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Optogenetics was developed in the field of neuroscience and is most commonly using light-sensitive rhodopsins to control the neural activities. Lately, we have expanded this technique into plant science by co-expression of a chloroplast-targeted β-carotene dioxygenase and an improved anion channelrhodopsin GtACR1 from the green alga Guillardia theta. The growth of Nicotiana tabacum pollen tube can then be manipulated by localized green light illumination. To extend the application of analogous optogenetic tools in the pollen tube system, we engineered another two ACRs, GtACR2, and ZipACR, which have different action spectra, light sensitivity and kinetic features, and characterized them in Xenopus laevis oocytes, Nicotiana benthamiana leaves and N. tabacum pollen tubes. We found that the similar molecular engineering method used to improve GtACR1 also enhanced GtACR2 and ZipACR performance in Xenopus laevis oocytes. The ZipACR1 performed in N. benthamiana mesophyll cells and N. tabacum pollen tubes with faster kinetics and reduced light sensitivity, allowing for optogenetic control of anion fluxes with better temporal resolution. The reduced light sensitivity would potentially facilitate future application in plants, grown under low ambient white light, combined with an optogenetic manipulation triggered by stronger green light.
In der vorliegenden Dissertation wurden die Folgen einer SPRED2-Defizienz in einem Knockout Mausmodell untersucht. Dabei wurde insbesondere die mögliche Verbindung zur Zwangsstörung, einer psychiatrischen Erkrankung beleuchtet. Das SPRED2-Protein kommt im menschlichen Körper in zahlreichen Geweben vor, besonders im Hirn wurde eine ubiquitäre Expression nachgewiesen und ein Zusammenhang mit der Neurogenese und neuronaler Differenzierung vermutet. Seine regulatorische Funktion besteht in einer inhibitorischen Wirkung auf den BDNF/TrkB-ERK-Signalweg, welcher u.a. für die Transkription neuronaler Gene verantwortlich ist. Die verwendeten SPRED2-defizienten Mäuse wurden durch Insertion eines Gene-Trap Vektors in das Spred2-Gen generiert. Die Insertion verhindert letztendlich die korrekte Translation des Proteins. Von der durch weitere Verpaarung entstehenden SPRED2-Knockout Mauslinie wurden ausschließlich männliche Tiere verwendet. Im Rahmen einer SPRED2-KO-Studie von der AG Schuh des Physiologischen Instituts der Universität Würzburg, die u.a. die Entgleisung der HHNA mit resultierendem erhöhten Stresshormonspiegel und eine Dysregulation des Mineralhaushaltshormons Aldosteron zeigte, wurden bei den Versuchstieren zwanghafte Verhaltensmuster beobachtet. Daraufhin wurden elektrophysiologische Messungen durchgeführt, die auf eine Anomalie in der synaptischen Übertragung zwischen Thalamus und Amygdala hindeuteten. Erhöhte Effizienz und Erregbarkeit der amygdaloiden Neuronen führten zu der morphologischen Untersuchung, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden. Da die Afferenzen des Thalamus vorwiegend in den lateralen Kern der Amygdala projizieren, wurde zunächst dieser betrachtet. Ziel der Untersuchung war es, Erkenntnisse darüber zu erlangen, ob der Knockout des SPRED2-Proteins in Mäusen zu einer veränderten Morphologie der Neuronen der lateralen Amygdala führt. Falls dies der Fall sein sollte, könnte damit zumindest ansatzweise das zwanghafte Verhalten der SPRED2-defizienten Mäusen erklärt werden. Die Hirne der Versuchstiere wurden nach der Golgi-Cox-Imprägnierung nach Glaser und Van der Loos und der Einbettung in Celloidin in 150 μm dicke Scheiben geschnitten und anschließend mithilfe eines Hellfeld-Mikroskops und des Neurolucida-Systems analysiert. Quantitativ erfasst und analysiert wurden pyramidale Klasse 1-Neuronen der lateralen Amygdala inklusive absoluter Anzahl und Dichte der Spines an ihren Dendriten. Die Untersuchung zeigte bei SPRED2-KO-Mäusen eine signifikante Erhöhung der mittleren Länge des apikalen Dendriten in Branch order 3 und eine tendenzielle Erhöhung der Gesamtzahl der Spines an den Dendriten in Branch order 1-3 gegenüber den Wildtyp-Mäusen. Daraus lässt sich folgern, dass ein Knockout des SPRED2-Proteins sich auf die Morphologie der Neuronen der lateralen Amygdala auswirkt. Die erhöhte mittlere Länge des apikalen Dendriten in Branch order 3 und die tendenziell erhöhte Spine-Anzahl korrelieren mit der gesteigerten synaptischen Übertragung und Erregbarkeit an amygdaloiden pyramidalen Neuronen. Auf molekularer Ebene kann die Hyperaktivität der lateralen Amygdala als Folge der fehlenden Inhibition des BDNF/TrkB-ERK-Signalwegs und der dadurch veränderten Expression zahlreicher synaptischer Proteine diskutiert werden. Die veränderte Morphologie der Neuronen in der lateralen Amygdala kann eine Ursache für das zwanghafte Verhalten der Mäuse sein, jedoch ist anzunehmen, dass Zwangsstörungen nicht bloß eine monokausale Ursache haben. Diese Arbeit identifiziert SPRED2 als neuen Regulator der Morphologie und Aktivität von Synapsen und die Amygdala als wichtige Hirnregion bei der Entstehung von Zwangsstörungen. SPRED2 ist somit ein vielversprechender Angriffspunkt für andere und spezifischere Untersuchungen der Hirnfunktion und eine potenzielle genetische Ursache für weitere neurologische Erkrankungen.
Hintergrund: Die interstitielle Fibrose spielt bei der Verschlechterung der Nierenfunktion mit dem Endstadium der Urämie eine große Rolle. In diesem Geschehen kommt der Interaktion der im Krankheitsfall vermehrt filtrierten Proteine mit der proximalen Tubuluszelle, dem Ort der Proteinrückresorption, eine entscheidende Bedeutung zu. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand eines Zellkulturmodells den Einfluss eines vermehrten Albuminangebots auf die Kollagenhomöostase kultivierter proximaler Tubuluszellen zu untersuchen, dabei involvierte Signaltransduktionswege aufzuzeigen und die zentrale Rolle der Albuminendozytose im Rahmen des Geschehens zu beurteilen. Methoden: Für unsere Untersuchungen verwendeten wir überwiegend die kultivierten proximalen Tubuluszellen des Opossums, welche – wie auch die LLC-PK1 Zellen - die für die Proteinendozytose notwendigen Komponenten - nämlich die Rezeptoren Megalin und Cubilin sowie den Natrium-Protonen-Austauscher 3 – besitzen und somit eine hohe Endozytoserate aufweisen. Diese wurden mit Albuminkonzentrationen - wie man sie bei erhöhter Proteinfiltration unter pathophysiologischen Bedingungen findet - inkubiert. Für Vergleichsstudien zogen wir Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) heran. Die Kollagenhomöostase wurde mittels Kollagenase-sensitiven Prolininkorporationsassay, Kollagen-ELISA und Kollagen-Western Blot, die Aktivität der Matrixmetalloproteinasen mittels Zymographie und Gelatinaseassay erfasst. Die Aktivierung von Signaltransduktionswegen wurde mittels eines SEAP-Reporter Gen Assays untersucht. Ergebnisse: Albuminexposition führte bei den Zelllinien mit hoher endozytotischer Aktivität (OK- und LLC-PK1- Zellen) zu einer vermehrten Sekretion von Kollagen Typ I, III und IV. Bei den Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) kam es nach Albuminexposition zu einem Rückgang der Kollagensekretion. Im Kollagen-Western Blot zeigte sich nach Inkubation mit Albumin eine Zunahme des zellulären Kollagens. Mittels Zymographie und Gelatinaseassay konnte eine Albumin-induzierte Abnahme der MMP-Aktivität nachgewiesen werden. Inkubation der OK-Zellen mit Albumin führte im SEAP-Reporter-Gen-Assay zu einer Aktivierung des NF-kappaB-, AP-1- und CRE-Singalweges. Hemmung der NF-kappaB-, PKC- und PKA- Aktivierung hatte eine teilweise Reduktion der Albumin-inudzierten Kollagensekretion zur Folge. Eine Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels des NHE3-Inhibitors EIPA verminderte sowohl die Kollagensekretion als auch die Aktivierung der untersuchten Signaltransduktionswege. Diskussion: Unsere Daten zeigen, dass ein Mehrangebot an Albumin die Kollagenhomöostase der proximalen Tubuluszellen aufgrund einer vermehrten Kollagensynthese und eines verminderten Kollagenabbaus stört. Dabei scheinen vor allem Kollagen Typ I und III zur tubulointerstitiellen Fibrose beizutragen. Albuminexposition aktiviert PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 und CRE. Für PKC, PKA und NF-kappaB konnte eine direkte Beteiligung an der Albumin-induzierten Kollagensekretion nachgewiesen werden. Albumin muss mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in die proximale Tubuluszelle aufgenommen werden, um die beobachteten Effekte zu vermitteln. Die alleinige Anwesenheit von Protein im proximalen Tubulus reicht dafür nicht aus. Es ist anzunehmen, dass die gestörte Matrixhomöostase zu einer Progression der interstitiellen Fibrose und somit zum Fortschreiten der Niereninsuffizienz führt. Albuminurie ist also nicht nur ein Marker, sondern ein Motor der Nierenfibrose.
The cardiac hormone atrial natriuretic peptide (ANP) regulates systemic and pulmonary arterial blood pressure by activation of its cyclic GMP-producing guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. In the lung, these hypotensive effects were mainly attributed to smooth muscle-mediated vasodilatation. It is unknown whether pulmonary endothelial cells participate in the homeostatic actions of ANP. Therefore, we analyzed GC-A/cGMP signalling in lung endothelial cells and the cause and functional impact of lung endothelial GC-A dysfunction. Western blot and cGMP determinations showed that cultured human and murine pulmonary endothelial cells exhibit prominent GC-A expression and activity which were markedly blunted by hypoxia, a condition known to trigger pulmonary hypertension (PH). To elucidate the consequences of impaired endothelial ANP signalling, we studied mice with genetic endothelial cell-restricted ablation of the GC-A receptor (EC GC-A KO). Notably, EC GC-A KO mice exhibit PH already under resting, normoxic conditions, with enhanced muscularization of small arteries and perivascular infiltration of inflammatory cells. These alterations were aggravated on exposure of mice to chronic hypoxia. Lung endothelial GC-A dysfunction was associated with enhanced expression of angiotensin converting enzyme (ACE) and increased pulmonary levels of Angiotensin II. Angiotensin II/AT(1)-blockade with losartan reversed pulmonary vascular remodelling and perivascular inflammation of EC GC-A KO mice, and prevented their increment by chronic hypoxia. This experimental study indicates that endothelial effects of ANP are critical to prevent pulmonary vascular remodelling and PH. Chronic endothelial ANP/GC-A dysfunction, e.g. provoked by hypoxia, is associated with activation of the ACE-angiotensin pathway in the lung and PH.
Die Plastizität von Nozizeptoren kann eine der Ursachen für neuropathische Schmerzen sein. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Capsaicinempfindlichkeit und der Galaninexpression in einzelnen Spinalganglionneuronen unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Diese Eigenschaften wurden gewählt, weil beide nach experimentellen Nervenverletzungen starken Veränderungen unterliegen und weil beide über „nerve growth factor“ reguliert werden. Neurone von Ratten mit experimenteller Axotomie oder „chronic constriction injury“ des N. ischiadicus wurden mit entsprechenden Neuronen von unverletzten Ratten unter Kulturbedingungen verglichen. Der gleichzeitige Nachweis beider Eigenschaften erfolgte in isolierten Neuronen durch eine Doppelfärbung, bei der die Capsaicinempfindlichkeit mittels Kobaltaufnahme und die Galaninexpression immunzytochemisch nachgewiesen wurden. Mit zunehmender Dauer einer Axotomie und mit zunehmender Dauer in Kultur sank der Anteil capsaicinempfindlicher Neurone. Gleichzeitig kam es zu einer starken Hochregulation von Galanin. Diese Effekte waren in vitro durch die Zugabe von „nerve growth factor“ oder „glial cell line-derived neurotrophic factor“ reversibel. Mit zunehmender Dauer einer „chronic constriction injury“ hingegen veränderten sich diese Populationen nicht. Die Analyse doppeltgefärbter Neurone ergab, daß nach einer Axotomie kein einziges Neuron gleichzeitig capsaicinempfindlich und galaninerg war. Unter bestimmten Kulturbedingungen sah man jedoch vereinzelt eine Doppelfärbung. Die nach einer Axotomie de novo galaninergen Neurone hatten ein Größenverteilungsprofil, das demjenigen von unverletzten capsaicinempfindlichen Neuronen stark ähnelte. Aus der Literatur ist bekannt, daß die Hochregulation von Galanin das Vorhandensein capsaicinempfindlicher Neurone voraussetzt. In dieser Arbeit wird daher die Hypothese aufgestellt, daß die nach einer Axotomie galaninergen Neurone zuvor capsaicinempfindlich gewesen sein müssen. Dies impliziert, daß im einzelnen Neuron die Hochregulation von Galanin erst nach einer Herabregulation der Capsaicinempfindlichkeit geschieht. Ob diese Sequenz eine funktionelle Bedeutung hat, bedarf weiterer Untersuchungen. Es liegt nahe, daß Galanin als Markerpeptid gelten kann, mit dem in künftigen Untersuchungen neuropathischer Zustände der Nozizeption diejenigen Neurone identifiziert werden können, die zuvor im unverletzten Zustand capsaicinempfindliche Nozizeptoren waren.
A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis
(2018)
Mechanisms that limit thrombosis are poorly defined. One of the few known endogenous platelet inhibitors is nitric oxide (NO). NO activates NO sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) in platelets, resulting in an increase of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). Here we show, using cGMP sensor mice to study spatiotemporal dynamics of platelet cGMP, that NO-induced cGMP production in pre-activated platelets is strongly shear-dependent. We delineate a new mode of platelet-inhibitory mechanotransduction via shear-activated NO-GC followed by cGMP synthesis, activation of cGMP-dependent protein kinase I (cGKI), and suppression of Ca2+ signaling. Correlative profiling of cGMP dynamics and thrombus formation in vivo indicates that high cGMP concentrations in shear-exposed platelets at the thrombus periphery limit thrombosis, primarily through facilitation of thrombus dissolution. We propose that an increase in shear stress during thrombus growth activates the NO-cGMP-cGKI pathway, which acts as an auto-regulatory brake to prevent vessel occlusion, while preserving wound closure under low shear.
Epithelzellen sind entlang einer apico-basolateralen Achse polarisiert. Die korrekte Insertion von Ionenkanälen und Transportproteinen ist für die normale Epithelfunktion unerlässlich. Im Gegensatz dazu sind migrierende Zellen in ihrer Bewegungsebene polarisiert, mit einem Lamellipodium und Zellkörper, die als Vorder- und Hinterende der Zell zu verstehen sind. In vorhergehenden Un- tersuchungen konnte gezeigt werden, dass Ionenkanäle und Transporter in be- stimmten Regionen von migrierenden Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) zu fin- den sind (z. B.: NHE1, Cl/HCO -Austauscher AE2). Diese reichern sich am Vor- derende der MDCK-F-Zellen an. Es war nicht bekannt, wo sich Markerproteine der apikalen Membran wiederfinden. Um dieser Frage nachzugehen, transfizierte ich MDCK-F-Zellen stabil mit dem Kalium-Kanal ROMK2. Dieser wird in der apikalen Membran im Nierensammelbecken expressioniert. Transfizierte Zellklone konnten durch Subcloning und RT-PCR-Experimente mit spezifischen ROMK2-Primern gefun- den werden. Desweiteren wurden Patch-Clamp-Experimente im Ganzzellmodus durch- geführt, um die Insertion von funktionellen ROMK2-Kanälen in die Zellmembran von transfizierten MDCK-F-Zellen nachzuweisen. Die mit dem Kalium-Kanal trans- fizierten Zellen produzieren einen Barium-hemmbaren Kalium-Strom, der in Mock- transfizierten Zellen nicht nachzuweisen war. Mock-transfizierte MDCK-F-Zellen migrieren mit einer Geschwindigkeit von ca 1,1 µm/min. Im Gegensatz dazu re- duziert die Insertion von ROMK2-Kanälen die Migrationsgeschwindigkeit auf 0,7 µm/min.In immunhistochemischen Experimenten konnte eine diffuse Verteilung des ROMK2 in MDCk-F-Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß es für 'apikale' und basolaterale' Proteine verschiedene intrazelluläre Transportwege in die Plasmamembran von migrierenden Zellen gibt.
Ochratoxin A ist ein Schimmelpilzmetabolit, der in vielen Nahrungsmitteln des Menschen vorkommt und in <80% der Blutproben nachweisbar ist. OTA wirkt hauptsächlich auf die Niere, und hier unter anderem durch Apoptose. Im täglichen Leben sind wir jedoch vielen Nephrotoxinen gleichzeitig ausgesetzt. Somit untersuchten wir die apoptoseinduzierende Wirkung verschiedener Substanzen, wie Antibiotika, NO-Donoren, H2O2, CdCl2, Cisplatin, Cyclosporin A und unterschiedliche pH-Werte in Kombination mit OTA. Bedingt durch die hohe Zahl möglicher Kombinationen verwendeten wirt ein schnelles und effizienztes Apoptose-Screening. Wir bestimmten Caspase-3 Aktivität und Proteingehalt direkt an Zellen, die in 96-Well Platten angesät wurden. Apoptose wurde mittels DNA-Leiterbildung bestätigt, Nekrose durch die Aufnahme von Trypanblau in die Zelle bestimmt. Die untersuchten Zellinien umfassten: LLC-PK1 und IHKE-Zellen (proximaler Tubulus) und MDCK-C7-Zellen (Sammelrohr). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die apoptoseinduzierende Wirkung von OTA von homöostatischen und nephritogenen Agenzien beeinflusst wird, denen die Zellen simultan mit OAT ausgesetzt werden. So beobachteten wir, abhängig von der Kombination antagonistische, additive und potenzierende Effekte. Potenzierung der Wirkung von OTA wurde u.a. für H2O2, Cadmiuim und Cisplatin b eobachtet, während NO-Donoren, Amphotericin B und Angiotensin II eine hemmende Wirkung aof OTA hatten. Cyclosporin A, Cephalexin und Gentamicin zeigten überwiegend additive Wirkung. Das Ausmass der INteraktionen war zwischen den einzelnen Zellininen unterschiedlich und somit zelltyp-, konzentrations- und toxinabhänigig.
Der erste klonierte Hitzerezeptor in Säugetieren ist der TRPV1. Er wird durch noxische Hitzereize ab 43° C und durch chemische Substanzen wie das Vanilloid Capsaicin aktiviert. Die Expression des TRPV1 wird durch das Neurotrophin „Nerve Growth Factor“ (NGF) gesteuert, welches in nichtneuronalen Zellen im Innervationsgebiet der Nozizeptoren gebildet und von dort retrograd zu den Somata der Neurone transportiert wird. Im Gegensatz zu Säugern reagieren Vögel nicht auf Capsaicin, aber auf Hitze ab 42° C. Der hierfür zuständige Rezeptor im Küken wurde kloniert und cTRPV1 genannt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Expression des TRPV1 von Küken ebenso wie bei Säugern von NGF reguliert wird. Hierfür erfolgte (i) eine Isolation von Spinalganglienneurone aus Ratten und Küken und deren Zellkultur für bis zu drei Tagen mit und ohne NGF und (ii) eine Ligation des Nervus ischiadicus des Kükens und die anschließende Isolation der korrespondierenden Spinalganglienneurone. Anschließend erfolgte die Stimulation mit 44 °C und der Anteil capsaicin- bzw. hitzesensitiver Neurone wurde mit Hilfe der Cobalt-Uptake-Methode ermittelt. Es zeigte sich, dass sowohl der Anteil der capsaicinsensitiven als auch der hitzesensitiven Spinalganglienneurone der Ratte bei Abwesenheit von NGF im Kulturmedium mit der Zeit in Zellkultur abnimmt. Im Unterschied dazu nimmt in Küken der Anteil hitzesensitiver Spinalganglienneurone unabhängig von der An- oder Abwesenheit von NGF im Kulturmedium mit der Zeit in Zellkultur zu. Auch unter in vivo-Bedingungen nach Ligation des Nervus ischiadicus zeigte sich beim Küken ein Anstieg der Proportion hitzesensitiver Spinalganglienneurone. Somit konnte gezeigt werden, dass der Küken-TRPV1 im Gegensatz zum TRPV1 der Ratten unabhängig von NGF reguliert wird. Die vorliegenden Ergebnisse tragen zur weiteren Charakterisierung des Küken-TRPV1 und zur Klärung pathologisch veränderter Hitzeempfindungen im Rahmen von Erkrankungen, die mit einer Änderung des NGF-Gehaltes im Innervationsgebiet von Nozizeptoren einhergehen, bei.
