem Phylum der Apicomplexa. Infektionen des Menschen mit T. gondii verlaufen meist subklinisch. Nach einer Infektion persistiert der Erreger für viele Jahre in Hirn- und Muskelgewebe. Durch Reaktivierung des Erregers, z. B. durch eine Immunschwächekrankheit oder unter Immunsuppression, kann eine Enzephalitis mit septischer Streuung entstehen. Eine diaplazentare Infektion führt zur Fetopathia toxoplasmotica mit Früh- und Totgeburten oder zu der typischen enzephalitischen Trias aus Chorioretinitis, Hydrozephalus und zerebralen Verkalkungen. Ein Mechanismus, der es T. gondii ermöglicht im Wirtsorganismus zu überleben, ist die ungewöhnlich hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber freien Radikalen. Die wichtigste Quelle für freie Radikale bei der Abwehrreaktion des Wirtsorganismus ist Wasserstoffperoxid (H2O2 ). Es wird beim sogenannten „respiratory burst“ von Makrophagen freigesetzt, diffundiert dann durch biologische Membranen und schädigt DNA, Lipide und Proteine durch Zerfall in Sauerstoffradikale. Außerdem entsteht (H2O2 ) auch bei normalen Stoffwechselvorgängen in den Persoxisomen der Zelle. Das Enzym Katalase (EC 1.11.1.6) wandelt zweiWasserstoffperoxidmoleküle in Wasser und Sauerstoff um und eliminiert somit toxisches Wasserstoffperoxid. Katalase liegt zumeist in spezialisierten Zellorganellen, den Peroxisomen oder Microbodies, vor. Dort dient es zum Abbau von bei metabolischen Prozessen entstehendem Wasserstoffperoxid. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Katalase von Toxoplasma gondii kloniert und charakterisiert. Die Klonierung von T. gondii Katalase cDNA ergab ein Protein mit 502 Aminosäuren und einem errechneten Gewicht von 57.2 kDa mit starker Homologie zu anderen eukaryontischen Katalasen. Ein polyklonales Antiserum gegen ein GST-Fusionsprotein zeigte imWestern-blot eine Bande bei ungefähr 63 kDa. Die Immunfluoreszenz zeigte ein vesikuläres Kompartiment im vorderen Ende des Parasiten. Dieses kann von anderen Zellorganellen (Mikronemen, Rhoptrien, Granula densa und dem Apikoplast) durch doppelte Immunfluoreszenzmarkierung unterschieden werden. Zytochemisch können Katalasen durch die DAB-Präzipitationstechnik nachgewiesen werden. Hier zeigten sich vesikuläre Strukturen vor dem Nukleus in der Lichtmikroskopie und runde, spezifische Präzipitate mit einem Durchmesser von 100 bis 300nm in der Elektronenmikroskopie. Am C-terminus der T. gondii Katalase findet sich ein „peroxisomales Targeting Signal“ (PTS1) in den letzten 3 Aminosäuren (-AKM). Die Expression der vollständigen Katalase in CHO-Zellen resultiert in einer peroxisomalen Lokalisation, während ein Konstrukt ohne die letzten 3 Aminosäuren im Zytosol verbleibt. Wird das PTS1 mit einem Reporterprotein (Chloramphenicol-Acetyltransferase) fusioniert, wechselt dessen Lokalisation vom Zytosol zu den Peroxisomen. Damit wurde gezeigt, daß das PTS1 der T. gondii Katalase in einem heterologen System sowohl im Kontext der Katalase als auch eines Reporterproteins den Import in Peroxisomen vermitteln kann. Diese Ergebnisse sind die ersten Hinweise auf Peroxisomen in einem Parasiten der Apikomplexa. Zugleich ist T. gondii, evolutionsbiologisch gesehen, der bisher niedrigste Eukaryont in dem bisher Peroxisomen nachgewiesen wurden.
