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Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können.
Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
Die Differenzierung von Mykobakterien auf Speziesebene mithilfe von herkömmlichen biochemischen Testverfahren ist langwierig, was zu signifikanten Verzögerungen in der Diagnostik führt. Molekulare Identifizierung hingegen weist, verglichen mit der phänotypischen Identifizierung, zwei entscheidende Vorteile auf: es kommt dabei zu einem Geschwindigkeitszuwachs und zu einer höheren Genauigkeit des Diagnoseerfahrens. Der Informationsgehalt des 5’-Endes des 16S-rRNA-Gens ist ausreichend für die Identifizierung der meisten bakteriellen Spezies. Wegen der vielen fehlerhaften Datenbestände können öffentliche Sequenzdatenbanken die benötigten Referenzsequenzen jedoch nicht zur Verfügung stellen. Es wurde deshalb eigens eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Sequenzen geschaffen. Die Sequenzen beinhalten beide Stränge der 5’-16S-rDNA (E. coli-Position 54-510) von 125 Stammsammlungisolaten. Dabei wurden alle bis zum 31.03.2000 valide beschriebenen Arten (n=89) und einige weitere, bereits veröffentlichte Sequevare-Varianten eingeschlossen. Konnten Stämme anhand der 16S-Sequenzen nicht unterschieden werden, wurde zusätzlich die Sequenz der „Internal Transcribed Spacer Region“ bestimmt (n=45). Insgesamt existierten von den Stämmen, die anhand ihrer 16S-rDNA-Sequenz nicht eindeutig zu identifizieren waren, 77 Isolate in der öffentlichen Datenbank Genbank. Den neu analysierten Sequenzen gegenübergestellt weisen diese im paarweisen Vergleich eine durchschnittliche Diskrepanz von 4,31 Basen auf. Durch die vergleichende 5‘-16S-rDNA-Sequenzanalyse war es möglich 64 der 89 validen Spezies zu identifizieren (71.9%). Nach Hinzunahme der ITS-Sequenz war es möglich, weitere 15 Spezies zu differenzieren. Nur die Arten des M. tuberculosis complex, M. marinum und M. ulcerans und die M. avium Subspezies konnten weder durch 5‘16S-rDNA-Sequenzanalyse noch anhand der ITS-Sequenz differenziert werden. Die Sequenzen aller Stämme sind abrufbar in der Datenbank des RIDOM-Projekts (“Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms”). Weiterführende Informationen (z.B. taxonomischer oder medizinischer Art) vervollständigen zusammen mit einem Algorithmus zur genotypischen Identifizierung aller valide beschriebenen Mykobakterien dieses Angebot. Nach ausführlicher Analyse verschiedener Mykobakterien Spezies ist es nun in der Tat möglich, die meisten Mykobakterien Arten anhand der vergleichenden Seqenzanalyse der 16S-rDNA und ITS zu unterscheiden. Voraussetzung hierfür ist eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Referenzsequenzen. Bereits in naher Zukunft ist die Anwendung dieses Verfahrens im Routinebetrieb, v.a. in Referenzlaboratorien, denkbar.
Es konnte mit PHR3 bei Candida albicans ein drittes GAS-homologes Gen nachgewiesen werden. Dieses weist überzeugende Übereinstimmungen der Nuklein- und Aminosäurensequenz und mit der fehlenden GPI-Verankerungsstelle und der pH-konstitutiven Expression auch interessante Unterschiede zu den bisher bekannten Genen der PHR-Familie auf. Eine funktionelle Homologie zu den weiteren PHR-Genen bei Candida albicans konnte nicht belegt werden. Es sind bisher in verschiedenen Spezies mehrere homologe Gene dieser Familie nachgewiesen worden. So sind auch bei Candida albicans weitere möglich und die endgültige Zahl der PHR-Gene wird erst nach Abschluß des Candida albicans-Genomprojektes bestimmt werden können. Der Zweck mehrerer homologer Gene ist insbesondere für die bei unterschiedlichen pH-Werten vorliegenden Proteine Phr1p und Phr2p noch nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung ist, dass ihre Translation auf unterschiedliche Weise die Expression anderer Gene oder die Prozessierung und Funktion von Proteinen beeinflusst. Eine solche feine Regulation von Wachstums- und Virulenzfaktoren und somit eine Anpassung an Umweltbedingungen und Infektionswege ist für die Pathogenität von Candida albicans von Bedeutung. Die spezifischen Faktoren für die Induktion von PHR3 sind, sollte eine differenzierte Regulation vorliegen, dagegen ebenso wenig wie für GAS4, als nähestes verwandtes Gen, und für die weiteren GAS-Gene bekannt. Zum Nachweis einer solchen signalspezifischen Transkription sind Experimente mit anderen Versuchsanordnungen, mit welchen sich komplexere Milieus und Infektionswege untersuchen lassen, wie DNA-Chips oder induktionsabhängige Signalkassetten (Morschhäuser et al., 1999; Staib et al., 1999) hilfreich. Da eine fehlende C-terminale Region bei GAS1 zur Sekretion eines vergrößerten Proteins mit Hypermannosylierung der serinreichen Region führt (Popolo et Vai, 1998), erscheint auch eine extrazelluläre Funktion von Phr3p, welches dieses hydrophobe 3’ Ende nativ nicht besitzt, möglich. Dabei ist eine zu Phr1p und Phr2p ähnliche oder gleiche enzymatische Funktion, welche in Diskussion 112 unterschiedlichen Kompartimenten oder von unterschiedlicher Lokalisation aus den Aufbau der Zellwand beeinflusst, denkbar.
128 Meningokokkenstämme unterschiedlicher klonaler Linien und Serogruppen aus verschiedenen Ländern wurden im Rahmen eines Screenings auf die Präsenz von Plasmiden untersucht. Aus 66% der Stämme konnten Plasmide isoliert werden. Diese waren innerhalb der verschiedenen klonalen Linien spezifisch verteilt. Das 1,986 kb große Plasmid pJS-A (EMBL Accession Number AJ238491) fand sich ausschließlich in Serogruppe A Stämmen der Subgruppe VI. Das 7,245 kb große Plasmid pJS-B (EMBL Accession Number AJ277475) wurde in 91% der untersuchten ET-37 Stämme und in 67% der nahe verwandten Cluster A4 Stämme gefunden. Es ist ein hochspezifischer Marker für diese klonalen Linien. Aus Vertretern des ET-5 Komplexes konnten keine Plasmide isoliert werden. Die Plasmide pJS-A und pJS-B wurden vollständig sequenziert. Beide zeichnen sich durch einen für Meningokokken untypisch hohen AT-Gehalt aus (pJS-A: 55,4%, pJS-B: 57,9%). Auf pJS-A befinden sich zwei, auf pJS-B acht offene Leseraster. Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergab für beide Plasmide keine signifikanten Homologien zu Datenbankeinträgen. Für pJS-B wurde an Position 20 bis 307 eine 93%ige Identität mit einer für das Genom des Gonokokkenstammes MS11-A beschriebenen Region festgestellt, welche die beiden Inverted Repeats IR1 und IR2 enthält und dem Gen pivNG benachbart ist, das für eine Rekombinase kodiert. Bei der Repeat-Region des Gonokokkenstammes MS11-A handelt es sich nach Carrick et al. möglicherweise um eine Rekombinationsstelle. Es konnte gezeigt werden, dass pJS-B über seine homologe Repeat-Region chromosomal integriert. Ob es jedoch als wirkliches Plasmid eigenständig replizieren kann, bleibt zweifelhaft. pJS-A und pJS-B stellen Beispiele für die spezifische und stabile Verteilung von DNA-Elementen in einer Bakterienpopulation dar, die sich grundsätzlich durch genetische Vielfalt und regen Austausch von DNA auszeichnet. pJS-B ist eines von vielen DNA-Elementen, die für den ET-37 Komplex und den Cluster A4 spezifisch sind. Dies unterstützt das Konzept der genetischen Isolierung dieser hypervirulenten Linien.
SL-Trans-Spleißen ist ein Mechanismus zur Transkriptprozessierung, welcher bisher bei kinetoplastiden Protozoen, Trematoden und Nematoden beschrieben wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals das Gen für einen Spliced Leader (SL) aus den Cestoden E. multilocularis und E. granulosus charakterisiert. Ausgangspunkt waren Studien zur Genregulation des E. multilocularis Gens elp, welches für einen Faktor der ERM-Familie kodiert. Es konnte gezeigt werden, daß elp über mindestens zwei unterschiedliche Transkripte kodiert wird. Für eines dieser Transkripte konnte gezeigt werden, daß ein 32 Nukleotide langes, nicht-proteinkodierendes Exon über konservatives Spleißen mit dem startmethionin-kodierenden Exon II der elp-mRNA fusioniert wird. Der entsprechende Transkriptionsstartpunkt und zugehörige Promotorstrukturen konnten auf dem E. multilocularis Chromosom identifiziert werden. Ein zweites Transkript enthielt anstelle des 32 nt Exon I von elp ein alternatives 36 nt langes Exon am 5‘-Ende, welches nicht Teil des genomischen elp Lokus ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß dieses 36 nt lange Exon einen Spliced Leader (SL) von E. multilocularis darstellt. Eine Analyse von E. multilocularis cDNA-Bibliotheken ergab, daß sich das 36 nt Exon nicht nur am 5‘-Ende der elp-mRNA befindet, sondern in identischer Form auch am 5‘-Ende von mindestens elf anderen mRNAs von E. multilocularis. Das zugehörige SL-RNA-Gen konnte isoliert und vollständig charakterisiert werden. Es befand sich auf einem 1513 bp langen Fragment, welches auf dem E. multilocularis Genom als mehrfacher Repeat angeordnet ist. Auf DNA-Sequenzebene konnte gezeigt werden, daß dieses Gen signifikante Homologien zu bereits bekannten SL-RNA-Sequenzen von Trematoden und Turbellaria nicht jedoch zu solchen von Nematoden und kinetoplastiden Protozoen aufweist. Die Sekundärstruktur der kodierten SL-RNA besitzt zudem strukturelle Charakteristika, die für SL-RNAs anderer Organismen bereits bekannt sind. Zusammengenommen lassen diese Daten den Schluß zu, daß es sich bei dem 36 nt langen Exon in der Tat um einen SL von E. multilocularis handelt. Die für E. multilocularis identifizierten trans-gespleißten mRNAs kodieren für Faktoren, welche an einer Reihe unterschiedlicher Prozesse in der Zelle beteiligt sind. Signifikante Unterschiede in den Spektren der trans-gespleißten Faktoren bei Echinococcus und anderen Plathelminthen können als Hinweis gewertet werden, daß keine generelle Korrelation besteht zwischen Trans-Spleißen einer bestimmten mRNA und der biologischen Funktion des Faktors. Ein zum SL-Gen von E. multilocularis hoch homologes Gen konnte zudem auf chromosomaler DNA des Hundebandwurms E. granulosus identifiziert werden. Trans-Spleißen wird demnach nicht nur vom Fuchsbandwurm, sondern auch vom Hundebandwurm zur Genexpression genutzt. Im Falle von elp besteht die ungewöhnliche Situation, daß ein identisches Protein zwei verschiedene Transkripte kodiert von denen eines konventionell und das andere trans-gespleißt wird. Der Regulationsmechanismus dieses alternativen Cis/Trans-Spleißens wurde in dieser Arbeit untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß den zwei elp Transkripten auch zwei unterschiedliche Primärtranskripte zugrunde liegen. Die dabei erlangten Daten stehen in Einklang mit dem gegenwärtigen Modell, daß alternatives Cis/Trans-Spleißen an einer Splice Akzeptorstelle ausschließlich vom Vorhandensein einer stromaufwärts gelegenen Splice Donorstelle abhängt. Weitere Studien haben gezeigt, daß die Expression der trans-oder cis-gespleißten elp-mRNA weder stadien- noch isolat-oder zytospezifische ist. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit erstmals umfassende Daten zum Mechanismus des Trans-Spleißens bei einem Cestoden erlangt werden, was sich für weitere molekularbiologische Untersuchungen an diesem Organismus hervorragend ausnutzen läßt. In einer abschließenden Studie wurde versucht einen weiteren ERM-homologen Faktor, der eventuell auch über alternatives Cis/Trans-Spleißen exprimiert wird, über PCR mit degenerativen Primern zu identifizieren. Es konnte jedoch neben elp kein anderer homologer Faktor bestimmt werden. Dieses Ergebnis entspricht den bereits bei anderen niederen Eukaryonten durchgeführten Untersuchungen.
Verschiedene mögliche Pathomechanismen einer Campylobacter jejuni-spezifischen Immunantwort bei der Entstehung akuter Immunneuropathien wurden untersucht. Neben anderen wurden für die Untersuchungen auch C. jejuni-Stämme eingesetzt, welche von Guillain-Barré- (GBS) und Miller-Fisher-syndrome (MFS) Patienten isoliert worden waren. Es wurden Ultraschall-Gesamt-Homogenate der C. jejuni Stämme sowie von Salmonella typhimurium als Kontrollbakterium hergestellt. Anschließend wurden verschiedene Proteinfraktionen isoliert und die Lipopolysaccharide (LPS) der Bakterien isoliert. Durch Immunisierung von Ratten mit diesen C. jejuni-Präparationen konnten keine Krankheitszeichen der experimentellen autoimmunen Neuritis (EAN) ausgelöst werden. Trotz Produktion hoher Titer C. jejuni-spezifischer Antikörper verlief in diesen Tieren eine anschließend durch P2-spezifische T-Lymphozyten induzierte adoptiv transferierte EAN (AT-EAN) nicht schwerer als in mit komplettem Freund´schen Adjuvans (CFA) kontrollimmunisierten Ratten. Nach Immunisierung mit C. jejuni-Protein wurden C. jejuni-spezifische T-Zellen von Lewis-Ratten gewonnen, die mit allen getesteten C. jejuni-Stämmen als Antigen reagieren, jedoch zeigten C. jejuni-spezifische Ratten-T-Zellen in vitro keine Kreuzreaktivität mit PNS-Antigenen und induzierten in vivo keine Neuritis. Im Modell der EAN läßt sich durch Füttern des Antigens eine natürliche orale Toleranz induzieren, welche die Tiere gegen eine aktiv induzierte EAN resistent macht. Die immunologische Auswirkung der enteralen Gabe von C. jejuni-LPS auf die natürliche Immuntoleranz wurde untersucht. Dabei konnte bei diskrepanten Ergebnissen keine pathogene Bedeutung von enteralen C. jejuni-Antigenen in der Ratte festgestellt werden. Zur Generation und Untersuchung C. jejuni-spezifischer monoklonaler Antikörper wurden Balb/c-Mäuse mit C. jejuni-LPS-Präparationen in CFA immunisiert und die Milzzellen dieser Tiere mit Maus-Myelomzellen fusioniert. Es konnte eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern etabliert werden. Selektive Spezifitäten der monoklonalen Antikörper für C. jejuni-LPS oder -protein wurden detektiert, die meisten der monoklonalen Antikörper als IgM, einige als IgG charakterisiert. Die Antikörper reagieren mit allen getesteten C. jejuni-Stämmen sowohl im ELISA als auch im Western Blot kreuz. Eine Reaktivität der Antikörper mit verschiedenen Gangliosiden konnte nicht nachgewiesen werden. Zur Untersuchung eines elektrophysiologisch fassbaren blockierenden Effektes von C. jejuni-spezifischen Antikörpern wurden Makro-patch-clamp-Untersuchungen am Mäusezwerchfell mit dialysierten Seren von C. jejuni-immunisierten Ratten durchgeführt. Einige der C. jejuni-Antiseren blockierten die präsynaptische Quantenfreisetzung partiell. Dieser Effekt war C. jejuni-spezifisch und durch Salmonella-Antiserum oder Kontrollseren CFA-immunisierter Tiere nicht induzierbar. Ein von uns generierter monoklonaler IgG-Antikörper gegen C. jejuni-LPS wurde ebenfalls in Makro-patch-clamp-Untersuchungen getestet und blockierte die Quantenfreisetzung. Weiterhin wurden humane T-Zellen gegen C. jejuni HB 93-13 generiert. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß diese Zellen mit anderen C. jejuni-Stämmen, jedoch nicht mit Salmonellen, kreuzreagieren und ausschließlich Proteine jedoch nicht LPS erkennen. Die generierten Zellen sind alle HLA-DR restringiert und der Phänotyp wurde als CD 4+/CD 8-, /-TZR+ identifiziert. Einige der C. jejuni-spezifischen T-Zell-Linien zeigten eine starke oder partielle Kreuzreaktivität mit humanem rekombinantem P2-Protein des PNS und mit einzelnen P2-Peptiden. Dieser Befund belegt erstmals, dass durch Konfrontation mit C. jejuni eine zelluläre Immunantwort angestoßen werden kann, die in autoimmuner Weise mit Myelinprotein des PNS kreuzreagiert.
Rezeptorkinasen spielen eine wichtige Rolle in der Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung und sind möglicherweise an hormonellen Kommunikations- Mechanismen zwischen parasitären Helminthen und ihren Säugetier- Wirten beteiligt. In dieser Arbeit wurden erstmals eine Rezeptor- Tyrosinkinase der EGF Familie, eine Serin- Threoninkinase der TGF- Familie sowie ein intrazellulärer Signaltransduktionsfaktor der Smad- Familie aus dem Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis charakterisiert. Mittels degenerativer PCR und 3´/ 5´-RACE Methoden konnten drei E. multilocularis cDNAs identifiziert und vollständig charakterisiert werden, welche für (i) eine Tyrosinkinase (EmRTK1) der EGF Rezeptor- Familie (5160 bp cDNA, 1564 Aminosäuren); (ii) eine Serin – Threoninkinase (EmRSK1) der TGF-Rezeptor - Familie (1892 bp cDNA, 543 Aminosäuren); und (iii) einen intrazellulären Signaltransduktor der Smad Familie (1530 bp cDNA, 318Aminosäuren) kodieren. Anhand von Sequenzvergleichen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigten alle drei Faktoren für die jeweilige Proteinfamilie typische Domänenstrukturen und hohe Homologien zu bereits bekannten Faktoren aus Säugern. Der zugehörige chromosomale Locus wurde in allen drei Fällen vollständig charakterisiert. Mit Hilfe von RT-PCR Analysen konnte die Expression von emrtk-1, emrsk-1 und emsmadA in den Larvenstadien Metacestode und Protoskolex während der Infektion des Zwischenwirtes nachgewiesen werden. Anhand dieser Daten kann vermutet werden, dass die beschriebenen Rezeptoren und EmSmadA eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Parasiten spielen und möglicherweise an Mechanismen der Wirt- Parasit Interaktion während der alveolären Echinokokkose beteiligt sind.
Permanente ZNS-Zelllinien der Ratte wurden mit Toxoplasma gondii unter Betrachtung der Invasions-, Replikations- und Stadienkonversionfähigeit des Parasiten infiziert. Additiv zu bekannten Tiermodellen konnte so ein Zellkulturmodell zur Erforschung der zerebralen Persistenz des Protozoons etabliert werden.
Charakterisierung und Lokalisation der Toxoplasma gondii Katalase: Peroxisomen in Apicomplexa?
(2002)
Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer, einzelliger Parasit aus dem Phylum der Apicomplexa. Infektionen des Menschen mit T. gondii verlaufen meist subklinisch. Nach einer Infektion persistiert der Erreger für viele Jahre in Hirn- und Muskelgewebe. Durch Reaktivierung des Erregers, z. B. durch eine Immunschwächekrankheit oder unter Immunsuppression, kann eine Enzephalitis mit septischer Streuung entstehen. Eine diaplazentare Infektion führt zur Fetopathia toxoplasmotica mit Früh- und Totgeburten oder zu der typischen enzephalitischen Trias aus Chorioretinitis, Hydrozephalus und zerebralen Verkalkungen. Ein Mechanismus, der es T. gondii ermöglicht im Wirtsorganismus zu überleben, ist die ungewöhnlich hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber freien Radikalen. Die wichtigste Quelle für freie Radikale bei der Abwehrreaktion des Wirtsorganismus ist Wasserstoffperoxid (H2O2 ). Es wird beim sogenannten „respiratory burst“ von Makrophagen freigesetzt, diffundiert dann durch biologische Membranen und schädigt DNA, Lipide und Proteine durch Zerfall in Sauerstoffradikale. Außerdem entsteht (H2O2 ) auch bei normalen Stoffwechselvorgängen in den Persoxisomen der Zelle. Das Enzym Katalase (EC 1.11.1.6) wandelt zweiWasserstoffperoxidmoleküle in Wasser und Sauerstoff um und eliminiert somit toxisches Wasserstoffperoxid. Katalase liegt zumeist in spezialisierten Zellorganellen, den Peroxisomen oder Microbodies, vor. Dort dient es zum Abbau von bei metabolischen Prozessen entstehendem Wasserstoffperoxid. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Katalase von Toxoplasma gondii kloniert und charakterisiert. Die Klonierung von T. gondii Katalase cDNA ergab ein Protein mit 502 Aminosäuren und einem errechneten Gewicht von 57.2 kDa mit starker Homologie zu anderen eukaryontischen Katalasen. Ein polyklonales Antiserum gegen ein GST-Fusionsprotein zeigte imWestern-blot eine Bande bei ungefähr 63 kDa. Die Immunfluoreszenz zeigte ein vesikuläres Kompartiment im vorderen Ende des Parasiten. Dieses kann von anderen Zellorganellen (Mikronemen, Rhoptrien, Granula densa und dem Apikoplast) durch doppelte Immunfluoreszenzmarkierung unterschieden werden. Zytochemisch können Katalasen durch die DAB-Präzipitationstechnik nachgewiesen werden. Hier zeigten sich vesikuläre Strukturen vor dem Nukleus in der Lichtmikroskopie und runde, spezifische Präzipitate mit einem Durchmesser von 100 bis 300nm in der Elektronenmikroskopie. Am C-terminus der T. gondii Katalase findet sich ein „peroxisomales Targeting Signal“ (PTS1) in den letzten 3 Aminosäuren (-AKM). Die Expression der vollständigen Katalase in CHO-Zellen resultiert in einer peroxisomalen Lokalisation, während ein Konstrukt ohne die letzten 3 Aminosäuren im Zytosol verbleibt. Wird das PTS1 mit einem Reporterprotein (Chloramphenicol-Acetyltransferase) fusioniert, wechselt dessen Lokalisation vom Zytosol zu den Peroxisomen. Damit wurde gezeigt, daß das PTS1 der T. gondii Katalase in einem heterologen System sowohl im Kontext der Katalase als auch eines Reporterproteins den Import in Peroxisomen vermitteln kann. Diese Ergebnisse sind die ersten Hinweise auf Peroxisomen in einem Parasiten der Apikomplexa. Zugleich ist T. gondii, evolutionsbiologisch gesehen, der bisher niedrigste Eukaryont in dem bisher Peroxisomen nachgewiesen wurden.
Molekulare Charakterisierung eines Tropomodulin-Homologen des Fuchsbandwurms E. multilocularis
(2002)
Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein Tropomodulin- homologer Faktor aus einem Plathelminthen auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Zudem wurde die Interaktion des kodierten Faktors mit einem kürzlich isolierten Tropomyosin- Homologen aus E. multilocularis nachgewiesen. Basierend auf diesen Daten ist es nun möglich, die biologische Signifikanz der Interaktion von Elp mit EmTY weiterführend zu untersuchen. Sollte sich in diesen Studien herausstellen, daß der ERM- Faktor Elp in der Tat mit dem Tropomodulin- Tropomyosin- System der E. multilocularis- Zelle interferiert, könnte dies ein wichtiger Beitrag zu unserem Verständnis des signaltransduktorischen Geschehens zwischen der Plasmamembran und dem Zytoskelett bei E. multilocularis sein.
Vergleichende Proteomanalyse eines avirulenten und virulenten Stammes von Legionella pneumophila Sg1 Subgruppe OLDA unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die Stämme unterliegen einer spontanen LPS-Phasenvariation und unterscheiden sich phänotypisch in multiplen Eigenschaften. Es zeigten sich different exprimierte Proteine der Membranoberfläche, der LPS-Biosynthese und des Bakterienstoffwechsels.
Im Rahmen der von November 1999 bis März 2000 durchgeführten bayerischen Meningokokkenträgerstudie wurden in zahlreichen Kindergärten und Schulen der bayerischen Gemeinden Ansbach, Augsburg, Erlangen, Griesbach, Ingolstadt, München, Pfarrkirchen, Sonthofen und Weiden insgesamt 287 Neisseria lactamica-Stämme isoliert. 26 ausgewählte, aus den benachbarten Städten Augsburg, Ingolstadt und München stammende Isolate wurden einer Multi-Lokus-Sequenztypisierung (MLST) zur Untersuchung ihrer genetischen Diversität unterzogen. Dabei wurden sowohl Sequenzen der 3 Stoffwechselgene argF, recA und rho, als auch Sequenzen des 16S rRNA-Gens analysiert. Für das 16S rRNA-Gen fanden sich zehn, für argF fünf, für recA acht und für rho neun differente Allele. Auf Basis der vier analysierten Gene konnten 17 verschiedene Genotypen definiert werden, von denen zwölf nur einmal, fünf hingegen mehrmals vorkamen. Es ist anzunehmen, dass durch Sequenzierung der vier in dieser Studie verwendeten Gene bereits eine ausreichende Diskriminierung von Neisseria lactamica erfolgte, da Versuche eine weiterführende Diskriminierung durch Sequenzierung des porB-Gens zu erreichen, keine wesentlichen zusätzlichen Informationen erbrachten. Durch visuelle Inspektion der Sequenzen konnte bei allen vier Genloci das Überwiegen von Rekombinationsereignissen gegenüber Punktmutationen bestätigt werden, so dass für die Spezies Neisseria lactamica horizontaler Gentransfer anzunehmen ist. Da nur ein einziger Genotyp in zwei verschiedenen Städten beobachtet wurde, zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass eine klonale Ausbreitung von Neisseria lactamica nur dann nachweisbar ist, wenn eine epidemiologische Verknüpfung zwischen Trägern besteht.
Das Gram negative Bakterium Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger der bakteriellen Meningitis. Obwohl das ausschließlich humanpathogene Bakterium in bis zu 25% der Europäischen Bevölkerung die oberen Atemwege als harmloser Kommensale besiedelt, kommt es unter bestimmten, noch nicht ganz verstandenen Bedingungen zu einer klinisch manifesten Infektion. In dieser Arbeit wurde die neue Technologie der DNA Mikroarray Technologie für die Untersuchung des Transkriptoms bei Neisseria meningitidis etabliert. Untersucht wurde die Reaktion von N. meningitidis auf einen Hitzeschock, eine plötzliche Steigerung der Temperatur. Während einer Infektion wird das Bakterium durch induziertes Fieber sehr ähnlichen Bedingungen ausgesetzt. Im Ergebnis erlaubten die RNA Expressionsanalysen nicht nur eine sichere Unterscheidung deregulierter Gene von Genen mit konstanter Expression, sondern es konnte auch das Ausmaß der Deregulation exakt bestimmt werden. Die Daten der DNA Mikroarray Experimente wurden mit der etablierten Technik der RT-PCR exakt bestätigt. Bei den Hitzeschock-Versuchen mit Neisseria meningitidis konnten zahlreiche ORFs als Hitzeschock-Gene identifiziert werden. Die Funktion dieser Gene, darunter groEL/groES und dnaJ/dnaK, war bereits bei anderen Organismen beschrieben worden, was die Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unterstreicht. Es konnte gezeigt werden, dass die Intensität des Hitzeschocks und damit die Deregulation der Hitzeschock-Gene mit steigender Temperatur zunimmt. Eine Erklärung für dieses interessante Ergebnis wäre, dass mit Steigerung der Temperatur der Schaden im Bakterium zunimmt und dadurch auch mehr Hitzeschock Proteine zur Reparatur benötigt werden. Daneben wurde erstmals die transkriptionelle Beeinflussung von Genen aus dem Bereich der Transformation durch einen Hitzeschock gefunden. Diese Daten konnten durch einen phänotypischen Nachweis der Verminderung der Transformationsaktivität von Meningokokken nach einem Hitzeschock bestätigt werden. Diese neue Technik wird eine der Schlüsseltechnologien für die Forschung in der postgenomischen Ära sein. Viele Fragen in dem noch lückenhaften Wissen über die Pathologie von Neisseria meningitidis sollen sich in Zukunft mit Hilfe der DNA Mikroarrays beantworten lassen.