Voltage-gated sodium (Na\(^+\)) channels respond to short membrane depolarization with conformational changes leading to pore opening, Na\(^+\) influx, and action potential (AP) upstroke. In the present study, we coupled channelrhodopsin-2 (ChR2), the key ion channel in optogenetics, directly to the cardiac voltage-gated Na\(^+\) channel (Na\(_v\)1.5). Fusion constructs were expressed in Xenopus laevis oocytes, and electrophysiological recordings were performed by the two-microelectrode technique. Heteromeric channels retained both typical Na\(_v\)1.5 kinetics and light-sensitive ChR2 properties. Switching to the current-clamp mode and applying short blue-light pulses resulted either in subthreshold depolarization or in a rapid change of membrane polarity typically seen in APs of excitable cells. To study the effect of individual K\(^+\) channels on the AP shape, we co-expressed either K\(_v\)1.2 or hERG with one of the Na\(_v\)1.5-ChR2 fusions. As expected, both delayed rectifier K\(^+\) channels shortened AP duration significantly. K\(_v\)1.2 currents remarkably accelerated initial repolarization, whereas hERG channel activity efficiently restored the resting membrane potential. Finally, we investigated the effect of the LQT3 deletion mutant ΔKPQ on the AP shape and noticed an extremely prolonged AP duration that was directly correlated to the size of the non-inactivating Na\(^+\) current fraction. In conclusion, coupling of ChR2 to a voltage-gated Na\(^+\) channel generates optical switches that are useful for studying the effect of individual ion channels on the AP shape. Moreover, our novel optogenetic approach provides the potential for an application in pharmacology and optogenetic tissue-engineering.
SPRED proteins are inhibitors of the Ras/ERK/MAPK signaling pathway, an evolutionary highly conserved and very widespread signaling cascade regulating cell proliferation, differentiation, and growth. To elucidate physiological consequences of SPRED2 deficiency, SPRED2 KO mice were generated by a gene trap approach. An initial phenotypical characterization of KO mice aged up to five months identified SPRED2 as a regulator of chondrocyte differentiation and bone growth. Here, the loss of SPRED2 leads to an augmented FGFR-dependent ERK activity, which in turn causes hypochondroplasia-like dwarfism. However, long term observations of older KO mice revealed a generally bad state of health and manifold further symptoms, including excessive grooming associated with severe self-inflicted wounds, an abnormally high water uptake, clear morphological signs of kidney deterioration, and a reduced survival due to sudden death. Based on these observations, the aim of this study was to discover an elicitor of this complex and versatile phenotype.
The observed kidney degeneration in our SPRED2 KO mice was ascribed to hydronephrosis characterized by severe kidney atrophy and apoptosis of renal tubular cells. Kidney damage prompted us to analyze drinking behavior and routine serum parameters. Despite polydipsia, which was characterized by a nearly doubled daily water uptake, the significantly elevated Na+ and Cl- levels and the resulting serum hyperosmolality could not be compensated in SPRED2 KOs. Since salt and water balance is primarily under hormonal control of aldosterone and AVP, we analyzed both hormone levels. While serum AVP was similar in WTs and KOs, even after experimental water deprivation and an extreme loss of body fluid, serum aldosterone was doubled in SPRED2 KO mice. Systematic investigation of contributing upstream hormone axes demonstrated that hyperaldosteronism developed independently of an overactivated Renin-Angiotensin system as indicated by halved serum Ang II levels in KO mice. However, aldosterone synthase expression in the adrenal gland was substantially augmented. Serum corticosterone, which is like aldosterone released from the adrenal cortex, was more than doubled in SPRED2 KOs, too. Similar to corticosterone, the production of aldosterone is at least in part under control of pituitary ACTH, which is further regulated by upstream hypothalamic CRH release. In fact, stress hormone secretion from this complete hypothalamic-pituitary-adrenal axis was upregulated because serum ACTH, the mid acting pituitary hormone, and hypothalamic CRH, the upstream hormonal inductor of HPA axis activity, were also elevated by 30% in SPRED2 KO mice. This was accompanied by an upregulated ERK activity in paraventricular nucleus-containing hypothalamic brain regions and by augmented hypothalamic CRH mRNA levels in our SPRED2 KO mice. In vitro studies using the hypothalamic cell line mHypoE-44 further demonstrated that both SPRED1 and SPRED2 were able to downregulate CRH promoter activity, CRH secretion, and Ets factor-dependent CRH transcription. This was in line with the presence of various Ets factor binding sites in the CRH promoter region, especially for Ets1.
Thus, this study shows for the first time that SPRED2-dependent inhibition of Ras/ERK/MAPK signaling by suppression of ERK activity leads to a downregulation of Ets1 factor-dependent transcription, which further results in inhibition of CRH promoter activity, CRH transcription, and CRH release from the hypothalamus. The consecutive hyperactivity of the complete HPA axis in our SPRED2 KO mice reflects an elevated endogenous stress response becoming manifest by excessive grooming behavior and self-inflicted skin lesions on the one hand; on the other hand, in combination with elevated aldosterone synthase expression, this upregulated HPA hormone release explains hyperaldosteronism and the associated salt and water imbalances. Both hyperaldosteronism and polydipsia very likely contribute further to the observed kidney damage.
Taken together, this study initially demonstrates that SPRED2 is essential for the appropriate regulation of HPA axis activity and of body homeostasis.
To further enlighten and compare consequences of SPRED2 deficiency in mice and particularly in humans, two follow-up studies investigating SPRED2 function especially in heart and brain, and a genetic screen to identify human SPRED2 loss-of-function mutations are already in progress.
Obsessive-compulsive disorder (OCD) is a common neuropsychiatric disease affecting about 2% of the general population. It is characterized by persistent intrusive thoughts and repetitive ritualized behaviors. While gene variations, malfunction of cortico-striato-thalamo-cortical (CSTC) circuits, and dysregulated synaptic transmission have been implicated in the pathogenesis of OCD, the underlying mechanisms remain largely unknown. Here we show that OCD-like behavior in mice is caused by deficiency of SPRED2, a protein expressed in various brain regions and a potent inhibitor of Ras/ERK-MAPK signaling. Excessive self-grooming, reflecting OCD-like behavior in rodents, resulted in facial skin lesions in SPRED2 knockout (KO) mice. This was alleviated by treatment with the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine. In addition to the previously suggested involvement of cortico-striatal circuits, electrophysiological measurements revealed altered transmission at thalamo-amygdala synapses and morphological differences in lateral amygdala neurons of SPRED2 KO mice. Changes in synaptic function were accompanied by dysregulated expression of various pre- and postsynaptic proteins in the amygdala. This was a result of altered gene transcription and triggered upstream by upregulated tropomyosin receptor kinase B (TrkB)/ERK-MAPK signaling in the amygdala of SPRED2 KO mice. Pathway overactivation was mediated by increased activity of TrkB, Ras, and ERK as a specific result of SPRED2 deficiency and not elicited by elevated brain-derived neurotrophic factor levels. Using the MEK inhibitor selumetinib, we suppressed TrkB/ERK-MAPK pathway activity in vivo and reduced OCD-like grooming in SPRED2 KO mice. Altogether, this study identifies SPRED2 as a promising new regulator, TrkB/ERK-MAPK signaling as a novel mediating mechanism, and thalamo-amygdala synapses as critical circuitry involved in the pathogenesis of OCD.
Characterization and modification of light-sensitive phosphodiesterases from choanoflagellates
(2022)
Enzyme rhodopsins, including cyclase opsins (Cyclops) and rhodopsin phosphodiesterases (RhoPDEs), were recently discovered in fungi, algae and protists. In contrast to the well-developed light-gated guanylyl/adenylyl cyclases as optogenetic tools, ideal light-regulated phosphodiesterases are still in demand. Here, we investigated and engineered the RhoPDEs from Salpingoeca rosetta, Choanoeca flexa and three other protists. All the RhoPDEs (fused with a cytosolic N-terminal YFP tag) can be expressed in Xenopus oocytes, except the AsRhoPDE that lacks the retinal-binding lysine residue in the last (8th) transmembrane helix. An N296K mutation of YFP::AsRhoPDE enabled its expression in oocytes, but this mutant still has no cGMP hydrolysis activity. Among the RhoPDEs tested, SrRhoPDE, CfRhoPDE1, 4 and MrRhoPDE exhibited light-enhanced cGMP hydrolysis activity. Engineering SrRhoPDE, we obtained two single point mutants, L623F and E657Q, in the C-terminal catalytic domain, which showed ~40 times decreased cGMP hydrolysis activity without affecting the light activation ratio. The molecular characterization and modification will aid in developing ideal light-regulated phosphodiesterase tools in the future.
The second messengers, cyclic adenosine 3′-5′-monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine 3′-5′-monophosphate (cGMP), play important roles in many animal cells by regulating intracellular signaling pathways and modulating cell physiology. Environmental cues like temperature, light, and chemical compounds can stimulate cell surface receptors and trigger the generation of second messengers and the following regulations. The spread of cAMP and cGMP is further shaped by cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs) for orchestration of intracellular microdomain signaling. However, localized intracellular cAMP and cGMP signaling requires further investigation. Optogenetic manipulation of cAMP and cGMP offers new opportunities for spatio-temporally precise study of their signaling mechanism. Light-gated nucleotide cyclases are well developed and applied for cAMP/cGMP manipulation. Recently discovered rhodopsin phosphodiesterase genes from protists established a new and direct biological connection between light and PDEs. Light-regulated PDEs are under development, and of demand to complete the toolkit for cAMP/cGMP manipulation. In this review, we summarize the state of the art, pros and cons of artificial and natural light-regulated PDEs, and discuss potential new strategies of developing light-gated PDEs for optogenetic manipulation.
Recent studies show that combinations of defined key developmental transcription factors (TFs) can reprogram somatic cells to pluripotency or induce cell conversion of one somatic cell type to another. However, it is not clear if single genes can define a cells identity and if the cell fate defining potential of TFs is also operative in pluripotent stem cells in vitro. Here, we show that ectopic expression of the neural TF Neurogenin2 (Ngn2) is sufficient to induce rapid and efficient differentiation of embryonic stem cells (ESCs) into mature glutamatergic neurons. Ngn2-induced neuronal differentiation did not require any additional external or internal factors and occurred even under pluripotency-promoting conditions. Differentiated cells displayed neuron-specific morphology, protein expression, and functional features, most importantly the generation of action potentials and contacts with hippocampal neurons. Gene expression analyses revealed that Ngn2-induced in vitro differentiation partially resembled neurogenesis in vivo, as it included specific activation of Ngn2 target genes and interaction partners. These findings demonstrate that a single gene is sufficient to determine cell fate decisions of uncommitted stem cells thus giving insights into the role of key developmental genes during lineage commitment. Furthermore, we present a promising tool to improve directed differentiation strategies for applications in both stem cell research and regenerative medicine.
Background:
The cardiac hormones atrial (ANP) and B-type natriuretic peptides (BNP) moderate arterial blood pressure and improve energy metabolism as well as insulin sensitivity via their shared cGMP-producing guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. Obesity is associated with impaired NP/GC-A/cGMP signaling, which possibly contributes to the development of type 2 diabetes and its cardiometabolic complications. In vitro, synthetic ANP, via GC-A, stimulates glucose-dependent insulin release from cultured pancreatic islets and β-cell proliferation. However, the relevance for systemic glucose homeostasis in vivo is not known. To dissect whether the endogenous cardiac hormones modulate the secretory function and/or proliferation of β-cells under (patho)physiological conditions in vivo, here we generated a novel genetic mouse model with selective disruption of the GC-A receptor in β-cells.
Methods:
Mice with a floxed GC-A gene were bred to Rip-CreTG mice, thereby deleting GC-A selectively in β-cells (β GC-A KO). Weight gain, glucose tolerance, insulin sensitivity, and glucose-stimulated insulin secretion were monitored in normal diet (ND)- and high-fat diet (HFD)-fed mice. β-cell size and number were measured by immunofluorescence-based islet morphometry.
Results:
In vitro, the insulinotropic and proliferative actions of ANP were abolished in islets isolated from β GC-A KO mice. Concordantly, in vivo, infusion of BNP mildly enhanced baseline plasma insulin levels and glucose-induced insulin secretion in control mice. This effect of exogenous BNP was abolished in β GC-A KO mice, corroborating the efficient inactivation of the GC-A receptor in β-cells. Despite this under physiological, ND conditions, fasted and fed insulin levels, glucose-induced insulin secretion, glucose tolerance and β-cell morphology were similar in β GC-A KO mice and control littermates. However, HFD-fed β GC-A KO animals had accelerated glucose intolerance and diminished adaptative β-cell proliferation.
Conclusions:
Our studies of β GC-A KO mice demonstrate that the cardiac hormones ANP and BNP do not modulate β-cell's growth and secretory functions under physiological, normal dietary conditions. However, endogenous NP/GC-A signaling improves the initial adaptative response of β-cells to HFD-induced obesity. Impaired β-cell NP/GC-A signaling in obese individuals might contribute to the development of type 2 diabetes.
Die kardialen Hormone Atriales (ANP) und B-Typ (BNP) Natriuretisches Peptid üben bekannte renale und kardiovaskuläre Effekte aus, welche durch ihren gemeinsamen, cGMP-bildenden Guanylatzyklase-Rezeptor A (GC-A) vermittelt werden. Diese Effekte sind entscheidend an der physiologischen Aufrechterhaltung des arteriellen Blutdrucks sowie des intravaskulären Blutvolumens beteiligt. Darüber hinaus zeigen aktuelle Studien, dass NPs die Mobilisierung von Fettsäuren aus dem Fettgewebe und deren Oxidation durch die Skelettmuskulatur steigern sowie die Thermogenese in braunem und weißem Fettgewebe aktivieren können. Dadurch können NPs den Energieverbrauch erhöhen und die Insulinsensitivität verbessern. Desweiteren ist Übergewicht mit einer gestörten NP/GC-A/cGMP-Signalübertragung verbunden, die möglicherweise zur Entwicklung von Diabetes Typ 2 und dessen kardio-metabolischen Folgeerkrankungen beiträgt. In vitro stimuliert synthetisches ANP über GC-A die Glukose-stimulierte Insulinsekretion aus kultivierten pankreatischen Inseln und die β-Zellproliferation. Die Bedeutung für die systemische Insulin/Glukosehomöostase in vivo ist jedoch unklar. Um zu untersuchen, ob die endogenen Herzhormone die sekretorische Funktion und/oder die Proliferation von β-Zellen unter (patho)physiologischen Bedingungen in vivo modulieren, haben wir ein neues genetisches Mausmodell mit selektiver Deletion des GC-A-Rezeptors in β-Zellen (ß GC-A KO) generiert.
In kultivierten Inseln von β GC-A KO-Mäusen waren die insulinotropen und proliferativen Effekte von ANP aufgehoben. Übereinstimmend damit führte die Infusion von BNP bei Kontroll-Tieren in vivo zu leicht erhöhten basalen Plasma-Insulinspiegeln und verbesserter Glukose-induzierter Insulinsekretion. Dieser Effekt von exogenem BNP konnte bei β GC-A KO-Mäusen nicht beobachtet werden, was die effiziente Deletion des GC-A-Rezeptors in β-Zellen bestätigt.
Interessanterweise hatte die Ablation des GC-A-Rezeptors auf ß-Zellen unter basalen Bedingungen keinen Einfluss auf physiologische und metabolische Parameter in vivo. Sowohl männliche als auch weibliche ß GC-A KO-Tiere zeigten keine Unterschiede in der basalen Insulin- und Glukosehomöostase, da sie ähnliche Nüchtern-Blutzucker- und Insulinspiegel (nach Fasten über Nacht) aufwiesen wie die Kontroll-Mäuse. Allerdings zeigten die mit HFD gefütterten β GC-A KO-Tiere frühzeitiger Glukose-Intoleranz sowie eine verminderte adaptive β-Zellproliferation. Abgesehen davon war das konsistenteste Ergebnis der in vivo-Studien der geschlechtsabhängige Unterschied in der Auswirkung der ß-Zellspezifischen GC-A-Deletion auf die Glukose-stimulierte Insulinsekretion. Weibliche, aber nicht männliche ß GC-A KO-Mäuse zeigten erhöhte Nüchtern-Insulinspiegel und eine signifikant erhöhte Glukose-stimulierte Insulinsekretion, was zu einer deutlich verbesserten Glukosetoleranz führte. Der postulierte und untersuchte Mechanismus beinhaltet eine Interaktion von Östrogenen und NPs, welche die Expression des mitochondrialen Uncoupling Protein 2 beeinflussen.
Diese Arbeit erweitert das derzeitige Wissen über die metabolischen Effekte des NP/GC-A-Systems. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, dass Natriuretische Peptide zu einer gesteigerten ß-Zellfunktion und Vitalität in frühen Stadien eines erhöhten Insulinbedarfs, d.h. bei Diabetes Typ 2, beitragen. Da die Studien eine wesentliche Rolle dieser kardialen Hormone im endokrinen Pankreas aufdecken, ist es umso wichtiger die pleiotropen Eigenschaften von NPs und ihre möglichen therapeutischen Anwendungen bei kardio-metabolischen Erkrankungen weiter zu untersuchen.
PTH1R Mutants Found in Patients with Primary Failure of Tooth Eruption Disrupt G-Protein Signaling
(2016)
Aim
Primary failure of tooth eruption (PFE) is causally linked to heterozygous mutations of the parathyroid hormone receptor (PTH1R) gene. The mutants described so far lead to exchange of amino acids or truncation of the protein that may result in structural changes of the expressed PTH1R. However, functional effects of these mutations have not been investigated yet.
Materials and Methods
In HEK293 cells, PTH1R wild type was co-transfected with selected PTH1R mutants identified in patients with PFE. The effects on activation of PTH-regulated intracellular signaling pathways were analyzed by ELISA and Western immunoblotting. Differential effects of wild type and mutated PTH1R on TRESK ion channel regulation were analyzed by electrophysiological recordings in Xenopus laevis oocytes.
Results
In HEK293 cells, activation of PTH1R wild type increases cAMP and in response activates cAMP-stimulated protein kinase as detected by phosphorylation of the vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP). In contrast, the PTH1R mutants are functionally inactive and mutant PTH1R/Gly452Glu has a dominant negative effect on the signaling of PTH1R wild type. Confocal imaging revealed that wild type PTH1R is expressed on the cell surface, whereas PTH1R/Gly452Glu mutant is mostly retained inside the cell. Furthermore, in contrast to wild type PTH1R which substantially augmented K+ currents of TRESK channels, coupling of mutated PTH1R to TRESK channels was completely abolished.
Conclusions
PTH1R mutations affect intracellular PTH-regulated signaling in vitro. In patients with primary failure of tooth eruption defective signaling of PTH1R mutations is suggested to occur in dento-alveolar cells and thus may lead to impaired tooth movement.
Die von Proffit und Vig (1981) als Primary Failure of Eruption (PFE, Primäre Durchbruchstörung) klassifizierte Zahndurchbruchstörung resultiert klinisch häufig in schwergradigen Auswirkungen. Hierbei handelt es sich um Beeinträchtigungen des Wachstums des Alveolarfortsatzes, ebenso wie Dilazerationen, große vertikale Defekte und schwergradige lateral offene Bisse.
Die eindeutige Diagnostik und Abgrenzung der PFE von anderen Zahndurchbruchstörungen gestaltete sich bis zur Bestimmung der zugrunde liegenden Ursachen als sehr schwierig. Aufgrund von Fehldiagnosen kam es häufig zu Behandlungsmisserfolgen.
Um die PFE schneller und spezifischer diagnostizieren zu können, ist das Wissen über die zugrunde liegenden Mutationen des Parathormonrezeptor 1- Genes (PTHR1-Genes), welche bei PFE-Patienten isoliert wurden, von großer Bedeutung.
Im Zuge vorangegangener Studien wurden bereits einige Mutationen des PTHR1 als pathogen klassifiziert, hierzu zählt die PTHR1-Mutante W339*, eine Abbruchmutante, welche auf einem Basenaustausch beruht. Darüber hinaus liegen Daten zu potenziell pathogenen Genvariationen, wie die PTHR1-Mutante G452E, eine Aminosäureaustausch-Mutante, vor. Der Nachweis ihrer Pathogenität würde die Diagnosestellung sichern.
Um die Pathogenität der PTHR1-Variationen nachweisen zu können, wurde ihre RNA in X. laevis Oozyten injiziert. Der PTHR1 wurde zusammen mit mTRESK, einem Kaliumkanal, exprimiert und im Anschluss auf sein Verhalten bei Zugabe von 100 nM Parathormon (PTH) mit elektrophysiolgischen Messungen untersucht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die bei nicht an PFE erkrankten Menschen vorkommende Variante des PTHR1 (PTHR1-WT) eine Aktivierung von 260,47% im Vergleich zu den Ausgangswerten unter einer physiologischen Lösung (ND96) zeigte. Im Gegensatz dazu konnte bei der bereits als pathogen klassifizierten PTHR1-Variation W339* kein signifikanter Anstieg der Aktivität unter PTH-Zugabe nachgewiesen werden. Für die potenziell pathogene PTHR1-Mutante G452E konnte ebenfalls keine signifikante Aktivitätssteigerung als Reaktion auf die Zugabe des Agonisten PTH nachzuweisen ermittelt werden.
Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei der PTHR1-Mutante G452E ebenfalls um eine pathogene Variation des PTHR1-Genes handelt, genauso wie bei der als pathogen klassifizierten Variation W339* des PTHR1, da beide in den durchgeführten Messungen dasselbe Verhalten zeigen.
Die als Kontrollgruppe künstlich erzeugte Mutante G452A des PTHR1 zeigte hingegen eine signifikante Aktivierung von 91,02% im Vergleich zu den gemessenen Ausgangswerten unter physiolgischem ND96. Durch einen einfachen Aminosäureaustausch wurde die Basensequenz des Rezeptors so verändert, dass die Funktion trotz der Mutation wieder hergestellt werden konnte. Dies geschah durch den Einbau eines Alanins anstelle des natürlich vorkommenden Glycins. Im Gegensatz zu dem Einbau von Glutamat, bei der im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante G452E, bei welcher die Funktionsfähigkeit nicht mehr vorliegt.