Molekulare Charakterisierung eines Tropomodulin-Homologen des Fuchsbandwurms E. multilocularis
(2002)
Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein Tropomodulin- homologer Faktor aus einem Plathelminthen auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Zudem wurde die Interaktion des kodierten Faktors mit einem kürzlich isolierten Tropomyosin- Homologen aus E. multilocularis nachgewiesen. Basierend auf diesen Daten ist es nun möglich, die biologische Signifikanz der Interaktion von Elp mit EmTY weiterführend zu untersuchen. Sollte sich in diesen Studien herausstellen, daß der ERM- Faktor Elp in der Tat mit dem Tropomodulin- Tropomyosin- System der E. multilocularis- Zelle interferiert, könnte dies ein wichtiger Beitrag zu unserem Verständnis des signaltransduktorischen Geschehens zwischen der Plasmamembran und dem Zytoskelett bei E. multilocularis sein.
Durch den monoklonalen Antikörper mAk 2625, der ein Epitop im Bereich des LPS bindet, konnte für den virulenten Stamm RC1 von Legionella pneumophila Serogruppe 1 Subgruppe OLDA eine spontane instabile LPS-Mutante isoliert werden. Die Mutante zeigte eine Phasenvariation des Epitops, sowie einen Verlust der Virulenz und Serumresistenz. Um Zugang zum molekularen Mechanismus der Phasenvariation des LPS zu bekommen, erfolgte zunächst die Komplementierung der stabilen mAk 2625-negativen LPS-Mutante 137 mit der Genbank des zugehörigen Wildtyps. Die Komplementierung und Rekonstitution des mAk 2625-Epitops gelang mit einem 3 kb langen klonierten genomischen Fragment. Die Mutation des Stammes 137 konnte einer Deletion eines Cytosin-Restes im später benannten Orf 8 zugeschrieben werden. Das Protein welches sich aus der Sequenz von Orf 8 ableitet, zeigt Homologien zu bakteriellen Methyltransferasen. Mit Sonden, welche sich aus den klonierten Fragmenten ableiteten, konnte eine Genbank des Stammes RC1 nach LPS-Biosynthese-Genen durchsucht werden. Auf diese Weise gelang die Identifizierung einer 32661 bp langen Region des Genoms von Legionella pneumophila, die 30 mögliche offenen Leseraster (Orfs) enthält. Einige dieser Orfs zeigen signifikante Homologien zu bekannten Gensequenzen der Core- und O-Antigen-Biosynthese. Der molekulare Mechanismus der Phasenvariation konnte jedoch durch diese Untersuchungen nicht entschlüsselt werden. Erst anschließende Untersuchungen zeigten, daß es sich um ein 30 kb langes instabiles genetisches Element handelt, das vermutlich auf einen Phagenursprung zurückgeht.
SL-Trans-Spleißen ist ein Mechanismus zur Transkriptprozessierung, welcher bisher bei kinetoplastiden Protozoen, Trematoden und Nematoden beschrieben wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals das Gen für einen Spliced Leader (SL) aus den Cestoden E. multilocularis und E. granulosus charakterisiert. Ausgangspunkt waren Studien zur Genregulation des E. multilocularis Gens elp, welches für einen Faktor der ERM-Familie kodiert. Es konnte gezeigt werden, daß elp über mindestens zwei unterschiedliche Transkripte kodiert wird. Für eines dieser Transkripte konnte gezeigt werden, daß ein 32 Nukleotide langes, nicht-proteinkodierendes Exon über konservatives Spleißen mit dem startmethionin-kodierenden Exon II der elp-mRNA fusioniert wird. Der entsprechende Transkriptionsstartpunkt und zugehörige Promotorstrukturen konnten auf dem E. multilocularis Chromosom identifiziert werden. Ein zweites