Die opportunistische humanpathogene Hefe Candida glabrata ist zum zweithäufigsten Erreger einer Candidose avanciert. Infektionen mit Candida glabrata sind schwierig zu behandeln und bergen eine hohe Sterblichkeit bei Risikopatienten in sich. Dies liegt vor allem in der geringen Sensitivität von C. glabrata gegenüber den etablierten Azol-Derivaten begründet. Deswegen ist man bei C. glabrata, wie auch bei anderen pathogenen Pilzen, auf der Suche nach geeigneten Zielstrukturen für neue Antimykotika. Dabei rückte die Hemmung der 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase in den Brennpunkt wissenschaftlichen Interesses. Die 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase ist ein pilzspezifisches Enzym, welches beim Menschen nicht vorkommt. Sie ist am Zellwandaufbau der Hefen beteiligt und wird durch die FKS Gene codiert. Die 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase-Hemmer sind wirksam gegenüber Pilzen, die gegenüber anderen Antimykotika resistent sind. Dies führte zur Entwicklung der Echinocandine, echinocandin ähnlicher Lipopeptide und Pneumocandine, wovon einige in klinische Versuche aufgenommen wurden. In dieser Arbeit wurde ein FKS homologes Gen von C. glabrata identifiziert, kloniert und sequenziert. Die erhaltene Gensequenz des gefundenen FKS-Homologs von Candida glabrata wurde in der GenBank des National Center for Biotechnological Information veröffentlicht.
Kurzfassung in deutsch Ziel dieser Studie war die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque bei einem Hypophosphatasiepatientenkollektiv durch Anwendung der 16S rRNA Technologie. Das Kollektiv bestand aus sieben männlichen Patienten mit einer infantil-juvenilen Hypophosphatasie. Es sollten mikrobiologische Evidenzen für oder gegen die Hypothese einer frühen Parodontitis bei Hypophosphatasiepatienten gewonnen werden. Subgingivale Plaqueproben wurden von jedem Patienten entnommen. Anschließend folgte die DNA Extraktion aus den Plaqueproben und die Amplifikation der 16S rRNA Gene mittels zweier verschiedener universeller Primer-Paare: 27f/519r; 515f/1525r. Die PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Dann folgte ein Vergleich der Sequenzen mit der Genbank Database durch den BLAST-Server des National Center for Biotechnology Information (NBCI, Bethesda, MD, USA). Insgesamt wurden zwei verschiedene 16S rRNA Genbanken erstellt und 101 Klone pro Genbank identifiziert. Mit der 27f/519r PCR wurden 15 bakterielle Familien, mit der 515f/1525r PCR 10 bakterielle Familien identifiziert. 66 Phylotypen wurden in der 27f/519r Genbank identifiziert, 41 in der 515f/1525r Genbank. Der Coverage war 50% in der 27f/519r Genbank und 73% in der zweiten Genbank. In allgemeinen zeigte sich ein hoher Anzahl der Keime der physiologischen Plaqueflora (Streptococcus sp. und Actinomyces sp.), dagegen kamen putative Parodontalpathogene wie Porphyromonas gingivalis, Filifactor alocis, Tannerella forsythensis, Campylobacter rectus niemals vor. Die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque erbrachte eine deutlich andere Zusammensetzung im Vergleich zu Padodontitispatienten. Es zeigte sich somit keine mikrobiologische Evidenz für eine Parodontitis bei dem Hypophosphatasiepatientenkollektiv.
Durch den monoklonalen Antikörper mAk 2625, der ein Epitop im Bereich des LPS bindet, konnte für den virulenten Stamm RC1 von Legionella pneumophila Serogruppe 1 Subgruppe OLDA eine spontane instabile LPS-Mutante isoliert werden. Die Mutante zeigte eine Phasenvariation des Epitops, sowie einen Verlust der Virulenz und Serumresistenz. Um Zugang zum molekularen Mechanismus der Phasenvariation des LPS zu bekommen, erfolgte zunächst die Komplementierung der stabilen mAk 2625-negativen LPS-Mutante 137 mit der Genbank des zugehörigen Wildtyps. Die Komplementierung und Rekonstitution des mAk 2625-Epitops gelang mit einem 3 kb langen klonierten genomischen Fragment. Die Mutation des Stammes 137 konnte einer Deletion eines Cytosin-Restes im später benannten Orf 8 zugeschrieben werden. Das Protein welches sich aus der Sequenz von Orf 8 ableitet, zeigt Homologien zu bakteriellen Methyltransferasen. Mit Sonden, welche sich aus den klonierten Fragmenten ableiteten, konnte eine Genbank des Stammes RC1 nach LPS-Biosynthese-Genen durchsucht werden. Auf diese Weise gelang die Identifizierung einer 32661 bp langen Region des Genoms von Legionella pneumophila, die 30 mögliche offenen Leseraster (Orfs) enthält. Einige dieser Orfs zeigen signifikante Homologien zu bekannten Gensequenzen der Core- und O-Antigen-Biosynthese. Der molekulare Mechanismus der Phasenvariation konnte jedoch durch diese Untersuchungen nicht entschlüsselt werden. Erst anschließende Untersuchungen zeigten, daß es sich um ein 30 kb langes instabiles genetisches Element handelt, das vermutlich auf einen Phagenursprung zurückgeht.
Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren.
Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten.
Ich praesentiere hier die Klonierung und Funktion eines ACAT-aehnlichen Enzyms von Toxoplasma gondii (T. gondii), das lebensnotwendig fuer T. gondii zu sein scheint. Medikamente, die gegen die menschliche ACAT gerichtet sind, erhoehen in geringen Konzentrationen die ACAT-Aktivitaet von T. gondii. In hoeheren Konzentrationen schraenken sie jedoch die Vitalitaet von T. gondii ein.
The role of DNA supercoiling in the coordinated regulation of gene expression in Helicobacter pylori
(2004)
Summary Mechanisms of global gene regulation in bacteria are not well characterized yet. Changes in global or local supercoiling of chromosomal DNA are thought to play a role in global gene silencing and gene activation. In Helicobacter pylori, a bacterium with few dedicated transcriptional regulators, the structure of some promoters indicates a dependency on DNA topology. For example, the promoter of the major flagellar subunit gene flaA (ó28-dependent) has a shorter spacing of 13 nucleotides (nt) in comparison to the consensus promoter (15 nt). Supercoiling changes might be a mechanism of gene-specific and global transcriptional regulation in this bacterium. The aim of this study was to elucidate, if changes in global supercoiling have an influence on global gene regulation in H. pylori, and on the temporal regulation of the flagellar biosynthesis pathway in this organism. In the present work, global DNA supercoiling in H. pylori was visualized for the first time, by determining the supercoiling state of plasmids under different growth conditions. Using this method, we showed that cellular supercoiling was clearly growth phase-dependent in H. pylori. Coinciding with increased supercoiling during the growth phases, transcription of the flaA gene was increased, while the transcription of a second ó28-dependent gene with regular promoter spacing (HP0472) was reduced, supporting the hypothesis that growth phase-dependency of promoters might be mediated by changes of DNA topology. Supercoiling in H. pylori could be influenced in a reproducible fashion by inhibition of gyrase using novobiocin, which led to DNA relaxation and to a concomitant decrease of flaA transcript levels. Promoter spacer mutagenesis of the flaA promoter was performed. With flaA promoters of increased or reduced length, transcription of flaA was reduced, less susceptible to supercoiling changes, and, under specific conditions, inverted as compared to the wild type promoter. Transcriptional interdependence between the coupled topA-flaB genes and flaA was found by analysis of the flaA promoter mutants. Chromosomally linked gyrA-flgR, and topA-flaB genes were all dependent on supercoiling and coregulated with each other. Comprehensive transcript profiling (DNA microarrays) of wildtype H. pylori with and without novobiocin treatment identified a number of genes (10% of total genes), including flagellin, virulence and housekeeping genes, which were strongly dependent on and appeared to be synchronized by supercoiling changes (transcriptional up- or downregulation). These findings indicate a tightly coupled temporal regulation of flagellar biogenesis and metabolism in H. pylori, dependent on global supercoiling. A specific group of genes was also regulated in H. pylori by overexpression of Topoisomerase I, as detected by genome-wide analysis (DNA microarray). The DNA-bending protein HU is thought to be responsible for influencing the negative supercoiling of DNA, through its ability to wrap DNA. HU is encoded by the hup single gene in H. pylori, and constitutively expressed during the whole growth curve. An H. pylori hup mutant was constructed. H. pylori cells lacking HU protein were viable, but exhibited a severe growth defect. Our data indicate that the lack of HU dramatically changes global DNA supercoiling, indicating an important function of HU in chromosome structuring in H. pylori. Transcriptome analyses were performed and demonstrated that a total of 66 genes were differentially transcribed upon hup deletion, which include virulence genes and many other cell functions. The data indicate that HU might act as further important global regulator in H. pylori. Increased gene expression of heat shock proteins and a decreased transcription of the urease gene cluster may indicate a co-ordinated response of H. pylori to changes of environmental conditions in its specific ecological niche, mediated by HU. After the whole genomic sequences of H. pylori strains 26695 and J99 were published, two ORFs (HP0116 and HP0440) were presumptively annotated as topoisomerase I orthologs. HP0116 is the functional H. pylori topoisomerase I (TopA). HP0440 (topA2) was found in only few (5 of 43) strains. Western blot analysis indicated that TopA2 is antigenically different from TopA. TopA2 is transcribed in H. pylori, but the protein must be functionally different from TopA, since it is lacking one functionally essential zinc finger motif, and was not able to functionally complement a TopA-deficient E. coli. Like topA, topA2 was also transcribed in a growth phase-dependent manner. We did not find a function of TopA2 in DNA structuring or topology, but, in the present study, we were able for the first time to establish a unique function for TopA2 in global gene regulation, by comprehensive transcriptome analysis (DNA microarray). Transcriptome analysis showed that a total of 46 genes were differentially regulated upon topA2 deletion, which included flagellar genes and urease genes. These results suggest that TopA2 might act as a novel important regulator of both flagellar biosynthesis and urease in H. pylori.
Helicobacter pylori ist ein pathogenes Bakterium, das verantwortlich gemacht wird für verschiedene Erkrankungen des Magens und Duodenums, wie beispielsweise chronische Gastritis, peptische Ulzera und maligne Lymphome. Das Bakterium zeichnet sich durch eine hohe Rekombinationsrate aus und besitzt ein hohes Maß an genetischer Allelvielfalt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rekombinationsrate und die Länge der rekombinerten DNA-Importe anhand von sequentiellen Isolaten, die zu definierten Zeitpunkten aus dem selben Patienten isoliert wurden, untersucht. Es wurden zehn Gene, darunter sieben 'housekeeping' Gene und drei virulenzassoziierte Gene, amplifiziert und sequenziert. Die Ergebnisse zeigten eine bis dahin noch nicht für Bakterien beschriebene Fragmentlänge der DNA-Importe von durchschnittlich lediglich 417 Basenpaaren. Die Rekombinationsrate war außergewöhnlich hoch. DNA-Microarray-Analysen konnten zeigen, dass es trotz dieser hohen Rekombinationsrate nur wenige Veränderungen in der genomischen Genausstattung gab. Jedoch hing das Auftreten von Rekombinationsereignissen direkt mit Veränderungen der Genausstattung zusammen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein neues in vitro-Transformationsmodell entwickelt, das die in vivo ermittelten Resultate nachvollziehen sollte. Das Modell konnte sowohl die in vivo gefundene Rekombinationsrate als auch den Import von kurzen DNA-Fragmenten bestätigen, die zu einem Allelmosaik zwischen DNA-Rezipient und Donor führten. Auffällig war eine stark verminderte Transformierbarkeit mit Donor-DNA aus asiatischen H. pylori-Stämmen. Um eine mögliche Beteiligung des Nukleotid-Excisions-Reparatur (NER) Mechanismus an der Rekombination zu ermitteln, wurden zwei Gene des Mechanismus ausgeschaltet. Die Ergebnisse der NER--Mutanten (uvrA-, uvrD-) zeigten eine starke Verminderung der Transformierbarkeit. Diese Verminderung hatte jedoch keinen Einfluss auf die Länge der rekombinierten DNA-Importe. Das Ausschalten des uvrA-Gens führte zudem zu einer erhöhten Sensibilität gegenüber UV-Licht. Der NER-Mechanismus ist bei H. pylori in einer noch nicht aufgeklärten Weise an der Rekombination beteiligt. In einem Rhesusaffen-Tiermodell wurde die initiale Besiedlung mit H. pylori untersucht. Die Tiere stellen einen natürlichen Wirt dar und zeigen ähnliche Krankheitssymptome wie menschliche Patienten. Die Rhesusaffen wurden experimentell mit zwei klinischen H. pylori-Isolaten infiziert. Die Reisolation zu bestimmten Zeitpunkten zeigte, dass sich nur einer der beiden Stämme im Affenmagen etablieren konnte und der zweite Stamm verdrängt worden war. In einem zweiten Versuchsansatz wurden die persistent infizierten Affen mit vier weiteren H. pylori-Stämmen infiziert, um eine transiente Koinfektion zu simulieren. Diese Stämme verdrängten jedoch den bereits etablierten Stamm, und es konnte keine in vivo-Rekombination festgestellt werden. Dennoch ist dieses Modell das Erste, in dem eine persistierende experimentelle H. pylori-Infektion in Rhesusaffen über einen Zeitraum von mehr als vier Jahren nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf den beim Menschen meist unentdeckten Anfang der H. pylori-Infektion. Die Untersuchungen an weiteren Spezies des Genus Helicobacter zeigten, dass die beschriebene Spezies Heelicobacter nemestrinae keine eigene Spezies darstellt, sondern der Spezies H. pylori zugeordnet werden konnte. Den damit nächsten 'Verwandten' stellt die Spezies H. acinonychis dar, deren Stämme sich untereinander wesentlich weniger stark unterscheiden als H. pylori-Stämme. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Daten zum Verständnis der Evolution und Mikroevolution innerhalb eines Wirtes von H. pylori, die zu besseren Strategien in der Bekämpfung dieses pathogenen Bakteriums führen können.
Neisseria meningitidis, ein pathogenes Bakterium, das schwere Fälle von Sepsis und Meningitis verursacht, interagiert während der Infektion mit verschiedenen Oberflächen des Wirtes. Die schnellstmögliche Anpassung an die spezifischen Milieubedingungen im Wirtsorganismus ist daher ein essentieller Schritt in der Pathogenese. Durch Verwendung von DNA-Mikroarrays, die auf gespotteten Oligonukleotiden basieren, wurde das Transkriptionsprofil von N. meningitidis während der Infektion von Epithel- und Endothelzellen analysiert. Zur Analyse wurde die isogene kapseldefiziente siaD-Mutante des N. meningitidis Stammes MC58 verwendet. 72 Gene konnten nach Kontakt mit Epithelzellen und 48 Gene nach Kontakt mit Endothelzellen als differential reguliert identifiziert werden. Darunter auch eine große Anzahl von Virulenzgenen. Während ein Teil der detektierten Gene in beiden Systemen als differentiell reguliert galt, gab es doch eine Anzahl von ORF´s, die nur für ein Zellkulturmodell spezifisch reguliert waren (59 spezifische Gene für HEp-2 und 35 spezifische Gene für HBMEC). Für einige ausgewählte Gene wurde die im Mikroarray detektierte Regulierung durch Quantitative RT-PCR nochmals bestätigt. Die Funktion von den als induziert identifizierten Genen rfaF, hem und NMB1843 wurde im Anschluß durch die Konstruktion von Mutanten näher untersucht. Das rfaF-Gen, eine in der LPS Biosynthese involvierte Heptosyl-II-transferase, wurde in beiden Zellkultursystemen als differentiell reguliert identifiziert. Die Deletion des Gens führte speziell für den bekapselten Stamm MC58 zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasion nach Infektion von Epithelzellen. Untersuchungen des Infektionspotential für HBMEC Zellen ergaben keine signifikant veränderte Adhärenz und Invasion. Bei zusätzlicher Deletion von rfaF in einem opc negativen Stamm konnte eine Abnahme der bakteriellen Aufnahme im Zellkulturmodell HBMEC beobachtet werden. Dagegen zeigten die opc, rfaF negativen Mutanten nach Kontakt mit HEp-2 Zellen keine verminderte Invasion. Weiterhin führte die Deletion des rfaF-Gens zu einer verstärkten Sensibilität gegenüber humanen Serum. Diese Daten deuten daraufhin, dass die LPS-Struktur eine Rolle in der bakteriellen Zellinteraktion spielt, speziell wenn eine für die Adhäsion wichtige Komponente nicht mehr exprimiert wird. Der ORF NMB1843, der für einen Transkriptionsregulator aus der MarR-Familie kodiert, ebenso wie das Hämolysin Gen konnten nur nach Kontakt mit HBMEC Zellen als differentiell reguliert identifiziert werden. In Infektionsstudien zeigten die hem-Mutanten keine veränderte Adhärenz und Invasion. Weiterhin war die Zytotoxizität der Mutanten nicht eingeschränkt. Ob der ORF NMB1646 daher als Hämolysin fungiert bleibt zu klären. Durchgeführte Mikroarraystudien mit den NMB1843-Mutanten, führten zur Identifizierung einiger ORF´s, die möglicherweise unter der Kontrolle dieses Regulators stehen. Dazu gehören die Virulenz assoziierten Gene sodC, iga und nadA sowie das für ein Hämolysin kodierende Gen NMB1779. Die Untersuchung des Expressionsprofils mittels SDS-PAGE Analyse führte zur Identifizierung einer Proteinbande bei 210 kDa, die spezifisch für die NMB1843 negativen Stämme ist. Dieses Protein wurde als nadA identifiziert. NadA induziert im Tiermodell bakterizide Antikörper und gilt daher als möglicher Impfstoffkandidat. Die in dieser Arbeit vorgelegten Daten liefern neue Einblicke in die Pathogenitätsmechanismen von N. meningitidis und belegen die Bedeutung der transkriptionellen Genregulation in den einzelnen Stadien der Meningokokkeninfektion.
C.dubliniensis kann, wie auch die nahe verwandte Spezies C.albicans, als Antwort auf eine Reihe von Umweltfaktoren von der Hefeform in echtes filamentöses Wachstum übergehen. Bei der Regulation des pH-abhängigen Dimorphismus von C.dubliniensis spielt, wie bei verschiedenen anderen Pilzspezies der Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Rim101 eine zentrale Rolle. Dieser weist mit 85% zwar eine im Speziesvergleich geringe Aminosäure-identität zu C.albicans-Rim101 auf, zeigt jedoch die gleiche pH-abhängige Expression wie C.albicans-RIM101, ist in C.albicans funktionell aktiv und kann die typischen Defekte einer C.albicans-rim101-Nullmutante komplementieren. C.dubliniensis-Rim101 ist zudem beteiligt an der Regulation des Wachstums bei 45°C und der Koloniefärbung auf CHROM agar-Candida, zwei Eigenschaften, in denen sich C.albicans und C.dubliniensis unterscheiden. Ursache für diese speziesspezifische Merkmalsausprägung ist die bei C.dubliniensis deutlich stärkere Expression von RIM101. Ein weiterer phänotypischer Unterschied zwischen C.albicans und C.dubliniensis betrifft mit der Fähigkeit zu Filamentierung und invasivem Wachstum zwei für C.albicans nachgewiesenermaßen wichtige Virulenzfaktoren. Auf Kochblutagar, nach 24 - 48-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO2, bildet C.dubliniensis glatte, weiß-glänzende, scharf begrenzte halbkugelförmige Kolonien, während C.albicans-Kolonien eine rauhe, grau erscheinende Oberfläche aufweisen und mit Ausläufern in den umgebenden Agar einwachsen. Auslösend für die ausgeprägte Filamentierung von C.albicans ist das additive Zusammenwirken von erhöhtem CO2-Gehalt, erhöhter Temperatur und einem noch nicht endgültig identifizierten Bestandteil des Kochblutagars. Mit einer Sensitivität von 95,8% und einer Spezifität von 100% eignet sich dieses Verfahren auch als einfacher diagnostischer Test. Auf molekularer Ebene sind Efg1 und Cph1 an der Filamentierungsauslösung beteiligt, wobei Efg1 aber eine wesentlich größere Bedeutung zukommt. Rim101 scheint keinen Einfluss zu haben.
Die vorliegende Untersuchung konnte die Hypothese einer klonalen Entwicklung von EHEC O103:H2 bestätigen. Die in Clustern angeordnete Übereinstimmungsrate der RAPD-Fragmentierungsmuster und der Plasmidrestriktionen zeigen diese Ähnlichkeit innerhalb der Serogruppe auf, während Gemeinsamkeiten mit dem O157-Referenzstamm sich auf das Vorhandensein ähnlicher Virulenzfaktoren beschränken. Diese Varianz der phänotypischen und genotypischen Eigenschaften zeigte bei der Untersuchung hinsichtlich ihrer Bedeutung für diagnostische, phylogenetische und epidemiologische Fragestellungen unterschiedliche Wertigkeiten. Die ständig fortschreitende Differenzierung der Virulenzdeterminanten kann dabei nicht nur Ansätze zur Diagnostik sondern auch zur Therapie liefern und muss daher weiter verfolgt werden. Dennoch ist weiterhin der Nachweis des krankheitsauslösenden Shiga Toxins in der Routinediagnostik vermuteter EHEC-Erkrankungen erforderlich, mittels differenzierter Multiplex-PCR-Methoden können dabei auch Kombinationen relevanter Pathogenitätsfaktoren in einem Arbeitsgang erfasst werden. EHEC O103 traten mehrere Jahre nach E. coli O157:H7 als HUS-Erreger in Erscheinung und haben wahrscheinlich die dazu erforderliche Kombination von Pathogenitätsfaktoren erst später erworben. EHEC-Erkrankungen weisen eine steigende Inzidenz auf, können beim Menschen zu lebensbedrohlichen Krankheitsbildern führen, besitzen aber auch in der Veterinärmedizin eine hohe Relevanz. Da bisher kausale Therapien klinisch noch nicht verfügbar sind, muß aktuell vor allem die Prävention durch Infektionsprophylaxe und rasche Erkennung von Erkrankungsfällen im Vordergrund stehen.
Interaktion von Neisseria meningitidis mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke
(2005)
Ein zentrales Ereignis in der Pathogenese einer bakteriellen, durch Neisseria menigitidis verursachten Meningitis stellt die Interaktion der Bakterien mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke dar. In der vorliegenden Arbeit konnten in Infektionsversuchen mit immortalisierten HBMEC-Zellen als etabliertem in-vitro Modell des okklusiven menschlichen Hirnendothels und N. meningitidis Isolaten unterschiedlicher klonaler Linien Pathomechanismen für die Interaktion von Meningokokken mit dem Endothel der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke identifiziert werden. Diese unterscheiden sich von jenen Pathomechanismen, die die Interaktion von Meningokokken und Epithelzelllinien bzw. peripheren Endothelzellen bestimmen. Die untersuchten hypervirulenten klonalen Linien ST-32, ST-11 und ST-1 zeigen in-vivo signifikante Unterschiede in ihrem Ausbreitungsverhalten und meist unterschiedliche Krankheitsverläufe. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen vermuten, dass die molekularen Mechanismen der Adhärenz und Invasion von N. meningitidis Serogruppe A, B und C Isolaten in ihrer Abhängigkeit von Außenmembrankomponenten und externen Faktoren differieren. Die Invasion von Serogruppe B Meningokokken konnte in Infektionsversuchen mit dem Serogruppe B Stamm MC58 als repräsentativem Vertreter der hypervirulenten klonalen Linie ST-32 als Folge einer trifaktoriellen Interaktion mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke identifiziert werden: (I) Die Internalisierung der Serogruppe B Isolate in HBMEC-Zellen ist von der Expression des Außenmembranproteins Opc sowie (II) von der Anwesenheit des Serumglykoproteins Fibronektin abhängig, das als invasionsfördernde Komponente humanen Serums die Bindung von Meningokokken an spezifische Rezeptoren auf HBMEC-Zellen vermittelt. Fibronektin bindet (III) als Brückenmolekül an RGD-Bindungsmotive der 51-Integrine auf HBMEC-Zellen. Diese stellen spezifische Rezeptoren der Fibronektin-vermittelten Invasion Opc-exprimierender Serogruppe B Meningokokken in zerebrale menschliche Hirnendothelzellen dar. Weder für Serogruppe A noch für Serogruppe C Meningokokken konnte in der vorliegenden Arbeit eine Serum-vermittelte Invasion in HBMEC-Zellen beschrieben werden. Als ursächlich können die natürlicherweise fehlende Opc-Expression durch Isolate des ST-11 Komplexes sowie eine ausgeprägte Variabilität der Opc-Expression durch die analysierten ST-1 Isolate diskutiert werden. Die wesentliche Bedeutung der Zytoskelettfunktion für die Invasion von N. meningitidis in HBMEC-Zellen konnte in Infektionsversuchen mit eukaryontischen Zytoskelettinhibitoren nachgewiesen werden. Mikrofilamente und Mikrotubuli als Elemente des Zytoskeletts wurden als essentielle Komponenten einer effizienten Internalisierung Opc-exprimierender Serogruppe B Meningokokken in HBMEC-Zellen identifiziert.