Die gemessene Aktivität ist zwar geringer als beim WT, legt aber nahe, dass es im Falle dieser künstlichen Mutation nicht zu einer Krankheitsausprägung kommt, da die Reaktion in ihrer Gesamtheit der des PTHR1-WT entspricht. Dies wird auch durch die signifikante Erhöhung des auswärts-gerichteten K+-Stromes deutlich, der sich analog zum gesunden PTHR1 verhält. . Es konnte somit die Funktionsfähigkeit der künstlichen PTHR1-Mutante G452A nachgewiesen werden. Die gesamten erzielten Ergebnisse waren durch die Abbildung von klinischen Befunden auf molekularer Ebene in Oozyten möglich. Durch die Kombination eines Kalium-Kanales mit dem krankheitsspezifischen Rezeptor konnte das Verhalten des Rezeptors anhand des mittels TEVC-Messungen ermittelten Verhaltens des Kalium-Kanales abgebildet werden.
Bei dem verwendeten Kalium-Kanal handelte es sich um mTRESK, welcher mit dem Parathormonrezeptor 1 zusammen exprimiert wurde. Durch die Zugabe des spezifischen Rezeptoragonisten PTH kam es bei den funktionsfähigen Variationen des Rezeptors zu einer Konformationsänderung des G-Proteins. Diese resultierte im weiteren Verlauf in einem Anstieg des intrazellulären Calcium-Spiegels und einer Aktivierung von Calcineurin. Die Dephosphorilierung des Kalium-Kanales mTRESK, welche zu einer Aktivitätssteigerung des Kanals führte, war die Folge.
Dies verdeutlicht, wie auch zukünftig durch die Kooexpression von krankheitsspezifischen Rezeptoren und elektrophysiologisch ableitbaren Strömen, die Bedeutungen und Auswirkungen von Mutationen auf molekularer Ebene funktionell nachgewiesen werden können.
Die vorliegende Arbeit erbringt somit unter Verwendung dieses Expressionssystems den Nachweis dafür, dass es sich bei der im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante G452E um eine pathogene Variation des PTHR1-Genes handelt. Zudem konnten die vorangegangenen Ergebnisse, wonach es sich bei der ebenfalls im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante W339* um eine pathogene Mutation handelt bestätigt werden.
Patienten mit diesen Genvariationen können somit eindeutig die Diagnose PFE erhalten und entsprechend zielführend therapiert werden.
The nicotinic acetylcholine receptor of skeletal muscle is one of the best-investigated synaptic proteins and often serves as model for the entire family of pentameric ligand gated ion channels (pLGICs). Receptors of this superfamily share a common architecture. After binding the agonist the characteristic C-loop structure closes around the ligand-binding site and triggers a wave of conformational changes that spread through the protein and finally result in the opening of the channel gate. As shown before, high-resolution single channel data can hardly be described by simple kinetic mechanisms (Parzefall et al., 1998, Hallermann et al., 2005). Recent advances in the field of kinetic modelling on receptor currents demonstrate that the introduction of additional short lived shut states in kinetic schemes enhances the quality of estimates of reaction rates. The additional shut states that immediately follow ligand bound states in the mechanism are suggested to resemble the closing movement of the C-loop (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). It has not been described yet whether and how the structural differences of the 2 binding sites of the receptor influence the opening behaviour. To address this question, high-resolution single channel recordings, in combination with agonists that are known to exhibit different binding site selectivity, were performed. Thereby, a detailed description of the binding site dependent generation of channel currents is possible. At the embryonic mouse-muscle receptor used in this study the ligand binding sites are located at the α-γ and α-δ subunit interfaces. By allocation of opening characteristics to the α-δ and α-γ sites it is possible to show the binding site dependent activation of distinct kinetic states. Furthermore, it will be shown that the recently introduced short-lived shut states are sufficient to describe high-resolution single channel data. Finally an enhanced kinetic mechanism based on the ‘primed states’ model, published in 2009 by Mukhtasimova et al., will be presented. In this model the structurally diverse α-δ and α-γ binding sites elicit different kinetic channel characteristics. Thus the complex high-resolution kinetic characteristics of the embryonic receptor can be described coherently.
Based on recent findings that show that depletion of factor XII (FXII) leads to better posttraumatic neurological recovery, we studied the effect of FXII-deficiency on post-traumatic cognitive and behavioral outcomes in female and male mice. In agreement with our previous findings, neurological deficits on day 7 after weight-drop traumatic brain injury (TBI) were significantly reduced in FXII\(^{−/−}\) mice compared to wild type (WT) mice. Also, glycoprotein Ib (GPIb)-positive platelet aggregates were more frequent in brain microvasculature of WT than FXII\(^{−/−}\) mice 3 months after TBI. Six weeks after TBI, memory for novel object was significantly reduced in both female and male WT but not in FXII\(^{−/−}\) mice compared to sham-operated mice. In the setting of automated home-cage monitoring of socially housed mice in IntelliCages, female WT mice but not FXII\(^{−/−}\) mice showed decreased exploration and reacted negatively to reward extinction one month after TBI. Since neuroendocrine stress after TBI might contribute to trauma-induced cognitive dysfunction and negative emotional contrast reactions, we measured peripheral corticosterone levels and the ration of heart, lung, and spleen weight to bodyweight. Three months after TBI, plasma corticosterone levels were significantly suppressed in both female and male WT but not in FXII\(^{−/−}\) mice, while the relative heart weight increased in males but not in females of both phenotypes when compared to sham-operated mice. Our results indicate that FXII deficiency is associated with efficient post-traumatic behavioral and neuroendocrine recovery.
Introduction
Structural plasticity with synapse formation and elimination is a key component of memory capacity and may be critical for functional recovery after brain injury. Here we describe in detail two surgical techniques to create a cranial window in mice and show crucial points in the procedure for long-term repeated in vivo imaging of synaptic structural plasticity in the mouse neocortex.
Methods
Transgenic Thy1-YFP(H) mice expressing yellow-fluorescent protein (YFP) in layer-5 pyramidal neurons were prepared under anesthesia for in vivo imaging of dendritic spines in the parietal cortex either with an open-skull glass or thinned skull window. After a recovery period of 14 days, imaging sessions of 45–60 min in duration were started under fluothane anesthesia. To reduce respiration-induced movement artifacts, the skull was glued to a stainless steel plate fixed to metal base. The animals were set under a two-photon microscope with multifocal scanhead splitter (TriMScope, LaVision BioTec) and the Ti-sapphire laser was tuned to the optimal excitation wavelength for YFP (890 nm). Images were acquired by using a 20×, 0.95 NA, water-immersion objective (Olympus) in imaging depth of 100–200 μm from the pial surface. Two-dimensional projections of three-dimensional image stacks containing dendritic segments of interest were saved for further analysis. At the end of the last imaging session, the mice were decapitated and the brains removed for histological analysis.
Results
Repeated in vivo imaging of dendritic spines of the layer-5 pyramidal neurons was successful using both open-skull glass and thinned skull windows. Both window techniques were associated with low phototoxicity after repeated sessions of imaging.
Conclusions
Repeated imaging of dendritic spines in vivo allows monitoring of long-term structural dynamics of synapses. When carefully controlled for influence of repeated anesthesia and phototoxicity, the method will be suitable to study changes in synaptic structural plasticity after brain injury.
Ziel dieser Arbeit war die biophysikalische Charakterisierung der Bindekomponente des Epsilon-Toxins und der Epsilon-Toxin-Mutanten mit Hilfe künstlicher Lipid-Bilayer-Messungen. Es galt herauszufinden, welcher Teil des Epsilon-Toxins für die Kanalbildung verantwortlich ist, um somit die kanalbildende Domäne definieren zu können. Um diese ermitteln können, wurden in der Arbeit vier Epsilon-Toxin Mutanten untersucht, bei denen in dieser potentiellen Porendomäne Punktmutationen eingefügt worden sind. Diese werden Epsilon-Toxin 700, 701, 702 und 703 genannt. Im Vergleich von Wildtyp und Mutanten hat sich gezeigt, dass sich die Werte der Einzelkanalleitfähigkeit, der Selektivität und der Spannungsabhängigkeit verändert haben. Damit wurde bewiesen, dass die Punktmutationen genau in dem Bereich des Toxins durchgeführt wurden, der für die Kanalbildung verantwortlich sein muss.
Adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs), a large molecule family with over 30 members in humans, operate in organ development, brain function and govern immunological responses. Correspondingly, this receptor family is linked to a multitude of diverse human diseases. aGPCRs have been suggested to possess mechanosensory properties, though their mechanism of action is fully unknown. Here we show that the Drosophila aGPCR Latrophilin/dCIRL acts in mechanosensory neurons by modulating ionotropic receptor currents, the initiating step of cellular mechanosensation. This process depends on the length of the extended ectodomain and the tethered agonist of the receptor, but not on its autoproteolysis, a characteristic biochemical feature of the aGPCR family. Intracellularly, dCIRL quenches cAMP levels upon mechanical activation thereby specifically increasing the mechanosensitivity of neurons. These results provide direct evidence that the aGPCR dCIRL acts as a molecular sensor and signal transducer that detects and converts mechanical stimuli into a metabotropic response.
G-protein-coupled receptors (GPCRs) are typically regarded as chemosensors that control cellular states in response to soluble extracellular cues. However, the modality of stimuli recognized through adhesion GPCR (aGPCR), the second largest class of the GPCR superfamily, is unresolved. Our study characterizes the Drosophila aGPCR Latrophilin/dCirl, a prototype member of this enigmatic receptor class. We show that dCirl shapes the perception of tactile, proprioceptive, and auditory stimuli through chordotonal neurons, the principal mechanosensors of Drosophila. dCirl sensitizes these neurons for the detection of mechanical stimulation by amplifying their input-output function. Our results indicate that aGPCR may generally process and modulate the perception of mechanical signals, linking these important stimuli to the sensory canon of the GPCR superfamily.
Aus vorherigen Veröffentlichungen der Arbeitsgruppe war bekannt, dass der TRPV1 Hitzerezeptor im Vogel sich vom TRPV1 der Säugetiere hinsichtlich der Capsaicinsensitivität und der Regulation der Expression durch NGF unterscheidet. Unterschiede in den Eigenschaften zwischen beiden Hitzerezeptorsubtypen könnten Rückschlüsse auf funktionelle Strukturen des Säugetier TRPV1 erlauben. In der vorliegenden Arbeit war die übergreifende Fragestellung, ob sich beide Hitzerezeptorsubtypen auch hinsichtlich ihrer Protonensensitivität unterscheiden. Für die Untersuchungen wurden Spinalganglienneurone von Küken isoliert und kultiviert. Mit Hilfe der Cobalt-uptake Methode wurde der Anteil der Neurone bestimmt, die funktionell den Hitzerezeptor TRPV1 exprimieren. Diese Experimente wurden nach 1, 2 und 3 Tagen unter Kulturbedingungen durchgeführt, um eine mögliche Veränderung mit der Zeit zu erfassen. Weiterhin wurde untersucht, ob durch Protonen der Anteil hitzesensitiver Neurone beeinflusst wird. Hierfür wurden die Somata nach einem Tag unter Kulturbedingungen in Kombination von Hitze und Protonen stimuliert. Um eine Sensibilisierung der Hitzeantwort durch Protonen in einzelnen Neuronen zu untersuchen, wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik in der whole-cell Konfiguration die Amplitude von Hitze-und protoneninduzierten Gesamteinwärtsströmen untersucht. Zunächst wurde mit der Cobalt-uptake Methode untersucht, ob der Anteil hitzesensitiver Neurone durch Protonen von der Zeit unter Kulturbedingungen beeinflusst wird. Bei einer Temperatur von 44°C stieg der Prozentsatz hitzesensitiver Neurone innerhalb der ersten 3 Tage unter Kulturbedingungen an, unabhängig von der Protonenkonzentration (pH 7,4, pH 6,6 und pH 5,8). Die nächste Frage war, wie hoch der Anteil protonensensitiver Neurone bei Raumtemperatur ist. Hierfür wurden die Zellen nach einem Tag in Zellkultur mit einem Medium von pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 oder pH 5,8 stimuliert. Es zeigte sich ein Anstieg von 3,3% ± 0,5% bei pH 7,4 auf 35,0% ± 4,0% bei pH 5,8. Im Folgenden wurde der Frage nachgegangen, ob dieser Anstieg temperaturabhängig ist. Hierfür wurden entsprechende Experimente bei 37°C, 40°C und 44°C nach einem Tag unter Kulturbedingeungen durchgeführt. Im Vergleich war bei 37°C der Anteil positiver Neurone bereits bei 6,2 so hoch wie bei Raumtemperatur bei pH 5,8. Mit weiter zunehmender Temperatur verringerte sich jedoch der Anteil positiver Neurone mit steigendem pH. So war bei 44°C und pH 5,8 nur noch ein geringer Anstieg zu verzeichnen. Im letzten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik hitze- und protoneninduzierte Einwärtsströme gemessen. Es konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduziereten Einwärtsstroms temperaturabhängig ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduzierten Einwärtsstroms bei einem Medium von pH 6,6 im Vergleich zu pH 7,4 deutlich ansteigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der Küken TRPV1 ähnlich wie der der Säugetiere durch Protonen in Konzentrationen, die im entzündlichen Gewebe vorkommen, sensibilisiert werden kann. Es kommt sowohl zu einer Rekrutierung von weiteren hitzesensitiven Neuronen also auch zu einer verstärkten Antwort bereits hitzesensitiver Neurone.
Plants do not have neurons but operate transmembrane ion channels and can get electrical excited by physical and chemical clues. Among them the Venus flytrap is characterized by its peculiar hapto-electric signaling. When insects collide with trigger hairs emerging the trap inner surface, the mechanical stimulus within the mechanosensory organ is translated into a calcium signal and an action potential (AP). Here we asked how the Ca\(^{2+}\) wave and AP is initiated in the trigger hair and how it is feed into systemic trap calcium-electrical networks. When Dionaea muscipula trigger hairs matures and develop hapto-electric excitability the mechanosensitive anion channel DmMSL10/FLYC1 and voltage dependent SKOR type Shaker K\(^{+}\) channel are expressed in the sheering stress sensitive podium. The podium of the trigger hair is interface to the flytrap’s prey capture and processing networks. In the excitable state touch stimulation of the trigger hair evokes a rise in the podium Ca2+ first and before the calcium signal together with an action potential travel all over the trap surface. In search for podium ion channels and pumps mediating touch induced Ca\(^{2+}\) transients, we, in mature trigger hairs firing fast Ca\(^{2+}\) signals and APs, found OSCA1.7 and GLR3.6 type Ca\(^{2+}\) channels and ACA2/10 Ca\(^{2+}\) pumps specifically expressed in the podium. Like trigger hair stimulation, glutamate application to the trap directly evoked a propagating Ca\(^{2+}\) and electrical event. Given that anesthetics affect K\(^+\) channels and glutamate receptors in the animal system we exposed flytraps to an ether atmosphere. As result propagation of touch and glutamate induced Ca\(^{2+}\) and AP long-distance signaling got suppressed, while the trap completely recovered excitability when ether was replaced by fresh air. In line with ether targeting a calcium channel addressing a Ca\(^{2+}\) activated anion channel the AP amplitude declined before the electrical signal ceased completely. Ether in the mechanosensory organ did neither prevent the touch induction of a calcium signal nor this post stimulus decay. This finding indicates that ether prevents the touch activated, glr3.6 expressing base of the trigger hair to excite the capture organ.
Zellmigration ist ein wichtiges Phänomen im gesamten Leben eines menschlichen Organismus. Erwünschte physiologische Bedeutung hat die Zellmigration z. B. im Rahmen der Embryogenese, der Wundheilung und der Immunabwehr, während sie pathophysiologisch unter anderem bei der Metastasierung maligner Neoplasien in Erscheinung tritt. Für optimale Migration ist eine Beteiligung von Ionenkanälen, Ionentransportern und zytoskeletalen Mechanismen in streng koordinierter Interaktion notwendig. Bei selektiver Blockade Ca2+-sensitiver K+-Kanäle (IK1) durch das Skorpiongift Charybdotoxin wird die Migrationsfähigkeit von Zellen erheblich gestört. Da dies ein möglicher thera-peutischer Ansatzpunkt zur Malignitätsreduzierung von Tumoren durch Hemmung der Metastasierung sein könnte, galt es in dieser Arbeit, den „Lebenslauf“ dieses Kanalproteins genauer zu erforschen. Bisherige Erkenntnisse über Migrationsmechanismen, Membran-Umbau und Integrintransport wurden in einem neuen Modell zusammengefasst, das unter anderem die Theorie des K+-Kanal-Rezirkulierens beinhaltet. Zur Überprüfung dieser Theorie wurde in der vorliegenden Doktorarbeit auf die Endo-zytose der Ca2+-abhängigen K+-Kanäle als ersten Schritt bei deren Rezirkulation fokussiert. Durch die Insertion eines viralen HA-Epitops in die Gensequenz des hIK1 mit PCR-Technik konnte der Kanal durch monoklonale anti-HA-Antikörper [Maus] markierbar und durch Zweitantikörper [anti-Maus] detektierbar gemacht werden. Nach der Transfektion des hIK1-HA-34-Plasmids in migrierende MDCK-F-Zellen war aufgrund der extrazellulären Lage des HA-34-Epitops im Kanalprotein eine Markierung der Kanäle mit Antikörpern in lebenden Zellen möglich. Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte nach 37°C-in vivo-Inkubation der Zellen mit extrazellulärer hIK1-HA-34-Markierung die Bildung von vesikelähnlichen Strukturen, die auf Endozytose hindeuten konnten. Untransfizierte Kontrollzellen blieben ungefärbt – die Aufnahme der Antikörper in die Zellen mit hIK1-HA-34 musste also spezi-fisch über Endozytose der Antikörper-Kanal-Komplexe geschehen sein. In der in vivo-Inkubation bei 4°C waren die Versuchszellen nur schemenhaft zu erkennen und auch das bei den 37°C-Experimenten deutlich sichtbare „ruffling“ an der Lamellipodiumspitze stellte sich nicht dar. Dies erhärtete den Verdacht auf eine Ansammlung von Vesikeln an der Lamellipodiumvorderkante. Mit dem Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) konnte die K+-Kanalpräsenz in der Plasmamembran quantifiziert werden. Gegenüber den untransfizierten Kontrollzellen waren die Peroxidase-Werte um das achtfache erhöht. Dies weist ebenfalls auf eine spezifische Endozytose der hIK1-markierenden Antikörper hin. Zudem zeigte sich bei der 37°C-Inkubation im Zeitverlauf über 60 Minuten eine Sättigungskinetik, die ebenfalls für ein Rezirkulieren des hIK1 sprechen könnte. Zusammengefasst scheinen die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungstechniken die Endozytose Ca2+-empfindlicher K+-Kanäle als ersten Schritt eines vermuteten Rezirkulierens der Kanalproteine zu bestätigen.
Protein-Protein-Interaktionen haben eine wesentliche Bedeutung bei der Regulierung verschiedenster Zellfunktionen. Sie spielen u.a. bei der Funktionssteuerung von Kanälen, Transportern und Ionenpumpen eine wesentliche Rolle. Ein PDZ-Motiv am C- terminalen Ende des ATP-abhängigen Kaliumkanals ROMK ließ mögliche Inter-aktionen mit zellulären und membran-assoziierten Proteinen erhoffen. Nach Durch-führung dreier „Yeast-Two-Hybrid“-Screens zur Identifizierung möglicher Interakt-ionspartner von ROMK kamen 17, von ihrer Funktion schon bekannte, aussichtsreiche Proteine, in die enge Auswahl. Nach weiterer Charakterisierung und Autoaktivierungs-tests blieben 13 Proteine zur weiteren Abklärung übrig. GST-Pulldown-Experimente und Immunfluoreszenz brachten weitere Aufschlüsse und Erkenntnisse zur Interaktion zwischen ROMK und seinen Partnern. Folgende Erkenntnisse konnten aus den Versuchen gewonnen werden: *) 174 positive Klone interagierten bei drei „Yeast-Two-Hybrid“-Screens mit dem zytoplasmatischen Teil von ROMK. *) der zytoplasmatische Teil des ATP-abhängigen Kaliumkanals der Niere, ROMK, ist an Protein- Protein- Interaktionen beteiligt. *) Proteine des Aktin-Zytoskeletts und Tyrosinkinase-assoziierte Proteine binden an den zytoplasmatisch Teil von ROMK. Daher könnten beide in Punkt 1.5.4. erwähnten Theorien der Aktivitätsänderung ROMKs durch a) Stimulierung ruhender Kanäle bzw. b) Einbau von in Vesikel gespeicherten Kanälen in die Membran vertreten werden. *) Shank3a, Calponin2, NHERF2, NUMB2 und Antiquitin1 binden an den C-terminalen Teil von ROMK in den GST-Pull-Down-Experimenten. *) Shank3a und ArgBP2 verändern das Verteilungsmuster von ROMK in der Zelle. *) Shank3a scheint für eine Interaktion mit ROMK am bedeutungsvollsten zu sein. Hypothetische Modelle und Gedankenspiele über den möglichen Einfluss der Interaktionspartner auf ROMK wurden in der Diskussion erstellt und näher erläutert. Es ist davon auszugehen, dass einige dieser Proteine, speziell diese, die mit Tyrosinkinase und dem Aktin-Zytokeletts assoziiert sind, auf ROMK Einfluss nehmen. Weitere Studien werden hoffentlich bald Aufschlüsse über Aktivitätsänderungen des ATP-ab-hängigen K+-Kanal, ROMK, offenbaren.