Transkript enthielt anstelle des 32 nt Exon I von elp ein alternatives 36 nt langes Exon am 5‘-Ende, welches nicht Teil des genomischen elp Lokus ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß dieses 36 nt lange Exon einen Spliced Leader (SL) von E. multilocularis darstellt. Eine Analyse von E. multilocularis cDNA-Bibliotheken ergab, daß sich das 36 nt Exon nicht nur am 5‘-Ende der elp-mRNA befindet, sondern in identischer Form auch am 5‘-Ende von mindestens elf anderen mRNAs von E. multilocularis. Das zugehörige SL-RNA-Gen konnte isoliert und vollständig charakterisiert werden. Es befand sich auf einem 1513 bp langen Fragment, welches auf dem E. multilocularis Genom als mehrfacher Repeat angeordnet ist. Auf DNA-Sequenzebene konnte gezeigt werden, daß dieses Gen signifikante Homologien zu bereits bekannten SL-RNA-Sequenzen von Trematoden und Turbellaria nicht jedoch zu solchen von Nematoden und kinetoplastiden Protozoen aufweist. Die Sekundärstruktur der kodierten SL-RNA besitzt zudem strukturelle Charakteristika, die für SL-RNAs anderer Organismen bereits bekannt sind. Zusammengenommen lassen diese Daten den Schluß zu, daß es sich bei dem 36 nt langen Exon in der Tat um einen SL von E. multilocularis handelt. Die für E. multilocularis identifizierten trans-gespleißten mRNAs kodieren für Faktoren, welche an einer Reihe unterschiedlicher Prozesse in der Zelle beteiligt sind. Signifikante Unterschiede in den Spektren der trans-gespleißten Faktoren bei Echinococcus und anderen Plathelminthen können als Hinweis gewertet werden, daß keine generelle Korrelation besteht zwischen Trans-Spleißen einer bestimmten mRNA und der biologischen Funktion des Faktors. Ein zum SL-Gen von E. multilocularis hoch homologes Gen konnte zudem auf chromosomaler DNA des Hundebandwurms E. granulosus identifiziert werden. Trans-Spleißen wird demnach nicht nur vom Fuchsbandwurm, sondern auch vom Hundebandwurm zur Genexpression genutzt. Im Falle von elp besteht die ungewöhnliche Situation, daß ein identisches Protein zwei verschiedene Transkripte kodiert von denen eines konventionell und das andere trans-gespleißt wird. Der Regulationsmechanismus dieses alternativen Cis/Trans-Spleißens wurde in dieser Arbeit untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß den zwei elp Transkripten auch zwei unterschiedliche Primärtranskripte zugrunde liegen. Die dabei erlangten Daten stehen in Einklang mit dem gegenwärtigen Modell, daß alternatives Cis/Trans-Spleißen an einer Splice Akzeptorstelle ausschließlich vom Vorhandensein einer stromaufwärts gelegenen Splice Donorstelle abhängt. Weitere Studien haben gezeigt, daß die Expression der trans-oder cis-gespleißten elp-mRNA weder stadien- noch isolat-oder zytospezifische ist. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit erstmals umfassende Daten zum Mechanismus des Trans-Spleißens bei einem Cestoden erlangt werden, was sich für weitere molekularbiologische Untersuchungen an diesem Organismus hervorragend ausnutzen läßt. In einer abschließenden Studie wurde versucht einen weiteren ERM-homologen Faktor, der eventuell auch über alternatives Cis/Trans-Spleißen exprimiert wird, über PCR mit degenerativen Primern zu identifizieren. Es konnte jedoch neben elp kein anderer homologer Faktor bestimmt werden. Dieses Ergebnis entspricht den bereits bei anderen niederen Eukaryonten durchgeführten Untersuchungen.