Neisseria meningitidis ist Auslöser der Meningokokkenmeningitis und der gefürchteten Meningokokkensepsis, die mit einer hohen Letalität belastet sind. Meningokokken lassen sich anhand ihrer Polysaccharidkapsel in verschiedene Serogruppen einteilen, wobei die Serogruppen A, B, C, W135 und Y mit Krankheit assoziiert sind. Krankheitsisolate aus Serum oder Liquor sind fast ausnahmslos bekapselt, während Trägerisolate, die aus dem Nasopharynx von ca. 10% der gesunden Bevölkerung isoliert werden können, häufig unbekapselt sind. Das Komplementsystem, das einen wichtigen Abwehrmechanismus gegen Meningokokken darstellt, ist Teil der unspezifischen angeborenen Immunabwehr und besteht aus mehreren Serumproteasen, die in einer Kaskade der Reihe nach aktiviert werden, um am Ende eine Pore (MAC) in der Membran des Pathogens zu bilden. In dieser Arbeit wurden Faktoren untersucht, die Neisseria meningitidis dazu befähigen, im Serum zu überleben und der Lyse durch das Komplementsystem zu entgehen. Ein Schwerpunkt lag dabei auf den Serumresistenzmechanismen von Serogruppe A Meningokokken, vergleichend wurden anschließend die Mutanten der Serogruppen B, C, W135 und Y untersucht. Um den Einfluss verschiedener Pathogenitätsfaktoren auf die Serumresistenz zu beurteilen, wurden isogene knock-out Mutanten verwendet, die durch ELISA und Tricingel auf ihre Kapsel- und LPS Struktur überprüft wurden. Die Serumresistenz der Mutanten wurde durch Bakterizidietests bestimmt; zur Detektion der Bindung von Komplementkomponenten, Immunglobulinen und regulatorischen Proteinen wurden FACS Analysen, Western Blot und ELISA benutzt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kapsel der Serogruppe A Meningokokken essentiell für das Überleben im Serum ist. Die Expression der Polysaccharidkapsel führte auch bei den übrigen Serogruppen zu einer verminderten Deposition von Komplementkomponenten (C3, C4 und MAC) auf der Bakterienoberfläche. Die verminderte Komplementdeposition war nicht durch veränderte Antikörperbindung bedingt. Die bekapselten und unbekapselten Bakterien zeigten die gleichen Bindungsmuster von IgG und IgM. Auch Faktor H, ein wichtiger Regulator des Komplementsystems, ist an der Vermittlung der Serumresistenz durch die Kapsel nicht beteiligt. Die serumsensiblen unbekapselten Mutanten banden mehr Faktor H, als die entsprechenden bekapselten Meningokokken. Aus der Literatur ist bekannt, dass LPS Immunotyp und LPS Sialysierung die Serumresistenz pathogener Neisserien beeinflussen kann. Für den Serogruppe A Stamm konnte nur dann ein Überlebensvorteil durch LPS Sialysierung gezeigt werden, wenn die unbekapselte Mutante untersucht wurde. Die Expression eines verkürzten L8 LPS hingegen führte bei diesem Stamm unabhängig von der Kapselexpression zu einer erhöhten Serumresistenz. Besonders auffällig bei den entsprechenden Kontrollexperimenten mit Derivaten anderer Serogruppen war die außergewöhnliche Komplementdeposition durch den Serogruppe Y Stamm. In weiterführenden Experimenten konnten wir in Kooperation mit Dr. Sanjay Ram, Boston, zeigen, dass besondere Phosphoethanolamin Substitutionen des LPS für dieses Phänomen verantwortlich waren. Die vorliegende Arbeit beleuchtet die Komplexität der Auseinandersetzung von Meningokokken mit dem Komplementsystem. Sie zeigt auf, dass Klon spezifische Unterschiede für das Verständnis der Serumresistenz von Bedeutung sind. Die Experimente belegen, dass bei Serogruppe A Meningokokken neben der Kapsel auch das LPS einen modulierenden Einfluss auf die Serumresistenz hat.
Charakterisierung von NadR : das essentielle Enzym der NAD-Synthese bei Haemophilus influenzae
(2005)
I Zusammenfassung Haemophilus influenzae, ein Gram-negatives, Bakterium der Familie Pasteurellaceae, kann beim Menschen eine Vielzahl an Erkrankungen auslösen: Die bekapselte Stämme, v. a. mit Typ b Kapsel können Cellulitis, septische Arthritis, Epiglottitis und Meningitis verursachen. Die nicht-bekapselte Stämme können Otitis media, Sinusitis, Pneumonie und in selteneren Fällen Bakterämie verursachen. Ein besonderes Merkmal des Metabolismus von H. influenzae ist dessen Unfähigkeit Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) de novo zu synthetisieren. Daher sind die Enzyme bzw. Transporter, die an NAD+ Aufnahme und Resynthese beteiligt sind, als putative antimikrobielle Ziele von Interesse. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass NAD+ zu Nikotinamidribosyl degradiert werden muss, bevor es in die Zelle aufgenommen werden kann. Auch Proteine, die an der Degradation des exogenen NAD+ zu Nikotinamidribosyl und dessen anschließender Aufnahme in die Zelle verantwortlich sind, konnten identifiziert und charakterisiert werden. Wie Nikotinamidribosyl im Cytoplasma wiederum zu NAD+ synthetisiert wird, ist auch erst kürzlich geklärt worden: für NadR konnte sowohl eine Ribosyl-Nukleotid-Kinase (RNK) Aktivität als auch eine Nikotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase (NMNAT) Aktivität in vitro gezeigt werden. Die Kristallstruktur von hiNadR im Komplex mit NAD+ wurde auch aufgeklärt. In dieser Arbeit sollte NadR, insbesondere dessen RNK Domäne, in vivo und in vitro näher charakterisiert werden. Um zu untersuchen, ob beide Domänen in vivo essentiell sind, wurden Deletionsmutanten erzeugt, bei welchen die komplette bzw. der C-terminale Teil der RNK Domäne fehlten. Diese Deletionen konnten im nadV+ Hintergrund erzeugt werden. Die Deletionen konnten in H. influenzae nur zusammen mit dem nadV-Gen transferiert werden oder alternativ nur in die Zellen, die mit pNadRKan Plasmid transformiert wurden. Dies verdeutlicht, dass nicht nur die NMNAT Domäne sondern auch die RNK Domäne bzw. sogar nur wenige C-terminal fehlende Aminosäuren des NadR Proteins essentiell für die Lebensfähigkeit von H. influenzae sind. Gleichzeitig zeigen diese Experimente, dass die RNK-Domäne in Anwesenheit von NadV redundant ist. Ein weiterer Phänotyp der RNK-Deletionsmutante zeigte sich beim Nikotinamidribosyl-Transport. Im Gegensatz zum Wt, welcher ca. 60-80% des 14C-Nikotinamidribosyls aufnahm, konnte für die RNK-Deletionsmutante nur 2-5% Aufnahme gemessen werden. Dies konnte durch das pNadRKan Plasmid komplementiert werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass spontan Aminopyridin-resistente H. influenzae Zellen Mutationen im nadR Gen haben, insbesondere im Walker A-Motif (P-Loop) der RNK Domäne. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass NadR aus Aminopyridin und ATP Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid synthetisieren kann. Somit konnte gezeigt werden, dass die wachstumshemmende Wirkung eigentlich durch das aus Aminopyridin synthetisierte Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid entsteht, welches NAD+ in Redox-Reaktionen verdrängt, wodurch es letztendlich zum Stillstand des Metabolimus kommt. Durch Einführen von gezielten AS-Substitutionen im Walker A und B Motif und in der LID-Domäne von NadR, konnten einige Aminosäuren identifiziert werden, welche essentiell für die Aktivität der RNK Domäne sind. Alle Aminosäuren-Substitutionen führten zum Verlust der RNK Aktivität, die NMNAT Aktivität jedoch war nicht beeinträchtigt. Desweiteren wurden diese NadR Punktmutanten in vivo untersucht. Für alle konnte eine signifikante Defizienz in der Nikotinamidribosyl-Aufnahme beobachtet werden, die gemessene Aufnahme lag im Bereich der RNK-Deletionsmutante. Dadurch konnte eine direkte Korrelation zwischen der RNK Aktivität und der Nikotinamidribosyl-Aufnahme gezeigt werden. In weiteren in vitro Experimenten konnte für NadR eine Feedback-Inhibition durch das NAD+ gezeigt werden, wobei NAD+ in erster Linie die RNK Domäne von NadR inhibiert. Eine graduelle Erhöhung der NAD+ Konzentration führte in den in vitro Assays zu einer graduellen Abnahme der RNK. Bei der NMNAT Aktivität jedoch zeigte sich keine signifikante Inhibition in Anwesenheit von NAD+. Begleitende in vivo Experimente, zeigten eine 2/3 Reduktion der Nikotinamidribosyl-Aufnahme bei den Zellen, die mit NAD+ inkubiert wurden, d. h. höhere intrazelluläre NAD+ Konzentration hatten. Für die genauere Analyse der Feedback-Inhibition durch NAD+ wurden weitere Punktmutanen hergestellt. Bei zwei der Punktmutanten wurde eine Beeinträchtigung der NadR-Aktivität beobachtet, daher wurden diese Punktmutanten von weiteren Analysen im Bezug auf NAD+-Feedback Inhibition ausgeschlossen. Eine Mutante (NadRW256F) jedoch, zeigte ähnliche Aktivität wie das Wt-NadR. In Anwesenheit von NAD+ wurde die RNK Aktivität dieser Punktmutante, im Gegensatz zum Wt-Protein, kaum gehemmt. Dadurch konnte W256 als eine der Aminosäuren identifiziert werden, die an der Vermittlung der NAD+-bedingten Inhibition der RNK-Domäne beteiligt ist.
Die Anwendbarkeit eines Oligonukleotid-basierten Microarray-Systems zur Transkriptomanalyse von Neisserie meningitidis Serogruppe B wurde im Vergleich mit einem cDNA-basierten System demonstriert. Hierzu wurde für ein Subset von 60 Genen die Eigenschaften anhand von Parallelhybridisierungen sowie eines vormals etablierten Hitzeschock Modells untersucht. Aufgrund der Vergleichsdaten wurde ein Gesamtgenmom-Array auf Oligonukleotidbasis etabliert und zur Analyse der Hitzeschock-Reaktion verwendet. Schließlich wurde mit diesem Array-System ein Modell zur Untersuchung der Transkriptomänderung nach Konfrontation mit humanem Serum realisiert. Insgesamt zeigten 284 Gene (13% des Genoms) eine differentielle Regulation mit ebenmäßigem Verhältnis von Hoch- und Herunterregulation. Die Anwendbarkeit im Hinblick auf die Suche nach potentiellen Vakzinekandidaten wurde diskutiert.
Neisseria meningitidis (Meningokokken) stellen einen häufigen Erreger von bakterieller Meningitis und generalisierter Sepsis bei Kleinkindern und Jugendlichen dar. Diese Bakterienspezies ist sehr kompetent für horizontalen DNA-Austausch durch Transformation, was zur einer sehr heterogenen Populationsstruktur führt. Innerhalb der Population gibt es wenige klonale Linien, die für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich sind, aber bei gesunden Trägern relativ selten gefunden werden. In den Achtziger Jahren trat ein hypervirulenter Klon in Kanada auf und war dort für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich. Dieser Klon wird als Elektrophoretischen Typ 15 (ET-15) bezeichnet und führt zu besonders schweren Erkrankungsverläufen, und einer hohen Letalität. In den Neunziger Jahren breitete sich dieser Klon in der Tschechischen Republik aus und trat 1998 im bayerischen Landkreis Rottal/Inn bei einem Ausbruch in Erscheinung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verbreitung von ET-15-Meningokokken unter 8000 Kindergartenkindern, Schülern und Bundeswehrsoldaten in elf Landkreisen und kreisfreien Städten sowie in sechs Bundeswehrkasernen untersucht. Die allgemeine Trägerrate an Meningokokken betrug 10,3%. Bei vier Probanden aus zwei Orten wurden ET-15-Meningokoken isoliert, was einer Trägerrate von 0,05% entspricht. Im Landkreis Rottal/ Inn wurden keine ET-15-Meningokokken gefunden. Während des Beobachtungszeitraumes ereigneten sich in Bayern vier Erkrankungsfälle durch diesen Bakterienklon. Der anschließende Vergleich der chromosomalen DNA mittels Pulsfeldgelelektrophorese nach SpeI-Verdau legte nahe, dass es sich bei den Trägerstämmen nicht um vier identische Klone handelte. Ebenso war kein gemeinsames Bandenmuster zwischen den vier Trägerisolaten und den vier Erkrankungsstämmen zu erkennen. Parallel dazu wurden die Träger- und Erkrankungsstämme mit identischen Referenzstämmen aus der Tschechischen Republik und aus Rottal/Inn verglichen, wobei sich auch hier kein gemeinsames DNA-Muster zeigte. Bei den Träger- als auch bei den Erkrankungsisolaten aus dem Untersuchungszeitraum in Bayern handelt es sich um neue Varianten des ET-15-Klones, die in Folge klonaler Expansion entstanden sein könnten. Die Inzidenz des ET-15-Trägertums in Bayern im Beobachtungszeitraum ist als niedrig einzuschätzen.
Obwohl inzwischen über 200 verschiedene Serogruppen von V. cholerae bekannt sind, wurden Ausbrüche der Cholera hauptsächlich von Stämmen der unbekapselten Serogruppe O1 und der bekapselten Serogruppe O139 verursacht. Die Komponenten des Lipopolysaccharids (LPS) von O1 und O139, sowie die Kapsel von O139 tragen zur Kolonisierung im Gastrointestinaltrakt bei. Um die Funktion des LPS und der Kapsel als Virulenzfaktor näher zu untersuchen, wurden Adhäsionsstudien mit definierten LPS- und/ oder Kapsel-Mutanten beider pathogener Serogruppen durchgeführt. Dazu wurde die Mukus-produzierende humane Darmzelllinie HT-29-Rev MTX verwendet. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (Wt) konnte für eine O Antigen-Mutante von O1 eine Reduktion um 85%, für eine O Antigen/ Kapsel-Mutante von O139 eine Reduktion um 70% in der Adhäsionsrate festgestellt werden. Ein Beitrag von ToxR regulierten Genprodukten ist ebenfalls möglich. Weiterhin wurden mit WavJ und WavD zwei Genprodukte der Kernoligosaccharid -Biosynthese charakterisiert, welche bislang nur in dem wa*-Genclustertyp 1 der klinischen Isolate nachgewiesen worden sind. Es konnte gezeigt werden, dass beide Genprodukte an der Biosynthese des Kern OS beteiligt sind, wobei WavJ mit hoher Wahrscheinlichkeit die Heptosyl-IV-Transferase darstellt. Die wavDJ-Doppelmutanten beider Serogruppen wiesen eine erhöhte Sensitivität gegenüber Novobiocin auf. Dagegen konnte eine Attenuation der Mutanten im Mausmodell nur für die Serogruppe O139 demonstriert werden. Ein Schlüsselenzym der LPS-Biosynthese stellt die Oberflächenpolymer:Lipid A-Kern OS-Ligase (WaaL), kurz O Antigen-Ligase genannt, dar. In dieser Arbeit wurden die in der Primärstruktur stark unterschiedlichen Ligasen aus einem pathogenen (P27459) und apathogenen (V194) V. cholerae Isolat strukturell und funktionell analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität beider Ligasen von der Anwesenheit eines N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Kernoligosaccharid abhängig ist. Dieser Zucker wird durch das Genprodukt WavL transferiert, welchem in dieser Arbeit die Aktivität einer N-Acetylglucosaminyltransferase zugeordnet werden konnte. Das Gen wavL wurde in allen zur Verfügung stehenden V. cholerae Isolaten nachgewiesen und stellt wahrscheinlich eine generelle Voraussetzung des Kern OS für eine O Antigen-Anheftung dar. Im Gegensatz dazu, diskriminiert die An- bzw. Abwesenheit einer Galaktose (Gal) im Kern OS die Spezifität der Ligasen von V. cholerae P27459 bzw. V194. Dabei ist die Aktivität der Galaktosyltransferase WavM, essentiell für die Aktivität der Gal-abhängigen Ligase von V194. Die Gal-unabhängige Ligase von P27459 wird hingegen durch die Anwesenheit von Gal im Kern OS inhibiert. Hybridfusionen der beiden Ligasen deuten an, dass die Erkennungsdomäne für Gal in der C-terminalen Hälfte lokalisiert ist. Erstmals wurde die Topologie einer Ligase durch PhoA- und LacZ-Fusionen analysiert. Die Suche nach konservierten Aminosäuren (AS) in verschiedenen Ligasen führte zur Identifizierung der Motive R(X3)L und H(X10)G in zwei periplasmatischen Schleife. Ein Austausch des R oder des H in diesen Motiven führte zum Verlust der Ligase-Aktiviät von WaaL aus V. cholerae und S. enterica. Damit geben diese Motive einen ersten Hinweis auf das aktive Zentrum des Enzyms. Desweiteren wurde nach möglichen O Antigen-Transportern bei V. cholerae gesucht, welche bislang noch nicht identifiziert worden waren. Über die Anpassungen von V. cholerae an aquatische Ökosysteme, insbesondere hinsichtlich der wechselnden Osmolarität, ist nahezu nichts bekannt. Durch ein in dieser Arbeit konstruiertes und etabliertes Transposonsystem konnten 3600 Mutanten erzeugt und auf Wachstumsdefekte unter hypertonischen Bedingungen untersucht werden. Eine dieser osmosensitiven Mutanten wies eine Insertion in dem Locus VCA0565 auf, welcher für eine putative Sensor-Histidinkinase kodiert. Mit dem Regulator, kodiert durch VCA0566, stellt VCA0565 das putative Zwei-Komponentensystem OsmRK dar. Transkriptomanalysen von osmR/ K-Mutanten lieferten keine Erklärung des Wachstumsdefekts unter hypertonischen Bedingungen, zeigten aber eine Vernetzung der durch OsmR/ K regulierten Gene mit dem ToxR-Regulon auf. Analysen der Außenmembran demonstrierten, dass eine Mutation von osmR/ K zu einer Repression von OmpU unter hohen Salzkonzentrationen führt. Vergleichende Experimente mit weiteren Mutanten deuteten an, dass es in osmR/ K- und toxS-Mutanten unter erhöhten Salzkonzentrationen zur Degradation von ToxR kommt. Während die Deregulation von OmpU in osmR/ K-Mutanten nur unter Salzstress zu beobachten war, führte in der toxS-Mutante auch ein Membranstress durch Zugabe von Protamin zu einer Repression von OmpU. Die zu OsmR/ K nah verwandten putativen Zwei-Komponentensysteme EnvZ/ OmpR und VCA0257/ VCA0256 hatten unter keiner der getesteten Bedingungen einen Einfluss auf die Proteine der AM. Weiterhin wurde eine C-terminale Degradation von HutA unter hypertonischen Bedingungen aufgedeckt.
Neisseria meningitidis ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen. Die Typisierung ist die Grundlage für die epidemiologische Überwachung der Erkrankung durch Meningokokken. Die Endonuklease NmeDI ist spezifisch für die klonalen Linien des ST-8 und ST-11 Komplex Meninkokken, die mit Erkrankungen der Serogruppe C assoziiert sind. Deshalb wurde für die rasche Identifizierung von Stämmen dieser Linien ein monoklonaler Antikörper entwickelt. Der Antikörper erkennt spezifisch die ST-8 und ST-11 Komplex Meningokokken in Western-Blot und Dot-Blot. Er wird mitlerweile routinemäßig im Nationalen Referenzzentrum für Meningokokken zur Identifizierung der Linien ohne zusätzliche Anwendung der Multilokus Sequenz Typisierung (MLST) eingesetzt.
Neisseria meningitidis ist einer der wichtigsten Erreger bakterieller Meningitiden und gefürchtet für das Potential Epidemien auszulösen. Die Meningokokken-Meningitis bleibt bis heute auch in Industrieländern mit hoher Mortalität verbunden. Um eine Meningitis verursachen zu können, müssen Meningokokken die Blut-Hirn/Liquor-Schranke überqueren. Dies erfolgt vermutlich über den transzellulären Weg durch die Endothelzellbarriere der Gehirnkapillare. Ereignisse unmittelbar vor der bakteriellen Internalisierung sind vielfach untersucht, noch wenig erforscht sind jedoch die in der Endothelzelle durch den initialen Kontakt des Erregers ausgelösten Signalkaskaden. Die Rolle des für eine ADP-Ribosyltransferase kodierenden narE Gens in der Pathogenese der Meningokokken-Infektion und die mögliche Bedeutung in der Aktivierung von Signaltransduktionsmechanismen wird diskutiert. Eine narE Insertionsmutante wurde hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurde die Aktivierung der extracellular signal regulated kinase (ERK) im Verlauf von Infektionsassays in HBMEC (human brain microvascular endothelial cell) mittels Western Blot untersucht. Eine Zu- oder Abnahme in der Phosphorylierung von ERK und folglich eine Aktivierung oder Deaktivierung der ERK-vermittelten Signalkaskaden in HBMEC konnte jedoch im Laufe der Infektion bei der narE Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm nicht festgestellt werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen Meningokokken intrazellulär einzeln aber auch zu mehreren in phagosomenähnlichen membranumgebenen Strukturen. Die Fähigkeit von N. meningitidis sich intrazellulär zu replizieren wurde mittels Infektions-assay untersucht. Bekapselte Meningokokken waren in der Lage, sich sowohl in Epithel- als auch in Endothelzellen zu replizieren, während unbekapselte Erreger intrazellulär abgetötet wurden. Bei Meningokokken wie auch beim Erreger neonataler Meningitiden E. coli K1 wird eine O-Acetylierung des Kapselpolysaccharids beobachtet. Die biologische Bedeutung der O-Acetylierung der Sialinsäure wurde in Infektionsassays mit einem nicht acetylierten E. coli K1 Stamm und einer isogenen konstitutiv acetylierten Mutante untersucht. In der Adhärenz an und Invasion in HBMEC konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Eine stärker ausgeprägte intrazelluläre Replikation wurde jedoch nach einer Verzögerung von mehreren Stunden bei dem nicht acetylierten Isolat beobachtet. Um die Neisseria containing Vacuole (NCV) näher zu charakterisieren und mögliche Interaktionen mit dem Endozytoseweg in HBMEC zu untersuchen, wurde eine dreifache Immunfluoreszenzfärbung zur simultanen Darstellung intrazellulärer Meningokken und spezifischer Marker des frühen bzw. späten Endosoms und Lysosoms etabliert. Eine Akquirierung des Transferrinrezeptors als Marker für das frühe Endosom und des Lamp-1 (lysosomal associated membrane protein 1) als Marker für das späte Endosom konnte durch Kolokalisationsstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt werden.
Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein.
In the present thesis, two projects on the use of microarray technology for molecular epidemiology of Neisseria meningitidis have been followed. The first one evaluated microarrays based on polymorphism-directed oligonucleotide design for typing of N. meningitidis adopting the multilocus sequence typing (MLST) concept. The number of oligonucleotides needed to cover all known polymorphisms was much lower compared to the number needed if a tiling strategy would have been chosen. Initial experiments using oligonucleotides 28-32 nucleotides in length, revealed that the applied hybridisation protocols were highly specific. However, despite of several optimisation steps, the rate of misidentification of oligonucleotides remained >1.8% in consecutive validation experiments using arrays representing the genetic diversity at three MLST loci. This finding led to the assumption that the high density of polymorphic sites and extensive GC-content variations at N. meningitidis MLST loci hindered the successful implementation of MLST microarrays based on polymorphism-directed oligonucleotide design. In the 1980s, the ET-15 clone emerged within the ST-11 complex of N. meningitidis. This new clone was associated with severe meningococcal disease and outbreaks world-wide. Therefore, the goal of the second project was to identify genetic differences between ET-15 strains and other ST-11 strains using whole genome microarray technology. Three genes encoding hypothetical proteins were identified to be present in all ET-15 strains but absent in other ST-11 strains. This finding together with unpublished observation from our group suggested that several genome alterations occurred before the clonal expansion of the ET-15 clone started. The role that these three genes play in the pathogenicity of the ET-15 clone is unclear. The genome comparisons revealed furthermore that studies of the ET-15 clone displayed approximately two-fold less gene content variation than ST-11 strains not belonging to the ET-15 clone. This finding is in accordance with the recent emergence and clonal expansion of the ET-15 variant.
In der vorliegenden Dissertation wurde für die Entwicklung eines Lebendimpfstoffs zum Schutz vor Infektionen durch Neisseria meningitidis Serogruppe B zunächst ein geeigneter Impfstamm aus mehreren Neisserienstämmen der Serogruppe B, ST-32 Komplex, ausgewählt. In diesem sollte anschließend die Sicherheit für den Impfstoff-Empfänger durch die unabhängige Deletion sowohl eines Virulenzgens als auch eines Gens, das die homologe Rekombination der Neisserien bedingt, garantiert werden. Als Virulenzgen wurde siaD deletiert, das für ein essentielles Enzym der Kapselbiosynthese kodiert (Edwards et al., 1994). Dabei wurde eine neue Transformationsmethode eingesetzt (modifiziert nach Gunn und Stein; Gunn und Stein, 1996). Die kapsellose siaD-Deletionsmutante wurde dann genotypisch und phänotypisch anhand verschiedener Adhärenz- und Invasionsassays an humanen Epithel-, Endothel- und Dendritischen Zellen geprüft. Dabei fanden sich Unterschiede im Adhärenz und Invasionsverhalten im Vergleich zu einer anderen siaD-Mutante des gleichen Wildtyps. Diese Unterschiede wurden durch eine im Westernblot nachgewiesene, bei beiden siaD-Mutanten unterschiedliche Opa-Expression begründet, da das Opa-Protein als Protein der äußeren Bakterienmembran Oberflächenproteine von humanen Epithel- und Endothelzellen bindet und so zur Adhärenz an die Zielzellen führt (Virji et al., 1993, 1995). Weiterhin sollte in der siaD-Deletionsmutante das für die homologe Rekombination essentielle recA-Gen deletiert werden (Koomey und Falkow, 1987; Miller und Kokjohn, 1990). Der Nachweis einer recA-Deletion gelang trotz mehrfacher Ansätze mit der neuen Transformationsmethode nicht, da die Deletionsrate von recA wahrscheinlich unter der Sensitivität der hier verwendeten Analysemethoden lag.
Molekulare Identifizierung von Neisseriaceae und Moraxellaceae mittels ribosomaler DNA-Sequenzierung
(2005)
Die schnelle und verlässliche Identifizierung mikrobiologischer Isolate ist ein fundamentales Ziel der klinischen Mikrobiologie. Bei einigen gram–negativen Spezies ist die klassische phänotypische Identifizierung, basierend auf metabolischen, enzymatischen oder serologischen Methoden erschwert, zeitraubend oder nicht suffizient. Durch die Sequenzierung partieller Abschnitte der 16S- oder 23S-rDNA können Bakterien meist exakt spezifiziert werden. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, hypervariable rDNA Abschnitte zu finden, die von stark konservierten Regionen flankiert werden, um auf molekularer Ebene Mitglieder der Familie Neisseriaceae und Moraxellaceae zu diskriminieren. Die inter- und intragenetischen Beziehungen von insgesamt 94 Stämmen wurden untersucht. Im Vergleich zu den Referenzstämmen der Genera waren bei der partiellen 16S-rDNA (E. coli Position 54 – 510) je Spezies durchschnittlich 30 polymorphe Positionen vorhanden. Die partiellen 23S-rDNA Abschnitte (E. coli Position 1400 – 1600) zeigten durchschnittlich 11 polymorphe Positionen. Neisseria macacae und N. mucosa subsp. mucosa (ATCC 19696) zeigten identische 16S- und 23S-rDNA Sequenzen. Die Gruppierung verschiedener Isolate war bei Acinetobacter lwoffii, Moraxella lacunata und Neisseria mucosa an beiden untersuchten Genabschnitten heterogen. Im Fall von N. meningitidis konnte mit Hilfe der 23S-rDNA Daten nicht suffizient gruppiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine Überlegenheit der untersuchten partiellen 16S-rDNA zur Diagnostik der Neisseriaceae und Moraxellaceae. Eine Referenzdatenbank zur Diagnostik von Mikroorganismen sollte mehr als ein Isolat einer Spezies enthalten und zudem einen polyphasischen Ansatz verfolgen. Die Sequenz–Chromatogramme und weitere diagnostisch relevante Informationen wurden mit der „offline“-Datenbank RIDOM_Tool gesammelt und sind ein Teil des Internet-basierenden Service von RIDOM (www.ridom-rdna.de). Eine eingegebene Sequenzfolge kann online eingefügt und damit ein direkter Vergleich mit den in der RIDOM Referenzdatenbank existierenden Datensätzen initiiert werden.