The interplay of specific leukocyte subpopulations, resident cells and proalgesic mediators results in pain in inflammation. Proalgesic mediators like reactive oxygen species (ROS) and downstream products elicit pain by stimulation of transient receptor potential (TRP) channels. The contribution of leukocyte subpopulations however is less clear. Local injection of neutrophilic chemokines elicits neutrophil recruitment but no hyperalgesia in rats. In meta-analyses the monocytic chemoattractant, CCL2 (monocyte chemoattractant protein-1; MCP-1), was identified as an important factor in the pathophysiology of human and animal pain. In this study, intraplantar injection of CCL2 elicited thermal and mechanical pain in Wistar but not in Dark Agouti (DA) rats, which lack p47phox, a part of the NADPH oxidase complex. Inflammatory hyperalgesia after complete Freund's adjuvant (CFA) as well as capsaicin-induced hyperalgesia and capsaicin-induced current flow in dorsal root ganglion neurons in DA were comparable to Wistar rats. Macrophages from DA expressed lower levels of CCR2 and thereby migrated less towards CCL2 and formed limited amounts of ROS in vitro and 4-hydroxynonenal (4-HNE) in the tissue in response to CCL2 compared to Wistar rats. Local adoptive transfer of peritoneal macrophages from Wistar but not from DA rats reconstituted CCL2-triggered hyperalgesia in leukocyte-depleted DA and Wistar rats. A pharmacological stimulator of ROS production (phytol) restored CCL2-induced hyperalgesia in vivo in DA rats. In Wistar rats, CCL2-induced hyperalgesia was completely blocked by superoxide dismutase (SOD), catalase or tempol. Likewise, inhibition of NADPH oxidase by apocynin reduced CCL2-elicited hyperalgesia but not CFA-induced inflammatory hyperalgesia. In summary, we provide a link between CCL2, CCR2 expression on macrophages, NADPH oxidase, ROS and the development CCL2-triggered hyperalgesia, which is different from CFA-induced hyperalgesia. The study further supports the impact of CCL2 and ROS as potential targets in pain therapy.
Anxiety disorders and depression are common comorbidities in cardiac patients. Mice lacking the serotonin transporter (5-HTT) exhibit increased anxiety-like behavior. However, the role of 5-HTT deficiency on cardiac aging, and on healing and remodeling processes after myocardial infarction (MI), remains unclear. Cardiological evaluation of experimentally naïve male mice revealed a mild cardiac dysfunction in ≥4-month-old 5-HTT knockout (−/−) animals. Following induction of chronic cardiac dysfunction (CCD) by MI vs. sham operation 5-HTT−/− mice with infarct sizes >30% experienced 100% mortality, while 50% of 5-HTT+/− and 37% of 5-HTT+/+ animals with large MI survived the 8-week observation period. Surviving (sham and MI < 30%) 5-HTT−/− mutants displayed reduced exploratory activity and increased anxiety-like behavior in different approach-avoidance tasks. However, CCD failed to provoke a depressive-like behavioral response in either 5-Htt genotype. Mechanistic analyses were performed on mice 3 days post-MI. Electrocardiography, histology and FACS of inflammatory cells revealed no abnormalities. However, gene expression of inflammation-related cytokines (TGF-β, TNF-α, IL-6) and MMP-2, a protein involved in the breakdown of extracellular matrix, was significantly increased in 5-HTT−/− mice after MI. This study shows that 5-HTT deficiency leads to age-dependent cardiac dysfunction and disrupted early healing after MI probably due to alterations of inflammatory processes in mice.
L-type calcium channels (LTCCs) control crucial physiological processes in cardiomyocytes such as the duration and amplitude of action potentials, excitation-contraction coupling and gene expression, by regulating the entry of Ca2+ into the cells. Cardiac LTCCs consist of one pore-forming α1 subunit and the accessory subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. Of these auxiliary subunits, Cavβ is the most important regulator of the channel activity; however, it can also have LTCC-independent cellular regulatory functions. Therefore, changes in the expression of Cavβ can lead not only to a dysregulation of LTCC activity, but also to changes in other cellular functions. Cardiac hypertrophy is one of the most relevant risk factors for congestive heart failure and depends on the activation of calcium-dependent prohypertrophic signaling pathways. However, the role of LTCCs and especially Cavβ in this pathology is controversial and needs to be further elucidated.
Of the four Cavβ isoforms, Cavβ2 is the predominant one in cardiomyocytes. Moreover, there are five different splice variants of Cavβ2 (Cavβ2a-e), differing only in the N-terminal region. We reported that Cavβ2b is the predominant variant expressed in the heart. We also revealed that a pool of Cavβ2 is targeted to the nucleus in cardiomyocytes. The expression of the nuclear Cavβ2 decreases during in vitro and in vivo induction of cardiomyocyte hypertrophy and overexpression of a nucleus-targeted Cavβ2 completely abolishes the in vitro induced hypertrophy. Additionally, we demonstrated by shRNA-mediated protein knockdown that downregulation of Cavβ2 enhances the hypertrophy induced by the α1-adrenergic agonist phenylephrine (PE) without involvement of LTCC activity. These results suggest that Cavβ2 can regulate cardiac hypertrophy through LTCC-independent pathways. To further validate the role of the nuclear Cavβ2, we performed quantitative proteome analyses of Cavβ2-deficient neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The results show that downregulation of Cavβ2 influences the expression of various proteins, including a decrease of calpastatin, an inhibitor of the calcium-dependent cysteine protease calpain. Moreover, downregulation of Cavβ2 during cardiomyocyte hypertrophy drastically increases calpain activity as compared to controls after treatment with PE. Finally, the inhibition of calpain by calpeptin abolishes the increase in PE-induced hypertrophy in Cavβ2-deficient cells. These results suggest that nuclear Cavβ2 has Ca2+- and LTCC-independent functions during the development of hypertrophy. Overall, our results indicate a new role for Cavβ2 in antihypertrophic signaling in cardiac hypertrophy.
Aldosteron ist ein Steroidhormon, das eine zentrale Rolle in der Regulation der Salz- und Wasserhomöostase des menschlichen Körpers spielt. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass Aldosteron außderdem fibrotische Vorgänge im Herz-Kreislaufsystem begünstigt, indem es beteiligt ist an endothelialer Dsyfunktion oder das sog „cardia redmodelling“ negativ beeinflusst. Aldosteron enthüllte aber noch ein anderes Geheimnis: Bisher wusste man, dass Aldosteron an den Mineralokortikoidrezeptor bindet, der als Liganden-abhängiger Transkriptionsfaktor fungiert; auf diese Art und Weise beeinflusste Aldosteron die Proteinsynthese; nun konnte aber gezeigt werden, dass Aldosteron unabhängig von seinem Rezeptor und unabhängig von der Proteinsynthese zu schnellen Reaktionen führen kann, z.B. zu einer Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration oder zu einer Veränderung des intrazellulären pH-Wertes. Die Interaktionen zwischen Aldosteron, dem Mineralokortikoidrezeptor und anderen Signalwegen scheinen komplexer zu sein als bisher angenommen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezielt der Einfluss von Calcium, Proteinkinase C, der PI-3-Kinase sowie von H2O2 auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors untersucht. Im Rahmen der Zellkultur wurden HEK-Zellen (human embryonic kidney cells) benutzt; als Techniken kamen hauptsächlich Reportergen-Assay, ELISA, Fluoreszenzmessungen und Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz. Folgende Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden: 1. Calcium ist an der Aldosteron-induzierten Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors beteiligt: die Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration führt zu einer Abnahme der Aktivität des Mineralokortikoidrezeptors. Da Aldosteron selbst zu einer Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration führt, könnte Calcium im Sinne eines negativen Feedback-Mechanismus im Rahmen der Aldosteron-induzierten Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors fungieren. 2. Die Proteinkinase C übte in den hier durchgeführten Experimenten keinen Einfluss aus auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors. Weder Inhibierung noch Aktivierung der Proteinkinase C zeigten Wirkung. 3. Einen klaren oder direkten Einfluss auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors zeigte sich auch bei der PI-3-Kinase nicht. 4. H2O2 führt – ab einer Konzentration > 500 µmol/l – zu einer deutlichen Herunterregulierung der Aktivität des Mineralokortikoidrezeptors. Diese Herunterregulierung ist unabhängig von Aldosteron, und findet z.B. auch in Gegenwart von anderen Steroidhormonen statt bzw. auch in völliger Abwesenheit eines Mineralokortikoidrezeptor-aktivierenden Hormons. Daher ist anzunehmen, dass H2O2 nicht direkt die Interaktion des Mineralokortikoidrezeptors mit seinem Hormon Aldosteron stört, sondern dass die Einflussnahme von H2O2 auf die Aktivität des Mineralokortikoidrezeptors an einem anderen Punkt der Regulierung der Aktivität des Mineralokortikoidrezeptors stattfinden muss.
Revealing the molecular organization of anatomically precisely defined brain regions is necessary for refined understanding of synaptic plasticity. Although three-dimensional (3D) single-molecule localization microscopy can provide the required resolution, imaging more than a few micrometers deep into tissue remains challenging. To quantify presynaptic active zones (AZ) of entire, large, conditional detonator hippocampal mossy fiber (MF) boutons with diameters as large as 10 mu m, we developed a method for targeted volumetric direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). An optimized protocol for fast repeated axial scanning and efficient sequential labeling of the AZ scaffold Bassoon and membrane bound GFP with Alexa Fluor 647 enabled 3D-dSTORM imaging of 25 mu m thick mouse brain sections and assignment of AZs to specific neuronal substructures. Quantitative data analysis revealed large differences in Bassoon cluster size and density for distinct hippocampal regions with largest clusters in MF boutons. Pauli et al. develop targeted volumetric dSTORM in order to image large hippocampal mossy fiber boutons (MFBs) in brain slices. They can identify synaptic targets of individual MFBs and measured size and density of Bassoon clusters within individual untruncated MFBs at nanoscopic resolution.
Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Veränderungen präsynaptischer Aktiver Zonen als mögliches Korrelat synaptischer Plastizität zu detektieren. Damit soll die Hypothese getestet werden, dass strukturelle Plastizität Aktiver Zonen eine zentrale Rolle bei der Informationsverarbeitung im Gehirn und bei Lern- und Gedächtnisprozessen spielt. Dazu war es notwendig Methoden zu etablieren, die die strukturelle Analyse Aktiver Zonen und deren Veränderung in vitalem Gewebe ermöglichen. Um die Untersuchungen in einem Gewebe mit plastischen Eigenschaften durchzuführen, wurden Methoden zur Herstellung organotypischer hippocampaler Hirnschnittkulturen etabliert, da hippokampale Moosfasersynapsen ausgeprägte präsynaptische Plastizität aufweisen (Bliss und Collingridge, 1993). Durch Einzelzellelektroporation wurde es möglich, individuelle Neurone mit Transgenen zur Markierung der gesamten Zelle (DsRed) und synaptischer Substrukturen wie Aktive Zonen (z.B.: GFP-CAST, einem Fluorophor-markierten AZ-Protein) zu transfizieren. Mit konfokaler Bildgebung transfizierter Zellen konnten strukturierte Anreicherungen von GFP-CAST in Moosfaserboutons dargestellt werden. Konfokale Bildgebung von Doppelimmunfluoreszenzfärbungen zur detaillierten Analyse der Proteinlokalisation zeigte ein diffraktionsbedingtes Auflösungsdefizit, das auch durch die Anwendung von STED-Mikroskopie nicht zufriedenstellend gelöst werden konnte. Um eine präzise Karte synaptischer Proteine zu erstellen, wurde hochauflösende Mikroskopie (dSTORM) mit einer lateralen räumlichen Auflösung von 20 nm etabliert. Dabei erwiesen sich die ausgeprägte Plastizität, die hohe Dichte an Aktiven Zonen und die variable Gestalt der Boutons im hippokampalen Präparat als problematisch. Aus diesem Grund wurde die elektronenmikroskopisch gut charakterisierte neuromuskuläre Endplatte mit ihrer symmetrischen molekularen Struktur als Präparat für dSTORM verwendet. An der Endplatte konnte die molekulare Organisation der Aktiven-Zonen-Proteine Piccolo und Bassoon dargestellt werden. Zudem konnten erstmals die Mündungen postsynaptischer Falten lichtmikroskopisch aufgelöst werden. So gelang es Werkzeuge zu etablieren, die mit lichtmikroskopischen Methoden die Darstellung der Architektur Aktiver Zonen mit molekularer Auflösung ermöglichen. Die Herausforderung wird es sein, diese neue Dimension in funktionellem Kontext zu nutzen. Die experimentellen Grundlagen dazu wurden durch eine spezielle Badkammer und die Etablierung von Rollertubekulturen bereits gelegt. Dabei ermöglicht dSTORM die Adressierung quantitativer Fragestellungen bis hin zur Bestimmung der Molekülanzahl.
Aktive Zonen (AZs) sind hoch spezialisierte, subzelluläre Kompartimente von Neuronen, die der synaptischen Übertragung dienen. Sie enthalten Gerüstproteine wie RIM (Rab3 interacting molecule) sowie elektronendichte Projektionen bestehend aus Bruchpilot bei Drosophila melanogaster oder Bassoon im Säuger, welche Schlüsselkomponenten des Vesikelverkehrs darstellen. Bei der Fliege sind Anzahl und Verteilung von Bruchpilot-Molekülen in AZs relevant für die funktionelle Differenzierung. Ihre Anordnung wird im Abstand von weniger als einem Mikrometer innerhalb einer präsynaptischen Endigung reguliert.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden elektrophysiologische Ableitungen und konfokale sowie höchstauflösende, immunhistochemische Bildgebung mit dem dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Verfahren an larvalen, neuromuskulären Synapsen von Drosophila durchgeführt. Dabei wurde das genetische Potenzial des Modellorganismus genutzt, um relevante Proteinfunktionen und -interaktionen zu analysieren.
RIM als zentrale Komponente Aktiver Zonen ist relevant für synaptische Plastizität. Eine als CORD7 (cone-rod dystrophy type 7) bezeichnete Punktmutation (Arginin zu Histidin) innerhalb der 310 Helix der C2A-Domäne von RIM wurde mit erhöhten kognitiven Fähigkeiten einer Patientengruppe in Verbindung gebracht. Weil die Drosophila C2A-Domäne eine hohe Homologie zur Säugerdomäne aufweist, konnte der Einfluss dieser Mutation auf Struktur und Funktion von Synapsen untersucht werden. Es zeigte sich, dass der Aminosäureaustausch der CORD7-Position und des benachbarten Arginin-Restes die synaptische Organisation und Transmission beeinflussen.
In einer Reihe weiterer Experimente wurde das Zusammenspiel von Bruchpilot und Synaptotagmin, dem Calciumsensor der evozierten Transmitterfreisetzung, analysiert. Während AZs ohne Bruchpilot auch ohne Synaptotagmin funktionieren, führt dessen Reduktion zu einer Umverteilung von Bruchpilot-Molekülen innerhalb von AZs und zu dramatischen Änderungen in ihrer Anzahl. Abschließend wurde so ein Beitrag zum Verständnis der molekularen Organisation synaptischer Informationsverarbeitung und Plastizität geleistet, wobei zu klären bleibt, wie die zuverlässige Speicherung von Informationen an AZs erreicht werden kann.
The active zone (AZ) protein Bruchpilot (Brp) is essential for rapid glutamate release at Drosophila melanogaster neuromuscular junctions (NMJs). Quantal time course and measurements of action potential-waveform suggest that presynaptic fusion mechanisms are altered in brp null mutants (brp\(^{69}\)). This could account for their increased evoked excitatory postsynaptic current (EPSC) delay and rise time (by about 1 ms). To test the mechanism of release protraction at brp\(^{69}\) AZs, we performed knock-down of Synaptotagmin-1 (Syt) via RNAi (syt\(^{KD}\)) in wildtype (wt), brp\(^{69}\) and rab3 null mutants (rab3\(^{rup}\)), where Brp is concentrated at a small number of AZs. At wt and rab3\(^{rup}\) synapses, syt\(^{KD}\) lowered EPSC amplitude while increasing rise time and delay, consistent with the role of Syt as a release sensor. In contrast, syt\(^{KD}\) did not alter EPSC amplitude at brp\(^{69}\) synapses, but shortened delay and rise time. In fact, following syt\(^{KD}\), these kinetic properties were strikingly similar in wt and brp\(^{69}\), which supports the notion that Syt protracts release at brp\(^{69}\) synapses. To gain insight into this surprising role of Syt at brp\(^{69}\) AZs, we analyzed the structural and functional differentiation of synaptic boutons at the NMJ. At tonic type Ib motor neurons, distal boutons contain more AZs, more Brp proteins per AZ and show elevated and accelerated glutamate release compared to proximal boutons. The functional differentiation between proximal and distal boutons is Brp-dependent and reduced after syt\(^{KD}\). Notably, syt\(^{KD}\) boutons are smaller, contain fewer Brp positive AZs and these are of similar number in proximal and distal boutons. In addition, super-resolution imaging via dSTORM revealed that syt\(^{KD}\) increases the number and alters the spatial distribution of Brp molecules at AZs, while the gradient of Brp proteins per AZ is diminished. In summary, these data demonstrate that normal structural and functional differentiation of Drosophila AZs requires concerted action of Brp and Syt.
Traumatic brain injury (TBI) is the leading cause of death and disability in polytrauma and is often accompanied by concomitant injuries. We conducted a retrospective matched-pair analysis of data from a 10-year period from the multicenter database TraumaRegister DGU\(^®\) to analyze the impact of a concomitant femoral fracture on the outcome of TBI patients. A total of 4508 patients with moderate to critical TBI were included and matched by severity of TBI, American Society of Anesthesiologists (ASA) risk classification, initial Glasgow Coma Scale (GCS), age, and sex. Patients who suffered combined TBI and femoral fracture showed increased mortality and worse outcome at the time of discharge, a higher chance of multi-organ failure, and a rate of neurosurgical intervention. Especially those with moderate TBI showed enhanced in-hospital mortality when presenting with a concomitant femoral fracture (p = 0.037). The choice of fracture treatment (damage control orthopedics vs. early total care) did not impact mortality. In summary, patients with combined TBI and femoral fracture have higher mortality, more in-hospital complications, an increased need for neurosurgical intervention, and inferior outcome compared to patients with TBI solely. More investigations are needed to decipher the pathophysiological consequences of a long-bone fracture on the outcome after TBI.
Aureobasidium pullulans is a black fungus that can adapt to various stressful conditions like hypersaline, acidic, and alkaline environments. The genome of A. pullulans exhibits three genes coding for putative opsins ApOps1, ApOps2, and ApOps3. We heterologously expressed these genes in mammalian cells and Xenopus oocytes. Localization in the plasma membrane was greatly improved by introducing additional membrane trafficking signals at the N-terminus and the C-terminus. In patch-clamp and two-electrode-voltage clamp experiments, all three proteins showed proton pump activity with maximal activity in green light. Among them, ApOps2 exhibited the most pronounced proton pump activity with current amplitudes occasionally extending 10 pA/pF at 0 mV. Proton pump activity was further supported in the presence of extracellular weak organic acids. Furthermore, we used site-directed mutagenesis to reshape protein functions and thereby implemented light-gated proton channels. We discuss the difference to other well-known proton pumps and the potential of these rhodopsins for optogenetic applications.
Regulation of actin cytoskeletal turnover is necessary to coordinate cell movement and cell adhesion. Proteins of the Enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important mediators in cytoskeleton control, linking cyclic nucleotide signaling pathways to actin assembly. In mammals, the Ena/VASP family consists of mammalian Enabled (Mena), VASP, and Ena-VASP-like (EVL). The family members share a tripartite domain organization, consisting of an N-terminal Ena/VASP homology 1 (EVH1) domain, a central proline-rich region (PRR), and a C-terminal EVH2 domain. The EVH1 domain mediates binding to the focal adhesion proteins vinculin and zyxin, the PRR interacts with the actin-binding protein profilin and with Src homology 3 (SH3) domains, and the EVH2 domain mediates tetramerization and actin binding.
Endothelial cells line vessel walls and form a semipermeable barrier between blood and the underlying tissue. Endothelial barrier function depends on the integrity of cell-cell junctions and defective sealing of cell-cell contacts results in vascular leakage and edema formation. In a previous study, we could identify a novel interaction of the PRR of VASP with αII-spectrin. VASP-targeting to endothelial cell-cell contacts by interaction with the αII-spectrin SH3 domain is sufficient to initiate perijunctional actin filament assembly, which in turn stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, barrier function of VASP-deficient endothelial cells and microvessels of VASP- null mice is defective, demonstrating that αII-spectrin/VASP complexes regulate endothelial barrier function in vivo.
The aim of the present study was to characterize the structural aspects of the binding of Ena/VASP proteins to αII-spectrin in more detail. These data are highly relevant to understand the cardiovascular function of VASP and its subcellular targeting. In the present study, the following points were experimentally addressed:
1. Comparison of the interaction between αII-spectrin and Mena, VASP, or EVL
In contrast to the highly conserved EVH1/EVH2 domains, the PRR is the most divergent part within the Ena/VASP proteins and may differ in binding modes and mechanisms of regulation. More specifically, VASP contains a triple GP5 motif, whereas EVL and Mena contain one or more GP6 motifs or even longer proline stretches. In the present study, we used peptide scans and competitive αII-spectrin SH3 pull-down assays with the recombinant Mena, VASP, and VASP mutants to investigate the relative binding efficiency. Our results indicate that binding of the αII-spectrin SH3 domain to GP6 motifs is superior to GP5 motifs, giving a rationale for a stronger interaction of αII-spectrin with EVL and Mena than with VASP.
