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Nach der Präparation von gewaschenen Thrombozyten, einem wichtigen Ausgangsmaterial für die experimentelle Forschung oder für die Transfusionsmedizin, tritt bekannterweise ein zunehmender Verlust der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit ein. Die verminderte Funktionsfähigkeit von Thromboyzten nach dem Waschvorgang kann somit auch experimentelle Ergebnisse beeinflussten.
Allerdings sind die dafür verantwortlichen molekularen Mechanismen bisher nicht aufgeklärt, sodass in dieser Dissertationsarbeit molekulare sowie auch funktionelle Vorgänge untersucht wurden, die zum bekannten Phänomen des raschen Verlustes der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit gewaschener Thrombozyten führen.
Die Wirkung von ADP wird über die drei purinergen Rezeptoren P2Y1, P2X1 und P2Y12 vermittelt wird. Daher wurde zunächst die ADP-induzierte Aggregationsfähigkeit alleine bzw. unter Kostimulation mit Epinephrin oder Serotonin - zwei Induktoren, deren Rezeptoren mit analogen Signalwegen wie die ADP-Rezeptoren P2Y1 bzw. P2Y12 gekoppelt sind - bestimmt. Um Hinweise zu erhalten, wie die Abnahme der ADP-vermittelten Reaktivität von gewaschenen Thrombozyten mit der purinergen Rezeptorexpression und -distribution sowie mit der nachgeschalteten Signalweiterleitung im Zusammenhang steht, wurde zudem die Expression purinerger Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche bzw. die Konzentration von purinergen Rezeptoren im Zytosol gewaschener Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie bzw. ELISA gemessen.
Es zeigte sich, dass die Funktion der den purinergen Rezeptoren nachgeschalteten Signalwege während der Lagerungszeit zunehmend beeinträchtigt wird, aber zumindest teilweise erhalten bleibt, wie anhand von Effekten durch Kostimulation mit den Induktoren Epinephrin und Serotonin gezeigt werden konnte. Die Distribution der Rezeptoren zwischen der Thrombozytenoberfläche und den intrazellulären Kompartimenten unterliegt komplexen Prozessen, die induktorabhängig reguliert sind. Eine initiale Zunahme der Expression von ADP-Rezeptoren während der Lagerung von gewaschenen Thrombozyten geht dabei nicht einher mit der Aufrechterhaltung der ADP-induzierten Aggregation.
In der Schlussfolgerung ist die fortschreitende Degeneration der ADP-vermittelten Aggregation - neben einem Rückgang der Rezeptorexpression nach mehr als einer Stunde Lagerungszeit - vor allem auf einen funktionellen Verlust der purinergen Rezeptoren zurückzuführen.
Background
Washing of platelets is an important procedure commonly used for experimental studies, e.g. in cardiovascular research. As a known phenomenon, responsiveness to adenosine diphosphate (ADP) is reduced in washed platelets, although underlying molecular mechanisms—potentially interfering with experimental results—have not been thoroughly studied.
Objectives
Since ADP mediates its effects via three purinergic receptors P2Y1, P2X1 and P2Y12, their surface expression and function were investigated in washed platelets and, for comparison, in platelet-rich-plasma (PRP) at different time points for up to 2 hours after preparation.
Results
In contrast to PRP, flow cytometric analysis of surface expression in washed platelets revealed an increase of all receptors during the first 60 minutes after preparation followed by a significant reduction, which points to an initial preactivation of platelets and consecutive degeneration. The activity of the P2X1 receptor (measured by selectively induced calcium flux) was substantially maintained in both PRP and washed platelets. P2Y12 function (determined by flow cytometry as platelet reactivity index) was partially reduced after platelet washing compared to PRP, but remained stable in course of ongoing storage. However, the function of the P2Y1 receptor (measured by selectively induced calcium flux) continuously declined after preparation of washed platelets.
Conclusion
In conclusion, decreasing ADP responsiveness in washed platelets is particularly caused by impaired activity of the P2Y1 receptor associated with disturbed calcium regulation, which has to be considered in the design of experimental studies addressing ADP mediated platelet function.