Im Rahmen der Etablierung eines Bettnetzprojektes zur Prävention der Malaria wurden eine städtische (n=60) und eine ländliche Probandengruppe (n=60) in Nigeria im Großraum Abeokuta vor und ein Jahr nach Einführung von mit Insektizid behandelten Bettnetzen (ITN) untersucht. Dabei war das Ziel dieser Arbeit (1) die epidemiologische Malariasituation im Untersuchungsgebiet zu erfassen; (2) Wissen durch Informationsgespräche zu den Themen Prävention, Diagnostik und Therapie der Malaria zu vermitteln; (3), Akzeptanz und Gebrauch der ITN zu dokumentieren; (4), den Effekt von ITN am Verlauf klinischer und labortechnischer Parameter zu verfolgen und (5) die Prävalenz und Höhe von Antikörpern (NANP19) gegen das Circumsporozoiten (CS) Protein, ein Hauptoberflächenprotein der Sporozoiten vor Projektbeginn zu erfassen, sowie ihre Veränderung ein Jahr nach Einführung von ITN. Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass Malaria eines der wichtigsten Gesundheitsprobleme der Region ist. Wissensvermittlung förderte die Akzeptanz und den regelmäßigen Gebrauch von ITN. Die klinischen und labortechnischen Untersuchungen bestätigen den protektiven Effekt durch Benutzung von ITN. Fast alle Parameter (Anzahl der Fieberepisoden/Jahr, Anzahl der arbeitsunfähigen Tage, Milzuntersuchung, Ausstrichuntersuchungen und Untersuchung auf Ak) zeigten für die Bettnetzbenutzergruppen Verbesserungen, von denen einige im Vergleich zum Vorjahr hochsignifikant waren. Die Resultate dieser Arbeit weisen darauf hin, dass im hochendemischen Südwesten Nigerias ITN effektiv zur Prävention der Malaria eingesetzt werden können. Der schwere Zugang zu medizinischer Versorgung für ländliche Bevölkerungsgruppen empfiehlt ihren Einsatz besonders in diesen Regionen. Hohe Infektionsraten mit der Gefahr rezidivierender Infektionen, besonders für Kinder, könnten dadurch gesenkt werden. Durch die gezeigte signifikante Reduktion der Krankeheitstage bei regelmäßiger ITN-Benutzung könnte ein zusätzlicher ökonomischer Benefit für Familien sein.
Untersuchungen zur Pathogenität von Helicobacter hepaticus : genomische und funktionelle Aspekte
(2006)
Helicobacter hepaticus stellt den Prototyp der enterohepatischen Helicobacter dar und führt zu einer persistenten Infektion von Mäusen. In immundefizienten Tieren kann er eine chronische Entzündung des Darmtraktes auslösen, welche den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen, Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa, ähnelt. Deshalb wird H. hepaticus bevorzugt als Modellorganismus zur Untersuchung der immunologischen Ursachen von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Tiermodell eingesetzt. Ebenfalls kann eine Infektion mit H. hepaticus in suszeptiblen Mäusestämmen (z.B. Balb/c, C3H/An) zu Entzündungen der Leber und Gallengänge führen, welche sich bis zu einer Hepatitis und Leberkarzinomen ausweiten können. In den meisten Studien wurde H. hepaticus bisher aber hauptsächlich als Auslöser dieser Erkrankungen eingesetzt, während die bakterielle Seite kaum betrachtet wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in einer Kooperation mit MWG Biotech, GeneData und dem Massachusetts Institute of Technology (MIT) die Gesamtgenomsequenz des H. hepaticus Referenzstammes ATCC 51449 bestimmt und annotiert. Das Genom hat eine Größe von 1.799.146 bp und kodiert für 1.875 Proteine. Die globale Ähnlichkeit des Genoms von H. hepaticus ist etwa gleich groß zu den sequenzierten Genomen von H. pylori und C. jejuni. Es fehlen H. hepaticus aber die meisten Virulenzfaktoren von H. pylori wie Adhäsine (SabA, BabA, AlpA), VacA und die meisten Proteine der cag-Pathogenitätsinsel, während Homologe zu Pathogenitätsfaktoren von C. jejuni wie CDT und Peb1 vorhanden sind. Das Genom von H. hepaticus enthält neben vielen kleineren genomischen Inseln eine Genominsel mit einer Größe von 71 kb, welche als HHGI1 benannt wurde. Sie kodiert mutmaßlich für ein TypIV-Sekretionssystem und enthält weitere Virulenzfaktoren. In Microarray- basierten Gesamtgenomvergleichen konnte gezeigt werden, dass die Insel in sieben von 13 untersuchten Stämmen großteils oder komplett fehlt. Während Mäuse, aus denen HHGI1-positive Stämme isoliert wurden, pathologische Veränderungen der Leber aufwiesen, wies keine von den Mäusen, aus denen HHGI1-negative Stämme isoliert wurden, Auffälligkeiten in der Leber oder dem Gallentrakt auf. In einem Tiermodell wurde in Kooperation mit dem MIT gezeigt, dass zwei Insel-negative Stämme zu einer geringeren Besiedlung und einer schwächeren Entzündung der Leber als der Insel-positive Referenzstamm ATCC 51449 führen. Durch die Genomvergleiche konnte auch gezeigt werden, dass verschiedene H. hepaticus-Stämme trotz einer niedrigen Sequenzvariabilität eine hohe Variation des Genomgehalts aufweisen und dass neben der HHGI1-Insel weitere kleinere Inseln in einzelnen Stämmen fehlen. Es wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals verschiedene isogene Mutanten von H. hepaticus in der HHGI-1-Insel hergestellt, die in vitro eine verringerte Immunstimulation in Makrophagen zeigten. Der Mechanismus dieser Immunsuppression konnte noch nicht vollständig aufgeklärt werden, sie werden jedoch derzeit in Mausmodellen weiter auf ihre krankheitsauslösenden Eigenschaften untersucht. Da bisher keine gut charakterisierten Zellkulturmodelle für die in vitro-Untersuchung von H. hepaticus vorlagen, wurden solche im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Dazu wurden die intestinale murine epitheliale Zelllinie m-ICcl2, welche das primäre Habitat von H. hepaticus (Krypten im Dünndarm) imitiert, die murine Hepatozytenzelllinie NCTC Klon 1469, welche ein mögliches sekundäres Habitat (Lebercanaliculi) imitiert und die murine Makrophagenzelllinie J774 benutzt. Während J774 und NCTC Klon 1469 durch die meisten Liganden für Mustererkennungsrezeptoren stimuliert werden konnten, reagierten m-ICcl2- Zellen substantiell nur auf den TLR4-Liganden E. coli-LPS. Dementsprechend induzierte H. hepaticus in J774 und NCTC Klon 1469 eine starke proinflammatorische Antwort, während m-ICcl2 trotz guter Adhärenz nur schwach von H. hepaticus stimuliert wurde. Es wurde gezeigt, dass LPS und Flagelline von H. hepaticus nur eine geringe immunstimulatorische Wirkung besitzen, während Lipoproteine und vermutlich auch Peptidoglykan die wichtigsten PAMPs von H. hepaticus darstellen. Durch die Analyse der durch H. hepaticus ausgelösten globalen Genregulation in J774 und NCTC Klon 1469 wurde nachgewiesen, dass H. hepaticus nicht primär über NF-κB, sondern über MAP-Kinasen eine proinflammatorische Antwort auslöst. Außerdem wurde gezeigt, dass H. hepaticus untypisch für extrazelluläre Bakterien eher eine Wirtsantwort auslöst, welche der durch intrazelluläre Bakterien ähnelt. In diesen Modellen führten HHGI1-negative Stämme oder Mutanten der HHGI1-Insel zu einer leicht verringerten proinflammatorischen Antwort. Dies spiegelte sich auch in der transkriptionellen Regulation von Schlüsselfaktoren der angeborenen Immunantwort wie TLR2, IL-12, NOD2 oder Tollip wieder. In m-ICcl2-Zellen führte eine Koinkubation mit lebenden H. hepaticus oder Lysaten zu einer verringerten durch E. coli-LPS ausgelösten Induktion von MIP-2. Darauf basierend wurde gezeigt, dass LPS von H. hepaticus einen wesentlichen Faktor für diese Inhibierung der proinflammatorischen Antwort darstellt, nicht jedoch die HHGI-1-Insel oder andere vermutete Virulenzfaktoren. Zumindest auf mRNA-Ebene wurde durch H. hepaticus auch die Induktion anderer Cytokine wie TNF-α oder MIP-1α gehemmt. Eine primäre Koinkubation von m-ICcl2 mit E. coli-LPS führte zu einer Toleranzinduktion gegenüber einer zweiten Stimulation. Diese Toleranzinduktion wurde durch eine Inkubation mit H. hepaticus ebenfalls gehemmt. Die Hemmung der proinflammatorischen Antwort durch H. hepaticus-LPS konnte auch in NCTC Klon 1469 und unter serumfreien Bedingungen für die durch S. typhimurium- Flagellin induzierte IL-8 Sekretion in der humanen Kolonkarzinomzelllinie Caco2 nachgewiesen werden. Damit war diese Hemmung weder zellspezifisch noch spezifisch für die TLR4-abhängige Stimulation. Basierend auf dieser Arbeit wurde ein Modell für die Entstehung einer chronischen Entzündung im Intestinaltrakt entwickelt, welches Erklärungsansätze für die Entwicklung einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung im Menschen liefern könnte.
Invasive Pilzinfektionen haben in den letzten Jahren stetig zugenommen und bedrohen insbesondere immunsupprimierte Patienten. Nach der Zulassung von neuen antimykotisch wirksamen Substanzen hat sich das verfügbare Spektrum an therapeutischen Optionen deutlich erweitert. Demgegenüber steckt die verfügbare Technik zur Resistenztestung humanpathogener Pilze noch weitgehend in den Kinderschuhen. Die Analyse zur Verfügung stehender Techniken ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zu diesem Zweck werden zunächst die Daten von 728 klinischen Isolaten von Candida spp., die zwischen April 2000 und November 2002 am Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg unter Anwendung des Mikrodilutionsverfahrens nach DIN getestet wurden, unter epidemiologischen Aspekten ausgewertet. Es zeigt sich ein deutliches Überwiegen von Candida albicans (53%), gefolgt von Candida glabrata (26%). Candida parapsilosis und Candida tropicalis hatten jeweils einen Anteil von ca. 7%. Sowohl Candida albicans wie auch Candida glabrata verhielten sich gegen Fluconazol, Amphotericin B und 5-Flucytosin in hohem Maße sensibel. Candida krusei und Candida tropicalis wurden zu einem nennenswerten Anteil resistent, vor allem gegen Fluconazol und 5-Flucytosin, getestet. Im zweiten Teil der Arbeit wird anhand von 56 Candida spp. ein Vergleich des Mikrodilutionsverfahrens nach DIN und des internationalen Standardverfahrens nach NCCLS durchgeführt. Es zeigen sich sowohl hinsichtlich Reproduzierbarkeit, Ablesezeitpunkt der minimalen Hemmkonzentration sowie Stabilität der Testergebnisse über den angestrebten Ablesezeitpunkt hinaus deutliche Vorteile des NCCLS- gegenüber dem DIN-Verfahren. Der wesentliche Unterschied zwischen beiden Protokollen liegt im verwendeten Wachstumsmedium. Ein Problem beider Verfahren besteht im großen Zeitaufwand, weshalb das YeastOne-Testverfahren, ein kommerziell erhältliches Mikrodilutionsverfahren, das den Farbindikator Alamar Blue zur Erleichterung der visuellen Endpunktbestimmung beinhaltet, im dritten Teil der Arbeit für die Anwendung am Institut in Würzburg gegenüber der NCCLS-Methode evaluiert wird. Es zeigt sich eine hohe Reproduzierbarkeit mit ca. 96% bei Fluconazol, Amphotericin B und 5-Flucytosin und eine gute Korrelation zum Standardverfahren nach NCCLS. Entscheidende Vorteile gegenüber dem NCCLS-Protokoll sind eine frühere Endpunktbestimmung für Azole, die bereits nach 24 Stunden erfolgen kann, sowie in der Zeitersparnis zwischen 64% und 94%. Ergänzend werden einige Schimmelpilze sowohl mit dem NCCLS- als auch mit dem YeastOne-Verfahren getestet, wobei sich eine hohe Korrelation der YeastOne- mit den NCCLS-Ergebnissen zeigt und sich für beide Vorgehensweisen der Ablesezeitpunkt bei gutem Wachstum nach 48 Stunden festlegen lässt. Die Resistenztestung klinischer Isolate wurde daraufhin im Institut für Hygiene und Mikrobiologie auf das YeastOne-System umgestellt. In ersten Anwendungen wurden dabei gute Ergebnisse erzielt.
Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative, microaerophilic, spiral-shaped bacterium. It resides in the gastric mucous layer and epithelial lining of the stomach, often clustering at the junction of epithelial cells. H. pylori colonization usually occurs during childhood, and, when left untreated, generally persists for the host’s lifetime. Persistent H. pylori infection can cause chronic superficial gastritis and gastric duodenal ulcers, which is possibly linked to the development of gastric carcinoma and primary gastric lymphoma, especially of the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) type. It was recently defined as a class 1 carcinogen. The gastric inflammatory response to H. pylori infection is characterized by infiltration of the mucosa by neutrophils, T and B cells, plasma cells and macrophages. This reaction is initially induced by H. pylori attachment, followed by cytokine release by gastric epithelial cells. Epidemiological studies revealed that more than 50% of adults are infected with H. pylori all over the world. However, interestingly, only a subset of individuals develops serious H. pylori-related disease, while most infected individuals show no clinical symptoms. Gastric epithelial cells, like intestinal epithelial cells, express a subset of Toll-like receptors (TLRs) and similar pattern recognition receptors, which are important for the activation of the innate immune system. Bacterial components such as lipopeptides, peptidoglycan, LPS, flagellin, and CpG DNA are the ligands of TLRs. Thus, TLRs in gastric epithelial cells might be able to contribute to innate immune responses to H. pylori infection. However, there is scant knowledge about the mechanisms of innate immune response to acute and chronic H. pylori infection. This study is focused on host cell interaction with H. pylori flagellins, which are major components of the flagellar apparatus, and innate immune responses against them. The flagellins, which are essential for bacterial motility, are important for H. pylori to survive in the stomach mucus during the whole infectious cycle. Flagellins are known to act as the main determinant of many mucosal pathogenic bacteria that mediates proinflammatory signaling, including transcriptional factor NF-B activation via TLR5. In the first part of the study, we investigated the effects of H. pylori flagellins on TLR5 expression, NF-B activation and IL-8 production in various human intestinal and gastric epithelial cell lines by using Western blotting, semi-quantitative RT-PCR and ELISA. IL-8 is a potent neutrophil-activating chemokine expressed by gastric epithelial cells. When we stimulated the cells with the native form of or E. coli-expressed recombinant H. pylori flagellins, FlaA and FlaB, IL-8 was not induced in any case, while S. typhimurium flagellin (FliC) induced it significantly. H. pylori was able to modulate TLR5 protein expression and NF-B activation in epithelial cells regardless of the presence of flagellins. Having established the finding that H. pylori flagellins have unusually low immune-stimulatory properties, we further investigated to find out possible reasons why H. pylori flagellins are distinct from other flagellins of pathogenic bacteria in terms of immune-stimulatory activity. From amino acid sequence comparisons, we found that some regions in the terminal D0D1 protein domains of H. pylori flagellins are different from flagellins of other pathogenic bacteria. D0D1 is the domain which is known to interact with TLR5 in Salmonella FliC. To examine whether the differences endow H. pylori flagellins with low immune-stimulatory properties, we created several mutated H. pylori flagellins (FlaA and FlaB) by site-directed mutagenesis that contain one to four epitopes of Salmonella flagellin D0D1 domain amino acid sequences. The mutant flagellins expressed both in H. pylori and E. coli were used to determine their influence on TLR5-signaling mediators and cytokines, such as MAPkinases, (ERK, p38), NF-B, IL-8, and MIP-3. Salmonella FliC expressed in E. coli induced activation of p38, IB and NF-B leading to IL-8 and MIP-3 production in gastric epithelial cells. However, none of the H. pylori flagellin mutants activated MAP kinases or induced those cytokines. In a co-immunoprecipitation assay none of the recombinant wild type or mutated H. pylori flagellins showed any direct physical interaction with TLR5, while Salmonella FliC significantly co-precipitated with TLR5. Interestingly, we found H. pylori flagellins bind to the surface of gastric epithelial cells like FliC, although they do not bind to or stimulate TLR5. Based on the physical interaction of H. pylori flagellins and FliC with human gastric epithelial cells, we further analyzed transcriptional regulation by H. pylori flagellin in these host cells using microarray analysis. The result showed that H. pylori flagellins modulate host cell gene expression, and many of the identified regulation events overlap with the genes regulated by FliC. These findings imply that H. pylori flagellins do play a role in gene regulation of host cells probably through still unknown factors or receptors, although they do not trigger TLR5-related signaling pathways. The results of our study suggest that, in addition to the low immune-stimulatory activity of H. pylori LPS, the evolutionary reduction in stimulating activity of H. pylori flagellins on the local innate immune responses in the stomach in vivo might be a further strategy of this chronic mucosal pathogen to evade and minimize deleterious host responses, thereby promoting life-long persistence in the host, and possibly contributing to cancerogenesis.
Neisseria meningitidis kann rasch tödlich verlaufende Erkrankungen wie die Meningokokken-Meningitis und –Sepsis hervorrufen. In den Industriestaaten werden diese Infektionen meist durch Meningokokken der Serogruppen B und C hervorgerufen. Während für die Serogruppe C bereits ein suffizienter Polysaccharidimpfstoff existiert, konnte ein solcher für Stämme der Serogruppe B aufgrund der Immuntoleranz gegen deren N-acetylneuraminsäure noch nicht gefunden werden. Eine Lebendvakzine könnte dieses Problem lösen, da hier viele verschiedene Antigene, welche eine Immunantwort im menschlichen Körper induzieren, zur Verfügung stünden. Die Voraussetzung für eine Lebendvakzine ist Attenuierung eines B-Meningokokken-Stammes durch die Deletion verschiedener Gene. In früheren Untersuchungen ergaben sich Hinweise darauf, dass die LOS-Sialylierung einen Virulenzfaktor darstellt. Das lst-Gen codiert für die α-2,3-Sialyltransferase, deren Aufgabe es ist, die Sialinsäurereste an die Lacto-N-Neotetraose des LOS zu binden. In unserer Arbeit konnten wir zeigen, dass eine lst-Deletionsmutante des Serogruppe-B-Stammes MC58 herstellbar ist. Das Wachstumsverhalten der Mutante in PPM+-Medium unterschied sich nicht von dem des Wildtyps. Auch die Resistenz der Bakterien gegenüber humanem Serum (bis 80%) blieb von der Deletion des lst-Gens unbeeinflusst. Bei der Interaktion mit Epithel- und Endothelzellen allerdings zeigte sich bei der Mutante eine erhöhte Invasivität. Da die Invasion durch Oberflächenproteine wie Opa und Opc vermittelt wird, wäre eine mögliche Begründung für diese Veränderung die bessere Zugänglichkeit dieser Proteine durch das Fehlen der LOS-Sialylierung. Meningokokken mit nicht sialyliertem LOS wurden außerdem von dendritischen Zellen signifikant besser phagozytiert als Wildtyp-Bakterien. Besonders deutlich zeigte sich dies bei fehlender Kapsel. Auch hier ist sicherlich die Maskierung von Bindungsstellen durch Sialinsäuregruppen ein Grund für diese Beobachtung. Weiterhin wurde die Interaktion von Meningokokken verschiedener Serogruppen mit dendritischen Zellen unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses der Polysaccharidkapsel untersucht. Die Meningokokken der untersuchten Serogruppen A, B und C wurden von dendritischen Zellen gut phagozytiert und abgetötet. Allerdings waren sowohl die Adhärenz als auch die Phagozytose bei Vorhandensein einer Polysaccharidkapsel stark inhibiert. Neisseria meningitidis-Stämme aller drei getesteten Serogruppen induzierten eine starke Ausschüttung der Zytokine TNF-α, IL-6 und IL-8. Als ein Induktor dieser Substanzen erwiesen sich die Lipooligosaccharide der Meningokokken. Allerdings zeigte sich in den Versuchen auch, dass noch weitere Bakterienbestandteile eine Zytokinausschüttung hervorrufen können. Die Sialylierung der Lipooligosaccharide hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Menge der produzierten Zytokine. Mit dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass dendritische Zellen mit der Ausschüttung von Zytokinen und der Phagozytose von Bakterien eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Erkrankungen durch Meningokokken spielen könnten. Auch beim Zusammenspiel mit DC-s wirkt die Kapsel als Schutzfaktor vor dem Angriff des menschlichen Immunsystems. Dieser Schutz kann durch die LOS-Sialylierung zusätzlich gesteigert werden. Die Deletion des lst-Gens könnte also als ein Baustein für die Konstruktion eines attenuierten Lebendvakzine-Stammes fungieren.
Haemophilus influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium aus der Familie der Pasteurellacaea. Das physiologische Merkmal von H. influenzae ist die essentielle, aber defiziente Hämin- und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) Biosynthese. Während Hämin für aerobes Wachstum benötigt wird, ist NAD+ sowohl für aerobes, als auch für anaerobes Wachstum essentiell. Als NAD+-abhängiger Organismus fehlen H. influenzae die meisten Enzyme für die NAD+-Biosynthese. Daher kann dieses Bakterium nur eine begrenzte Anzahl an Vorläufermolekülen, wie NAD+(P), Nikotinamid-Mono-Nukleotid (NMN) und Nikotinamid-Ribosid (NR) aus der Umwelt zur NAD+-Synthese nutzen. Andere NAD+-unabhängige Pasteurellacaea-Spezies, wie Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida und Actinobacillus actinomycetemcomitans, können auch kein NAD+ aus der de novo Biosynthese bereitstellen, diese Arten können aber zusätzlich auf Nikotinamid (NAm) wachsen. Die Erforschung des NAD+-Aufnahmesystems kann für die Entwicklung antimikrobieller Therapeutika von großem Interesse sein. Von unserer Arbeitsgruppe wurde die NAD+-Aufnahmeroute aufgeklärt; so werden NAD+(P) und NMN von e(P4) und NadN zu NR degradiert, nachdem NAD+ und NMN durch OmpP2 in das Periplasma gelangt sind. NR wird schließlich, als einziges Substrat, durch einen putativen Transporter in das Zytoplasma aufgenommen. In dieser Arbeit wurde der putative NR-Transporter als das hypothetische Gen HI1077.1 im Genom von H. influenzae identifiziert, welches nur 13,8% Identität zu Escherichia coli pnuC und 43,6% Identität zu P. multocida pnuC aufwies. Es konnten zwei Sequenzierungsfehler im original-annotierten Genom von H. influenzae gefunden werden, die zu einer Leserasterverschiebung geführt haben. HI1077.1 wurde zu pnuCHi reannotiert und weist nun eine 19,7% Identität zu pnuCEc und 71,4% Identität zu pnuCPm auf. Es wurde eine HI1077.1 Mutante konstruiert, die ein Wachstumsdefizit auf BHI-Platten bis zu einer NAD+-Konzentration von 15 mM bzw. unterhalb einer NR-Konzentration von 0,1 mM zeigte. Im Transport-Assay transportierte die HI1077.1 Mutante nur noch etwa 1% des eingesetzten NAD+- bzw. NR-Labels. Im Rattenversuch konnte gezeigt werden, dass das in vitro nicht essentielle pnuC in vivo sehr wohl essentiell ist. Die HI1077.1 Mutante verursachte, im Gegensatz zum Wildtyp und zur pnuC-Komplementante keine Bakteriämie mehr. Bei einer Komplementation mit NadV, kodierend für eine Nikotinamid-Phosphoribosyltransferase von H. ducreyi, wurde ebenfalls eine mit dem Wildtyp vergleichende Bakteriämie verursacht. Da bisher noch keine H. influenzae Isolate bekannt sind, die nadV besitzen, würde sich der hier identifizierte NR-Transporter von H. influenzae gut als antimikrobielles Ziel eignen. Die Protein-Topologie von PnuC wurde hinsichtlich der Membranlokalisation analysiert und PnuC konnte als ein Transmembranprotein bestätigt werden, das in der cytosolischen Membran lokalisiert ist. Durch PhoA und LacZ Analysen konnte die Topologie von PnuC aufgeklärt werden. Demnach besitzt PnuC acht Transmembrandomänen (TMD), wobei die N- und C-Termini im Cytosol lokalisiert sind. Die Analyse der strukturellen Funktion ergab, dass PnuC nur eine Unterbrechung der sechs letzten C-terminalen Aminosäuren (AS) toleriert, während die Proteinfunktion durch einen fusionierten C- und N-terminaler His-Tag nur mäsig beeinflusst wird. Des Weiteren wurde die Substratspezifität von PnuC untersucht. Dabei zeigte sich, dass der lange geglaubte NMN-Transporter von E. coli ebenfalls als NR-Transporter fungiert. Die Substratspezifität wurde auch bei A. actinomycetemcomitans und P. multocida untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass A. actinomycetemcomitans und P. multocida ebenfalls als einziges Substrat NR transportieren können, aber im Gegensatz zu H. influenzae NAD+ und NMN nicht als NR-Quellen verwerten können, was wahrscheinlich auf das Fehlen von e(P4) und NadN zurückzuführen ist. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit das Gen HI0308 untersucht. Um dem Aspekt der Energetisierung des PnuC-Transporters näher zu kommen, sind die Gencluster HI1078-HI1080 und HI0164-HI0171 in die Untersuchung mit einbezogen worden. Die Na+-NQR-Oxidoreduktase wurde im Hinblick ihrer Dehydrogenase-Aktivität genauer charakterisiert. Die Suche nach möglichen Inhibitoren von PnuC führte zu 3-Aminopyridin-Analoga. Durch eine Mutantenanalyse konnte gezeigt werden, dass 3-AADP, 3-AAD und 3-AmPR der selben Aufnahmeroute folgen wie NADP+, NAD+ und NR, und via PnuC in die Zelle aufgenommen werden. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass NadR aus 3-AmPR und ATP das 3-AAD synthetisiert, welches als kompetitiver Inhibitor mit NAD+ in den zellulären Redoxreaktionen konkurriert und dadurch den Stoffwechsel hemmt. Des Weiteren wurden mehrere spontan 3-Aminopyridin-resistente H. influenzae Mutanten isoliert.