Rezeptorkinasen spielen eine wichtige Rolle in der Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung und sind möglicherweise an hormonellen Kommunikations- Mechanismen zwischen parasitären Helminthen und ihren Säugetier- Wirten beteiligt. In dieser Arbeit wurden erstmals eine Rezeptor- Tyrosinkinase der EGF Familie, eine Serin- Threoninkinase der TGF- Familie sowie ein intrazellulärer Signaltransduktionsfaktor der Smad- Familie aus dem Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis charakterisiert. Mittels degenerativer PCR und 3´/ 5´-RACE Methoden konnten drei E. multilocularis cDNAs identifiziert und vollständig charakterisiert werden, welche für (i) eine Tyrosinkinase (EmRTK1) der EGF Rezeptor- Familie (5160 bp cDNA, 1564 Aminosäuren); (ii) eine Serin – Threoninkinase (EmRSK1) der TGF-Rezeptor - Familie (1892 bp cDNA, 543 Aminosäuren); und (iii) einen intrazellulären Signaltransduktor der Smad Familie (1530 bp cDNA, 318Aminosäuren) kodieren. Anhand von Sequenzvergleichen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigten alle drei Faktoren für die jeweilige Proteinfamilie typische Domänenstrukturen und hohe Homologien zu bereits bekannten Faktoren aus Säugern. Der zugehörige chromosomale Locus wurde in allen drei Fällen vollständig charakterisiert. Mit Hilfe von RT-PCR Analysen konnte die Expression von emrtk-1, emrsk-1 und emsmadA in den Larvenstadien Metacestode und Protoskolex während der Infektion des Zwischenwirtes nachgewiesen werden. Anhand dieser Daten kann vermutet werden, dass die beschriebenen Rezeptoren und EmSmadA eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Parasiten spielen und möglicherweise an Mechanismen der Wirt- Parasit Interaktion während der alveolären Echinokokkose beteiligt sind.
Verschiedene mögliche Pathomechanismen einer Campylobacter jejuni-spezifischen Immunantwort bei der Entstehung akuter Immunneuropathien wurden untersucht. Neben anderen wurden für die Untersuchungen auch C. jejuni-Stämme eingesetzt, welche von Guillain-Barré- (GBS) und Miller-Fisher-syndrome (MFS) Patienten isoliert worden waren. Es wurden Ultraschall-Gesamt-Homogenate der C. jejuni Stämme sowie von Salmonella typhimurium als Kontrollbakterium hergestellt. Anschließend wurden verschiedene Proteinfraktionen isoliert und die Lipopolysaccharide (LPS) der Bakterien isoliert. Durch Immunisierung von Ratten mit diesen C. jejuni-Präparationen konnten keine Krankheitszeichen der experimentellen autoimmunen Neuritis (EAN) ausgelöst werden. Trotz Produktion hoher Titer C. jejuni-spezifischer Antikörper verlief in diesen Tieren eine anschließend durch P2-spezifische T-Lymphozyten induzierte adoptiv transferierte EAN (AT-EAN) nicht schwerer als in mit komplettem Freund´schen Adjuvans (CFA) kontrollimmunisierten Ratten. Nach Immunisierung mit C. jejuni-Protein wurden C. jejuni-spezifische T-Zellen von Lewis-Ratten gewonnen, die mit allen getesteten C. jejuni-Stämmen als Antigen reagieren, jedoch zeigten C. jejuni-spezifische Ratten-T-Zellen in vitro keine Kreuzreaktivität mit PNS-Antigenen und induzierten in vivo keine Neuritis. Im Modell der EAN läßt sich durch Füttern des Antigens eine natürliche orale Toleranz induzieren, welche die Tiere gegen eine aktiv induzierte EAN resistent macht. Die immunologische Auswirkung der enteralen Gabe von C. jejuni-LPS auf die natürliche Immuntoleranz wurde untersucht. Dabei konnte bei diskrepanten Ergebnissen keine pathogene Bedeutung von enteralen C. jejuni-Antigenen in der Ratte festgestellt werden. Zur Generation und Untersuchung C. jejuni-spezifischer monoklonaler Antikörper wurden Balb/c-Mäuse mit