2. Interaction of SH3i with Ena/VASP proteins
In the mammalian heart, an αII-spectrin splice variant exists (SH3i), which contains a 20 amino acid insertion C-terminal to the SH3 domain. We used GST-fusion proteins of αII-spectrin, comprising the SH3 domain with or without the alternatively spliced amino acids, to pull-down recombinant Mena, VASP or VASP mutants. The results demonstrate a substantially increased binding of the C-terminal extended SH3 domain as compared to the general αII-spectrin isoform without the 20 amino acid insertion. These findings were also confirmed in pull-down experiments with heart lysates and purified Mena from heart muscle. The increased binding was not due to an alternative, SH3-independent binding interface because a pointmutation of the SH3 domain (W1004R) in the alternatively spliced αII-spectrin isoform completely abrogated the interaction. To analyze the interaction of SH3i and Ena/VASP proteins in living cells, we expressed the extended SH3 domain as GFP fusion proteins in endothelial cells. Here, we observed an extensive co-localization with Mena and VASP at the leading edge of lamellipodia confirming the in vivo relevance of the interaction with potential impact on cell migration and angiogenesis.
3. Binding affinity and influence of the Ena/VASP tetramerization domain
We also determined the binding affinity of the general and the alternatively spliced αII-spectrin SH3 with Ena/VASP proteins by isothermal titration calorimetry (ITC) using a peptide from the PRR of Mena (collaboration with Dr. Stephan Feller, University of Oxford). Surprisingly, the binding affinity of the general SH3 domain was low (~900 μM) as compared to other SH3 domain- mediated interactions, which commonly display binding constants in the low micromolar range. Furthermore and in contrast to the pull-down assays, we could not detect an increased binding affinity of the C-terminally extended SH3 domain. This could be either explained by the existence of a third protein, which “bridges” the Mena/αII-spectrin complex in the pull-down assays, or, more likely, by the small size of the Mena peptide, which lacks major parts of the Mena protein, including the tetramerization domain. Indeed, it has been previously shown that the tetramerization of Ena is crucial for the interaction with the Abl- SH3 domain, although no SH3 binding sites are found in the tetramerization domain. To address this point experimentally, we used a VASP mutant that lacks the tetramerization domain in pull-down assays. Neither the general nor the alternatively spliced SH3 domain bound to the monomeric VASP, demonstrating the crucial (indirect) impact of Ena/VASP tetramerization on the interaction with αII-spectrin.
In summary, we conclude that the αII-spectrin SH3 domain binds to the proline- rich region of all Ena/VASP proteins. However, binding to EVL and Mena, which both possess one or more GP6 motifs, is substantially more efficient than VASP, which only contains GP5 motifs. The C-terminally extended SH3 domain, which is present in the αII-spectrin splice variant SH3i, binds stronger to the Ena/VASP proteins than the general isoform and expression of the isolated domain is sufficient for co-localization with Ena/VASP in living endothelial cells. Finally, the tetramerization of the Ena/VASP proteins is indispensable for the interaction with either isoform of αII-spectrin.
Kernpunkt dieser Arbeit ist die interessante pharmakologische Regulation der 2PDK+- Kan�le durch Inhalationsan�sthetika. �ber die molekularen Grundlagen dieser Interaktion und deren Bedeutung in vivo ist noch immer sehr wenig bekannt. Am Beispiel von Halothan, das in der aktuellen Literatur in diesem Zusammenhang am h�ufigsten verwendete Inhalationsan�sthetikum, soll im Hauptteil der Arbeit mit elektrophysiologischen Methoden die Wirkung der Inhalationsan�sthetika auf den Aktivit�tszustand der unterschiedlichen Subgruppen der 2PD-K+-Kan�le beschrieben werden. Die in Xenopus-Oozyten exprimierten 2PD-K+-Kan�le dienen hierbei als Modell nativer 2PD-K+-Kan�le. Es wird eine pharmakologische Konzentrations-Wirkungs-Beziehung erstellt, mit der anschlie�end R�ckschl�sse auf die Bedeutung der 2PD-K+-Kan�le f�r die Vermittlung der Narkose gezogen werden k�nnen. Es soll auch untersucht werden, ob diese Halothanwirkung durch andere physiologische Regulatoren der 2PD-K+- Kan�le beeinflusst wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit soll anhand von Mutagenese bestimmter Kanalabschnitte der molekulare Wirkmechanismus von Halothan genauer charakterisiert werden: Liegt dem beobachteten Ph�nomen eine Ligandenbindung nach dem Schl�ssel-Schloss-Prinzip zugrunde oder vermitteln kompliziertere Mechanismen, etwa ein Ionenkanal-Gate oder komplexe intrazellul�re Signalwege, die Wirkung von Halothan auf die 2PD-K+-Kan�le?
Typisch für die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unlöslicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrillärem beta-Amyloid, das durch Glykierungen verändert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrilläre beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod führen. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern überprüft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen näher untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung führen. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zunächst durch eine hochmolekulare Hyaluronsäure, wie sie nativ in der extrazellulären Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyaluronsäurefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyaluronsäuremolekülgröße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellulären Matrix, wie D-Glukuronsäure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringfügig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen während ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyaluronsäure in kleinere Bruchstücke zerschneiden können. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein Rückschluß auf einen bestimmten Rezeptor möglich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" für die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bezüglich ihrer Überlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizität des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung für die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranständige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies führte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, können zu einer NF-kappa-B Aktivierung führen. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht für die mikrogliavermittelte Neurotoxizität verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivität unmittelbar mit der Neurotoxizität korreliert ist.
Östrogen bewirkt in physiologischer Konzentration in Kardiomyozyten eine schnelle Induktion des Egr-1-Promotors. Dieser Effekt wird über die Östrogenrezeptoren ER alpha und ER beta vermittelt. Überraschenderweise erfolgt die östrogenabhängige Genregulation von Egr-1 aber nicht über den klassischen Signalweg mittels Bindung des Östrogenrezeptors an östrogenresponsive Elemente (ERE), sondern findet unter Bindung von Serumfaktor an serumresponsive Elemente (SRE) des Egr-1-Promotors unter Mitbeteiligung des ERK1/2-Signalweges statt. Am Beispiel der Egr-1-Induktion durch Östrogen ließ sich die Bedeutung serumresponsiver Elemente (SRE) für die Genregulation durch Östrogen aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit konnte damit ein neuartiger Signalweg bei der östrogenabhängigen schnellen Genaktivierung in Kardiomyozyten gezeigt werden.
Neurotransmitter release is stabilized by homeostatic plasticity. Presynaptic homeostatic potentiation (PHP) operates on timescales ranging from minute- to life-long adaptations and likely involves reorganization of presynaptic active zones (AZs). At Drosophila melanogaster neuromuscular junctions, earlier work ascribed AZ enlargement by incorporating more Bruchpilot (Brp) scaffold protein a role in PHP. We use localization microscopy (direct stochastic optical reconstruction microscopy [dSTORM]) and hierarchical density-based spatial clustering of applications with noise (HDBSCAN) to study AZ plasticity during PHP at the synaptic mesoscale. We find compaction of individual AZs in acute philanthotoxin-induced and chronic genetically induced PHP but unchanged copy numbers of AZ proteins. Compaction even occurs at the level of Brp subclusters, which move toward AZ centers, and in Rab3 interacting molecule (RIM)-binding protein (RBP) subclusters. Furthermore, correlative confocal and dSTORM imaging reveals how AZ compaction in PHP translates into apparent increases in AZ area and Brp protein content, as implied earlier.
Single-molecule localization microscopy (SMLM) greatly advances structural studies of diverse biological tissues. For example, presynaptic active zone (AZ) nanotopology is resolved in increasing detail. Immunofluorescence imaging of AZ proteins usually relies on epitope preservation using aldehyde-based immunocompetent fixation. Cryofixation techniques, such as high-pressure freezing (HPF) and freeze substitution (FS), are widely used for ultrastructural studies of presynaptic architecture in electron microscopy (EM). HPF/FS demonstrated nearer-to-native preservation of AZ ultrastructure, e.g., by facilitating single filamentous structures. Here, we present a protocol combining the advantages of HPF/FS and direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) to quantify nanotopology of the AZ scaffold protein Bruchpilot (Brp) at neuromuscular junctions (NMJs) of Drosophila melanogaster. Using this standardized model, we tested for preservation of Brp clusters in different FS protocols compared to classical aldehyde fixation. In HPF/FS samples, presynaptic boutons were structurally well preserved with ~22% smaller Brp clusters that allowed quantification of subcluster topology. In summary, we established a standardized near-to-native preparation and immunohistochemistry protocol for SMLM analyses of AZ protein clusters in a defined model synapse. Our protocol could be adapted to study protein arrangements at single-molecule resolution in other intact tissue preparations.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen.
Mittels RT-PCR konnte gezeigt werden, dass humane neutrophile Granulozyten auf mRNA-Ebene hIK1-Kanäle exprimieren. Die spezifischen hIK1-Kanalblocker Clotrimazol und Charybdotoxin führten zu einer dosisabhängigen Verringerung der Migrationsgeschwindigkeit Neutrophiler. Eine Hemmung der hIK1-Kanäle mittels Clotrimazol und Charybdotoxin fürte zu einer signifikanten Zellschwellung. Die mittels Hypotonie erzwungene Zellschwellung führte zu einer signifikanten Reduktion der Migrationsgeschwindigkeit Neutrophiler. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Migration humaner neutrophiler Granulozyten von der Aktivität der hIK1-Kanäle abhängig ist.
Characterisation of Mena Promoter Activity and Protein Expression in Wild-type and Gene-trapped Mice
(2011)
Proteins of the Ena/VASP protein family are important regulators of actin and participate in cell-cell and cell-matrix adhesions. To date, the physiological importance of Ena/VASP proteins for integrity of the cardiovascular system has remained unclear. To study cardiovascular functions of Mena and VASP, we used an established VASP knockout mouse in combination with a novel gene-trap-based model to ablate Mena function. In the mutated Mena mouse, the endogenous Mena gene is disrupted by the insertion of a β-galactosidase construct and β-galactosidase expression is under the control of the endogenous Mena promoter. X-gal staining of mouse organs revealed Mena promoter activity in smooth muscle layers of vessels, intestines and bronchioles, but also in cells of the brain, in cardiomyocytes and in the respiratory epithelium of bronchioles. In wild-type mice, Western blotting revealed differing protein expression patterns of VASP and Mena. Mena expression was observed in almost every tissue, predominantly in heart, lung, stomach, large intestine, testis, brain and eye. Additionally, the neuronalspecific Mena isoform was expressed in brain, eye, and slightly in heart and stomach. VASP protein, in contrast, was predominantly detected in spleen and thrombocytes. In gene-trapped mice, Mena expression was largely reduced in heart, lung and stomach but only slightly decreased in brain and testis. Immunofluorescence microscopy revealed colocalisation of Mena and F-actin at intercalated discs of cardiomyocytes and strong colocalisation of Mena and α- smooth-muscle-actin in vessels and bronchioles. Functional analysis of Mena/VASP-mutated and wild-type mice using electrocardiography suggested that the depletion of either Mena or VASP does not interfere with normal heart function. However, in double-deficient mice, the resting heart rate was significantly increased, probably reflecting a mechanism to compensate defects in ventricle contraction and to maintain a normal cardiac output. In agreement, cardiac catheter investigations suggested dilated cardiomyopathy in doubledeficient mice. Thus, although Western blot analysis showed differing protein expression patterns of Mena and VASP, these findings suggest that Mena and VASP mutually compensate for each other. Concerning Mena, we propose an important role of the protein in vessel walls, cardiomyocytes and bronchioles.
Correlating molecular labeling at the ultrastructural level with high confidence remains challenging. Array tomography (AT) allows for a combination of fluorescence and electron microscopy (EM) to visualize subcellular protein localization on serial EM sections. Here, we describe an application for AT that combines near-native tissue preservation via high-pressure freezing and freeze substitution with super-resolution light microscopy and high-resolution scanning electron microscopy (SEM) analysis on the same section. We established protocols that combine SEM with structured illumination microscopy (SIM) and direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). We devised a method for easy, precise, and unbiased correlation of EM images and super-resolution imaging data using endogenous cellular landmarks and freely available image processing software. We demonstrate that these methods allow us to identify and label gap junctions in Caenorhabditis elegans with precision and confidence, and imaging of even smaller structures is feasible. With the emergence of connectomics, these methods will allow us to fill in the gap-acquiring the correlated ultrastructural and molecular identity of electrical synapses.
The second messenger cyclic AMP (cAMP) plays an important role in synaptic plasticity. Although there is evidence for local control of synaptic transmission and plasticity, it is less clear whether a similar spatial confinement of cAMP signaling exists. Here, we suggest a possible biophysical basis for the site-specific regulation of synaptic plasticity by cAMP, a highly diffusible small molecule that transforms the physiology of synapses in a local and specific manner. By exploiting the octopaminergic system of Drosophila, which mediates structural synaptic plasticity via a cAMP-dependent pathway, we demonstrate the existence of local cAMP signaling compartments of micrometer dimensions within single motor neurons. In addition, we provide evidence that heterogeneous octopamine receptor localization, coupled with local differences in phosphodiesterase activity, underlies the observed differences in cAMP signaling in the axon, cell body, and boutons.
Synaptic plasticity shapes the development of functional neural circuits and provides a basis for cellular models of learning and memory. Hebbian plasticity describes an activity-dependent change in synaptic strength that is input-specific and depends on correlated pre- and postsynaptic activity. Although it is recognized that synaptic activity and synapse development are intimately linked, our mechanistic understanding of the coupling is far from complete. Using Channelrhodopsin-2 to evoke activity in vivo, we investigated synaptic plasticity at the glutamatergic Drosophila neuromuscular junction. Remarkably, correlated pre- and postsynaptic stimulation increased postsynaptic sensitivity by promoting synapse-
specific recruitment of GluR-IIA-type glutamate receptor subunits into postsynaptic receptor fields. Conversely, GluR-IIA was rapidly removed from synapses whose activity failed to evoke substantial postsynaptic depolarization. Uniting these results with developmental GluR-IIA dynamics provides a comprehensive physiological concept of how Hebbian plasticity guides synaptic maturation and sparse transmitter release controls the stabilization of the molecular composition of individual synapses.
Synaptic plasticity determines the development of functional neural circuits. It is widely accepted as the mechanism behind learning and memory. Among different forms of synaptic plasticity, Hebbian plasticity describes an activity-induced change in synaptic strength, caused by correlated pre- and postsynaptic activity. Additionally, Hebbian plasticity is characterised by input specificity, which means it takes place only at synapses, which participate in activity. Because of its correlative nature, Hebbian plasticity suggests itself as a mechanism behind associative learning.
Although it is commonly assumed that synaptic plasticity is closely linked to synaptic activity during development, the mechanistic understanding of this coupling is far from complete.
In the present study channelrhodopsin-2 was used to evoke activity in vivo, at the glutamatergic Drosophila neuromuscular junction. Remarkably, correlated pre- and postsynaptic stimulation led to increased incorporation of GluR-IIA-type glutamate receptors into postsynaptic receptor fields, thus boosting postsynaptic sensitivity. This phenomenon is input-specific.
Conversely, GluR-IIA was rapidly removed from synapses at which neurotransmitter release failed to evoke substantial postsynaptic depolarisation. This mechanism might be responsible to tame uncontrolled receptor field growth. Combining these results with developmental GluR-IIA dynamics leads to a comprehensive physiological concept, where Hebbian plasticity guides growth of postsynaptic receptor fields and sparse transmitter release stabilises receptor fields by preventing overgrowth.
Additionally, a novel mechanism of retrograde signaling was discovered, where direct postsynaptic channelrhodopsin-2 based stimulation, without involvement of presynaptic neurotransmitter release, leads to presynaptic depression. This phenomenon is reminiscent of a known retrograde homeostatic mechanism, of inverted polarity, where neurotransmitter release is upregulated, upon reduction of postsynaptic sensitivity.
Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten Mäusen
(2013)
Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung für das vaskuläre System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht hauptsächlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-ähnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges für die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskulären Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) führt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. Überraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterführende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie nähergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, während sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungeklärt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivität der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollständigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivität: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die Stärke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren können. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis für cGMP unabhängige Effekte nutzen sollte.
Ultrastructural analysis of wild-type and RIM1α knockout active zones in a large cortical synapse
(2022)
Rab3A-interacting molecule (RIM) is crucial for fast Ca\(^{2+}\)-triggered synaptic vesicle (SV) release in presynaptic active zones (AZs). We investigated hippocampal giant mossy fiber bouton (MFB) AZ architecture in 3D using electron tomography of rapid cryo-immobilized acute brain slices in RIM1α\(^{−/−}\) and wild-type mice. In RIM1α\(^{−/−}\), AZs are larger with increased synaptic cleft widths and a 3-fold reduced number of tightly docked SVs (0–2 nm). The distance of tightly docked SVs to the AZ center is increased from 110 to 195 nm, and the width of their electron-dense material between outer SV membrane and AZ membrane is reduced. Furthermore, the SV pool in RIM1α\(^{−/−}\) is more heterogeneous. Thus, RIM1α, besides its role in tight SV docking, is crucial for synaptic architecture and vesicle pool organization in MFBs.
In Nervensystemen bedürfen Informationsweitergabe und Gedächtnisformation eines präzisen Zusammenspiels von Synapsen in Zeit und Raum. Synaptische Transmission basiert strukturell auf mesoskopischen cytosolischen Kompartimenten an der präsynaptischen Membran, sogenannten Aktiven Zonen (AZ). Ihre Cytomatrix, bestehend aus zentralen Gerüstproteinen wie Rab3 interacting molecule (RIM), ermöglicht eine schnelle Freisetzung synaptischer Vesikel. Die Defizienz der lokal häufigsten Isoform RIM1α resultiert an einer komplexen zentralen Säugersynapse, die des hippocampalen Moosfaserboutons (MFB) zu im Cornu ammonis (CA)3 befindlichen Pyramidalzellen, in einer dezimierten Langzeitplastizität. Auf Verhaltensebene zeigen diese Mäuse eine reduzierte Lernfähigkeit.
Die vorliegende Dissertation widmet sich grundlegend der bisher unbekannten dreidimensionalen (3D) AZ-Ultrastruktur des MFB in akuten Hippocampusschnitten der adulten Wildtyp- und RIM1α-Knock-Out-Maus (RIM1α\(^{-/-}\)). In einer methodischen Entwicklungsphase wurde ein neuartiges, anspruchsvolles Protokoll der nahezu artefaktfreien (near to native) Synapsenpräparation am MFB mittels Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution sowie der 3D-Modellierung mittels Elektronentomographie etabliert. In einer zweiten Experimentier- und Analysephase ermöglichte die hochwertige synaptische Gewebeerhaltung in beiden Genotypen eine standardisierte, auf Programmierskripten basierte Quantifizierung der AZ-Ultrastruktur bis auf die Ebene eines individuell gedockten synaptischen Vesikels.
Dieser Dissertation gelingt der Nachweis, dass eine Defizienz von RIM1α zu einer multidimensionalen ultrastrukturellen Veränderung der AZ und ihres Vesikelpools am MFB führt. Neben einer Reduktion, Dezentralisierung und strukturellen Veränderung (eng) gedockter Vesikel – der ultrastrukturellen Messgrößen von unmittelbar freisetzungsfähigen Vesikeln – verdichtet sich der distaler lokalisierte Vesikelpool auf zugleich größeren, heterogenen AZ-Flächen mit erweitertem synaptischem Spalt. Vorliegende Untersuchungen tragen zum Verständnisgewinn über eine zentrale Rolle von RIM1α für das Docking und die Organisation von Vesikeln der AZ im MFB bei. Darüber hinaus stellen die präzisen ultrastrukturellen Analysen eine morphologische Grundlage für weiterführende Studien mit Hilfe modernster Techniken dar, beispielsweise über die Auswirkungen der geänderten RIM1α\(^{-/-}\) AZ-Ultrastruktur auf die präsynaptische Plastizität sowie in Korrelation zum Gedächtnis und Lernen der Tiere.
The afferent function (excitability) and efferent function (release of neuropeptides) of primary afferent nerve fibres is based on Ca2+-influx. Aim of the present study was to examine the presence of L-and N-type Ca2+-channels at sensory nerve fibres in the mouse knee joint capsule. Specific fluorescent labelled channel blocker and antisera against these channel subtypes were combined with an immunhistochemical staining for calcitonin gene-related peptide (CGRP), a neuropeptide that is wildly distributed in primary afferents. There was nearly complete colocalisation of calcitonin gene-related peptide immunoreactivity and the binding of conotoxin GVIA or BODIPY- verapamil demonstrating the presence of N-type and L-type Ca2+-channels, respectively. These data were further confirmed by identical results obtained after an immunohistochemical demonstration of the two channel subtypes at the peptidergic nerve fibres.