Es wird angenommen, dass die invasiven Stadien parasitärer Helminthen zur Organfindung und zur Weiterentwicklung auf die Sensierung spezifischer Wirts-Signale angewiesen sind, wobei die molekulare Natur dieser Signale bislang weitgehend ungeklärt ist. Vorangegangene Untersuchungen am Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis, dem Erreger der alveolären Echinokokkose, hatten bereits ergeben, dass dessen Metacestoden-Larvenstadium zur Weiterentwicklung kleine, lösliche Wirtsmoleküle benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein axenisches (Wirtszell-freies) Kultursystem für das Metacestoden-Stadium entwickelt, mittels dessen sich diese Fragestellungen in vitro angehen lassen. Mit Hilfe dieses Kultursystems konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die drei Wirts-Hormone/Zytokine, Insulin, epidermal growth factor (EGF) und bone morphogeneic protein 2 (BMP2), einen Einfluss auf die Proliferation und die Differenzierung von E. multilocularis haben. Während für Insulin und EGF Wachstums-stimulierende Effekte gezeigt werden konnten, förderte BMP2 die Differenzierung des Metacestoden zum nächsten Larvenstadium, dem Protoscolex. In Modellorganismen wie Säugern, Drosophila und Caenorhabditis elegans verlaufen die durch Insulin- und EGF-ähnlichen Zytokine induzierten Signalmechanismen über die sogenannte mitogen activated protein (MAP)-Kinase-Kaskade. Um zu untersuchen, ob die externe Zugabe von Wirts-Insulin bzw. -EGF in einer Stimulierung der MAPK-Kaskade des Parasiten führt, wurden in dieser Arbeit zunächst die Komponenten dieses Signalweges bei E. multilocularis auf molekulargenetischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die Arbeiten umfassten Studien zu kleinen GTPasen des Parasiten (EmRas, EmRap1, EmRap2, EmRal), zu einem Orthologen der Kinase Raf (EmRaf), sowie Orthologen der Kinasen MEK (EmMKK) und ERK (EmERK). Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren in E. multilocularis Teil einer MAP-Kinase-Kaskade sind. Zudem wurde nachgewiesen, dass diese Faktoren stromabwärts eines EGF-Rezeptor-Orthologen (EmER) des Parasiten fungieren, welches ebenfalls in der vorliegenden Arbeit analysiert wurde. Damit wurden die Voraussetzungen geschaffen, den Einfluss exogen zugegebenen Insulins bzw. EGFs auf die Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade im Parasiten zu untersuchen. Erste Analysen zeigten bereits, dass die zentrale Komponente dieser Kaskade, EmERK, durch die genannten Wirts-Zytokine aktiviert wird. Dies legt nahe, dass Wirt-Parasit-Kommunikationsmechanismen über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen der alveolären Echinokokkose spielen. Aufbauend auf dem axenischen Kultursystem ist es in dieser Arbeit auch erstmals gelungen, Primärzellkulturen für E. multilocularis anzulegen und die Parasitenzellen zur in vitro Neubildung von Metacestoden-Vesikeln anzuregen. Erste Experimente zur genetischen Manipulation dieser Primärzellen konnten erfolgreich durchgeführt werden. Aufbauend auf der hier vorgestellten Methodik sollte es in künftigen Untersuchungen möglich sein, stabil transfizierte Echinococcus-Zellen zu generieren und diese zur Herstellung vollständig transgener Parasiten-Stadien zu nutzen. Dies würde die zur Untersuchung der E. multilocularis-Entwicklung und der Wirt-Parasit-Interaktionsmechanismen bei einer Infektion zur Verfügung stehenden Methoden entscheidend erweitern und könnte u.a. zur weiteren biochemischen Analyse der in dieser Arbeit dargestellten Signalmechanismen des Parasiten herangezogen werden.
Meningokokken sind nach wie vor eine wichtige Ursache für Gehirnhautentzündungen und Sepsen weltweit, vor allem bei Kindern und Jugendlichen. Weil viele Pathomechanismen dieses Erregers bislang noch unvollständig verstanden sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit populationsbiologische und pathogenetische Aspekte von Neisseria meningitidis untersucht. Die Kapsel ist der hauptsächliche Pathogenitätsfaktor von Meningokokken und wichtig für die Besiedelung von neuen Wirten. Isolate von symptomfreien Trägern sind allerdings häufig unbekapselt. Um Ursachen oder Mechanismen für den Verlust der Kapselexpression aufzudecken, wurden insgesamt 166 Isolate der Bayerischen Meningokokkenträgerstudie untersucht. Alle Isolate besaßen sämtliche zur Kapselsynthese notwendigen Gene, exprimierten aber keine Kapsel. Bei 39 Isolaten fanden sich Längenvariationen in homopolymeren Sequenzen (slipped strand mispairing, SSM) in den Genen siaA und siaD. 46 Isolate enthielten Insertionselemente (IS1301, IS1016 und IS1106) in den Genen der Kapselsynthese. Irreversible Mutationen (Deletionen, Insertionen, Basensubstitutionen) wurden bei 47 Isolaten gefunden. Veränderungen der Promotorregion schienen keine Rolle zu spielen. Es wurden bei insgesamt sechs Isolaten zwei nicht-synonyme Mutationen in unmittelbarer Nähe zum putativen aktiven Zentrum der UDP-N- Acetylglukosamin-2-Epimerase entdeckt, die einen Verlust der Kapselsynthese erklären könnten. Insgesamt wurden keine Akkumulationen von Mutationen in defekten Genen gefunden und es gab auch keine Korrelationen zwischen den verschieden Ursachen und bestimmten klonalen Linien. Die erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass die meisten der zur Blockierung der Kapselexpression führenden Ereignisse erst im aktuellen Wirt aufgetreten sind und dass zumindest bei bestimmten klonalen Linien die Verbreitung von der Expression einer Kapsel abhängig ist. Viele pathogene Bakterien nutzen zur Infektion des Menschen die ubiquitär im Körper vorkommende Protease Plasmin. Dazu binden diese Plasmin oder das Proenzym Plasminogen. Auch Meningokokken interagieren mit Plasmin und Plasminogen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten drei Rezeptormoleküle für Plasminogen identifiziert werden. Die drei Proteine Enolase, DnaK und Peroxiredoxin konnten mit verschiedenen Methoden auf der Oberfläche der Erreger nachgewiesen werden. Die Bindung des Plasminogens ist bei Meningokokken ausschließlich über Lysinreste der Rezeptoren vermittelt, die C-terminalen Lysinreste der hier identifizierten Rezeptormoleküle spielen aber, wenn überhaupt, nur eine untergeordnete Rolle. Die Bindung von Plasminogen war durch rekombinante Rezeptorproteine konzentrationsabhängig inhibierbar. Plasminogen konnte von Meningokokken auch aus dem Serum rekrutiert werden. Gebundenes Plasminogen war mit uPA (Urokinase Plasminogen Aktivator) aktivierbar und physiologisch aktiv, was durch die Degradation von Fibrinogen nachgewiesen wurde. Das gebundene Plasmin wurde durch die Bakterien vor der Desaktivierung durch α2- Antiplasmin geschützt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Meningokokken auch mit weiteren Faktoren des Fibrinolyse-Systems (uPA) interagieren. Sie rekrutierten uPA an ihre Oberfläche und gebundenes uPA war physiologisch aktiv. Die erhaltenen Ergebnisse bestärken die These, dass Meningokokken die Faktoren des Fibrinolyse-Systems für ihre Pathogenese nutzen.
The insulin receptor ortholog EmIR of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis displays significant structural homology to the human insulin receptor (HIR) and has been suggested to be involved in insulin sensing mechanisms of the parasite’s metacestode larval stage. In the present work, the effects of host insulin on Echinococcus metacestode vesicles and the proposed interaction between EmIR and mammalian insulin have been studied using biochemical and cell-biological approaches. Human insulin, exogenously added to in vitro cultivated parasite larvae, (i) significantly stimulated parasite survival and growth, (ii) induced DNA de novo synthesis in Echinococcus, (iii) affected overall protein phosphorylation in the parasite, and (iv) specifically induced the phosphorylation of the parasite’s Erk-like MAP kinase orthologue EmMPK1. These results clearly indicated that Echinococcus metacestode vesicles are able to sense exogenous host insulin which induces a mitogenic response. To investigate whether EmIR mediates these effects, anti-EmIR antibodies were produced and utilized in biochemical assays and immunohistochemical analyses. EmIR was shown to be expressed in the germinal layer of the parasite both on the surface of glycogen storing cells and undifferentiated germinal cells. Upon addition of exogenous insulin to metacestode vesicles, the phosphorylation of EmIR was significantly induced, an effect which was suppressed in the presence of specific inhibitors of insulin receptor-like tyrosine kinases. Furthermore, upon expression of EmIR/HIR receptor chimera containing the extracellular ligand binding domain of EmIR in HEK 293 cells, a specific autophosphorylation of the chimera could be induced through the addition of exogenous insulin. These results indicated the capability of EmIR to sense and to transmit host insulin signals to the Echinococcus signaling machinery. The importance of insulin signaling mechanisms for parasite survival and growth were underscored by in vitro cultivation experiments in which the addition of an inhibitor of insulin receptor tyrosine kinases led to vesicle degradation and death. Based on the above outlined molecular data on the interaction between EmIR and mammalian insulin, the parasite’s insulin receptor orthologue most probably mediates the insulin effects on parasite growth and is, therefore, a potential candidate factor for host-parasite communication via evolutionary conserved pathways. In a final set of experiments, signaling mechanisms that act downstream of EmIR have been analyzed. These studies revealed significant differences between insulin signaling in Echinococcus and the related cestode parasite Taenia solium. These differences could be associated with differences in the organo-tropism of both species.
Introduction: This study investigates the role of Wolbachia bacteria in the pathogenesis of O. volvulus keratitis in a mouse model. Wolbachia bacteria are essential symbionts of most filarial nematodes of importance for mankind. Methods: Using a mouse model for river blindness in which soluble extracts of filarial nematodes are injected in the corneal stroma, changes in stromal thickness and haze of the cornea are observed by in vivo confocal microscopy, followed by immunohistochemical staining for neutrophils and PECAM-1, as well as ELISA of corneal chemokines. Reactions to filarial extracts containing Wolbachia are compared to those without the endosymbiont. Results: The approach of characterizing Wolbachia’s role in river blindness in this study is threefold. Firstly, Wolbachia-depleted extracts from doxycycline treated onchocerciasis patients led to a diminished inflammatory response in corneas of C57BL/6 mice compared to untreated, i.e. Wolbachia containing antigen. The decreased cell recruitment observed with doxycycline treated extracts involved neutrophils, but not eosinophils. This finding demonstrated that the presence of Wolbachia increases neutrophil recruitment. Secondly, extracts from Wolbachia-containing B. malayi revealed markedly more pathology than endosymbiont-free A. viteae antigen. This again pointed at the role of Wolbachia in development of disease. Thirdly, Toll-like Receptor 4 (TLR4) dependence was shown to exist for the inflammatory response to Wolbachia harboring O. volvulus antigen by looking at the corneal pathology in TLR4-mutant C3H/HeJ mice, compared to the wild-type C3H/HeN strain. Investigating further Wolbachia mediated mechanisms of neutrophil recruitment to the cornea, this study also showed that expression of the adhesion molecule PECAM-1 in limbal vessels, as well as upregulation of the CXC chemokines KC and MIP-2 were dependent on the presence of functional TLR4 and Wolbachia respectively. Conclusions: This study indicates that the innate immune system and Wolbachia endobacteria play an important role in the inflammatory response associated with the pathogenesis of onchocerca keratitis, suggesting a complete alteration in our understanding of the immunopathology of filariasis.
1. Zusammenfassung Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger invasiver Infektionen bei Kindern und Heranwachsenden. Der in vielen Ländern niedrigen Inzidenz stehen hohe Raten asymptomatischer Kolonisation des menschlichen Nasopharynx mit Meningokokken gegenüber. Während die Pathogenese durch Meningokokken ausführlich untersucht ist, wurde dem Trägertum von Meningokokken bisher wenig Aufmerksamkeit geschenkt, nicht zuletzt auch wegen des Fehlens eines geeigneten Tiermodells. Kürzlich publizierte Daten lassen die asymptomatische Persistenz von Meningokokken in einem Biofilm-ähnlichen Stadium auf und innerhalb des Tonsillengewebes vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines Biofilmmodells für Meningokokken als ein Modell für asymptomatisches Trägertum. Es wurde zudem die Biofilmbildung von Meningokokken unterschiedlichster klonaler Linien mit dem Ziel untersucht, auf molekularer Ebene die Biofilmbildung bei Meningokokken zu verstehen. In statischen Biofilmtests konnte gezeigt werden, dass Biofilmbildung eine ubiquitäre Eigenschaft von Meningokokken ist, solange diese keine Kapsel exprimieren. Hierbei war es unerheblich, ob Trägerisolate oder Isolate aus invasiven Meningokokkenerkrankungen untersucht wurden. Durch die Konstruktion fluoreszierender Meningokokkenstämme und die Etablierung eines Minimalmediums konnte für Meningokokken ein standardisiertes Biofilmmodell unter Flussbedingungen erstellt werden. Das Flussmodell für Meningokokkenbiofilme erwies sich als äußerst robust und reproduzierbar. Es wurde deutlich, dass Meningokokken Biofilme unterschiedlicher Struktur ausbildeten, die teilweise über 120 Stunden in vitalem Zustand gehalten werden konnten. Die Mehrzahl der Stämme bildete heterogene Biofilme mit distinkten Mikrokolonien aus, während andere Stämme homogene Biofilme ohne Mikrokolonien ausbildeten. Diese strukturellen Unterschiede hatten keinen Effekt auf die Antibiotika-Empfindlichkeit der Biofilme. Es konnte gezeigt werden, dass Meningokokkenbiofilme durch Ciprofloxacin und Rifampicin, nicht aber durch Penicillin im Wachstumsmedium abgetötet werden konnten. Diese Ergebnisse passen zu in vivo-Befunden, die zeigen, dass Ciprofloxacin und Rifampicin im Gegensatz zu Penicillin sehr zuverlässig das Trägertum von Meningokokken eradizieren können. Durch die Untersuchung der Biofilmbildung von PilX- und PilE-Mutanten konnte die Bedeutung der Twitching Motility für die Mikrokoloniebildung im Meningokokkenbiofilm aufgezeigt werden. Ausgeprägte Motilität führte zu Mikrokoloniebildung, während weitgehend unbewegliche Stämme flache unstrukturierte Biofilme bildeten. In der vorliegenden Arbeit konnte der Verlust der Mikrokoloniebildung bei der PilX-Mutante durch Reduktion der Piliierung, die zu verminderter Motilität führte, erklärt werden. Autoaggregation der Zellen spielte für die Mikrokoloniebildung keine Rolle, was im Widerspruch zur kürzlich publizierten Rolle von PilX steht. Initiale Schritte der Biofilmbildung bei Meningokokken könnten von extrazellulärer DNA (exDNA) abhängen, da die Zugabe von DNase zur Vorkultur die Biofilmbildung verhinderte, jedoch bestehende reife Biofilme nicht auflöste. Die Funktion, der Mechanismus der Freisetzung, sowie die Menge und Verteilung dieser exDNA in Meningokokkenbiofilmen wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
Das RpoS-Protein aus Vibrio cholerae : Funktionsanalyse und Charakterisierung der Proteolyse-Kaskade
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Konservierung bekannter RpoS-assoziierter Funktionen für das V. cholerae Homolog untersucht. Dabei ergab die phänotypische Analyse der rpoS-Deletionsmutante, dass analog zu der Bedeutung als Regulator des Stationärphasen-Wachstums in E. coli, definierte Zelldichte-abhängige Eigenschaften in V. cholerae gleichermaßen der Kontrolle von RpoS unterliegen. In weiterführenden Experimenten konnte daraufhin die Konservierung der entsprechenden Promotorstrukturen über die funktionelle Komplementierung rpoS-abhängiger Gene durch das jeweils speziesfremde Protein aufgedeckt werden. Dahingegen konnte die Bedeutung von RpoS bei der Ausprägung der generellen Stress-Resistenz u. a. in E. coli für das V. cholerae Homolog über den gewählten experimentellen Ansatz nicht belegt werden. So wurden in Survival-Assays für keine der getesteten Stress-Bedingungen signifikante Unterschiede zwischen rpoS-Mutante und Wildtyp ermittelt. Die in E. coli gezeigte intrazelluläre Anreicherung des Sigmafaktors unter diversen Stress-Situationen konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Hinsichtlich der potentiellen Stellung von RpoS als globaler Regulator für Virulenz-assoziierte Gene, unterstützen und ergänzen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die gegenwärtige Theorie, wonach RpoS das Ablösen der V. cholerae Zellen vom Darm-Epithel fördert. Die postulierte Bedeutung des alternativen Sigmafaktors in der letzten Phase der Pathogenese wurde über die RpoS-abhängige Sekretion der Mukin-degradierenden Protease HapA und die hier unabhängig nachgewiesene Transkriptionskontrolle von Chemotaxis-Genen bestätigt. In E. coli gilt als entscheidender Parameter für die dargelegten RpoS-Funktionen die intrazelluläre Konzentration des Masterregulators. Deshalb war ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit die Regulation des RpoS-Levels in V. cholerae. Neben der Identifizierung von Bedingungen, welche die RpoS-Expression beeinflussen, wurde vorrangig der Mechanismus der Proteolyse analysiert. Dabei wurden als RpoS-degradierende Komponenten in V. cholerae die Homologe des Proteolyse-Targetingfaktors RssB und des Protease-Komplexes ClpXP identifiziert. Die weitere Untersuchung der RpoS-Proteolyse ergab außerdem, dass bestimmte Stress-Signale den Abbau stark verzögern. Interessanterweise resultierten die gleichen Signale jedoch nicht in der Akkumulation von RpoS. Als weiterer Unterschied zu der bekannten Proteolysekaskade in E. coli zeigte sich, dass das V. cholerae Homolog der RssB-aktivierenden Kinase ArcB (FexB) an der RpoS-Proteolyse nicht beteiligt ist. Indessen deuten die Ergebnisse weiterführender Experimente auf den Einfluss der Kinasen CheA-1 und CheA-3 des V. cholerae Chemotaxis-Systems auf die RpoS-Degradation. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein zu E. coli abweichendes Modell der RpoS-Proteolyse postuliert, in welchem die aktiven CheA-Kinasen den Targetingfaktor RssB phosphorylieren und somit den Abbau einleiten. Die Beteiligung von MCP-Rezeptoren an der Kontrolle der intrazellulären RpoS-Konzentration und damit an der Transkription der Chemotaxisgene selbst, beschreibt erstmalig ein Regulationssystem, wonach innerhalb der Chemotaxis-Kaskade die Rezeptoraktivität wahrscheinlich über einen positiven „Feedback-Loop“ mit der eigenen Gen-Expression gekoppelt ist. Darüber hinaus deutete sich die Beteiligung der ATP-abhängigen Protease Lon an der RpoS-Proteolyse-Kaskade in V. cholerae an. Die Inaktivierung der in E. coli unter Hitzeschock-Bedingungen induzierten Protease resultierte in einem extrem beschleunigten RpoS-Abbau. Ein letztes Teilprojekt dieser Arbeit adressierte die Regulationsmechanismen der V. cholerae Osmostress-Adaptation. Während in E. coli der alternative Sigmafaktor dabei eine zentrale Rolle spielt, konnte die Beteiligung des V. cholerae RpoS an der Osmostress-Regulation jedoch nicht aufgedeckt werden. Dafür ergab die Funktionsanalyse eines neu definierten Osmostress-Sensors (OsmRK) die Kontrolle von ompU durch dieses Zwei-Komponentensystems unter hypertonen Bedingungen. Dieses Ergebnis überraschte, da bislang nur der Virulenzfaktor ToxR als Regulator für das Außenmembranporin beschrieben wurde. Die nachgewiesene ompU-Transkriptionskontrolle durch zwei Regulatoren führte zu der Hypothese eines unbekannten regulativen Netzwerkes, welchem mindestens 52 weitere Gene zugeordnet werden konnten. Insgesamt ist festzuhalten, dass die in dieser Arbeit durchgeführte molekulare Charakterisierung der RpoS-Proteolyse in V. cholerae Beweise für eine mögliche Verbindung zwischen der Transkriptionskontrolle für Motilitäts- und Chemotaxisgene mit der Chemotaxis-Reizwahrnehmung erbrachte. Eine derartige intermolekulare Verknüpfung wurde bislang für keinen anderen Organismus beschrieben und stellt somit eine neue Variante der Signaltransduktion innerhalb der Virulenz-assoziierten Genregulation dar.
Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a life-threatening disease with limited options of chemotherapeutic treatment. Anti-AE chemotherapy is currently based on a single class of drugs, the benzimidazoles. Although acting parasitocidic in vitro, benzimidazoles are merely parasitostatic during in vivo treatment of AE and cause severe site effects. In the case of operable lesions, the resection of parasite tissue needs to be supported by a prolonged chemotherapy. Thus, the current treatment options for AE are inadequate and require alternatives. In the present work, the flatworm signaling pathways were analyzed to establish potential targets for novel therapeutic approaches. I focused on factors that are involved in development and proliferation of E. multilocularis using molecular, biochemical and cell biological methods. Among the analysed factors were three MAP kinases of the parasite, EmMPK1, an Erk-1/2 orthologue, EmMPK2, a p38 orthologue and EmMPK3, an Erk7/8 orthologue. Further, I identified and characterized EmMKK2, a MEK1/2 orthologue of the parasite, which, together with the known kinases EmRaf and EmMPK1, forms an Erk1/2-like MAPK module. Moreover, I was able to demonstrate several influences of host growth factors such as EGF (epidermal growth factor) and insulin on worm signaling mechanisms and larval growth, including the phosphorylation of Elp, an ezrin-radixin-moesin like protein, EmMPK1, EmMPK3 and increased mitotic activity of Echinococcus cells. In addition, several substances were examined for their efficacy against the parasite including (i) general tyrosine kinase inhibitors (PP2, leflunamide), (ii) compounds designed to inhibit the activity of receptor tyrosine kinases, (iii) anti-neoplastic agents (miltefosine, perifosine), (iv) serine/threonine kinase inhibitors that have been designed to block the Erk1/2 MAPK cascade and (v) inhibitors of p38 MAPKs. In these studies, EmMPK2 proved to be a promising drug target for the following reasons. Amino acid sequence analysis disclosed several differences to human p38 MAPKs, which is likely to be the reason for the observed enhanced basal activity of recombinant EmMPK2 towards myelin basic protein in comparison to human recombinant p38 MAPK-α. In addition, the prominent auto-phosphorylation activity of the recombinant EmMPK2 protein together with the absence of an interaction with the Echinococcus MKKs suggest a different mechanism of regulation compared to the human enzyme. EmMPK2 activity could be effectively inhibited in vitro and in cultivated metacestode vesicles by treatment with SB202190 and ML3403, two ATP-competitive pyridinyl imidazole inhibitors of p38 MAPKs, in a concentration-dependent manner. Moreover, both compounds, in particular ML3403, caused parasite vesicle inactivation at concentrations which did not affect cultured mammalian cells. Likewise, during the cultivation of Echinococcus primary cells, the presence of ML3403 prevented the generation of new vesicles. Targeting members of the EGF signaling pathway, particulary of the Erk1/2-like MAPK cascade, with Raf and MEK inhibitors prevented the phosphorylation of EmMPK1 in metacestodes cultivated in vitro. However, although parasite growth was prevented under these conditions, the structural integrity of the metacestode vesicles maintained during long-term cultivation in the presence of the MAPK cascade inhibitors. Similar results were obtained when studying the effects of other drugs mentioned above. Taken together, several targets could be identified that reacted with high sensitivity to the presence of inhibitory substances, but did not cause the parasite’s death with one exception, the pyridinyl imidazoles. Based on the presented data, I suggest pyridinyl imidazoles as a novel class of anti-Echinococcus drugs and imply EmMPK2 as survival signal mediating factor, the inhibition of which could be used for the treatment of AE.
Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe.
Vibrio cholerae, der Erreger der gastrointestinalen Erkrankung Cholera, ist ein Gram- negatives, fakultativ anaerobes gekrümmtes Stäbchenbakterium und zugleich der wohl bekannteste Vertreter der Familie Vibrionaceae. Es persisitiert die meiste Zeit in aquatischen Ökosystemen wie Flüssen, Seen oder Meeresküsten, wo das Bakterium meist mit Crustaceen oder anderen Organismen mit Chitin-haltigen Oberflächen assoziiert vorliegt. Über orale Aufnahme kontaminierter Lebensmittel oder von Wasser kann das Bakterium in den menschlichen Organismus gelangen und dort den oberen Dünndarmbereich kolonisieren, wo letztlich durch verschiedene Virulenzfaktoren, aber hauptsächlich durch das Cholera-Toxin, die Symptomatik der Cholera ausgelöst wird. V. cholerae ist somit sowohl in seiner natürlichen Umgebung, als auch im humanen Wirt höchst unterschiedlichen Umweltbedingungen ausgesetzt. Diese alternierenden Umweltreize stellen verschiedene Anforderungen an die Expressions- und Regulationsfähigkeiten von Proteinbiosynthesen des Bakteriums dar. Die Notwendigkeit einer raschen Adaption setzt daher vielfältige und komplexe Genregulationsmechanismen voraus. Im ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit sollte die Genregulation des chs-Operons untersucht werden. Als Grundlage dienten hierbei Hinweise, nach welchen dieses Operon als putatives PTS eine Rolle für den Metabolismus von dem Chitin-Derivat Chitobiose spielen könnte. Zudem sollte der Einfluss des aus Escherichia coli bekannten Repressors Mlc auf die Expression des Operons tiefer gehend untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit war es gelungen, das als ChsR benannte Protein eindeutig als spezifischen LacI-ähnlichen Repressor für das chs-Operon zu bestätigen. Weiter konnte auch eine cAMP-abhängige Expressionsinduktion bestätigt werden, welche sich allerdings nur bei inaktiven ChsR durchsetzen kann. Als spezifischer Induktor für den Repressor ChsR konnte Chitobiose (GlcN)2 identifiziert werden, welches zwar bei dem in dieser Arbeit verwendeten O1-Stamm SP27459-S nicht als alleinige Kohlenstoffquelle dienen kann, aber unter induktiven Konzentrationen die Repressoreigenschaft von ChsR inhibiert. Zugleich konnte ChsC als für den Import des Induktors Chitobiose verantwortliches Protein identifiziert werden. Weiter nicht eindeutig zu klären blieb der Einfluss von Mlc auf das chs-Operon. Zwar konnte der aktivierende Effekt von Mlc auf die chs-Expression durch Komplementation bestätigt werden, der genaue Mechanismus bleibt jedoch weiterhin unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen. Einzig der Einfluss von Mlc auf den Chitobiose-Import konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte der weitaus komplexere Mechanismus der Virulenzgenregulation untersucht werden. Im Fokus stand hierbei der Hauptvirulenz-genregulator ToxR und dessen Abhängigkeit von der periplasmatischen Protease DegS. Anhand unterschiedlicher Experimente auf Promotoraktivitäts-, mRNA- und Proteinebene konnte eine Abnahme der ToxR-Aktivität in der degS-Knockout Mutante beobachtet werden, was auf eine Aktivierung von ToxR durch DegS schließen lässt. Weiter konnte eine Abhängigkeit der Aktivität von ToxR von der ebenfalls DegS-abhängigen RpoE-Signalkaskade ausgeschlossen werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Integrität von ToxR durch ToxS, nicht aber durch DegS bestimmt wird. Der exakte Mechanismus der DegS-induzierten ToxR-Aktivierung konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr ermittelt werden. Es wurden jedoch Hinweise darauf gewonnen, dass eine direkte ToxR-DegS-Interaktion im periplasmatischen Raum stattfinden könnte. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse hinsichtlich der ToxR-Regulation durch DegS bieten sowohl eine interessante neue Perspektive der Funktionsweise der periplasmatischen Protease DegS, als auch eine breite Grundlage für weitergehende Untersuchungen bezüglich der Aktivierung des wichtigsten Virulenzregulators ToxR in V. cholerae.
Die afrikanische Schlafkrankheit füht unweigerlich zum Tod wenn sie unerkannt und somit unbehandelt bleibt. Zur Therapie stehen nur sehr wenige Medikamente zur Verfügung, wovon die meisten bereits seit mehr als 50 Jahren im Einsatz sind. Unter der Therapie treten in ca. 5-10% der Fälle Enzephalopathien auf, die in vielen Fällen tödlich verlaufen. Bisher ist nicht sicher, wie der dahinterstehende Pathomechanismus verläuft. Zu dieser Frage wurden Untersuchungen des Glukosemetabolismus an Patienten im 2. Stadium der Schlafkrankheit durchgeführt. Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg des durchschnittlichen Glukoseniveaus im Verlauf der Therapie. Des weiteren wurden unterschiedliche Verläufe von arzneimittel-induzierter Enzephalopathie klinisch beobachtet und beschrieben.