C. jejuni-LPS-Präparationen in CFA immunisiert und die Milzzellen dieser Tiere mit Maus-Myelomzellen fusioniert. Es konnte eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern etabliert werden. Selektive Spezifitäten der monoklonalen Antikörper für C. jejuni-LPS oder -protein wurden detektiert, die meisten der monoklonalen Antikörper als IgM, einige als IgG charakterisiert. Die Antikörper reagieren mit allen getesteten C. jejuni-Stämmen sowohl im ELISA als auch im Western Blot kreuz. Eine Reaktivität der Antikörper mit verschiedenen Gangliosiden konnte nicht nachgewiesen werden. Zur Untersuchung eines elektrophysiologisch fassbaren blockierenden Effektes von C. jejuni-spezifischen Antikörpern wurden Makro-patch-clamp-Untersuchungen am Mäusezwerchfell mit dialysierten Seren von C. jejuni-immunisierten Ratten durchgeführt. Einige der C. jejuni-Antiseren blockierten die präsynaptische Quantenfreisetzung partiell. Dieser Effekt war C. jejuni-spezifisch und durch Salmonella-Antiserum oder Kontrollseren CFA-immunisierter Tiere nicht induzierbar. Ein von uns generierter monoklonaler IgG-Antikörper gegen C. jejuni-LPS wurde ebenfalls in Makro-patch-clamp-Untersuchungen getestet und blockierte die Quantenfreisetzung. Weiterhin wurden humane T-Zellen gegen C. jejuni HB 93-13 generiert. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß diese Zellen mit anderen C. jejuni-Stämmen, jedoch nicht mit Salmonellen, kreuzreagieren und ausschließlich Proteine jedoch nicht LPS erkennen. Die generierten Zellen sind alle HLA-DR restringiert und der Phänotyp wurde als CD 4+/CD 8-, /-TZR+ identifiziert. Einige der C. jejuni-spezifischen T-Zell-Linien zeigten eine starke oder partielle Kreuzreaktivität mit humanem rekombinantem P2-Protein des PNS und mit einzelnen P2-Peptiden. Dieser Befund belegt erstmals, dass durch Konfrontation mit C. jejuni eine zelluläre Immunantwort angestoßen werden kann, die in autoimmuner Weise mit Myelinprotein des PNS kreuzreagiert.
Permanente ZNS-Zelllinien der Ratte wurden mit Toxoplasma gondii unter Betrachtung der Invasions-, Replikations- und Stadienkonversionfähigeit des Parasiten infiziert. Additiv zu bekannten Tiermodellen konnte so ein Zellkulturmodell zur Erforschung der zerebralen Persistenz des Protozoons etabliert werden.
Die Differenzierung von Mykobakterien auf Speziesebene mithilfe von herkömmlichen biochemischen Testverfahren ist langwierig, was zu signifikanten Verzögerungen in der Diagnostik führt. Molekulare Identifizierung hingegen weist, verglichen mit der phänotypischen Identifizierung, zwei entscheidende Vorteile auf: es kommt dabei zu einem Geschwindigkeitszuwachs und zu einer höheren Genauigkeit des Diagnoseerfahrens. Der Informationsgehalt des 5’-Endes des 16S-rRNA-Gens ist ausreichend für die Identifizierung der meisten bakteriellen Spezies. Wegen der vielen fehlerhaften Datenbestände können öffentliche Sequenzdatenbanken die benötigten Referenzsequenzen jedoch nicht zur Verfügung stellen. Es wurde deshalb eigens eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Sequenzen geschaffen. Die Sequenzen beinhalten beide Stränge der 5’-16S-rDNA (E. coli-Position 54-510) von 125 Stammsammlungisolaten. Dabei wurden alle bis zum 31.03.2000 valide beschriebenen Arten (n=89) und einige weitere, bereits veröffentlichte Sequevare-Varianten eingeschlossen. Konnten Stämme anhand der 16S-Sequenzen nicht unterschieden werden, wurde zusätzlich die Sequenz der „Internal Transcribed Spacer Region“ bestimmt (n=45). Insgesamt existierten von den Stämmen, die anhand ihrer 16S-rDNA-Sequenz nicht eindeutig zu identifizieren waren, 77 Isolate in der öffentlichen Datenbank