Die genauen Mechanismen der frühen Atheroskleroseentstehung sind Thema intensiver Forschungsarbeit. Hierbei hat sich in den letzten Jahren eine zunehmend wichtige Rolle für Thrombozyten herauskristallisiert. Sie spielen nicht nur in der Hämostase, sondern auch bei immunologischen und entzündlichen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Aktivierte Blutplättchen interagieren auf vielfältige Weise mit unterschiedlichen Zellen ihrer Umgebung – Endothelzellen, glatten Muskelzellen oder Leukozyten – wodurch es auf beiden Seiten zur Freisetzung von Botenstoffen und nachfolgend zur Aktivierung diverser Signalwege kommt. Auf der Thrombozytenoberfläche finden sich u.a. Rezeptoren für das Chemokin Fractalkin (CX3CL1). Dieses wurde bereits mit Thrombozytenaktivierung und Leukozytenadhäsion am Endothel in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der thrombozytäre ADP-Rezeptor P2Y12 und der Rezeptor für Fractalkin, CX3CR1, eine ähnliche intrazelluläre G-Protein-Kopplung und Signalkaskade aufweisen, die in der Aktivierung der PI3K mündet. Der Effekt ist unabhängig von einer ADP-Zugabe und wird über G vermittelt, so dass hierüber eine Blockung des P2Y12-Rezeptors durch z.B. Clopidogrel umgangen werden könnte. Des Weiteren ist bekannt, dass Fractalkin die Expression des Glykoproteins mfg-e8 beeinflusst. Inwiefern mfg-e8 einen Einfluss auf Thrombozyten hat, ist bislang nur unzureichend erforscht. In der vorliegenden Arbeit konnte eine proaktivierende Wirkung von mfg-e8 auf Thrombozyten nachgewiesen werden: Sowohl im Western blot (Aktivierung der PI3K) wie auch durchflusszytometrisch (Aktivierung des GPIIb/IIIa). Unter arteriellen Flussbedingungen schwächte mfg-e8 die Bindung von Thrombozyten an Fibrinogen-beschichtete Oberflächen ab. Welche Rezeptoren an dieser Interaktion beteiligt sind, ist derzeit nicht geklärt. Sowohl mfg-e8 als auch Fractalkin stellen interessante, thrombozytenaktivierenden Substanzen dar, deren Einfluss aufeinander und auf das Gefäßsystem weiterführender Untersuchung bedarf.
Das Mineralokortikoid Aldosteron ist ein wichtiger Regulator der Salz- und Wasserhomöostase und damit auch des Blutdrucks. Seine physiologische Wirkung entfaltet es über den Mineralokortikoidrezeptor (MR), indem es zu einer Homodimerisierung bzw. Heterodimerisierung mit dem Glukokortikoidrezeptor führt. Zudem sind die pathophysiologischen Wirkungen des Aldosterons beispielsweise auf das Herz-Kreislauf-System in den Focus gerückt, welche zumindest teilweise auch vom MR abhängig sind. Zur weiteren Charakterisierung dieser Signalwege sollen Interaktionen des MR mit möglichen Zielproteinen untersucht werden. Biolumineszenz Resonanz Energietransfer (BRET) ist eine Methode zur Untersuchung von Proteininteraktionen. Um ein BRET-System für den MR zu erstellen, wurde der MR an eine Renilla Luciferase (Rluc) einerseits und das enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) andererseits gekoppelt. Beide Fusionsproteine wurden auf ihre Funktionalität und Interaktion hin überprüft. Befinden sich die Fusionsproteine in räumlicher Nähe, regt das von der Luciferase emittierte Licht das fluoreszierende Protein an. Das aus Fluoreszenz und Lumineszenz berechnete BRET-Signal steigt und weist damit auf eine Proteininteraktion hin. Ansätze ohne fluoreszierenden Akzeptor korrigieren unspezifische Signaländerungen. Wir untersuchten den Effekt von Aldosteron und dem Aldosteronantagonisten Spironolacton sowie von Geldanamycin, das eine Dissoziation des MR von den Hitzeschockproteinen im Zytoplasma bewirkt. Aldosteron führte zu einer Steigerung des BRET-Signals, was die bereits bekannte Interaktion der Fusionsrezeptoren auch im BRET-System bestätigt. Geldanamycin bewirkte ebenfalls eine Signalsteigerung. Die gleichzeitige Gabe der beiden Substanzen sowie die Gabe von Spironolacton bewirkte keine Veränderung des BRET-Signals. Als Negativkontrolle verwendeten wir ein System mit an EYFP gekoppeltem MR und ungekoppelter Luciferase, also ohne Interaktionspartner für den EYFP-MR. Keine der oben genannten Substanzen führte hier zu einer Änderung des BRET-Signals. Das BRET-System kann damit die Grundlage für die Untersuchung der Interaktionen des MR mit weiteren Zielproteinen darstellen.
Spatial relationships between Cav channels and release sensors at active zones (AZs) are a major determinant of synaptic fidelity. They are regulated developmentally, but the underlying molecular mechanisms are largely unclear. Here, we show that Munc13-3 regulates the density of Cav2.1 and Cav2.2 channels, alters the localization of Cav2.1, and is required for the development of tight, nanodomain coupling at parallel-fiber AZs. We combined EGTA application and Ca2+-channel pharmacology in electrophysiological and two-photon Ca2+ imaging experiments with quantitative freeze-fracture immunoelectron microscopy and mathematical modeling. We found that a normally occurring developmental shift from release being dominated by Ca2+ influx through Cav2.1 and Cav2.2 channels with domain overlap and loose coupling (microdomains) to a nanodomain Cav2.1 to sensor coupling is impaired in Munc13-3-deficient synapses. Thus, at AZs lacking Munc13-3, release remained triggered by Cav2.1 and Cav2.2 microdomains, suggesting a critical role of Munc13-3 in the formation of release sites with calcium channel nanodomains.
In dieser Arbeit wurde die Wirkung der ungesättigten Fettsäure Arachidonsäure, des Endocannabinoids Anandamid und des synthetischen Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN55,212-2 auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 untersucht. Dazu wurden an Xenopus Oozyten, denen die entsprechende Kanal-RNA injiziert wurde, in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme elektrophysiologische Messungen durchgeführt. Zunächst wurden für alle drei Substanzen Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt. Diese führten zu folgenden Ergebnissen: • TASK-1 wird durch WIN55,212-2 um bis zu ca. 81% gehemmt. Die IC50 beträgt 0,83 µM. Anandamid besitzt eine IC50 von 1,92 µM und hemmt den Strom um bis zu ca. 71%. Bei WIN55,212-2 bzw. bei Anandamid liegt mit einem Hill-Koeffizienten (nH) von 1,65 bzw. von 1,42 positive Kooperativität vor. Arachidonsäure hingegen inhibiert den Strom nur um bis zu ca. 63%. Die IC50 beträgt 11,3 µM. Der Hill-Koeffizient von 0,9 ergibt negative Kooperativität. • TASK-3 wird durch alle drei Substanzen deutlich weniger inhibiert. Die maximale Inhibition durch WIN55,212-2 [10µM] beträgt 32,4% (± 9,7). Fünf µM Anandamid bzw. 80 µM Arachidonsäure verursachen eine Hemmung um 32,1% (± 5,4) bzw. um 20,3% (± 5,5). Bei beiden Kanalproteinen wurde außerdem untersucht, welche Bedeutung den Aminosäuren in Position 243-248, die bei TASK-1 und TASK-3 mit Ausnahme einer Aminosäure übereinstimmen, bei der Wirkung von Cannabinoiden zukommt. Dazu wurden Mutationsstudien im Bereich des C-Terminus von TASK-1 und TASK-3 durchgeführt. • Es wurden die sechs Aminosäuren in Position 243-248 aus TASK-1 bzw. TASK-3 entfernt (TASK-1 [243-248] bzw. TASK-3 [243-248]). Die inhibitorische Wirkung von WIN55,212-, Anandamid und Arachidonsäure war bei TASK-1 [243-248] deutlich vermindert, während es bei TASK-3 [243-248] zu unterschiedlichen Effekten kam. • Der gesamte C-Terminus des TASK-1 wurde entfernt, mit Ausnahme der sechs Aminosäuren in Position 243-248. Außerdem wurden die endständigen Aminosäuren RSSV an das Restprotein angefügt, da diese für einen gut funktionierenden Transport in die Membran notwendig sind (TASK-1 [249-390RSSV]. Die Wirkungen von WIN55,212-2, Anandamid und Arachidonsäure entsprachen bei dieser Mutante denen, die beim TASK-1 [Wildtyp] beobachtet wurden. • Durch Punktmutation wurde beim TASK-3 Leucin an Position 247 durch Methionin ersetzt (TASK-3 [L247M]. Diese Mutante besitzt dadurch in Position 243-248 das gleiche Sequenzmotiv wie der TASK-1. Im Vergleich zum TASK-3 [Wildtyp] waren die Wirkungen der Cannabinoide bei dieser Mutante jedoch unverändert. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die untersuchten Cannabinoide eine rezeptorunabhängige, spezifische und reversible inhibitorische Wirkung auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 haben. Die Aminosäuren in Position 243-248 sind für diese Wirkung der Cannabinoide von wesentlicher Bedeutung.
The study of animal development is one of the oldest disciplines in the field of biology and the collected data from countless investigations on numerous species have formed a general understanding of the animal life-cycle. Almost one century ago, one consequence of these intense investigations was the discovery of specific morphological changes that occur during the cleavage phase, a period that follows fertilization and egg activation at the very beginning of animal embryogenesis. These observations resulted into the formulation of the concept of a midblastula transition (MBT). So far, the mechanism of the nucleo-cytoplasmic ratio model is the only one that explains MBT regulation in a satisfying way. It suggests that the MBT is controlled by several maternal repressive factors in the egg, which are titrated out by every cell division until they lose their repressing potential. Although this regulatory mechanism was proven for several species and in different approaches, it is still only a rudimentary model for MBT control and leaves numerous questions unanswered. On this conceptual background, this thesis has shown that embryos from the medaka fish (Oryzias latipes) lose their cell cycle synchrony already after the fourth or fifth round of cell divisions, and replace it by a metasynchronous divisions pattern, in which cell division occurs in clear waves beginning in the embryo's center. The reason for this change in division mode is still unknown, although several hypotheses were put forward, most notable a difference in yolk-access between cells. However, this theory was weakened by division waves that progressed from one embryonic pole to the opposing one, which were occasionally observed in deformed embryos, leaving the mechanism for this phenomenon furthermore unclear. Those deformed embryos were most likely the result of asymmetric cell divisions at very early stages, a phenomenon which occurred in a significant percentage of medaka embryos and which directly influenced the equal distribution of cytoplasmic material. It could not beuncovered what kind of effects this unequal distribution of cytoplasm exerted on the progression of embryonic development, but it can be argued that relevant differences in cell volumes could result in cell clusters that will enter MBT at different time points. Comparable observations were already made in other species and it was hypothesized that they were the direct results of early unequal cell cleavages. Finally, it was demonstrated that zygotic transcription in medaka embryos is activated prior to the hitherto assumed time of the first transcriptional initiation. Moreover, indications were found that strongly speak for a transcriptional activation that occurs in two steps; a first step at the 16-cell stage when first cells were identified positive for RNAPII phosphorylation, and a second step at the 64-cell stage, when the number of p-RNAPII positive cells significantly increased. A stepwise activation of zygotic transcription was already observed in other species, but only for the overall increasing amount of mRNAs and irrespective of the actual number of transcriptionally active cells within the embryos. .. Overall, these data confirm and expand the basic knowledge of pre-MBT embryos and about the MBT itself. Furthermore, they also suggest that many early processes in pre-MBT embryos are only rudimentarily understood or still totally unknown.
Nitric oxide (NO) binds to soluble guanylyl cyclase (sGC), activates it in a reduced oxidized heme iron state, and generates cyclic Guanosine Monophosphate (cGMP), which results in vasodilatation and inhibition of osteoclast activity. In inflammation, sGC is oxidized and becomes insensitive to NO. NO- and heme-independent activation of sGC requires protein expression of the α\(_1\)- and β\(_1\)-subunits. Inflammation of the periodontium induces the resorption of cementum by cementoclasts and the resorption of the alveolar bone by osteoclasts, which can lead to tooth loss. As the presence of sGC in cementoclasts is unknown, we investigated the α\(_1\)- and β\(_1\)-subunits of sGC in cementoclasts of healthy and inflamed human periodontium using double immunostaining for CD68 and cathepsin K and compared the findings with those of osteoclasts from the same sections. In comparison to cementoclasts in the healthy periodontium, cementoclasts under inflammatory conditions showed a decreased staining intensity for both α\(_1\)- and β\(_1\)-subunits of sGC, indicating reduced protein expression of these subunits. Therefore, pharmacological activation of sGC in inflamed periodontal tissues in an NO- and heme-independent manner could be considered as a new treatment strategy to inhibit cementum resorption.
PDZ (PSD-95/Disc large/Zonula occludens-1) protein interaction domains bind to cytoplasmic protein C-termini of transmembrane proteins. In order to identify new interaction partners of the voltage-gated L-type \(Ca^{2+}\) channel Cav1.2 and the plasma membrane \(Ca^{2+}\) ATPase 4b (PMCA4b), we used PDZ domain arrays probing for 124 PDZ domains. We confirmed this byGST pulldowns and immunoprecipitations. In PDZ arrays, strongest interactionswith \(Ca_v1.2\) and PMCA4b were found for the PDZ domains of SAP-102, MAST-205, MAGI-1, MAGI-2, MAGI-3, and ZO-1. We observed binding of the \(Ca_v1.2\) C-terminus to PDZ domains of NHERF1/2, Mint-2, and CASK. PMCA4b was observed to interact with Mint-2 and its known interactions with Chapsyn-110 and CASK were confirmed. Furthermore, we validated interaction of \(Ca_v1.2\) and PMCA4b with NHERF1/2, CASK,MAST-205 and MAGI-3 viaimmunoprecipitation. We also verified the interaction of \(Ca_v1.2\) and nNOS and hypothesized that nNOS overexpression might reduce \(Ca^{2+}\) influx through \(Ca_v1.2\). To address this, we measured \(Ca^{2+}\) currents in HEK 293 cells co-expressing \(Ca_v1.2\) and nNOS and observed reduced voltage-dependent \(Ca_v1.2\) activation. Taken together, we conclude that \(Ca_v1.2\) and PMCA4b bind promiscuously to various PDZ domains, and that our data provides the basis for further investigation of the physiological consequences of these interactions.
In dorsal root ganglia (DRG) neurons TRESK channels constitute a major current component of the standing outward current IK\(_{SO}\). A prominent physiological role of TRESK has been attributed to pain sensation. During inflammation mediators of pain e.g. lysophosphatidic acid (LPA) are released and modulate nociception. We demonstrate co-expression of TRESK and LPA receptors in DRG neurons. Heterologous expression of TRESK and LPA receptors in Xenopus oocytes revealed augmentation of basal K\(^{+}\) currents upon LPA application. In DRG neurons nociception can result from TRPV\(_{1}\) activation by capsaicin or LPA. Upon co-expression in Xenopus oocytes LPA simultaneously increased both depolarising TRPV\(_{1}\) and hyperpolarising TRESK currents. Patch-clamp recordings in cultured DRG neurons from TRESK[wt] mice displayed increased IK\(_{SO}\) after application of LPA whereas under these conditions IK\(_{SO}\) in neurons from TRESK[ko] mice remained unaltered. Under current-clamp conditions LPA application differentially modulated excitability in these genotypes upon depolarising pulses. Spike frequency was attenuated in TRESK[wt] neurons and, in contrast, augmented in TRESK[ko] neurons. Accordingly, excitation of nociceptive neurons by LPA is balanced by co-activation of TRESK channels. Hence excitation of sensory neurons is strongly controlled by the activity of TRESK channels, which therefore are good candidates for the treatment of pain disorders.
Sowohl der ANP und BNP bindende Guanylylzyklase-A-Rezeptor, als auch der CNP bindende Guanylylzyklase-B-Rezeptor auf den die Endothelzellen ummantelnden Perizyten sind für eine normale postnatale Gefäßentwicklung in der Netzhaut der Maus von entscheidender Bedeutung. Eine perizytenspezifische Deletion der Guanylylzyklase-Rezeptoren führt in Mäusen zu einer signifikanten Verminderung der postnatalen Ausdehnung sowie der Dichte des Gefäßnetzes. Dies ist nicht auf eine Verminderung der Bedeckung des Endothels durch Perizyten zurückzuführen. Weiterhin geht diese Rezeptordeletion mit einer geschlechterunabhängigen Erhöhung des systolischen Blutdrucks einher. Die intrazelluläre Weiterleitung, des durch die natriuretischen Peptide ausgelösten cGMP-Signals erfolgt über die cGMP-abhängige Proteinkinase Typ I (cGKI).
In diesem Projektteil charakterisierten wir mittels vergleichenden Analysen an Mäusen mit konditioneller, herzspezifischer Deletion der GC-A (CM GC-A KO; (Holtwick et al., 2003; Kilic et al., 2005 und 2007)) und Kontrolltieren die zellulären Mechanismen, welche bei Dysfunktion des ANP/GC-A-Systems die Entwicklung von Herzhypertrophie begünstigen. Wir untersuchten, ob/wie ANP die kardialen Effekte von -adrenerger versus Ang II/AT1 (Gs versus Gq-mediierter) Stimulation beeinflusst. Zunächst kombinierten wir an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten elektrophysiologische Messungen der L-Typ Ca2+ Ströme (LTCS, mittels voltage-clamp Messungen in Kooperation mit Herrn Dr. M. Kruse und Herrn Prof. O. Pongs am Zentrum für Molekulare Neurobiologie, Universität Hamburg), fluorometrische Messungen der intrazellulären Calcium-Transienten (mittels Indo-1 AM) und Messungen der Kontraktilität (Zellverkürzung, mittels edge detection). Diese ex vivo Untersuchungen zeigten, dass Isoproterenol (ISO) und Ang II die LTCS, [Ca2+]i und Kontraktilität isolierter adulter Myozyten stimulieren. Interessanterweise hemmt ANP/GC-A die Effekte von Ang II, nicht aber die Effekte von ISO. Um der Bedeutung dieser Interaktion zwischen ANP und Ang II für die Entwicklung einer pathologischen Herzhypertrophie ...
TRPC4α and TRPC4β Similarly Affect Neonatal Cardiomyocyte Survival during Chronic GPCR Stimulation
(2016)
The Transient Receptor Potential Channel Subunit 4 (TRPC4) has been considered as a crucial Ca\(^{2+}\) component in cardiomyocytes promoting structural and functional remodeling in the course of pathological cardiac hypertrophy. TRPC4 assembles as homo or hetero-tetramer in the plasma membrane, allowing a non-selective Na\(^{+}\) and Ca\(^{2+}\) influx. Gαq protein-coupled receptor (GPCR) stimulation is known to increase TRPC4 channel activity and a TRPC4-mediated Ca\(^{2+}\) influx which has been regarded as ideal Ca\(^{2+}\) source for calcineurin and subsequent nuclear factor of activated T-cells (NFAT) activation. Functional properties of TRPC4 are also based on the expression of the TRPC4 splice variants TRPC4α and TRPC4β. Aim of the present study was to analyze cytosolic Ca\(^{2+}\) signals, signaling, hypertrophy and vitality of cardiomyocytes in dependence on the expression level of either TRPC4α or TRPC4β. The analysis of Ca\(^{2+}\) transients in neonatal rat cardiomyocytes (NRCs) showed that TRPC4α and TRPC4β affected Ca\(^{2+}\) cycling in beating cardiomyocytes with both splice variants inducing an elevation of the Ca\(^{2+}\) transient amplitude at baseline and TRPC4β increasing the Ca\(^{2+}\) peak during angiotensin II (Ang II) stimulation. NRCs infected with TRPC4β (Ad-C4β) also responded with a sustained Ca\(^{2+}\) influx when treated with Ang II under non-pacing conditions. Consistent with the Ca\(^{2+}\) data, NRCs infected with TRPC4α (Ad-C4α) showed an elevated calcineurin/NFAT activity and a baseline hypertrophic phenotype but did not further develop hypertrophy during chronic Ang II/phenylephrine stimulation. Down-regulation of endogenous TRPC4α reversed these effects, resulting in less hypertrophy of NRCs at baseline but a markedly increased hypertrophic enlargement after chronic agonist stimulation. Ad-C4β NRCs did not exhibit baseline calcineurin/NFAT activity or hypertrophy but responded with an increased calcineurin/NFAT activity after GPCR stimulation. However, this effect was not translated into an increased propensity towards hypertrophy but rather less hypertrophy during GPCR stimulation. Further analyses revealed that, although hypertrophy was preserved in Ad-C4α NRCs and even attenuated in Ad-C4β NRCs, cardiomyocytes had an increased apoptosis rate and thus were less viable after chronic GPCR stimulation. These findings suggest that TRPC4α and TRPC4β differentially affect Ca\(^{2+}\) signals, calcineurin/NFAT signaling and hypertrophy but similarly impair cardiomyocyte viability during GPCR stimulation.
ROMK ist ein einwärts-gleichrichtender Kaliumkanal, der hauptsächlich in der Niere exprimiert wird. Er wird dabei vor allem in der apikalen Membran des aufsteigenden Astes der Henleschen Schleife, dem distalen Tubulus und dem Sammelrohr exprimiert. Die Hauptaufgaben von ROMK bestehen in der Rezirkulation von Kalium im dicken aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife und der Kaliumsekretion im kortikalen Sammelrohr. ROMK wurde kloniert und in Oozyten exprimiert. Die Expression sowie Struktur- und Funktionsstudien haben viele Informationen über die Biophysik und die Regulation dieses Kanals gebracht. Dennoch ist bisher wenig über die für den Transport zur apikalen Membran von Epithelzellen verantwortlichen Mechanismen des Kanals bekannt. Der C- Terminus von ROMK ist aufgrund einer sehr hohen Homologie zu einem PDZ-Motiv ein möglicher Teilnehmer an Protein- Protein Interaktionen. In einem Hefe-zwei-Hybrid Screen wurden verschiedene mögliche Interaktionspartner gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die Interaktion zwischen einigen im Hefe-System gefundenen Proteinen und dem Kanalprotein zu identifizieren, verifizieren und charakterisieren. In dem in vitro HIS- Pulldown Assay konnten die im Hefe-zwei-Hybrid System gefundenen Interaktionen zwischen ROMK und HEF1, Antiquitin1 sowie Calponin2 bestätigt werden. Ebenso war es möglich, durch Kolokalisationsstudien mittels indirekter Immunfluoreszenz weitere Anhaltspunkte für eine mögliche Interaktion von ROMK und Antiquitin1, Calponin2, Shank und ArgBP2 zu liefern. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die gefundenen Interaktionspartner zum einen für den Einbau und die Stabilität von ROMK in der Membran zuständig sein und zum anderen durch Verbindung zu möglichen Signalkomplexen, z.B. durch ArgBP2, ein Rolle in der Aktivitätssteuerung von ROMK spielen könnten.
Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist der wichtigste Rezeptor für das freigesetzte Signalmolekül NO und katalysiert die Bildung des second Messenger cGMP. Die NO/cGMP Signalkaskade ist im kardiovaskulären System essentiell für die Hemmung der Thrombozytenaggregation und des Tonus der glatten Gefäßmuskulatur und trägt damit zur Regulation des Blutdrucks bei. In der Arbeitsgruppe wurden Mauslinien generiert, bei denen die NO-GC ubiquitär (GCKO) oder spezifisch in glatten Muskelzellen (SM-GCKO) ausgeschaltet ist. Beide Mausstämme zeigen eine arterielle Hypertonie mit einem Anstieg des systolischen Blutdrucks um 30 mmHg im Vergleich zu den jeweiligen Kontrolltieren.
Neben cGMP ist auch cAMP als weiterer second messenger in einer Reihe von Regulationsprozessen im kardiovaskulären System involviert. Die Intensität und Dauer eines cAMP-Signals wird zum einen durch seine Synthese durch die Adenylyl-Cyclasen, zum anderen durch seine Hydrolyse durch die Phosphodiesterasen (PDE) bestimmt. Dabei spielt die PDE3 als cGMP-inhibierte, cAMP-abbauende PDE eine
wichtige Rolle im sogenannten cGMP/cAMP-Crosstalk. Ein wichtiges Instrument zur Untersuchung PDE3-abhängiger Prozesse ist der spezifische Hemmstoff Milrinon.
Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PDE3-Expression abhängig ist von der Expression des cGMP-produzierenden Enzyms NO-GC: So zeigte sich in
Thrombozyten wie auch in glatten Gefäßmuskelzellen nach Deletion der NO-GC im Vergleich zu den Kontrolltieren eine Reduktion der PDE3 um die Hälfte. Diese Reduktion der PDE3-Expression war sowohl in den glatten Muskelzellen von GCKO wie auch von SM-GCKO-Mäusen zu finden. Weiterhin konnte dargestellt werden, dass
die Down-Regulation der PDE3 in glatter Gefäßmuskulatur in SM-GCKO-Mäusen parallel zur Reduktion der NO-GC und nicht parallel zum daraus resultierenden Anstieg
des Blutdrucks verläuft. Die Reduktion der PDE3-Expression ging mit einer Verminderung der Aktivität in den Thrombozyten und glatten Muskelzellen des GCKOs
einher. In Herzmuskelgewebe dagegen änderten sich Expression und Aktivität der PDE3 nicht. Der spezifische PDE3-Hemmstoff Milrinon führte zu einem weiteren
Anstieg des systolischen Blutdrucks in den KO-Linien, nicht aber in Kontrolltieren.
Zusammenfassend spielt die PDE3 eine wichtige Rolle im cGMP/cAMP-Crosstalk sowohl in Thrombozyten als auch in glatten Gefäßmuskelzellen von Mäusen.
Synaptische Plastizität wird als Grundlage für Lern- und Gedächtnisprozesse in unserem Gehirn angesehen. Aktive Zonen (AZ) und ihre spezifischen Proteine modulieren diesen Prozess und bahnen essentielle Vorgänge der synaptischen Transmission. In dieser Arbeit wurden drei zentrale Proteine Aktiver Zonen - Bruchpilot, RIM (Rab3 interacting molecule) und Fife - untersucht und ihre Rolle bei konditionierten Lernprozessen in Drosophila melanogaster Larven geprüft. Hierzu wurde das etablierte Paradigma des larvalen appetitiven olfaktorischen Lernens genutzt, bei dem eine Gruppe von Larven lernt, einen Duft mit einem gustatorischen Verstärker zu koppeln. Durch die vielfältigen genetischen Manipulationsmöglichkeiten des Modellorganismus war es möglich, die Funktion der Proteine bei assoziativen Lernvorgängen selektiv zu betrachten.
Bruchpilot wird für den funktionellen Aufbau Aktiver Zonen in Drosophila benötigt und ist wichtig für die Akkumulation von Calcium-Kanälen in der Nähe von AZ. Durch gentechnische Veränderungen dieses Proteins ließ sich jedoch keine Beeinträchtigung im olfaktorischen Lernverhalten von Drosophila Larven beobachten. RIM fungiert durch seine Interaktionsdomänen als Bindeglied zwischen verschiedensten Effektoren und hat Einfluss auf synaptische Plastizität. Es wurde gezeigt, dass eine Punktmutation in der C2A-Domäne von RIM beim Menschen gleichzeitig zur Retinadegeneration und zu einem gesteigert verbalen IQ (Intelligenzquotient) führt. Eine durch die hohe Homologie vergleichbare Mutation im Drosophila-Genom resultierte nicht in einem veränderten Phänotyp im olfaktorischen Lernen. Fife ist ein Protein, das für eine funktionsfähige Architektur von AZ und damit u.a. für den reibungslosen Vesikelverkehr zuständig ist. Es zeigte sich, dass dieses Protein auch synaptische Plastizität und Lernvorgänge beeinflusst.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind ein Beitrag, um die Zusammenhänge der synaptischen Plastizität und die Funktion Aktiver Zonen Proteine besser begreifen zu können. Hervorzuheben dabei ist, dass die Bruchpilot- und RIM-Mutanten-Larven keinen veränderten Phänotyp, bzw. bei Fife nur teilweise einen eingeschränkten Phänotyp im olfaktorischen larvalen Lernen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen zeigten. Gleichwohl man früher schon signifikante strukturelle Veränderungen an Aktiven Zonen dieser Mutanten an der neuromuskulären Endplatte und auch Effekte auf das Verhalten in adulten Drosophila gefunden hat. Es wird entscheidend sein, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion Aktiver Zonen Proteine weiter zu konkretisieren.
The transcription factor NRF2 is the major mediator of oxidative stress responses and is closely connected to therapy resistance in tumors harboring activating mutations in the NRF2 pathway. In melanoma, such mutations are rare, and it is unclear to what extent melanomas rely on NRF2. Here we show that NRF2 suppresses the activity of the melanocyte lineage marker MITF in melanoma, thereby reducing the expression of pigmentation markers. Intriguingly, we furthermore identified NRF2 as key regulator of immune-modulating genes, linking oxidative stress with the induction of cyclooxygenase 2 (COX2) in an ATF4-dependent manner. COX2 is critical for the secretion of prostaglandin E2 and was strongly induced by H\(_2\)O\(_2\) or TNFα only in presence of NRF2. Induction of MITF and depletion of COX2 and PGE2 were also observed in NRF2-deleted melanoma cells in vivo. Furthermore, genes corresponding to the innate immune response such as RSAD2 and IFIH1 were strongly elevated in absence of NRF2 and coincided with immune evasion parameters in human melanoma datasets. Even in vitro, NRF2 activation or prostaglandin E2 supplementation blunted the induction of the innate immune response in melanoma cells. Transcriptome analyses from lung adenocarcinomas indicate that the observed link between NRF2 and the innate immune response is not restricted to melanoma.
Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have revolutionized the generation of experimental disease models, but the development of protocols for the differentiation of functionally active neuronal subtypes with defined specification is still in its infancy. While dysfunction of the brain serotonin (5-HT) system has been implicated in the etiology of various neuropsychiatric disorders, investigation of functional human 5-HT specific neurons in vitro has been restricted by technical limitations. We describe an efficient generation of functionally active neurons from hiPSCs displaying 5-HT specification by modification of a previously reported protocol. Furthermore, 5-HT specific neurons were characterized using high-end fluorescence imaging including super-resolution microscopy in combination with electrophysiological techniques. Differentiated hiPSCs synthesize 5-HT, express specific markers, such as tryptophan hydroxylase 2 and 5-HT transporter, and exhibit an electrophysiological signature characteristic of serotonergic neurons, with spontaneous rhythmic activities, broad action potentials and large afterhyperpolarization potentials. 5-HT specific neurons form synapses reflected by the expression of pre- and postsynaptic proteins, such as Bassoon and Homer. The distribution pattern of Bassoon, a marker of the active zone along the soma and extensions of neurons, indicates functionality via volume transmission. Among the high percentage of 5-HT specific neurons (~ 42%), a subpopulation of CDH13 + cells presumably designates dorsal raphe neurons. hiPSC-derived 5-HT specific neuronal cell cultures reflect the heterogeneous nature of dorsal and median raphe nuclei and may facilitate examining the association of serotonergic neuron subpopulations with neuropsychiatric disorders.
Fibroblasts were isolated from a skin biopsy of a clinically diagnosed 51-year-old female attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) patient carrying a duplication of SLC2A3, a gene encoding neuronal glucose transporter-3 (GLUT3). Patient fibroblasts were infected with Sendai virus, a single-stranded RNA virus, to generate transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs). SLC2A3-D2-iPSCs showed expression of pluripotency-associated markers, were able to differentiate into cells of the three germ layers in vitro and had a normal female karyotype. This in vitro cellular model can be used to study the role of risk genes in the pathogenesis of ADHD, in a patient-specific manner.
Background
Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Neuroinflammation contributes to acute damage after TBI and modulates long-term evolution of degenerative and regenerative responses to injury. The aim of the present study was to evaluate the relationship of microglia activation to trauma severity, brain energy metabolism, and cellular reactions to injury in a mouse closed head injury model using combined in vivo PET imaging, ex vivo autoradiography, and immunohistochemistry.
Methods
A weight-drop closed head injury model was used to produce a mixed diffuse and focal TBI or a purely diffuse mild TBI (mTBI) in C57BL6 mice. Lesion severity was determined by evaluating histological damage and functional outcome using a standardized neuroscore (NSS), gliosis, and axonal injury by immunohistochemistry. Repeated intra-individual in vivo μPET imaging with the specific 18-kDa translocator protein (TSPO) radioligand [\(^{18}\)F]DPA-714 was performed on day 1, 7, and 16 and [\(^{18}\)F]FDG-μPET imaging for energy metabolism on days 2–5 after trauma using freshly synthesized radiotracers. Immediately after [\(^{18}\)F]DPA-714-μPET imaging on days 7 and 16, cellular identity of the [\(^{18}\)F]DPA-714 uptake was confirmed by exposing freshly cut cryosections to film autoradiography and successive immunostaining with antibodies against the microglia/macrophage marker IBA-1.
Results
Functional outcome correlated with focal brain lesions, gliosis, and axonal injury. [\(^{18}\)F]DPA-714-μPET showed increased radiotracer uptake in focal brain lesions on days 7 and 16 after TBI and correlated with reduced cerebral [\(^{18}\)F]FDG uptake on days 2–5, with functional outcome and number of IBA-1 positive cells on day 7. In autoradiography, [\(^{18}\)F]DPA-714 uptake co-localized with areas of IBA1-positive staining and correlated strongly with both NSS and the number of IBA1-positive cells, gliosis, and axonal injury. After mTBI, numbers of IBA-1 positive cells with microglial morphology increased in both brain hemispheres; however, uptake of [\(^{18}\)F]DPA-714 was not increased in autoradiography or in μPET imaging.
Conclusions
[\(^{18}\)F]DPA-714 uptake in μPET/autoradiography correlates with trauma severity, brain metabolic deficits, and microglia activation after closed head TBI.
Die Niere stellt das wichtigste Zielorgan für die Akkumulation von anorganischem Quecksilber dar. Versuche an Ratten ergaben, dass bereits wenige Stunden nach Injektion einer geringen Menge Quecksilberchlorid 50% dieser Dosis in den Nieren akkumuliert war. Durch verschiedene Untersuchungen wurden die proximale Tubuli (Pars convoluta et recta) als Ort der Quecksilber-Anreicherung identifiziert. Der Schwermetallchelator DMPS (2,3-Dimercapto-1-Propansulfonsäure) ist heutzutage das Mittel der Wahl für die Behandlung von Vergiftungen mit anorganischem Quecksilber. DMPS hat sich gegenüber dem früher verwendeten BAL aus mehreren Gründen als überlegen erwiesen: in klinischen Tests bezüglich der Quecksilberentgiftung zeigt DMPS die größere Wirksamkeit, kann oral angewendet werden und ist zudem weitaus weniger toxisch als sein Vorgänger BAL. Jedoch war der Wirkmechanismus von DMPS nicht genau bekannt. Allerdings existieren zahlreiche in-vivo- und in-vitro-Studien, die zeigen, dass das organische Anion DMPS ein Substrat des „klassischen Organische-Anionen-Transportsystems“ bzw. des 1997 klonierten, tertiär aktiven Anionenaustauschers OAT1 sein könnte. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine direkte Interaktion zwischen DMPS und OAT1 stattfindet und DMPS ein Substrat von OAT1 ist. Von entscheidendem Interesse war dabei die Frage, ob der Redoxzustand von DMPS (reduziert-monomer, oxidiert-dimer) einen Einfluß auf einen möglichen Transport durch OAT1 hat. Darüber hinaus sollte die Rolle von Albumin, welches unter physiologischen Bedingungen im Blutkreislauf des Menschen in hoher Konzentration vorhanden ist, bei diesem Vorgang geklärt werden. In einem zweiten Teil lag das Interesse auf den Mechanismen, die DMPS und v.a. den intrazellulär gebildeten Quecksilber-DMPS-Komplex (Hg-DMPS-Chelat) aus der Tubuluszelle sezernieren und damit aus dem Organismus eliminieren. Dabei sollte insbesondere die Rolle des apikal lokalisierten, passiven Transporters OAT-K2 („kidney-specific“ Organische-Anionen-Transporter 2) geklärt werden. Die Untersuchung der Transportvorgänge an hOAT1 (menschliches Ortholog von OAT1) und OAT-K2 wurden an Xenopus laevis Ooztyen, HeLa-Zellen sowie OK-Zellen durchgeführt Das organische Anion DMPS war sowohl in reduzierter als auch in oxidierter Form in der Lage, den Transport von PAH kompetitiv zu hemmen: Ki (reduziertes DMPS) = 22.4 mM bzw. Ki (oxidiertes DMPS) = 66.0 mM DMPS-Äquivalente. Bei Anwesenheit von 0.1mM Albumin erlosch die Hemmung des PAH-Transports durch reduziertes und oxidiertes DMPS vollständig. Albumin alleine hatte hingegen keinen Einfluß auf den PAH-Transport durch hOAT1. Die Transstimulations-Experimente an hOAT1-transfizierten HeLa-Zellen zeigten, dass reduziertes und oxidiertes DMPS den Efflux von PAH stimulieren konnten: innerhalb von drei Minuten wurden so 10 bzw. 8% des PAH-Zellgehaltes aktiv über hOAT1 aus der Zelle sezerniert. Das Hg-DMPS-Chelat hatte im Gegensatz zu den beiden Einzelkomponenten Quecksilber und DMPS keinen hemmenden Einfluß auf den PAH-Transport in Oozyten. Damit hat der Komplex auch keine Affinität zu hOAT1, womit der basolaterale Weg für die Elimination des gebundenen Quecksilbers aus der Zelle keine Rolle spielt. Untersuchungen an OAT-K2 konnten aufgrund eines zu niedrigen Expressionsniveaus des Transporters in Oozyten und MDCK-Zellen nicht durchgeführt werden. OK-Zellen, die OAT1 aufgrund ihres Ursprungs aus dem proximalen Tubulus des Opossums endogen exprimieren, waren in der Lage, reduziertes DMPS transzellulär zu sezernieren. Ein Teil dieses Transports konnte durch PAH inhibiert werden. Damit zeigte sich nicht nur, dass hOAT1 DMPS als Substrat für den Transport über die basolaterale Membran akzeptiert, sondern darüber hinaus auch, dass in der apikalen Membran der Tubuluszelle Transporter lokalisiert sind, die DMPS in das Tubuluslumen sezernieren können. Die vorliegenden Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass hOAT1 eine tragende Rolle im Wirkmechanismus des Quecksilberantidots DMPS spielt: hOAT1 ist entscheidend am Transport von DMPS an den Ort der Vergiftung, die proximale Tubuluszelle, beteiligt. Dabei spielt es keine Rolle, ob die reduzierte oder oxidierte Form am Transporter vorliegt, da beide nachweislich Substrate von hOAT1 sind. Von wesentlicher Bedeutung ist die lockere Bindung von DMPS an Albumin, die DMPS einerseits vor einer raschen glomerulären Filtration bewahrt, andererseits aber durch einfaches Abdiffundieren eine rasche Gleichgewichtseinstellung mit dem perivaskulären Intersitium der Niere und anschließenden Transport in die Tubuluszelle erlaubt. Das intrazellulär gebildete Hg-DMPS-Chelat hat im Gegensatz zu DMPS keine Affinität zu hOAT1, wodurch eine Rückkehr des mobilisierten Quecksilbers in den Körperkreislauf auf diesem Weg verhindert wird.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktion von ANP und Ang II im Bereich der blutdruckbestimmenden Widerstandsgefäße zu untersuchen. Ein besonderer Augenmerk wurde hierbei auch auf die Bedeutung von RGS2 gerichtet. Durch das Zusammenspiel der beiden funktionellen Antagonisten ANP und Ang II wird der Blutdruck reguliert. ANP und Ang II üben hierbei jeweils gegenteilige Effekte aus. Ang II hat vasokonstriktorische Effekte auf die Blutgefäße, vermindert die Natriurese und Diurese und erhöht den Sympathikustonus. ANP hingegen besitzt blutdruckmindernde Effekte, hervorgerufen durch Vasodilatation, gesteigerte Diurese, die Erhöhung der endothelialen Durchlässigkeit und der Hemmung des Sympathikustonus. Da nichts über die Interaktion dieser beiden Hormone in der Mikrozirkulation bekannt ist, wurden im Rahmen der Dissertation intravitalmikroskopische Studien der Mikrozirkulation des Musculus cremaster der Maus, in Anlehnung an der von Baez (1973) publizierten Methode, durchgeführt. Darüber hinaus wurden auch die Effekte von Ang II und ANP auf den Blutdruck durch invasive Blutdruckmessung untersucht. Der Durchmesser von präkapillären Arteriolen des M. cremaster wurde vor und während lokaler Superfusion von Ang II oder ANP gemessen. Ang II löste eine konzentrationsabhängige stabile Konstriktion aus. Bei der ausschließlichen Superfusion von ANP in verschiedenen Konzentrationen hingegen, zeigte sich kein Effekt auf den basalen Vasotonus. ANP war jedoch in der Lage, an Ang II vorkontrahierten Arteriolen, den konstriktorischen Effekt von Ang II aufzuheben und sogar darüber hinaus eine ausgeprägte Vasodilatation zu bewirken. Dieser Effekt konnte auch bei der invasiven Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen werden. Der durch Ang II ausgelöste Blutdruckanstieg wurde durch die zusätzliche Infusion von ANP gemindert. Ang II aktiviert die Kontraktion von glatten Gefäßmuskelzellen durch den Gαq-gekoppelten AT1-Rezeptor. RGS2 hingegen ist ein negativer Regulator von Gαq. Da von RGS2 bekannt ist, dass er von cGKI phosphoryliert und stimuliert wird (Osei-Owusu et al., 2007), stellte sich die Frage, ob ANP über RGS2 dem vasokonstriktiven Effekt von Ang II entgegenwirkt. Bei den Versuchen an RGS2-KO Mäusen zeigt sich hierbei, dass ANP nicht mehr in der Lage ist, den vasokonstriktiven Effekt von Ang II aufzuheben. Daraus ist nun der Schluss zu ziehen, dass RGS2 eine bedeutende Rolle für die Wechselwirkung zwischen ANP und Ang II in der Mikrozirkulation spielt und somit eine wichtige Aufgabe bei der Regulation des peripheren Widerstands und des Blutdrucks hat.
Stimulation of soluble guanylyl cyclase protects against obesity by recruiting brown adipose tissue
(2015)
Obesity is characterized by a positive energy balance and expansion of white adipose tissue (WAT). In contrast, brown adipose tissue (BAT) combusts energy to produce heat. Here we show that a small molecule stimulator (BAY 41-8543) of soluble guanylyl cyclase (sGC), which produces the second messenger cyclic GMP (cGMP), protects against diet-induced weight gain, induces weight loss in established obesity, and also improves the diabetic phenotype. Mechanistically, the haeme-dependent sGC stimulator BAY 41-8543 enhances lipid uptake into BAT and increases whole-body energy expenditure, whereas ablation of the haeme-containing \(\beta\)\(_{1}\)-subunit of sGC severely impairs BAT function. Notably, the sGC stimulator enhances differentiation of human brown adipocytes as well as induces 'browning' of primary white adipocytes. Taken together, our data suggest that sGC is a potential pharmacological target for the treatment of obesity and its comorbidities.