Meningokokken gehören zu den wichtigsten Erregern bakterieller Sepsis und Meningitis. Der Schweregrad des Krankheitsverlaufs bei Meningokokkenerkrankungen korreliert mit der Konzentration an proinflammatorischen Zytokinen im Serum. Dendritische Zellen (DZ) bilden die erste Abwehr am humanen Epithel des Nasopharynx, welches die Eingangspforte von Neisseria meningitidis darstellt und sind eine wichtige Quelle proinflammatorischer Zytokine. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bekapselte Meningokokken-Stämme bei DZ signifikant weniger proinflammatorische Zytokine als isogene Kapsel-defiziente Stämme oder obligat unbekapselte Stämme induzieren. Dieser Effekt ist unabhängig von der chemischen Zusammensetzung der Kapsel, da aufgereinigtes Kapselpolysaccharid der Serogruppe B nicht den reduzierenden Effekt der Zytokininduktion beeinflusste. Darüber hinaus spielt die Kapsel-O-Acetylierung bei Serogruppe C, W-135 und Y nur eine untergeordnete Rolle bei der Erkennung von Meningokokken durch DZ. Microarray Versuche zum Transkriptionsprofil von DZ, die mit dem konstitutiv unbekapselten Trägerisolat alpha 14, dem bekapselten MC58 oder dem isogenen unbekapselten Stamm MC58siaD durchgeführt wurden, zeigten nach 4 h ein identisches Profil von proinflammatorischen Zytokinen. Nur der phagozytierte unbekapselten Stamm MC58siaD zeigte eine differentielle Regulation von weiteren Zytokinen. Jedoch glich sich das Profil nach 18 h Infektion durch alle drei Stämme an. Der Scavenger Rezeptor der Klasse A (SR-A) wurde als Hauptrezeptor identifiziert, der die Erkennung und Phagozytose von Meningokokken durch DZ initialisiert. Eine Assoziation phagozytierter Meningokokken mit SR-A konnte mittels Elektronenmikroskopie bestätigt werden. Nach Infektion von THP-1 Makrophagen mit bekapselten Serogruppe B und C Stämmen, den isogenen Kapsel-defizienten Stämmen und dem obligat unbekapselten Stamm alpha 14 wurde auf Transkriptionsebene keine differentielle Regulation der SR-A nachgewiesen. Lediglich eine minimale Hochregulation des SR-A auf der zellulären Oberfläche konnte nach einer Stunde Infektion verzeichnet werden. Nach Infektion von DZ oder THP-1 Makrophagen mit MC58siaD kommt es zur Dephosphorylierung des SR-A. Unter Verwendung von globalen Phagozytose-Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass für die maximale Induktion der proinflammatorischen Zytokine TNF-alpha, IL-6 und IL-1 Phagozytose von N. meningitidis benötigen wird, dies ist jedoch für die IL 8 Produktion nicht notwendig. Außerdem konnte gezeigt werden, dass mit dem spezifischen SR-A Inhibitor poly G eine Reduktion von TNF-alpha, IL-6, IL-1 und IL-8 zu verzeichnen war. Folglich ist die Phagozytose über SR-A nötig, um TNF-alpha, IL-6 und IL-1 zu induzieren, jedoch nur die Erkennung aber nicht die Phagozytose via SR-A die IL-8 Produktion initiiert. Die Aufnahme von Neisseria meningitidis über den SR-A durch DZ ist damit nicht nur für die Phagozytose und Abtötung verantwortlich sondern auch für die Zytokininduktion wichtig ist. Es gibt jedoch auch Meningokokken Stämme, die nicht vom SR-A erkannt werden. Mit alpha 14 konnte erstmals ein Meningokokken-Stamm identifiziert werden, der nicht an SR-A bindet. Die Induktion von Zytokinfreisetzung durch alpha 14 erfolgt dementsprechend unabhängig von SR-A und nach Kontakt von alpha 14 mit humanen DZ ist keine Veränderung der Phosphorylierungsstatus dieses Rezeptors zu beobachten. Die erhobenen Daten legen eine zentrale Rolle von SR-A in der Induktion von Immunität gegen N. meningitidis nahe.
Die Alveoläre Echinokokkose ist eine bedeutende, gefährliche Parasitose des Menschen. Über die molekularen Grundlagen und Mechanismen der Wirt-Parasit- Interaktion ist bislang nur wenig bekannt. In den letzten Jahren konnten Hinweise erlangt werden, dass Wirt und Parasit über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme kommunizieren. Eines dieser Systeme ist das TGF-b/BMP-Signaltransduktionssystem. TGF-β-Signaltransduktionskomponenten steuern grundlegende Prozesse der Entwicklung und Differenzierung in allen Tieren. Über dieses Signalsystem wird ein weites Spektrum von zellulären Prozessen wie Proliferation, Apoptose und Differenzierung reguliert. Dieses System besteht aus strukturell verwandten Zytokinen der TGF-β (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, membranständigen Rezeptoren der TGF-β-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) sowie intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie. Bislang konnten verschiedene Echinokokken Smad-Faktoren (EmSmadA, EmSmadB, EmSmadC und EmSmadD) sowie drei Echinokokken Rezeptoren der Typ I Familie (EmRSK1, EmRSK2, EmRSK3) in E. multilocularis identifiziert werden. Ein Mitglied der TGF-β Typ II-Rezeptorfamilie war bislang noch nicht beschrieben. In dieser Arbeit wird ein solches Molekül vorgestellt, EmRSK4 (=TGF-b Typ IISerin/ Threonin Kinase Rezeptor aus Echinococcus multilocularis). Genexpressionsanalysen und immunhistochemische Untersuchungen zeigen an, dass EmRSK4 in der Germinalschicht des E. multilocularis Metacestoden zusammen mit EmRSK1 (=BMP Typ I-Serin/Threonin Kinase Rezeptor) exprimiert wird. Studien an heterolog exprimierten Rezeptoren zeigten, dass EmRSK4 funktionell aktiv ist und mit humanen Typ I-Rezeptoren einen Komplex bilden kann. Diese Studien zeigen auch, dass EmRSK4 mit EmRSK1 einen aktiven heterologen Typ I-/Typ II-Rezeptorkomplex in HEK293-T Zellen bildet, der durch Wirts-BMP2 stimuliert wird und EmSmadB aktiviert. In Untersuchungen mit EmRSK2 (= TGF-β Typ ISerin/ Threonin Kinase Rezeptor) konnte gezeigt werden, dass bei Anwesenheit beider Rezeptoren, EmRSK2 und EmRSK4, eine Phosphorylierung von EmSmadC nachweisbar ist, während eine Phosphorylierung von EmSmadA auch ohne die Anwesenheit von EmRSK4 stattfindet. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass der Inhibitor SB-431452 die Kinaseaktivität von EmRSK2 hemmt. Nach Zugabe von exogenem BMP2 zu Metazestodenvesikel konnten Hinweise erhalten werden, dass ein bislang noch nicht charakterisiertes, zusätzliches EmSmad aktiviert wird. Zusammengenommen lässt die Co-Expression von EmRSK1 mit EmRSK4 in der Germinalschicht, die Bildung eines BMP-responsiven Komplexes aus beiden Rezeptoren und die Phosphorylierung mindestens eines zellulären Faktors nach exogener Zugabe von Wirts-BMP2 zu Metacestodenvesikeln darauf schließen, dass beide Rezeptoren während einer Infektion an der Sensierung von BMP Signalen des Wirts beteiligt sein könnten
Staphylococcus aureus reagiert auf veränderte Umweltbedingungen wie Hitze, pH und Chemikalien mit Hilfe globaler Regulatoren wie dem Sae (S. aureus exoprotein expression) Zweikomponenten-System. Subinhibitorische Konzentrationen einiger Antibiotika können die Expression von Virulenzfaktoren erhöhen. In dieser Arbeit wurde die Stressantwort von S. aureus auf subletale Konzentrationen des geläufigen Desinfektionsmittels Perform® untersucht. Dazu wurden biochemische Methoden wie SDS-PAGE und Massen-Spektrometrie sowie molekularbiologische Methoden wie qRT-PCR und Promotoraktivitäts-Assays eingesetzt. Davon abhängige, funktionelle Veränderungen wurden in durchfluss-zytometrischen Invasions-Assays analysiert. Perform wirkt durch die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Das Wachstum von S. aureus in Medien mit subletalen Konzentrationen von Perform verringerte in den Stämmen 6850, COL und ISP479C die Expression mehrerer Proteine, wohingegen im Stamm Newman eine gesteigerte Expression mehrerer Proteine festgestellt werden konnte. In der Literatur werden diese vermehrt exprimierten Proteine als sae-abhängig beschrieben. Der Effekt von Perform konnte durch das im Desinfektionsmittel enthaltene Detergenz SDS nachgeahmt werden, jedoch nicht durch Paraquat oder weitere Detergenzien wie Triton X-100 oder Tween 20. Eine Solubilisierungsreaktion durch die Detergenz-Wirkung konnte ausgeschlossen werden, da der beobachtete Effekt von lebenden Bakterien abhängt. Für Eap (extracellular adherence protein) konnte die deutlichste Steigerung der Proteinexpression festgestellt werden und eine Transkriptionsanalyse bestätigte die gesteigerte Eap-Expression. Die Promotoraktivität des sae Promotors P1 wurde sowohl durch Perform als auch durch SDS verstärkt. Die Anwesenheit von Perform und SDS hatte auch funktionelle Änderungen zur Folge: In durchflusszytometrischen Experimenten erhöhte sich beispielsweise die Invasivität auf das 2,5- bzw. 3,2-fache und die beobachteten Unterschiede konnten durch Lysostaphin Protektions Versuche bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Invasivität in Stamm Newman von Eap und dem sae-System abhängig war, während agr, sarA, sigB und FnBPs keinen entscheidenden Einfluss auf die Invasivität hatten. In dieser Arbeit wurde außerdem aufgedeckt, dass die Besonderheit des Stammes Newman durch eine Mutation in saeS (Sensor-Histidinkinase) bedingt war. Obwohl postuliert wird, dass diese Punktmutation ein konstitutiv aktiviertes sae System zur Folge hat, konnte die hohe sae Aktivität durch Perform und SDS jedoch noch weiter gesteigert werden. Durch den Austausch des gesamten sae-Operons konnte gezeigt werden, dass sich der Stamm Newman saeISP479C wie der Stamm ISP479C, und der Stamm ISP479C saeNewman sich analog zu Stamm Newman verhielt. Zusammenfassend kann aus den vorliegenden Ergebnissen geschlussfolgert werden, dass ein Aminosäurenaustausch in der Sensor-Histidinkinase SaeS des Stammes Newman verantwortlich für die gesteigerte Expression von Eap und die daraus resultierende gesteigerte Invasivität nach der Inkubation mit subletalen Konzentrationen von Perform und SDS ist. Diese Daten können dazu beitragen, die Virulenzmechanismen im Stamm Newman, speziell die Rolle des Sae-Systems, aber auch die der generellen Regulation, besser verstehen zu können.
Die Bedeutung des Zwei-Partner-Sekretionssystems für die Adhärenz von Meningokokken an Epithelzellen
(2009)
Das two-partner secretion-system (TPS-System) ist ein unter Gram-negativen Bakterien weit verbreiteter Weg der Proteinsekretion. Die als TpsA bezeichneten Exoproteine des TPS Systems benötigen ein spezifisches Partnerprotein (genannt TpsB) in Form eines kanalbildenden Transporters. Im sequenzierten Genom des Meningokokkenstammes MC58 finden sich fünf putative tpsA Gene, die als hemagglutinin/hemolysin-related protein (hrps) bezeichnete werden. Neben MC58 finden sich auch in den anderen sequenzierten Meningokokkenstämmen (FAM18, Z2491, alpha14) hrps. Diese weisen N-terminal Homologien zum filamentösen Hämagglutinin (FHA) von B. pertussis auf, das als TpsA-Protein des two-partner-secretion-system (TPS) aus der Zelle transportiert wird. In dieser Arbeit werden die hrps als hrpA Gene bzw. HrpA-Proteine bezeichnet. Alle sequenzierten Meningokokkenstämme verfügen über tpsB homologe Gene (hrpB), die jeweils in enger Nachbarschaft zu den hrpA Genen zu finden sind. Das Vorhandensein von hrpA und hrpB Genen deutet darauf hin, dass auch Meningokokken über ein funktionales TPS-System verfügen. Bei einer Dot-Blot-Analyse von 830 Meningokokkenstämmen aus einer bayerischen Trägerstudie mit Sonden spezifisch für die C-terminalen Bereiche der im Stamm MC58 gefundenen hrpA Gene hybridisierten 80% der ausgewerteten Stämme mit mindestens einer der Sonden. Stämme der hypervirulenten klonalen Komplexen (ST-8, ST-11, ST32, ST-44) zeigten sogar in über 99% eine positive Reaktion. Dagegen wiesen die nicht-hypervirulenten klonalen Komplexe zu 29% im Dot Blot kein hrpA auf, das homolog zu den hrpA Genen von Stamm MC58 ist, wobei es sich hierbei mehrheitlich (82%) um cnl Stämme handelte, so dass sich nur in 10% der untersuchten Kapsel-null-locus-Stämme (cnl) ein zu den hrpA Genen von MC58 homologes Gen nachweisen ließ. Mit der Hypothese, dass auch diese Stämme ein hrpA besitzen, welches sich im C-terimalen Anteil von denen des MC58 unterscheidet wurden in dieser Arbeit Dot Blots durchgeführt, deren Sonde spezifisch für das hrpB NMC0443 war. 97,6% der mit dieser Sonde untersuchten Stämme zeigten die Anwesenheit eines hrpB Homologs. Um die Vermutung zu bestätigen, dass allen hrpB Genen ein zugehöriges hrpA Gen benachbart liegt, wurden repräsentativ PCRs von häufigen klonalen Komplexen durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass ein TPS-System sowohl in den hypervirulenten als auch den nicht-hypervirulenten klonalen Komplexen der Meningokokken vorkommt. Die vielfältigen Funktionen von bereits untersuchten TpsA Proteinen sind zumeist mit der Pathogenität der Bakterien assoziiert. In dieser Arbeit wurde ein möglicher Einfluss der HrpA Proteine auf die Adhäsion der Bakterien an humane Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl eine kapsellose, als auch eine kapsellose, LPS-trunkierte hrpA Deletionsmutante signifikant schlechter an Epithelzellen adhäriert als die parentalen Vergleichsstämme. Ebenso zeigten die analog durchgeführten Infektionsversuche mit der hrpB Deletionsmutante einen Adhärenzverlust, der jedoch nur für die unbekapselte und LPS trunkierte hrpB Deletionsmutante signifikant war. In dieser Arbeit ist es gelungen das HrpB Protein des Stammes 2120 in E. coli zu exprimieren und aufzureinigen, sodass die Entwicklung eines gegen HrpB gerichteten Antikörpers in Auftrag gegeben werden konnte. Mit Hilfe dieses Antikörpers sollen noch offene Fragen zur Synthese und dem Transport des HrpB Transportproteins beantwortet werden. Außerdem können weitere Untersuchungen zur Lage und Verteilung der HrpBs in der Meningokokkenmembran dazu beitragen, weiteren Aufschluss über die Komplexität von Pathogenität und Virulenz von N. meningitidis zu geben.
Parodontitis ist eine Erkrankung des Zahnhalteapparates, die durch einen komplexen bakteriellen Biofilm unterhalten wird. Neben Mikroorganismen wie A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. denticola und T. forsythensis werden Keime unbekannter Spezies in parodontalen Taschen ausfindig gemacht. Durch die Entschlüsselung von 16S rRNA-Gensequenzen konnte die orale Flora nahezu vollständig katalogisiert werden. Allerdings fehlen bei vielen Phylotypen die entsprechenden Typstämme für weitergehende phänotypische Analysen. Grundlage dieser Arbeit bildeten 59 Patientenisolate der Parodontitis-Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie bei denen partielle 16S rRNA Sequenzen keine Spezieszuordnung ermöglichten. Nahezu vollständige 16S rRNA-Sequenzen wurden erstellt und mit Datenbankeinträgen verglichen. Bei mehr als der Hälfte der Stämme konnte keine taxonomische Zuordnung auf Sequenzierebene getroffen werden. 43 Isolate wuchsen unter aerober Atmosphäre, 16 benötigten eine anaerobe Umgebung. Alle Kulturmorphologien und nach Gram gefärbten mikroskopischen Präparate wurden fotografisch dokumentiert und katalogisiert. Die hier untersuchten Stämme, die zufällig auf der Basis taxonomischer Fragestellungen ausgewählt wurden, waren zum überwiegenden Teil auf Amoxicillin und Metronidazol empfindlich. Diese Antibiotika finden alle ihre Verwendung bei der Parodontitistherapie. Ciprofloxacin, das wegen seiner intrazellulären Wirkung ein interessantes Agens ist, wies v.a. bei Actinomyceten und Streptokokken Wirkungslücken auf. Es bleibt zu diskutieren, ob dieser Umstand nachteilig ist, da auf der einen Seite diese Genera ein orales Reservoir für Gyrasehemmer-Resistenzen ausbilden können, auf der anderen Seite diese grampositiven Keime möglicherweise parodontalprotektiv wirken könnten. In dieser Studie konnte eine Stammsammlung charakterisiert werden, die zukünftig insbesondere angesichts der zu erwartenden Entschlüsselung des oralen Metagenoms für weitere funktionelle Untersuchungen von Interesse sein dürfte.
Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.
Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen.
Disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a hallmark event in the pathophysiology of bacterial meningitis. Several inflammatory mediators, such as tumor necrosis factor alpha (TNF-a), nitric oxide and matrix metalloproteinases (MMPs), contribute to this disruption. Here we show that infection of human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) with Neisseria meningitidis induced an increase of permeability at prolonged time of infection. This was paralleled by an increase in MMP-8 activity in supernatants collected from infected cells. A detailed analysis revealed that MMP-8 was involved in the proteolytic cleavage of the tight junction protein occludin, resulting in its disappearance from the cell periphery and cleavage to a lower-sized 50-kDa protein in infected HBMEC. Abrogation of MMP-8 activity by specific inhibitors as well as transfection with MMP-8 siRNA abolished production of the cleavage fragment and occludin remained attached to the cell periphery. In addition, MMP-8 affected cell adherence to the underlying matrix. A similar temporal relationship was observed for MMP activity and cell detachment. Injury of the HBMEC monolayer suggested the requirement of direct cell contact because no detachment was observed when bacteria were placed above a transwell membrane or when bacterial supernatant was directly added to cells. Inhibition of MMP-8 partially prevented detachment of infected HBMEC and restored BBB permeability. Together, we established that MMP-8 activity plays a crucial role in disassembly of cell junction components and cell adhesion during meningococcal infection.
Introduction: Chronic nonbacterial osteomyelitis (CNO) is an inflammatory disorder of unknown etiology. In children and adolescents CNO predominantly affects the metaphyses of the long bones, but lesions can occur at any site of the skeleton. Prospectively followed cohorts using a standardized protocol in diagnosis and treatment have rarely been reported. Methods: Thirty-seven children diagnosed with CNO were treated with naproxen continuously for the first 6 months. If assessment at that time revealed progressive disease or no further improvement, sulfasalazine and short-term corticosteroids were added. The aims of our short-term follow-up study were to describe treatment response in detail and to identify potential risk factors for an unfavorable outcome. Results: Naproxen treatment was highly effective in general, inducing a symptom-free status in 43% of our patients after 6 months. However, four nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) partial-responders were additionally treated with sulfasalazine and short-term corticosteroids. The total number of clinical detectable lesions was significantly reduced. Mean disease activity estimated by the patient/physician and the physical aspect of health-related quality of life including functional ability (global assessment/childhood health assessment questionnaire and childhood health assessment questionnaire) and pain improved significantly. Forty-one percent of our patients showed radiological relapses, but 67% of them were clinically silent. Conclusions: Most children show a favorable clinical course in the first year of anti-inflammatory treatment with NSAIDs. Relapses and new radiological lesions can occur at any time and at any site in the skeleton but may not be clinically symptomatic. Whole-body magnetic resonance imaging proved to be very sensitive for initial and follow-up diagnostics.
Neisseria meningitidis is a facultatively pathogenic human commensal and strictly adapted to its niche within the human host, the nasopharynx. Not much is known about the regulatory processes required for adaptation to this environment. Therefore the role of the transcriptional regulator NMB1843, one of the two predicted regulators of the MarR family in the meningococcal genome, was investigated. As this gene displayed a high sequence homology to FarR, the Fatty acid resistance Regulator in N. gonorrhoeae, we designated the meningococcal protein FarR (NmFarR). Homology modeling of this protein revealed a dimeric structure with the characteristic winged helix-turn-helix DNA binding motif of the MarR family. NmFarR is highly conserved among meningococcal strains and expression of farR during exponential growth is controlled post-transcriptionally, being highest in the late exponential phase. By means of electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) the direct and specific binding of FarR to the farAB promoter region was shown, comparable to its homologue in gonococci. As FarR is involved in fatty acid resistance in N. gonorrhoeae, susceptibility assays with the medium chain lauric acid (C12:0), the long chain saturated palmitic acid (C16:0) and the long chain unsaturated linoleic acid (C18:2) were performed, testing a wide variety of strains of both species. In contrast to the unusually susceptible gonococci, a high intrinsic fatty acid resistance was detected in almost all meningococcal isolates. The molecular basis for this intrinsic resistance in N. meningitidis was elucidated, showing that both a functional FarAB efflux pump system as well as an intact lipopolysaccharide (LPS) are responsible for palmitic acid resistance. However, even despite circumvention of the intrinsic resistance, FarR could not be connected with fatty acid resistance in meningococci. Instead, FarR was shown to directly and specifically repress expression of the Neisseria adhesin A (nadA), a promising vaccine candidate absent in N. gonorrhoeae. Microarray analyses verified these results and disclosed no further similarly regulated genes, rendering the FarR regulon the smallest regulon in meningococci reported until now. The exact FarR binding site within the nadA promoter region was identified as a 16 bp palindromic repeat and its influence on nadA transcription was proved by reporter gene fusion assays. This repression was also shown to be relevant for infection as farR deficient mutant strains displayed an increased attachment to epithelial cells. Furthermore, farR transcription was attested to be repressed upon contact with active complement components within human serum. Concluding, it is shown that FarR adopted a role in meningococcal host niche adaptation, holding the balance between immune evasion by repressing the highly antigenic nadA and host cell attachment via this same adhesin.
OatC ist die O-Acetyltransferase von Serogruppe C Meningokokken. Sie katalysiert die O-Acetylierung der Sialinsäurekapsel. Das Enzym konnte vor Beginn dieser Arbeit keiner bekannten Gruppe von Enzymen zugeordnet werden. Durch in vivo-Versuche und in vitro-Studien sollten weitere Erkenntnisse zu Lage und Struktur des aktiven Zentrums von OatC gewonnen werden. Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Teilen: 1. Es sollte eine Meningokokken-Mutante mit einer Deletion des oatC -Gens hergestellt werden. 2. Das oatC -Gen sollte schrittweise verkürzt und in trans auf dem pAP1His Vektor in die oatC-Deletionsmutante eingebracht werden. 3. Gerichtete Mutagenese von Histidinresten, Serin 286 und Aspartat 376 sollte Aussagen über die in vivo-Relevanz der Aminosäuren ermöglichen. Die Mutanten wurden im ELISA auf Ihren O-Acetylierungsstatus hin überprüft. Die oatC -Deletionsmutante war erwartungsgemäß negativ. Bereits die erste Verkürzung von OatC um 16 Aminosäuren führte zu einem vollständigen Verlust der O-Acetylierung, der Austausch der Aminosäuren Histidin 399, Serin 286 und Aspartat 376 durch gerichtete Mutagenese ebenfalls. Wir spekulieren, dass der Verlust des C-Terminus zu einer veränderten Proteinfaltung führt oder eine katalytische Funktion des Histidin 456 eliminiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass OatC der Gruppe der α/β-Hydrolasen zugeordnet werden kann (s. a. Bergfeld et al. 2009). Das katalytische Zentrum besteht aus Serin 286, Aspartat 376 und Histidin 399. Der Bereich um Histidin 456 beeinflusst die Funktion erheblich.
Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Trägertum im Nasenrachenraum ist entscheidend für die Übertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Frühere Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilmähnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell für das Trägertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, während bisher keine Proteomanalysen durchgeführt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschläuchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse über 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse über 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit überwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verstärkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn möglich, mit spezifischen Antikörpern abgesichert. Die Expression von ungefähr 2 % aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Veränderungen beobachtet, die mit einem Nährstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden können. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erhöht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zurückzuführen ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell für Biofilmwachstum, nicht aber für planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator für metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte über die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adhäsine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden.
In dieser Arbeit wurde das in vitro Wachstumsverhalten ausgesuchter MRSA in Konkurrenz zu Bakterien der Standortflora unter Optimalbedingungen und unter Mangelbedingungen getestet. Es lässt sich für alle getesteten MRSA-Stämme zusammenfassend sagen, dass ihre klinische Prävalenz nicht mit dem Wachstum in vitro korreliert, d.h. das häufige Spa-Typen nicht besser unter unseren Versuchbedingungen gewachsen sind als seltene. In vitro konnte kein verdrängendes Wachstum des Methicillin sensiblen S. aureus gegenüber den resistenten Stämme beobachtet werden. Vielmehr gelingt es den MRSA-Stämmen, ein Wachstumsgemisch zu ihrem Vorteil zu beeinflussen, indem sie die getesteten anderen Mikroorganismen (S. epidermidis, S. cerivisiae) im Wachstum hemmen, mit Ausnahme von E. faecium. Die Arbeit beleuchtet die Schwierigkeiten der Identifizierung von probiotischen Arten zur Verdrängung eines MRSA. In Zukunft sollte vielleicht an der Optimierung von in vitro Systemen gearbeitet werden (in vitro Organkulturen) oder Tiermodelle verwendet werden. Den Transmissionsunterschieden und der Tenazität sind weiterhin Aufmerksamkeit zu widmen. Wie in der Literatur beschrieben ist es zum Verständnis des Wachstumsverhal-tens der resistenten Stämme wichtig zu wissen, auf welchen molekularbiologischen Grundlagen die Resistenz beruht, da eine einzelne Site-Mutation zusätzliche Resistenzen bedeuten und einen eventuellen Wachstumsnachteil wieder ausgleichen kann. Im Klinikalltag scheinen sich die MRSA-Stämme auszubreiten, die den Wachstumsnachteil bereits ausgeglichen haben, beziehungsweise deren Methicillinresistenz keinen Wachstumsnachteil bedeutet.
Alveolar echinococcosis (AE) of human being caused by Echinococcus multilocularis is a rare but important zoonosis especially in tempered zones of middle Europe and Northern America with endemic character in many countries. Due to the long incubation period, various clinical manifestations, critical prognosis, and outcome AE presents a serious and severe disease. The primary focus of infection is usually the liver. Although secondary affection of visceral organs is possible extrahepatic AE is highly uncommon. Moreover, the involvement of bone and muscle presents with an even lower incidence. In the literature numerous cases on hepatic AE have been reported. However, extrahepatic AE involving bones and/or muscles was described very rarely. We report a case of an 80-year-old man with primary extrahepatic alveolar Echinococcosis of the lumbar spine and the psoas muscle. The etiology, diagnosis, differential diagnoses, treatment options and outcome of this rare disease are discussed in context with the current literature.
Visceral pentastomiasis caused by Armillifer armillatus larvae was diagnosed in 2 dogs in The Gambia. Parasites were subjected to PCR; phylogenetic analysis confirmed relatedness with branchiurans/crustaceans. Our investigation highlights transmission of infective A. armillatus ova to dogs and, by serologic evidence, also to 1 human, demonstrating a public health concern.