Genbank. Den neu analysierten Sequenzen gegenübergestellt weisen diese im paarweisen Vergleich eine durchschnittliche Diskrepanz von 4,31 Basen auf. Durch die vergleichende 5‘-16S-rDNA-Sequenzanalyse war es möglich 64 der 89 validen Spezies zu identifizieren (71.9%). Nach Hinzunahme der ITS-Sequenz war es möglich, weitere 15 Spezies zu differenzieren. Nur die Arten des M. tuberculosis complex, M. marinum und M. ulcerans und die M. avium Subspezies konnten weder durch 5‘16S-rDNA-Sequenzanalyse noch anhand der ITS-Sequenz differenziert werden. Die Sequenzen aller Stämme sind abrufbar in der Datenbank des RIDOM-Projekts (“Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms”). Weiterführende Informationen (z.B. taxonomischer oder medizinischer Art) vervollständigen zusammen mit einem Algorithmus zur genotypischen Identifizierung aller valide beschriebenen Mykobakterien dieses Angebot. Nach ausführlicher Analyse verschiedener Mykobakterien Spezies ist es nun in der Tat möglich, die meisten Mykobakterien Arten anhand der vergleichenden Seqenzanalyse der 16S-rDNA und ITS zu unterscheiden. Voraussetzung hierfür ist eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Referenzsequenzen. Bereits in naher Zukunft ist die Anwendung dieses Verfahrens im Routinebetrieb, v.a. in Referenzlaboratorien, denkbar.
Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können.
Es konnte mit PHR3 bei Candida albicans ein drittes GAS-homologes Gen nachgewiesen werden. Dieses weist überzeugende Übereinstimmungen der Nuklein- und Aminosäurensequenz und mit der fehlenden GPI-Verankerungsstelle und der pH-konstitutiven Expression auch interessante Unterschiede zu den bisher bekannten Genen der PHR-Familie auf. Eine funktionelle Homologie zu den weiteren PHR-Genen bei Candida albicans konnte nicht belegt werden. Es sind bisher in verschiedenen Spezies mehrere homologe Gene dieser Familie nachgewiesen worden. So sind auch bei Candida albicans weitere möglich und die endgültige Zahl der PHR-Gene wird erst nach Abschluß des Candida albicans-Genomprojektes bestimmt werden können. Der Zweck mehrerer homologer Gene ist insbesondere für die bei unterschiedlichen pH-Werten vorliegenden Proteine Phr1p und Phr2p noch nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung ist, dass ihre Translation auf unterschiedliche Weise die Expression anderer Gene oder die Prozessierung und Funktion von Proteinen beeinflusst. Eine solche feine Regulation von Wachstums- und Virulenzfaktoren und somit eine Anpassung an Umweltbedingungen und Infektionswege ist für die Pathogenität von Candida albicans von Bedeutung. Die spezifischen Faktoren für die Induktion von PHR3 sind, sollte eine differenzierte Regulation vorliegen, dagegen ebenso wenig wie für GAS4, als nähestes verwandtes Gen, und für die weiteren GAS-Gene bekannt. Zum Nachweis einer solchen signalspezifischen Transkription sind Experimente mit anderen Versuchsanordnungen, mit welchen sich komplexere Milieus und Infektionswege untersuchen lassen, wie DNA-Chips oder induktionsabhängige Signalkassetten (Morschhäuser et al., 1999; Staib et al., 1999) hilfreich. Da eine fehlende C-terminale Region bei GAS1 zur Sekretion eines vergrößerten Proteins mit Hypermannosylierung der serinreichen Region führt (Popolo et Vai, 1998), erscheint auch eine extrazelluläre Funktion von Phr3p, welches dieses hydrophobe 3’ Ende nativ nicht besitzt, möglich. Dabei ist eine zu Phr1p und Phr2p ähnliche oder gleiche enzymatische Funktion, welche in Diskussion 112 unterschiedlichen Kompartimenten oder von unterschiedlicher Lokalisation aus den Aufbau der Zellwand beeinflusst, denkbar.