Durch die Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation erhöht sich das Risiko für opportunistische Infektionen wie invasive Aspergillose (IA). IA wird hauptsächlich durch den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus, der durch die Luft übertragen wird, verursacht. Deshalb haben Erkennung und Therapie von IA in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung erlangt. Für eine erfolgreiche Behandlung sind die Mechanismen des Immunsystems nach Kontaktaufnahme mit dem Pathogen von zentraler Bedeutung. Die Erstinfektion mit A. fumigatus findet in der Lunge statt. Als Bewohner der Alveolen wurden deshalb dendritische Zellen (DCs) auf ihre Fähigkeiten hin untersucht, das Immunsystem anzuregen. DCs besitzen vor allem die wichtigen Aufgaben, das Immunsystem zu modulieren und T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen. Ein Großteil dieser Arbeit befasst sich mit der Analyse des Einflusses des Immunsuppressivums 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf neutrophile Granulozyten und auf die in vitro Generierung von moDCs sowie deren Fähigkeit mit dem Pathogen A. fumigatus zu interagieren. RAD bindet an das zytosolische FK506 bindende Protein (FKBP12), wodurch die Kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibiert und somit die T-Zellantwort unterdrückt wird. Klinische Anwendung findet RAD bereits, um eine Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation zu erhalten. Der oxidative Burst neutrophiler Granulozyten war nach RAD-Behandlung und Konfrontation mit A. fumigatus signifikant verringert. Die Generierung der moDCs aus Monozyten erfolgte über 7 Tage, wobei ab dem Tag der Isolation der Monozyten 10 nM RAD oder EtOH zur Kontrolle hinzugegeben wurde. RAD zeigte vielfältige Effekte auf die Immunfunktion dendritischer Zellen. Obwohl sich keine Änderung in der Differenzierung der moDCs fand, was durch die Oberflächenmarker CD1a+, CD14- und HLA-DR+ überprüft wurde, zeigte sich eine signifikante Reduktion der Rezeptoren TLR4 und Dectin-1 sowie der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD83 und CD86. Nach Konfrontation mit A. fumigatus verblieb CD40 unter RAD Behandlung signifikant reduziert, während CD83 genau dieses Schema als Trend aufwies. Ferner wies CD86 sowohl in der Kontrolle als auch mit RAD-Behandlung die gleiche Expression auf. Nach 6 h Konfrontation der moDCs mit A. fumigatus waren die Zytokine IL-12, TNF-α und CCL20 auf Genexpressionsebene unter RAD reduziert, was sich auf Proteinebene teilweise bestätigen ließ, da sich hier erst nach 12 h eine signifikante Reduktion von IL-12, TNF-α und CCL20 in RAD-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zeigte. Des Weiteren war das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 signifikant reduziert. Die Phagozytose sowohl von FITC-Dextran-Beads als auch von A. fumigatus Konidien und zugleich die Schädigung von A. fumigatus Keimschläuchen war in unreifen RAD-behandelten moDCs signifikant reduziert. Ob moDCs, die mit RAD behandelt wurden, schlechter in der Lage waren, CD8+-T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, geht nicht mit Sicherheit aus dieser Studie hervor, da große spenderabhängige Unterschiede auftraten. Es wurde zudem ein Vergleich von in vitro aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) und myeloiden DCs (mDCs) angefertigt. Mittels eines home-made Microarrays, der vor allem Gene mit einschloss, die für Zytokine und Rezeptoren von Immunzellen kodieren, konnten in einem Modell der frühen IA in der Lunge differentiell regulierte Gene nach Konfrontation mit A. fumigatus identifiziert werden. Es wurden insgesamt 30 Gene mehr als 2-fach reguliert, wie zum Beispiel die Interleukine und Chemokine IL-1β, IL-8, CXCL2, CCL3, CCL4 und CCL20, der Immunrezeptor PTX3 und der Transkriptionsfaktor Nf-κB. Generell konnte beobachtet werden, dass moDCs mehr regulierte Gene aufwiesen als mDCs. Zuletzt wurde betrachtet, ob der Knock-down von CXCL10, dessen Fehlen ein erhöhtes Risiko für IA nach sich zieht, einen Einfluss auf moDCs hat, so dass sie schlechter auf A. fumigatus reagieren können. Diese Hypothese konnte in dieser Studie nicht bestätigt werden, da kein Unterschied in der Zytokinproduktion oder Expression kostimulatorischer Moleküle zwischen Kontroll-moDCs und moDCs, in denen das CXCL10-Gen ausgeschaltet wurde, festgestellt werden konnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die Microarray-Analyse wichtige Gene in moDCs und mDCs identifizierbar waren, die nach Konfrontation mit A. fumigatus reguliert wurden. Zudem fanden sich lediglich minimale Unterschiede zwischen artifiziellen DCs und myeloiden DCs, die direkt aus dem Körper isoliert wurden. Eine Behandlung mit RAD erhöht das Risiko eines Patienten an invasiver Aspergillose zu erkranken unabhängig von der Eigenschaft des RAD, die Proliferation von T-Lymphozyten zu inhibieren.
Neisseria meningitidis, Auslöser der Meningokokken-Meningitis und Sepsis, trägt auch heute noch zur hohen Kindersterblichkeit in Entwicklungsländern bei und sorgt, vor allem im afrikanischen Meningitis-Gürtel, immer wieder für Epidemien mit gravierenden Folgen für die Betroffenen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei an der Pathogenität von N. meningitidis beteiligte Proteine, der Transkriptionsregulator FarR und der Transportkanal HrpB, näher charakterisiert, um weitere Einblicke in die immer noch nicht vollständig entschlüsselte Pathogenese der Meningokokken-Meningitis zu erhalten. Das Neisseria adhesin A NadA ist Bestandteil der sich aktuell in der Entwicklung befindenden Impfung gegen Meningokokken der Serogruppe B. Im dem bekapselten B-Stamm MC58 wurde gezeigt, dass nadA unter der negativen Kontrolle des Transkriptionsregulators FarR steht (Schielke et al., 2009). In den ebenfalls zur Gattung Neisseria gehörenden Neisseria gonorrhoeae (Ng) wurde bereits 2001 ein FarR-Homolog beschrieben (Shafer et al., 2001). NgFarR ist an der Resistenz gegenüber antimikrobiellen, langkettigen Fettsäuren beteiligt, indem es die Expression des FarABEffluxpumpen-Systems reguliert, welches eingedrungene Fettsäuren wieder nach extrazellulär befördert. Dagegen zeigten Palmitinsäure-Resistenztests, dass FarR nicht an der intrinsischen Fettsäure-Resistenz der Meningokokken beteiligt ist. Die Deletion und die Komplementierung von farR hatten weder in bekapselten noch in unbekapselten Meningokokken Einfluss auf das normale Wachstumsverhalten. Ein Western Blot- Nachweis des FarR-Proteins in der frühen, mittleren und späten exponentiellen Wachstumsphase von Wildtyp, Kapsel-Deletionsmutante und farR-Komplementante zeigte, dass die Menge an FarR im zeitlichen Verlauf kontinuierlich zunimmt und FarR damit Wachstumsphasen-abhängig exprimiert wird. Dabei scheint es einer posttranskriptionalen oder posttranslationalen Regulation zu unterliegen, da auch in dem farRkomplementierten Stamm unabhängig vom farR-Promotor eine entsprechende Hochregulation stattfindet. In Infektionsversuchen wurde die Interaktion zwischen Meningokokken und humanen polymorphkernigen Granulozyten untersucht. In den Infektionsassays wurde die farRDeletionsmutante innerhalb des dreistündigen Versuchsrahmens deutlich stärker durch die Granulozyten abgetötet als der Serogruppe B-Wildtyp. Als Mitglied der in Bakterien und Archaeen weit verbreiteten Familie der MarR-Transkriptionsregulatoren (Multiple antibiotic resistance Regulator, MarR) bindet FarR mit hoher Wahrscheinlichkeit auch als Homodimer an seine Bindesequenz auf der DNA. FarR erkennt eine 16 bp lange, palindromische Sequenz in der Promotorregion von nadA (NMB1994), wodurch die nadA-Expression verhindert wird. Außerdem erkennt FarR eine ähnliche Bindesequenz im Promotorbereich von farAB (NMB0318/0319), wobei es aber keinen regulatorischen Einfluss ausübt. Mit einer aus diesen beiden Bindestellen berechneten minimalen Bindesequenz wurde im Genom von MC58 weitere mögliche Bindepartner detektiert. Eine Auswahl dieser möglichen Bindestellen wurde in Electrophoretic Mobility Shift Assays auf eine direkte Interaktion mit dem FarR-Protein hin untersucht, wobei sich allerdings keine direkte Bindung nachweisen ließ. Diese Ergebnisse darauf hin, dass der Transkriptionsregulator FarR hoch spezifisch bestimmte DNA-Bindesequenzen erkennt und die entsprechenden Gene reguliert. In der Promotorregion des TpsB-Proteins HrpB wurde in den sequenzierten Referenzstämmen Z2491, MC58, FAM18 und α14 eine mit der minimalen FarR-Bindesequenz kompatible Sequenz gefunden. In Electrophoretic Mobility Shift Assays konnte allerdings gezeigt werden, dass FarR nicht direkt daran bindet. Um das Transport-Protein HrpB näher zu charakterisieren, wurde das entsprechende Gen in 22 N. meningitidis-Isolaten sequenziert. Dabei zeigte sich, dass das Transportprotein hrpB in allen untersuchten invasiven und nicht-invasiven Stämmen vorhanden ist. Dieses äußerst konservierte Protein weist nur im seinem C-terminalen Bereich eine relativ variable Region auf, was vermutlich auf Rekombinationsereignisse zurückzuführen ist. Ein Alignment der Aminosäure-Sequenz des Serogruppe C-Stamms FAM18 mit der des homologen Bordetella pertussis TpsB-Proteins FhaC zeigte, dass die dreidimensionale Struktur des HrpB ebenfalls eine α-Helix, eine transmembranöse Domäne und variable extrazelluläre Loops enthält. Zusammengenommen erfüllt HrpB somit wichtige Bedingungen, um als Vakzine-Bestandteil in Betracht gezogen zu werden.
Echinococcus multilocularis besitzt als Lebergewebe - infiltrierender Parasit und Erreger der Alveolären Echinokokkose evolutionär konservierte Faktoren des TGF-β / BMP Signalsystems, die im Konzept der hormonellen Wirt - Parasit Kreuzkommunikation nicht nur hinsichtlich des Wirts - Einflusses auf die Entwicklung des Parasiten sondern auch umgekehrt in Bezug auf Immunantwort und Physiologie des Wirts eine mögliche regulierende Funktion besitzen. Die vorliegende Arbeit befasst sich primär mit den Auswirkungen von TGF-β / BMP Signaling auf den Fuchsbandwurm E. multilocularis. Dazu wurde zunächst durch Immunlokalisation das Vorliegen aller Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren während einer natürlich aufgetretenen Alveolären Echinokokkose überprüft, sowie die funktionelle Interaktion von EmRSK3 und EmRSK4 mit humanem TGF-β1 in vitro nachgewiesen. Mit Hilfe von humanen Zytokinen (BMP2 und TGF β1) und Rezeptor - spezifischen Inhibitoren (SB431542, Dorsomorphin und LY364947) wurde die Rolle von TGF β / BMP Signaling in Bezug auf Vitalität, Wachstum, Differenzierung und Regeneration von E. multilocularis in verschiedenen Stadien untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von humanem BMP2 und von SB431542 auf die Genexpression in E. multilocularis analysiert. Die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation durch Echinokokken Faktoren des TGF-β / BMP Signaling wurde ebenfalls adressiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren in vitro durch sekretierte Faktoren aus Metazestoden aktiviert werden können. Auf Basis von Genomsequenzierungsdaten wurden zudem weitere Komponenten des TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis, wie die bisher unbekannten TGF β / BMP Homologe EmBMP2 und EmAct, die Noggin-like Homologe EmNlg1 und 2, ein I-Smad (EmSmadF) sowie ein zweiter BR-Smad (EmSmadE) identifiziert, strukturell charakterisiert und die jeweilige Genexpression in verschiedenen Stadien überprüft. EmSmadE wurde zudem in weiterführenden Studien funktionell charakterisiert. Fragestellungen bezüglich der Spezifität, Funktionalität und Möglichkeit der konstitutiven Aktivierung von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis wurden auf Basis von EmSmadA, EmRSK3 und EmRSK3b in weiteren molekularbiologischen Studien untersucht und dienen dem tieferen Verständnis von TGF-β / BMP Signaling. In der vorliegenden Arbeit konnten damit alle grundlegenden Faktoren von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis identifiziert werden und es wurden erstmals die eindeutige Sensierung von Wirts TGF-β / BMP Zytokinen durch Metazestoden sowie die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation über Echinokokken TGF-β / BMP Faktoren belegt. Zusätzlich deuten die neu identifizierten potenziell sekretierten TGF-β / BMP Faktoren auf eine mögliche Beeinflussung von Physiologie und Immunantwort des Wirts durch Echinokokken TGF-β / BMP Zytokine hin.
Background: Specific cell targeting is an important, yet unsolved problem in bacteria-based therapeutic applications, like tumor or gene therapy. Here, we describe the construction of a novel, internalin A and B (InlAB)-deficient Listeria monocytogenes strain (Lm-spa+), which expresses protein A of Staphylococcus aureus (SPA) and anchors SPA in the correct orientation on the bacterial cell surface. Results: This listerial strain efficiently binds antibodies allowing specific interaction of the bacterium with the target recognized by the antibody. Binding of Trastuzumab (Herceptin®) or Cetuximab (Erbitux®) to Lm-spa+, two clinically approved monoclonal antibodies directed against HER2/neu and EGFR/HER1, respectively, triggers InlABindependent internalization into non-phagocytic cancer cell lines overexpressing the respective receptors. Internalization, subsequent escape into the host cell cytosol and intracellular replication of these bacteria are as efficient as of the corresponding InlAB-positive, SPA-negative parental strain. This specific antibody/receptormediated internalization of Lm-spa+ is shown in the murine 4T1 tumor cell line, the isogenic 4T1-HER2 cell line as well as the human cancer cell lines SK-BR-3 and SK-OV-3. Importantly, this targeting approach is applicable in a xenograft mouse tumor model after crosslinking the antibody to SPA on the listerial cell surface. Conclusions: Binding of receptor-specific antibodies to SPA-expressing L. monocytogenes may represent a promising approach to target L. monocytogenes to host cells expressing specific receptors triggering internalization.
Neisseria meningitidis ist mit jahrlich etwa 700.000 Erkrankungsfallen weltweit und einer Mortalitat von circa 7% einer der häufigsten Ausloser der bakteriellen Hirnhautentzündung. Der entscheidende Schritt zur Auslosung einer Meningitis ist die Uberwindung der Blut-Hirn-Schranke. Diese im menschlichen Korper einmalig dichte Barriere wird maßgeblich durch Tight-Junctions spezialisierter Endothelzellen der Hirnkapillaren aufrecht erhalten. Ob N. Meningitidis diese Barriere auf einem parazellulären oder transzellulärem Weg uberwindet, ist nicht vollstandig geklart. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von N. meningitidis auf die Tight-Junction Proteine Occludin und ZO-1 unter Nutzung des HBMEC Zellkulurmodelles untersucht. Neben einer verminderten Genexpression von Occludin zeigte sich dabei eine Abspaltung eines 50 kDa Fragmentes von Occludin. Gleichzeitig konnte eine Umverteilung von Occludin von den Zellgrenzen in das Zytoplasma beobachtet werden. ZO-1 hingegen wurde weder in seiner Exprimierung, noch in seiner intrazellularen Verteilung beeinflusst. Mittels eines in dieser Arbeit etablierten Assays zur Bestimmung der Permeabilitat eines HBMEC-Monolayer als vereinfachtes in-vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke konnte bestatigt werden, dass durch die Beeinflussung von Tight-Junction Proteinen die parazellulare Permeabilitat steigt. In weiteren Analysen konnten diese Prozesse auf eine gesteigerte Aktivitat von Matrixmetalloproteinase 8 zurückgefuhrt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuen Mechanismus auf, durch den N. meningitidis im Stande ist, die-Hinr-Schranke auf einem parazellulärem Weg zu überwinden.
Hintergrund: Zunehmend wird der Eigenschaft von Staphylococcus aureus als fakultativ intrazellulärem Erreger Bedeutung zugemessen. Ein direkter Nachweis der in vivo Relevanz von fakultativ intrazellulärem S. aureus bleibt allerdings bisher aus. Der Mechanismus zellulärer Invasivität ist bekannt und korreliert mit verschiedenen molekularen Markern (spa-Typ, SCCmec-Typ und pls/Pls). In dieser Studie wurde die Zuverlässigkeit und Ausweitbarkeit dieser Marker getestet. Des Weiteren wurde überprüft, ob sich die zelluläre Invasivität von kolonisierenden und Infektions-assoziierten MRSA-Isolaten unterscheidet und, ob die alleinige Bestimmung molekularer Marker in vitro die Virulenz eines Isolats in vivo abzuschätzen vermag. Methoden:Insgesamt wurden 109 MRSA-Isolate gesammelt, molekular charakterisiert (spa-Typ, BURP-Analyse, SCCmec-Typ, pls, agr-Typ, Hämolyseverhalten) und das Potential zellulärer Invasivität in vitro ermittelt. Die Assoziation eines Isolates mit einer Infektion in vivo wurde nachverfolgt (93 Kolonisierer versus 16 Infektions-assoziierte-Isolate). Zusätzlich wurde eine Referenzgruppe aus 13 S. aureus-Isolaten etabliert, die klinisch mit vergleichsweise invasiven Infektionen assoziiert waren (12 Osteomyelitis-Isolate und 1 Endokarditis-Isolat). Ergebnisse: Die bekannten molekularen Marker zellulärer Invasivität korrelieren zuverlässig in einer Population klinischer MRSA-Isolate und lassen sich auch auf bisher nicht bekannte (spa- und SCCmec-) Typen ausweiten. Das Hämolyseverhalten korrelierte nicht mit der zellulären Invasivität. Der agr-Typ wurde als weiterer molekularer Marker identifiziert. Die zelluläre Invasivität war unabhängig von der Etablierung einer Infektion in vivo (mediane Invasivität der Kolonisierer 100% versus 108% der Infektions-assoziierten Studienisolate und 110% der externen Referenzisolate). Des Weiteren waren die molekularen Marker spa- und agr-Typ nicht in der Lage, die Virulenz eines MRSA-Isolats in vivo abzuschätzen. Diskussion: Die zelluläre Invasivität klinischer MRSA-Isolate korreliert zuverlässig mit molekularen Markern. Allerdings vermögen weder die zelluläre Invasivität, noch mit ihr assoziierte molekulare Marker die Etablierung einer Infektion in vivo vorherzusagen. Beide scheinen also als Surrogat-Parameter zur Abschätzung der klinischen Virulenz eines Isolats ungeeignet. Zur Klärung der Frage, ob molekulare Marker zellulärer Invasivität in anderen Abschnitten der Pathogenese von S. aureus- Infektionen eine Rolle spielen, bedarf es weiterer Studien.
Background
Neisseria meningitidis is a naturally transformable, facultative pathogen colonizing the human nasopharynx. Here, we analyze on a genome-wide level the impact of recombination on gene-complement diversity and virulence evolution in N. meningitidis. We combined comparative genome hybridization using microarrays (mCGH) and multilocus sequence typing (MLST) of 29 meningococcal isolates with computational comparison of a subset of seven meningococcal genome sequences.
Principal Findings
We found that lateral gene transfer of minimal mobile elements as well as prophages are major forces shaping meningococcal population structure. Extensive gene content comparison revealed novel associations of virulence with genetic elements besides the recently discovered meningococcal disease associated (MDA) island. In particular, we identified an association of virulence with a recently described canonical genomic island termed IHT-E and a differential distribution of genes encoding RTX toxin- and two-partner secretion systems among hyperinvasive and non-hyperinvasive lineages. By computationally screening also the core genome for signs of recombination, we provided evidence that about 40% of the meningococcal core genes are affected by recombination primarily within metabolic genes as well as genes involved in DNA replication and repair. By comparison with the results of previous mCGH studies, our data indicated that genetic structuring as revealed by mCGH is stable over time and highly similar for isolates from different geographic origins.
Conclusions
Recombination comprising lateral transfer of entire genes as well as homologous intragenic recombination has a profound impact on meningococcal population structure and genome composition. Our data support the hypothesis that meningococcal virulence is polygenic in nature and that differences in metabolism might contribute to virulence.
Alveolar echinococcosis (AE), a severe and life-threatening disease is caused by the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis. Currently, the options of chemotherapeutic treatment are very limited and are based on benzimidazole compounds, which act merely parasitostatic in vivo and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs and targets are urgently needed. In the present work the role of two evolutionarily conserved signalling pathways in E. multilocularis, namely the insulin signalling cascade and Abl kinases, has been studied in regard to host-parasite interaction and the possible use in anti-AE chemotherapy.
Wie das pathogene Bakterium Neisseria meningitidis kolonisiert auch Neisseria lactamica als Kommensale den oberen Nasopharynx des Menschen. Penicillin G ist ein first-line-Therapeutikum gegen Meningokokkeninfektionen. Reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin wird bei Meningokokken durch Mutationen im penA-Gen verursacht. Horizontaler Gentransfer zwischen den verschiedenen Neisseria spp. wurde auch für das penA-Gen beschrieben. Ziel dieser Arbeit war daher eine phänotypische und genotypische Analyse der Penicillinresistenz von N. lactamica. Aus den Versuchen sollten Prognosen über die zukünftige Resistenzentwicklung von Meningokokken abgeleitet werden. Die phänotypische Analyse von 123 N. lactamica-Stämmen (MIC [Minimum inhibitory concentration]-Bereich: 0,064 – 2,0 µg/ml, Median: 0,38 µg/ml) und 129 N. meningitidis- Stämmen (MIC-Bereich: 0,016 – 0,25 µg/ml, Median: 0,064 µg/ml) zeigte signifikant höhere MIC-Werte gegenüber Penicillin G bei den N. lactamica-Stämmen als bei den untersuchten Meningokokken. Bei Meningokokken sind Polymorphismen (fünf spezifische Mutationen betreffend) im penA-Gen (kodiert für das PBP2 (penicillin binding protein 2)) für verminderte Penicillinsensibilität verantwortlich, weshalb der betroffene Abschnitt des penA-Gens in allen N. lactamica-Stämmen und N. meningitidis-Stämmen untersucht und mit den bekannten Allelen der penA-Datenbank verglichen wurde. Bei den 123 N. lactamica-Stämmen konnten 60 verschiedene penA-Allele nachgewiesen werden, wovon 51 neu in die internationale penA-Datenbank eingefügt werden konnten. Im Gegensatz zu Meningokokken trugen die N. lactamica-Stämme entweder drei oder fünf der für intermediär resistente Meningokokken charakteristischen Mutationen im penA-Gen. N. lactamica-Stämme mit fünf Mutationen (MIC-Bereich: 0,25 – 2,0 µg/ml, Median: 0,5 µg/ml) zeigten signifikant höhere MIC-Werte als Stämme mit drei Mutationen (MIC-Bereich: 0,064 – 0,38 µg/ml, Median: 0,125 µg/ml), aber auch als Meningokokken mit fünf Mutationen (MIC-Bereich: 0,064 – 0,25 µg/ml, Median: 0,125 µg/ml). Eine phylogenetische Analyse aller in der penA-Datenbank hinterlegten Allele zusammen mit den 51 neuen dieser Studie ergab, dass die Allele mit fünf Mutationen unabhängig von der Spezies eine gemeinsame phylogenetische Linie bildeten, während sowohl die Allele mit drei Mutationen (N. lactamica) als auch die ohne Mutationen (N. meningitidis) jeweils eine separate phylogenetische Gruppe formten. Im Rahmen von in vitro-Transformationen mit chromosomaler DNA von N. lactamica konnte der MIC-Wert des Penicillin-sensiblen Meningokokkenstamms 14 in einem single-step-Ereignis durch Übernahme des betreffenden penA-Gens von N. lactamica erhöht werden. Allerdings konnten nur MIC-Werte erreicht werden, die mit intermediär-sensiblen Meningokokken vergleichbar waren und somit weit unter den MIC-Werten der benutzten N. lactamica-Stämme lagen. Dieser Befund legt nahe, dass erhöhte MIC-Werte bei N. lactamica wie auch bei Meningokokken mit Mutationen in der Transpeptidaseregion des PBP2 assoziiert sind. Jedoch sind die im Vergleich zu Meningokokken generell höheren MIC-Werte bei N. lactamica auf andere Faktoren zurückzuführen, die bei N. lactamica eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin bedingen. In den in vitro-Experimenten der vorliegenden Studie konnten diese Faktoren nicht auf Meningokokken übertragen werden. Demnach kann eine Co-Kolonisation mit N. lactamica zwar die MIC-Werte von Meningokokken erhöhen, das Erreichen von bei N. lactamica beobachteten Resistenzniveaus ist allerdings auf diesem Wege nicht möglich. Es ist somit nicht zu befürchten, dass Meningokokken – wie bei Pneumokokken beobachtet – über kommensale Spezies der gleichen Gattung eine massive Reduktion der Empfindlichkeit gegenüber Penicillin entwickeln werden.
The eradication of infectious agents is an attractive means of disease control that, to date, has been achieved for only one human pathogen, the smallpox virus. The introduction of vaccines against Neisseria meningitidis into immunisation schedules, and particularly the conjugate polysaccharide vaccines which can interrupt transmission, raises the question of whether disease caused by this obligate human bacterium can be controlled, eliminated, or even eradicated. The limited number of meningococcal serogroups, lack of an animal reservoir, and importance of meningococcal disease are considerations in favour of eradication; however, the commensal nature of most infections, the high diversity of meningococcal populations, and the lack of comprehensive vaccines are all factors that suggest that this is not feasible. Indeed, any such attempt might be harmful by perturbing the human microbiome and its interaction with the immune system. On balance, the control and possible elimination of disease caused by particular disease-associated meningococcal genotypes is a more achievable and worthwhile goal.
Background: Alveolar echinococcosis (AE) is caused by the metacestode stage of Echinococcus multilocularis. Differential diagnosis with cystic echinococcosis (CE) caused by E. granulosus and AE is challenging. We aimed at improving diagnosis of AE on paraffin sections of infected human tissue by immunohistochemical testing of a specific antibody.
Methodology/Principal Findings: We have analysed 96 paraffin archived specimens, including 6 cutting needle biopsies and 3 fine needle aspirates, from patients with suspected AE or CE with the monoclonal antibody (mAb) Em2G11 specific for the Em2 antigen of E. multilocularis metacestodes. In human tissue, staining with mAb Em2G11 is highly specific for E. multilocularis metacestodes while no staining is detected in CE lesions. In addition, the antibody detects small particles of E. multilocularis (spems) of less than 1 mm outside the main lesion in necrotic tissue, liver sinusoids and lymphatic tissue most probably caused by shedding of parasitic material. The conventional histological diagnosis based on haematoxylin and eosin and PAS stainings were in accordance with the immunohistological diagnosis using mAb Em2G11 in 90 of 96 samples. In 6 samples conventional subtype diagnosis of echinococcosis had to be adjusted when revised by immunohistology with mAb Em2G11.
Conclusions/Significance: Immunohistochemistry with the mAb Em2G11 is a new, highly specific and sensitive diagnostic tool for AE. The staining of small particles of E. multilocularis (spems) outside the main lesion including immunocompetent tissue, such as lymph nodes, suggests a systemic effect on the host.
Neisseria meningitidis employs polysaccharides and outer membrane proteins to cope with human serum complement attack. To screen for factors influencing serum resistance, an assay was developed based on a colorimetric serum bactericidal assay. The screening used a genetically modified sequence type (ST)-41/44 clonal complex (cc) strain lacking LPS sialylation, polysaccharide capsule, the factor H binding protein (fHbp) and MutS, a protein of the DNA repair mechanism. After killing of >99.9% of the bacterial cells by serum treatment, the colorimetric assay was used to screen 1000 colonies, of which 35 showed enhanced serum resistance. Three mutant classes were identified. In the first class of mutants, enhanced expression of Opc was identified. Opc expression was associated with vitronectin binding and reduced membrane attack complex deposition confirming recent observations. Lipopolysaccharide (LPS) immunotype switch from immunotype L3 to L8/L1 by lgtA and lgtC phase variation represented the second class. Isogenic mutant analysis demonstrated that in ST-41/44 cc strains the L8/L1 immunotype was more serum resistant than the L3 immunotype. Consecutive analysis revealed that the immunotypes L8 and L1 were frequently observed in ST-41/44 cc isolates from both carriage and disease. Immunotype switch to L8/L1 is therefore suggested to contribute to the adaptive capacity of this meningococcal lineage. The third mutant class displayed a pilE allelic exchange associated with enhanced autoaggregation. The mutation of the C terminal hypervariable region D of PilE included a residue previously associated with increased pilus bundle formation. We suggest that autoaggregation reduced the surface area accessible to serum complement and protected from killing. The study highlights the ability of meningococci to adapt to environmental stress by phase variation and intrachromosomal recombination affecting subcapsular antigens.
Acute bacterial meningitis is a life-threatening disease in humans. Discussed as entry sites for pathogens into the brain are the blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). Although human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) constitute a well established human in vitro model for the blood-brain barrier, until now no reliable human system presenting the BCSFB has been developed. Here, we describe for the first time a functional human BCSFB model based on human choroid plexus papilloma cells (HIBCPP), which display typical hallmarks of a BCSFB as the expression of junctional proteins and formation of tight junctions, a high electrical resistance and minimal levels of macromolecular flux when grown on transwell filters. Importantly, when challenged with the zoonotic pathogen Streptococcus suis or the human pathogenic bacterium Neisseria meningitidis the HIBCPP show polar bacterial invasion only from the physiologically relevant basolateral side. Meningococcal invasion is attenuated by the presence of a capsule and translocated N. meningitidis form microcolonies on the apical side of HIBCPP opposite of sites of entry. As a functionally relevant human model of the BCSFB the HIBCPP offer a wide range of options for analysis of disease-related mechanisms at the choroid plexus epithelium, especially involving human pathogens.
Introduction: Although there has been a worldwide emergence and spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), little is known about the molecular epidemiology of MRSA in Tanzania.
Methodology: In this study, we characterized MRSA strains isolated from clinical specimens at the Bugando Medical Centre, Tanzania, between January and December 2008. Of 160 S. aureus isolates from 600 clinical specimens, 24 (15%) were found to be MRSA. Besides molecular screening for the Panton Valentine leukocidin (PVL) genes by PCR, MRSA strains were further characterized by Multi-Locus Sequence Typing (MLST) and spa typing.
Results: Despite considerable genetic diversity, the spa types t690 (29.1%) and t7231 (41.6%), as well as the sequence types (ST) 88 (54.2%) and 1797 (29.1%), were dominant among clinical isolates. The PVL genes were detected in 4 isolates; of these, 3 were found in ST 88 and one in ST1820. Resistance to erythromycin, clindamicin, gentamicin, tetracycline and co-trimoxazole was found in 45.8%, 62.5%, 41.6%, 45.8% and 50% of the strains, respectively.
Conclusion: We present the first thorough typing of MRSA at a Tanzanian hospital. Despite considerable genetic diversity, ST88 was dominant among clinical isolates at the Bugando Medical Centre. Active and standardized surveillance of nosocomial MRSA infection should be conducted in the future to analyse the infection and transmission rates and implement effective control measures.
Background: Alveolar echinococcosis, caused by Echinococcus multilocularis larvae, is a chronic disease associated with considerable modulation of the host immune response. Dendritic cells (DC) are key effectors in shaping the immune response and among the first cells encountered by the parasite during an infection. Although it is assumed that E. multilocularis, by excretory/secretory (E/S)-products, specifically affects DC to deviate immune responses, little information is available on the molecular nature of respective E/S-products and their mode of action. Methodology/Principal Findings: We established cultivation systems for exposing DC to live material from early (oncosphere), chronic (metacestode) and late (protoscolex) infectious stages. When co-incubated with Echinococcus primary cells, representing the invading oncosphere, or metacestode vesicles, a significant proportion of DC underwent apoptosis and the surviving DC failed to mature. In contrast, DC exposed to protoscoleces upregulated maturation markers and did not undergo apoptosis. After pre-incubation with primary cells and metacestode vesicles, DC showed a strongly impaired ability to be activated by the TLR ligand LPS, which was not observed in DC pre-treated with protoscolex E/S-products. While none of the larvae induced the secretion of pro-inflammatory IL-12p70, the production of immunosuppressive IL-10 was elevated in response to primary cell E/S-products. Finally, upon incubation with DC and naive T-cells, E/S-products from metacestode vesicles led to a significant expansion of Foxp3+ T cells in vitro. Conclusions: This is the first report on the induction of apoptosis in DC by cestode E/S-products. Our data indicate that the early infective stage of E. multilocularis is a strong inducer of tolerance in DC, which is most probably important for generating an immunosuppressive environment at an infection phase in which the parasite is highly vulnerable to host attacks. The induction of CD4+CD25+Foxp3+ T cells through metacestode E/S-products suggests that these cells fulfill an important role for parasite persistence during chronic echinococcosis.
Alveolar echinococcosis (AE) is a severe and life-threatening disease caused by the metacestode larva of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis. Parasite entry into the host evokes an early and potentially parasiticidal Th1 immune response that is gradually replaced by a permissive Th2 response. An immunoregulatory environment has also been reported in the host as the disease progresses. As a result of immunomodulation, E. multilocularis larvae persist in the host for decades without being expelled, and thus almost act like a perfect transplant. Very little is currently known on the molecular basis of the host immunomodulation by E. multilocularis. In this work, in vitro cultivation systems were used to assess the influence of metabolites released by the parasite larvae (E/S products) on host immune effector cells. E/S products of cultivated larvae that respresent the early (primary cells) and chronic (metacestode vesicles) phase of AE induced apoptosis and tolerogenic properties (poor responsiveness to LPS stimulation) in host dendritic cells (DC) whereas those of control larvae (protoscoleces) failed to do so. These findings show that the early infective stage of E. multilocularis induces tolerogenicity in host DC, which is most probably important for generating an immunosuppressive environment at an infection phase in which the parasite is highly vulnerable to host attacks. Interestingly, metacestode E/S products promoted the conversion of naïve CD4+ T-cells into Foxp3+ regulatory T-cells in vitro, whereas primary cell and protoscolex E/S products failed to do it. Since Foxp3+ regulatory T-cells are generally known to mediate immunosuppression, the present finding indicates that Foxp3+ regulatory T-cells, expanded by E/S products of the metacestode larva, could play a role in the parasite-driven immunomodulation of the host observed during AE. Furthermore, a substantial increase in number and frequency of suppressive Foxp3+ regulatory T-cells could be observed within peritoneal exudates of mice following intraperitoneal injection of E. multilocularis metacestodes, indicating that Foxp3+ regulatory T-cells could also play an important role in E. multilocularis-driven immunomodulation in vivo. Interestingly, a parasite activin ortholog, EmACT, secreted by metacestodes, was shown to expand host regulatory T-cells in a TGF-β-dependent manner, similarly to mammalian activin A. This observation indicated that E. multilocularis utilizes evolutionarily conserved TGF-β superfamily ligands, like EmACT, to expand host regulatory T-cells. Taken together, the present findings suggest EmACT, a parasite activin secreted by the metacestode and capable of expanding host regulatory T-cells, as an important player in the host immunomodulation by E. multilocularis larvae. Another parasite factor EmTIP, homologous to mammalian T-cell immunomodulatory protein (TIP) was characterized in this work. EmTIP could be detected in the secretions of the parasite primary cells and localized to the intercellular space within the parasite larvae. EmTIP blockade inhibited the proliferation of E. multilocularis primary cells and the formation of metacestode vesicles indicating a major role for parasite development. Furthermore, EmTIP evoked a strong release of IFN-γ by CD4+ T-cells hence suggesting that the secretion of this factor as a result of its role in parasite development could “secondarily” induce a potentially protective Th1 response. In conclusion, this work identified two molecules, EmACT and EmTIP, with high immunomodulatory potential that are released by E. multilocularis larvae. The data presented do provide insights into the mechanisms of parasite-driven host immunomodulation during AE that are highly relevant for the development of anti-parasitic immune therapies.
Entry of Neisseria meningitidis (the meningococcus) into human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) is mediated by fibronectin or vitronectin bound to the surface protein Opc forming a bridge to the respective integrins. This interaction leads to cytoskeletal rearrangement and uptake of meningococci. In this study, we determined that the focal adhesion kinase (FAK), which directly associates with integrins, is involved in integrin-mediated internalization of N. meningitidis in HBMEC. Inhibition of FAK activity by the specific FAK inhibitor PF 573882 reduced Opc-mediated invasion of HBMEC more than 90%. Moreover, overexpression of FAK mutants that were either impaired in the kinase activity or were not capable of autophosphorylation or overexpression of the dominant-negative version of FAK (FRNK) blocked integrin-mediated internalization of N. meningitidis. Importantly, FAK-deficient fibroblasts were significantly less invaded by N. meningitidis. Furthermore, N. meningitidis induced tyrosine phosphorylation of several host proteins including the FAK/Src complex substrate cortactin. Inhibition of cortactin expression by siRNA silencing and mutation of critical amino acid residues within cortactin, that encompass Arp2/3 association and dynamin binding, significantly reduced meningococcal invasion into eukaryotic cells suggesting that both domains are critical for efficient uptake of N. meningitidis into eukaryotic cells. Together, these results indicate that N. meningitidis exploits the integrin signal pathway for its entry and that FAK mediates the transfer of signals from activated integrins to the cytoskeleton. A cooperative interplay between FAK, Src and cortactin then enables endocytosis of N. meningitidis into host cells.
Cytosine methylation is a conserved epigenetic feature found throughout the phylum Platyhelminthes
(2013)
Background: The phylum Platyhelminthes (flatworms) contains an important group of bilaterian organisms responsible for many debilitating and chronic infectious diseases of human and animal populations inhabiting the planet today. In addition to their biomedical and veterinary relevance, some platyhelminths are also frequently used models for understanding tissue regeneration and stem cell biology. Therefore, the molecular (genetic and epigenetic) characteristics that underlie trophic specialism, pathogenicity or developmental maturation are likely to be pivotal in our continued studies of this important metazoan group. Indeed, in contrast to earlier studies that failed to detect evidence of cytosine or adenine methylation in parasitic flatworm taxa, our laboratory has recently defined a critical role for cytosine methylation in Schistosoma mansoni oviposition, egg maturation and ovarian development. Thus, in order to identify whether this epigenetic modification features in other platyhelminth species or is a novelty of S. mansoni, we conducted a study simultaneously surveying for DNA methylation machinery components and DNA methylation marks throughout the phylum using both parasitic and non-parasitic representatives.
Results: Firstly, using both S. mansoni DNA methyltransferase 2 (SmDNMT2) and methyl-CpG binding domain protein (SmMBD) as query sequences, we illustrate that essential DNA methylation machinery components are well conserved throughout the phylum. Secondly, using both molecular (methylation specific amplification polymorphism, MSAP) and immunological (enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA) methodologies, we demonstrate that representative species (Echinococcus multilocularis, Protopolystoma xenopodis, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Fasciola hepatica and Polycelis nigra) within all four platyhelminth classes (Cestoda, Monogenea, Trematoda and 'Turbellaria') contain methylated cytosines within their genome compartments.
Conclusions: Collectively, these findings provide the first direct evidence for a functionally conserved and enzymatically active DNA methylation system throughout the Platyhelminthes. Defining how this epigenetic feature shapes phenotypic diversity and development within the phylum represents an exciting new area of metazoan biology.
Human alveolar echinococcosis (AE) is a potentially deadly disease; recent studies have shown that the endemic area of Echinococcus multilocularis, its causative agent, is larger than previously known. This disease has low prevalence and remains underreported in Europe. Emerging clinical data show that diagnostic difficulties are still common. We report on a 76-year old patient suffering from AE lesions restricted to the left lobe of the liver who underwent a curative extended left hemihepatectomy. Prior to the resection a liver biopsy under the suspicion of an atypical malignancy was performed. After the intervention he developed a pseudoaneurysm of the hepatic artery that was successfully coiled. Surprisingly, during surgery, the macroscopic appearance of the tumour revealed a growth pattern that was rather typical for cystic echinococcosis (CE), i.e., a gross tumour composed of multiple large vesicles with several centimeters in diameter. In addition, there were neither extensive adhesions nor infiltrations of the neighboring pancreas and diaphragm as was expected from previous imaging results. The unexpected diagnosis of AE was confirmed by definite histopathology, specific polymerase chain reaction and serology results. This is a rare case of unusual macroscopic presentation of AE that posed immense diagnostic challenges and had an eventful course. To our knowledge this is the first case of an autochthonous infection in this particular geographic area of Germany, the federal state of Saxony. This report may provide new hints for an expanding area of risk for AE and emphasizes the risk of complications in the scope of diagnostic procedures and the limitations of modern radiological imaging.
Pathogenic Neisseria meningitidis isolates contain a polysaccharide capsule that is the main virulence determinant for this bacterium. Thirteen capsular polysaccharides have been described, and nuclear magnetic resonance spectroscopy has enabled determination of the structure of capsular polysaccharides responsible for serogroup specificity. Molecular mechanisms involved in N. meningitidis capsule biosynthesis have also been identified, and genes involved in this process and in cell surface translocation are clustered at a single chromosomal locus termed cps. The use of multiple names for some of the genes involved in capsule synthesis, combined with the need for rapid diagnosis of serogroups commonly associated with invasive meningococcal disease, prompted a requirement for a consistent approach to the nomenclature of capsule genes. In this report, a comprehensive description of all N. meningitidis serogroups is provided, along with a proposed nomenclature, which was presented at the 2012 XVIIIth International Pathogenic Neisseria Conference.
Staphylococcus aureus is a frequent human commensal bacterium and pathogen. Here we report the complete genome sequence of strain 6850 (spa type t185; sequence type 50 [ST50]), a highly cytotoxic and clinically virulent methicillin-sensitive strain from a patient with complicated S. aureus bacteremia associated with osteomyelitis and septic arthritis.
Background
The metacestode larva of Echinococcus multilocularis (Cestoda: Taeniidae) develops in the liver of intermediate hosts (typically rodents, or accidentally in humans) as a labyrinth of interconnected cysts that infiltrate the host tissue, causing the disease alveolar echinococcosis. Within the cysts, protoscoleces (the infective stage for the definitive canid host) arise by asexual multiplication. These consist of a scolex similar to that of the adult, invaginated within a small posterior body. Despite the importance of alveolar echinococcosis for human health, relatively little is known about the basic biology, anatomy and development of E. multilocularis larvae, particularly with regard to their nervous system.
Results
We describe the existence of a subtegumental nerve net in the metacestode cysts, which is immunoreactive for acetylated tubulin-α and contains small populations of nerve cells that are labeled by antibodies raised against several invertebrate neuropeptides. However, no evidence was found for the existence of cholinergic or serotoninergic elements in the cyst wall. Muscle fibers occur without any specific arrangement in the subtegumental layer, and accumulate during the invaginations of the cyst wall that form brood capsules, where protoscoleces develop. The nervous system of the protoscolex develops independently of that of the metacestode cyst, with an antero-posterior developmental gradient. The combination of antibodies against several nervous system markers resulted in a detailed description of the protoscolex nervous system, which is remarkably complex and already similar to that of the adult worm.
Conclusions
We provide evidence for the first time of the existence of a nervous system in the metacestode cyst wall, which is remarkable given the lack of motility of this larval stage, and the lack of serotoninergic and cholinergic elements. We propose that it could function as a neuroendocrine system, derived from the nervous system present in the bladder tissue of other taeniids. The detailed description of the development and anatomy of the protoscolex neuromuscular system is a necessary first step toward the understanding of the developmental mechanisms operating in these peculiar larval stages.
Neisseria meningitidis is a facultative human pathogen that occasionally shows strong resistance against serum complement exposure. Previously described factors that mediate meningococcal serum resistance are for example the capsule, LPS sialylation, and expression of the factor H binding protein. I aimed for identification of novel serum resistance factors, thereby following two approaches, i) the analysis of the impact of global regulators of gene expression on serum resistance; and ii) a comparative analysis of closely related strains differing in serum resistance. (i) Of six meningococcal global regulators of gene expression studied, only mutation of the zinc uptake regulator Zur reduced complement deposition on meningococci. Little was known about meningococcal Zur and regulatory processes in response to zinc. I therefore elucidated the yet unidentified meningococcal Zur regulon comparing the transcriptional response of the N. meningitidis strain MC58 under zinc-rich and zinc-deficient conditions using a common reference design of microarray analysis. The meningococcal Zur regulon comprises 17 genes, of which 15 genes were repressed and two genes were activated at high zinc condition. Amongst the Zur-repressed genes were genes involved in zinc uptake, tRNA modification, and ribosomal assembly. A 23 bp meningococcal consensus Zur binding motif (Zur box) with a conserved central palindrome was established (TGTTATDNHATAACA) and detected in the promoter region of all regulated transcriptional units (genes/operons). In vitro binding of meningococcal Zur to the Zur box of three selected genes was shown for the first time using EMSAs. Binding of meningococcal Zur to DNA depended specifically on zinc, and mutations in the palindromic sequence constrained Zur binding to the DNA motif. ii) Three closely related strains of ST-41/44 cc from invasive disease and carriage which differed in their resistance to serum complement exposure were analysed to identify novel mediators of serum resistance. I compared the strains’ gene content by microarray analysis which revealed six genes being present in both carrier isolates, but absent in the invasive isolate. Four of them are part of two Islands of horizontally transferred DNA, i.e. IHT-B and –C. The working group furthermore applied a comprehensive screening assay, a transcriptome and a proteome analysis leading to identification of three target proteins. I contributed to establish the role of these three proteins in serum resistance: The adhesin Opc mediates serum resistance by binding of vitronectin, a negative regulator of the complement system; the hypothetical protein NMB0865 slightly contributes to serum resistance by a yet unknown mechanism; and NspA, recently identified to bind the negative complement regulator factor H, led to considerable reduced complement-mediated killing.
Neisseria meningitidis ist ein wichtiger Erreger von Meningitis und Sepsis insbesondere bei jungen Menschen, gleichzeitig sind hohe Raten asymptomatischen Trägertums bekannt. Als die Virulenz begünstigende Faktoren wurden unter anderem die Kapsel, Pili, äußere Membranvesikel (OMV) und Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert, die es dem Erreger erleichtern, das menschliche Immunsystem zu überwinden.
Dabei war bisher die Rolle von Neutrophil Extracellular Traps (NETs) als neu beschriebene Komponente der angeborenen Immunantwort nicht untersucht worden. NETs stellen spinnennetzartige DNA-Strukturen mit globulären Proteindomänen dar, die aus neutrophilen Granulozyten entstehen und als antimikrobiell gelten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von NETs auf Meningokokken zu charakterisieren und mögliche Resistenzmechanismen der Bakterien zu identifizieren.
In den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass Meningokokken an NETs binden und durch diese in ihrer Proliferation gehemmt werden. Eine Lokalisation der Bakterien an die NETs konnte dargestellt werden, LPS und Pili wurden als wichtige Strukturen für die Vermittlung der NET-Bindung identifiziert. OMVs zeigten sich als protektiv gegenüber dem Einfluss der NETs, indem sie die Bindung der Erreger an die NETs blockierten.
Wenig empfindlich zeigten sich die Bakterien gegenüber Histonen als den quantitativ bedeutsamsten NET-Proteinen. Meningokokken schützen sich gegenüber dem Einfluss der NETs durch Ausbildung von Kapsel und LPS mit intakter Phosphoethanolamin-Modifikation. Ebenso vermitteln zwei Cathelicidin-Resistenzgene den Bakterien einen Überlebensvorteil. Keine Rolle bei der NET-Resistenz spielten die untersuchten Effluxmechanismen.
Neuere Untersuchungen von Lappann et al. indentifizierten Meningokokken und OMVs als potente NET-Induktoren. Damit könnten durch die relativ NET-resistenten Mikroorganismen andere Abwehrmechanismen der Neutrophilen konterkariert werden und eine Immunevasion begünstigt werden. Genauere Untersuchungen diesbezüglich stehen noch aus.
Background
Published models predicting nasal colonization with Methicillin-resistant Staphylococcus aureus among hospital admissions predominantly focus on separation of carriers from non-carriers and are frequently evaluated using measures of discrimination. In contrast, accurate estimation of carriage probability, which may inform decisions regarding treatment and infection control, is rarely assessed. Furthermore, no published models adjust for MRSA prevalence.
Methods
Using logistic regression, a scoring system (values from 0 to 200) predicting nasal carriage of MRSA was created using a derivation cohort of 3091 individuals admitted to a European tertiary referral center between July 2007 and March 2008. The expected positive predictive value of a rapid diagnostic test (GeneOhm, Becton & Dickinson Co.) was modeled using non-linear regression according to score. Models were validated on a second cohort from the same hospital consisting of 2043 patients admitted between August 2008 and January 2012. Our suggested correction score for prevalence was proportional to the log-transformed odds ratio between cohorts. Calibration before and after correction, i.e. accurate classification into arbitrary strata, was assessed with the Hosmer-Lemeshow-Test.
Results
Treating culture as reference, the rapid diagnostic test had positive predictive values of 64.8% and 54.0% in derivation and internal validation corhorts with prevalences of 2.3% and 1.7%, respectively. In addition to low prevalence, low positive predictive values were due to high proportion (> 66%) of mecA-negative Staphylococcus aureus among false positive results. Age, nursing home residence, admission through the medical emergency department, and ICD-10-GM admission diagnoses starting with “A” or “J” were associated with MRSA carriage and were thus included in the scoring system, which showed good calibration in predicting probability of carriage and the rapid diagnostic test’s expected positive predictive value. Calibration for both probability of carriage and expected positive predictive value in the internal validation cohort was improved by applying the correction score.
Conclusions
Given a set of patient parameters, the presented models accurately predict a) probability of nasal carriage of MRSA and b) a rapid diagnostic test’s expected positive predictive value. While the former can inform decisions regarding empiric antibiotic treatment and infection control, the latter can influence choice of screening method.
Background
Occupational exposure to live meningococci can potentially cause invasive meningococcal disease in laboratory staff. While, until recently, immunization with quadrivalent polysaccharide vaccine represented one cornerstone of protection, data on long-term persistence of antibodies in adults remain scarce.
Methods
We analyzed the relationship of antibody levels and time following quadrivalent polysaccharide vaccination (Mencevax® ACWY, GlaxoSmithKline) in a cross-sectional sample of 20 laboratory workers vaccinated at ages between 16.4 to 40.7 years from Germany. Sera were obtained 0.4 to 158.5 (median 35.3) months after vaccination. At the time of sampling, laboratory workers had been regularly exposed to meningococci for periods between 3.2 to 163.8 (median 41.2) months. Serum bactericidal assay (SBA) with rabbit complement and a microsphere-based flow analysis method were used to determine bactericidal titers and concentrations of IgG, respectively, against serogroups A, C, W135, and Y. Decay of antibodies was modeled using linear regression. Protective levels were defined as SBA titers ≥ 8.
Results
Half-lives of SBA titers against serogroups A, C, W135, and Y were estimated at 27.4, 21.9, 18.8, and 28.0 months, respectively. Average durations of protection were estimated at 183.9, 182.0, 114.6, and 216.4 months, respectively. Inter-individual variation was high; using lower margins of 95% prediction intervals, minimal durations of protection against serogroups A, C, W135 and Y were estimated at 33.5, 24.6, 0.0, and 55.1 months, respectively. The proportion of staff with protective SBA titers against W135 (65.0%) was significantly lower than proportions protected against A (95.0%), C (94.7%), and Y (95.0%). Consistently, geometric mean titer (97.0) and geometric mean concentration of IgG (2.1 μg/ml) was lowest against serogroup W135. SBA titers in a subset of individuals with incomplete protection rose to ≥ 128 (≥ 8 fold) after reimmunization with a quadrivalent glycoconjugate vaccine.
Conclusions
The average duration of protection following immunization with a quadrivalent polysaccharide vaccine in adults was ≥ 115 months regardless of serogroup. A substantial proportion (approximately 23% according to our decay model) of adult vaccinees may not retain protection against serogroup W135 for five years, the time suggested for reimmunization.
Flatworm parasites (platyhelminths) cause serious infection diseases in humans, such as schistosomiasis and hydatid disease, mainly prevalent in developing countries. However, the current repertoire of drug armamentarium used to combat flatworm infections is limited. For instance, praziquantel is the only drug available for mass treatment of Schistosoma infections. In contrast to their hosts, flatworm parasites possess a distinct redox arrangement of redox pathways in which the selenoenzyme thioredoxin glutathione reductase (TGR) controls the overall redox homeostasis. Interference with this enzyme leads to parasite death. Hence, this key redox enzyme seems to be a new promising drug target against flatworm infections.
Because most flatworms are difficult to cultivate in the laboratory (e.g. Echinococcus granulosus experimental infection in mice takes about 10 month to develop into cysts), this work was focused on Mesocestoides vogae (syn. corti), a non-human flatworm parasite which is an interesting laboratory model to study other flatworm infections: it is very rare in humans, can be easily manipulated both in vivo and in vitro and grows extremely fast in mice. With the aim to assess TGR inhibitors as possible drugs to treat flatworm infections, the thioredoxin and glutathione pathways of M.vogae were studied. Here, the objectives were to study whether the biochemical pathways that maintain the redox homeostasis in M. vogae conform to the general biochemical scenario proposed for other platyhelminth parasites.
Here, it was proven that M. vogae extracts possess both thioredoxin and glutathione reductase activities. The thioredoxin and glutathione reductase activities were partially purified from total extracts by a combination of ammonium sulfate precipitation, anion exchange and hydroxyapatite chromatography. Both activities co-purified in all steps which strongly indicates the existence of TGR rather than a single TR and GR. Furthermore partially purified activities could be inhibited by the organogold compound auranofin, a known TGR inhibitor. Moreover, the glutathione reductase activity displays hysteresis (a peculiar kinetic behavior) at high concentrations of oxidised glutathione, a feature typical of flatworm TGRs, but not of conventional GR. Although M. vogae activities could not be purified to homogeneity, the overall results strongly indicate that this flatworm possesses TGR and lacks conventional GR and TR.
Furthermore the thiadiazole WPQ75 and the N-oxide VL16E (a furoxan derivate) were identified as inhibitors of TGR activity of M.vogae at a 10 µM concentration. These inhibitors were able to kill M.vogae larval worms in vitro as well as in experimental infection in mice.
Due to the existence of TGR activity in M.vogae, the possibility to inhibit this activity with recently discovered inhibitors of flatworm TGR and the successes achieved by testing these inhibitors both in vitro and in vivo, it is strongly evident that M. vogae would be an excellent model to assess TGR inhibitors in flatworm infections.