Die Migration neutrophiler Granulozyten aus dem Gefäßsystem in das umgebende Gewebe stellt einen zentralen Schritt bei der Entstehung von akuten Entzündungsherden dar. Es ist bislang vergleichsweise wenig über die Rolle von Ionenkanälen und Carriermolekülen wie dem Ca2+-empfindlichen K+-Kanal hIK1 oder den Na+/H+- und Cl-/HCO3 --Austauschern bei der Wanderung von Neutrophilen bekannt. Nach heutigem Wissen ist die Funktion dieser Transportmoleküle neben zytoskelettalen Umbauvorgängen aber unter anderem in metastasierenden Melanomzellen, Fibroblasten oder auch sogenannten MDCK-F-Zellen für die Migration wichtig. Große Übereinstimmungen bekannter Migrationsmechanismen zwischen diesen Zelltypen und Neutrophilen, wie auch erste Versuche an Granulozyten legen eine Kanalfunktion auch bei ihnen nahe. In meiner Arbeit untersuchte ich, inwieweit ein Einfluss Ca2+-empfindlicher K+-Kanäle auf die Migration von humanen neutrophilen Granulozyten bei einer Migration auf dem Matrixprotein Fibronektin nachweisbar ist. Dazu wurden humane neutrophile Granulozyten mit dem Chemotaxin fMLP stimuliert und auf verschieden starken Fibronektinbeschichtungen zur Migration gebracht. Die Neutrophilen wurden dabei mit erwärmter Ringerlösung überströmt, und ihre Migrationsgeschwindigkeit mittels Zeitraffer-Videomikroskopie und computergestützter Auswertung der Migrationstrajektorien bestimmt. Den Einfluss der hIK1-Kanäle auf die Migration beobachtete ich durch Kanalinhibition mittels Clotrimazol bzw. Kanalaktivierung mittels 1-EBIO. Es stellte sich heraus, dass die Migrationsgeschwindigkeit der neutrophilen Granulozyten stark von der Fibronektinbeschichtung abhing. Die Migrationsgeschwindigkeit hing biphasisch von der Fibronektinkonzentration ab und wies ein Maximum von 6 µm/min bei einer mittleren Beschichtungsstärke von 100 µg/ml Fibronektin auf. Unter diesen Bedingungen wanderten die Neutrophilen in einer amöboiden Weise. Bei Hemmung der Kaliumkanäle mit Clotrimazol oder Aktivierung mit 1-EBIO zeigten alle Zellen unabhängig von ihrer Morphologie und Geschwindigkeit keine Veränderung der Migrationsgeschwindigkeit. Dies war angesichts vergleichbarer Versuche auf Polylysinbeschichtungen überraschend, da diese eine dosisabhängige Verlangsamung der Neutrophilen nach Blockade der Kaliumkanäle mit Clotrimazol und Charybdotoxin ergebenhatten. Nachdem ausgeschlossen wurde, dass Zellmorphologie oder –geschwindigkeit diesen Unterschied bedingten, spricht dies für einen matrixspezifischen „Crosstalk“ zwischen Adhäsionsmolekülen der Zelle und Untergrund. Die dabei aktivierten verschiedenartigen Signalkaskaden bzw. alternative in die Zellmembran eingebrachte Kaliumkanaltypen könnten zur Kompensation der hIK1-Blockade auf Fibronektin geführt haben. Vor dem Hintergrund der sich durch meine Arbeit abzeichnenden hohen Modulationsfähigkeit kanalvermittelter Migrationsschritte dürfte sich die Entwicklung neuer antimigratorisch-antiinflammatorisch wirkender Kaliumkanalhemmstoffe für Neutrophile deutlich schwieriger gestalten, als bislang vermutet.
Eine der Hauptaufgaben der Niere besteht in der Ausscheidung körpereigener und körperfremder Abfallstoffe und Stoffwechselmetabolite. Eine Reihe dieser Substanzen gehört zur Gruppe der organischen Anionen, diese werden mit Hilfe eines eigenen Transportsystems aus dem Blut durch die Nierenepithelzelle in den Urin transportiert. Eines der wichtigsten Transportproteine dieses Ausscheidungssystems ist der organische Anionentransporter hOAT1 der basolateralen Zellmembran. Es ist bekannt, dass die an der Stoffausscheidung beteiligten Transportproteine modulatorischen Einflüssen unterliegen können. Kürzlich fanden sich an OK (opossum kidney)-Zellen Hinweise, dass der Wachstumsfaktor EGF das Transportsystem für organische Anionen stimulieren kann, ohne dass die genaue Identität der beteiligten Transportproteine aufgeklärt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der akute, modulatorische Einfluß des Wachstumsfaktors EGF auf ein definiertes menschliches Transportprotein für organische Anionen, den hOAT1, untersucht. Die menschliche Nierenepithelzelllinie IHKE1 wurde zu diesem Zweck mit dem hOAT1-Transportprotein stabil transfiziert. Die Versuchsergebnisse zeigten eine hohe basolaterale Transportaktivität der transfizierten Zellen für organische Anionen, und nach einer zehnminütigen Vorinkubation mit EGF eine deutliche Stimulation der basolateralen Aufnahmeaktivität. Durch EGF wird also in menschlichen Nierenepithelien der organische Anionentransport akut über das hOAT1-Protein in der basolateralen Zellmembran stimuliert. Es konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Signaltransduktion dieses stimulierenden Effektes durch die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt wird. In der Absicht, mehr Aufschluss über die Mechanismen der intrazellulären Signaltransduktion vom EGF-Rezeptor an den hOAT1 zu gewinnen, etablierten wir das System aus EGF-Rezeptor HER1 und Anionentransporter hOAT1 für weitere Versuche in der CHO-Zelllinie. In CHO-HER1-Zellen führte eine Vorinkubation mit EGF zu einer Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, und CHO-hOAT1-Zellen zeigten im Gegensatz zum CHO-Wildtyp eine deutliche Transportaktivität für Fluorescein. In ko-transfizierten CHO-HER1-hOAT1-Zellen konnte in IHKE1-hOAT1-Zellen ein modulatorischer Effekt des Wachstumsfaktors auf die Aktivität des Anionentransporters nachgewiesen werden. EGF bewirkte jedoch hier keine Stimulation, sondern eine (ebenfalls über die Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2 vermittelte) Hemmung des hOAT1-Transportproteins. EGF wirkt also in den unpolaren CHO-Zellen genau gegensätzlich auf das hOAT1-Transportprotein wie an der basolateralen Membran der polaren, epithelialen IHKE1-Zellen, in beiden Fällen wird jedoch die Wirkung über die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt. Wie reagieren nun in polaren IHKE1-Zellen hOAT1-Proteine, die sich nicht in der basolateralen Membran befinden? Zur Klärung dieser Frage nutzten wir den Umstand, dass der hOAT1 in transfizierten IHKE1-hOAT1-Zellen stark überexprimiert wird, und untersuchten die Wirkung von EGF auf die apikale Fluoresceinaufnahme. Im Transportversuch zeigte sich in IHKE1-hOAT1-Zellen ohne EGF eine gegenüber dem Wildtyp signifikante Fluoresceinaufnahme an der apikalen Membran. Auf eine Vorinkubation mit EGF reagierten IHKE1-hOAT1-Zellen mit einer Hemmung dieser apikalen Fluoresceinaufnahme. Die hOAT1-Transportproteine in der apikalen Membran der IHKE1-hOAT1-Zellen reagierten somit genauso auf EGF wie Transportproteine in unpolaren CHO-Zellen: In beiden Versuchsaufbauen fand sich eine Hemmung der Fluoresceinaufnahme. In CHO-Zellen wurde diese Hemmung vermittelt über eine Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, in IHKE1-Zellen jedoch erfolgte die Hemmung unabhängig davon. Ein stimulierender Effekt von EGF auf den hOAT1, den die Ergebnisse an OK-Zellen nahegelegt hatten, fand sich nur an der basolateralen Membran von IHKE1-hOAT1-Zellen. Ob die unterschiedliche Wirkung von EGF auf hOAT1-Transportproteine in der basolateralen und der apikalen Nierenepithelmembran eine physiologische Bedeutung hat, lässt sich nur vermuten. Denkbar wäre jedoch, dass durch gleichzeitige Stimulation der basolateralen Aufnahme und Hemmung des Rücktransportes durch die apikale Membran eine ausreichende Sekretion organischer Anionen über EGF vermittelt auch bei entzündlicher Schädigung des Nierencortex oder im Falle einer Ischämie gewährleistet bleibt.
Neurogenic inflammation is evoked by neuropeptides released from primary afferent terminals and,
presumably, by other secondarily released inflammatory mediators. This study examines whether prostaglandins might participate in the development of neurogenic inflammation in humans and whether cyclooxygenase inhibitors have any anti-inflammatory effect on this type of inflammation. In healthy volunteers, neurogenic inflammation was elicited by epicutaneously applied capsaicin (1 %), after systemic pretreatment with acetylsalicylic acid, or topically applied indomethacin compared to pretreatment with saline or vehicle, respectively. The extent of neurogenic inflammation was quantified by planimetry of visible flare size and recording the increase of superficial cutaneous blood flow (SCBF) with a laser Doppler flowmeter. Capsaicin-induced flare sizes and outside SCBF (both representing neurogenically evoked inflammation) were unaffected by acetylsalicylic acid or indomethacin. Only the capsaicin-induced increase; of inside SCBF was attenuated by local pretreatment with indomethacin, reflecting the participation of prostaglandins in the inflammatory response of those areas which were in direct contact with capsaicin.
Vocalization is an important part of social communication, not only for humans but also for mice. Here, we show in a mouse model that functional deficiency of Sprouty-related EVH1 domain-containing 2 (SPRED2), a protein ubiquitously expressed in the brain, causes differences in social ultrasound vocalizations (USVs), using an uncomplicated and reliable experimental setting of a short meeting of two individuals. SPRED2 mutant mice show an OCD-like behaviour, accompanied by an increased release of stress hormones from the hypothalamic–pituitary–adrenal axis, both factors probably influencing USV usage. To determine genotype-related differences in USV usage, we analyzed call rate, subtype profile, and acoustic parameters (i.e., duration, bandwidth, and mean peak frequency) in young and old SPRED2-KO mice. We recorded USVs of interacting male and female mice, and analyzed the calls with the deep-learning DeepSqueak software, which was trained to recognize and categorize the emitted USVs. Our findings provide the first classification of SPRED2-KO vs. wild-type mouse USVs using neural networks and reveal significant differences in their development and use of calls. Our results show, first, that simple experimental settings in combination with deep learning are successful at identifying genotype-dependent USV usage and, second, that SPRED2 deficiency negatively affects the vocalization usage and social communication of mice.
The presynaptic active zone (AZ) of chemical synapses is a highly dynamic compartment where synaptic vesicle fusion and neurotransmitter release take place. During evolution the AZ was optimized for speed, accuracy, and reliability of chemical synaptic transmission in combination with miniaturization and plasticity. Single-molecule localization microscopy (SMLM) offers nanometer spatial resolution as well as information about copy number, localization, and orientation of proteins of interest in AZs. This type of imaging allows quantifications of activity dependent AZ reorganizations, e.g., in the context of presynaptic homeostatic potentiation. In combination with high-pressure freezing and optogenetic or electrical stimulation AZs can be imaged with millisecond temporal resolution during synaptic activity. Therefore SMLM allows the determination of key parameters in the complex spatial environment of AZs, necessary for next generation simulations of chemical synapses with realistic protein arrangements.
G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) regulieren eine Vielzahl physiologischer als auch pathophysiologischer Prozesse im menschlichen Körper. Verankert in der Zellmembran vermitteln sie die Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung nachgeschalteter Signalwege.
Durch die Aktivierung Adenylatcyclasen-, Phosphlipasen C- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)- abhängiger Signalwege, vermittelt der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor PTH1R die endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-verwandten Proteins (PTHrP). Diese sind die Regulation der Kalzium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Skelettentwicklung.
In dieser Arbeit wurden vier Mutationen im PTH1-Rezeptor untersucht, die durch Roth und Mitarbeiter (2014) in den Zusammenhang mit dem Krankheitsbild der primären Zahndurchbruchsstörung (PFE) gebracht wurden.
Die vier untersuchten Mutanten sind PTH1R [P119L], PTH1R [H442D], PTH1R [L232R] und PTH1R [L292P]: Bei den durch Mutagenese herbeigeführten Punktmutationen handelt es sich jeweils um eine missense-Mutation, bei der der Austausch einer einzelnen Base in der DNA-Sequenz zum Einbau einer anderen Aminosäure im Protein führt.
Es folgte die funktionelle Charakterisierung des Parathormon-Rezeptors und seiner Mutanten, welche auf einer indirekten Messung der Rezeptoraktivität basierte. Direkt gemessen wurden dabei die Kaliumströme der Tandemporen-Kaliumkanäle TASK-1 und TRESK, welche durch Gq-Protein gekoppelte Rezeptoren reguliert werden können: So werden TASK-Ströme durch GPCRs inhibiert, TRESK-Ströme dagegen aktiviert.
TASK-1 Kanäle und Parathormon-Rezeptoren wurden zeitgleich heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und anschließend mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) elektrophysiologisch untersucht.
Nach Zugabe von PTH (100 nM) ergab sich nach Kopplung an den TASK-1 Kanal für den PTH1R-Wildtyp eine durchschnittliche Stromamplitude von 52,11 % ± 3,60 % (n=28). Dagegen zeigten sich für die PTH1R-Mutanten keine signifikanten Änderungen der Stromamplituden nach Zugabe der PTH-haltigen Messlösung.
Die Untersuchungen wurden mit dem TRESK-Kanal wiederholt. Hier zeigte sich eine deutliche TRESK-Aktivierung durch Kopplung an den PTH1R-Wildtyp beim Einwaschen von PTH. Bei den Mutanten kam es ebenfalls nicht zu einer signifikanten Änderung der Stromamplitude durch PTH-Zugabe.
Ein Austausch dieser entsprechenden Aminosäuren führt somit zu einem Funktionsverlust des Parathormon-Rezeptors Typ 1. Bei den untersuchten Mutationen handelt es sich daher um Loss-of-function-Mutationen.
Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die von Roth und Mitarbeitern in ihrer Pathogenität als „wahrscheinlich schädlich“ eingestuften Mutationen durch die vorliegende Arbeit nun als „pathogen“ und damit PFE-verursachend bezeichnet werden können.
Die zahnmedizinische Relevanz dieser Ergebnisse liegt darin begründet, dass durch eine genetisch gesicherte Diagnose PFE, die korrekte und erfolgversprechendste Behandlungsoption gewählt werden kann. Von PFE betroffene Zähne ankylosieren nach Applikation kieferorthopädischer Kräfte und können nicht weiter bewegt werden. Somit kann nach der Diagnose PFE ein individuelles Behandlungskonzept erstellt werden, das sich nach dem Ausmaß der Durchbruchsstörung richtet. Langjährige und frustrierende kieferorthopädische Behandlungen bleiben dem Patienten, aber auch dem Kieferorthopäden erspart.
Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Darüber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazelluläre Domäne der GC-A wird intrazellulär, durch die katalytische Domäne des Rezeptors, der sekundäre Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erhöhte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors führen. Der Verlust der Funktionsfähigkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellulär lokalisierten Aminosäuren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung möglicher Interaktionspartner in vivo könnte der Grundstein für neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine kürzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminosäuren verkürzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellulären Domänen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellulären Domäne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdomäne befindet. Oberflächenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfläche von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen präsentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellulären cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die Fähigkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpräzipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression für GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus für die Verringerung der Sensitivität des GC-A-Rezeptors gegenüber ANP darstellen.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer Überexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es ermöglicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu können um danach Analysen zu posttranslationalen Veränderungen und möglichen Interaktionspartnern durchzuführen. Zunächst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zusätzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz für die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingefügt. Die Expression und Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsfähigkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpräzipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an Mäusen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpräzipitationen, überprüft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, Überexpression des Rezeptors. Dieser konnte über das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die Überexpression funktionsfähiger GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie schützt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer Überexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern ähnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des Überexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkanälen TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die Möglichkeit die Epitope und das murine Überexpressionsmodell auch zukünftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren.
Regulation der Capsaicin-Sensitivität von murinen Spinalganglienzellen durch neurotrophe Faktoren
(2003)
In der vorliegenden Arbeit konnte anhand von Zellkulturen von Spinalganglienzellen herausgearbeitet werden, dass die Regulation der Capsaicin-Sensitivität in der Maus von vielen Faktoren abhängig ist: Es ließ sich ein komplexes System der Regulation von Capsaicin-induziertem Cobalt-Uptake als Surrogat-Marker für nozizeptive Neurone herausarbeiten: Zum einen konnte gezeigt werden, dass NGF dosisabhängig Einfluss auf die peptiderge Neuronenpopulation nimmt und über den niederaffinen NGF-Rezeptor p75NTR Capsaicin-Empfindlichkeit, CGRP-Expression und VR1-Expression reguliert. Dieser Rezeptor hat dabei keine Bedeutung für den konstitutiven Cobalt-Uptake, jedoch für die Aufrechterhaltung des Cobalt-Uptakes in der Zellkultur. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass GDNF dosisabhängig den Anteil der Neurone mit Capsaicin-induziertem Cobalt-Uptake reguliert und dosisabhängig parallel in zwei Gruppen von Spinalganglienzellen den Cobalt-Uptake induziert: einerseits über den GDNF-Rezeptor GFRa2 und die Rezeptortyrosinkinase c-RET in der IB4-Population, andererseits über GFRa1 und SRC-Kinasen in der GFRa1-Population. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Spinalganglienzellen die Sensibilität gegenüber noxischen Reizen selbständig komplex regulieren und damit auf äußere Einflüsse reagieren können. Möglicherweise ergeben sich in Zukunft neue Ansatzpunkte der Therapie dadurch, dass die Neurone direkt beeinflusst werden können.
SPRED2 ist ein Membran-assoziiertes Protein, das als wichtiger Regulator der Zelle fungiert. Es übt eine inhibitorische Wirkung auf dem Ras/ERK/MAPK-Signalweg und ist u.a. in der Neurogenese im zentralen Nervensystem beteiligt. Durch diverse Verhaltenstests in SPRED2-KO Mäusen konnten OCD-ähnliche Symptome bei den Tieren festgestellt werden sowie eine vermehrte Aktivität in thalamo-amygdalen Synapsen. Zur weiteren Abklärung dieser synaptischen Dysfunktion, wurde eine Quantifizierung von prä- und postsynaptischen Protein-Veränderungen in der Amygdala-Region in SPRED2-defizienten Mäusen im Vergleich zur Wildtyp Mäusen durchgeführt. Hier konnten signifikante Unterschiede festgestellt werden.
Functional and genetic dissection of mechanosensory organs of \(Drosophila\) \(melanogaster\)
(2016)
In Drosophila larvae and adults, chordotonal organs (chos) are highly versatile mechanosensors
that are essential for proprioception, touch sensation and hearing. Chos share molecular,
anatomical and functional properties with the inner ear hair cells of mammals. These multiple
similarities make chos powerful models for the molecular study of mechanosensation.
In the present study, I have developed a preparation to directly record from the sensory neurons
of larval chos (from the lateral chos or lch5) and managed to correlate defined mechanical inputs
with the corresponding electrical outputs. The findings of this setup are described in several case
studies.
(1) The basal functional lch5 parameters, including the time course of response during continuous
mechanical stimulation and the recovery time between successive bouts of stimulation, was
characterized.
(2) The calcium-independent receptor of α-latrotoxin (dCIRL/Latrophilin), an Adhesion class G
protein-coupled receptor (aGPCR), is identified as a modulator of the mechanical signals
perceived by lch5 neurons. The results indicate that dCIRL/Latrophilin is required for the
perception of external and internal mechanical stimuli and shapes the sensitivity of neuronal
mechanosensation.
(3) By combining this setup with optogenetics, I have confirmed that dCIRL modulates lch5
neuronal activity at the level of their receptor current (sensory encoding) rather than their ability
to generate action potentials.
(4) dCIRL´s structural properties (e.g. ectodomain length) are essential for the mechanosensitive
properties of chordotonal neurons.
(5) The versatility of chos also provides an opportunity to study multimodalities at multiple levels.
In this context, I performed an experiment to directly record neuronal activities at different
temperatures. The results show that both spontaneous and mechanically evoked activity increase
in proportion to temperature, suggesting that dCIRL is not required for thermosensation in chos.
These findings, from the development of an assay of sound/vibration sensation, to neuronal
signal processing, to molecular aspects of mechanosensory transduction, have provided the first
insights into the mechanosensitivity of dCIRL.
In addition to the functional screening of peripheral sensory neurons, another
electrophysiological approach was applied in the central nervous system: dCIRL may impact the
excitability of the motor neurons in the ventral nerve cord (VNC). In the second part of my work,
whole-cell patch clamp recordings of motor neuron somata demonstrated that action potential
firing in the dCirl\(^K\)\(^O\) did not differ from control samples, indicating comparable membrane
excitability.
Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise für eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So können Mineralocorticoide nach zerebraler Ischämie zu einem vermehrten vaskulären Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration führen und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verstärken. Daher wäre eine mögliche Erklärung für die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu überprüfen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erhöht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Primärkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen bestätigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. Über den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung auslösen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders für therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivität des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivität im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Domäne für die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Domänen C, D, E und F genügt nicht, um den EGFR-Promoter vollständig zu aktivieren. Um Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellulärmatrix in glatten Gefäßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt für die vermehrte Bildung von extrazellulärer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskulären und renalen System kommt es über eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, nämlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und könnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zusätzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron führen diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und führt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte können folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron führt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabhängig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabhängig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen für eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorgängen.
Since Channelrhodopsins has been described first and introduced successfully in freely moving animals (Nagel et al., 2003 and 2005), tremendous impact has been made in this interesting field of neuroscience. Subsequently, many different optogenetic tools have been described and used to address long-lasting scientific issues. Furthermore, beside the ‘classical’ Channelrhodopsin-2 (ChR2), basically a cation-selective ion channel, also altered ChR2 descendants, anion selective channels and light-sensitive metabotropic proteins have expanded the optogenetic toolbox. However, in spite of this variety of different tools most researches still pick Channelrhodopsin-2 for their optogenetic approaches due to its well-known kinetics. In this thesis, an improved Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), is described, which might become an useful tool to provide ambitious neuroscientific approaches by dint of its characteristics. Here, ChR2XXM was chosen to investigate the functional consequences of Drosophila larvae lacking latrophilin in their chordotonal organs. Finally, the functionality of GtACR, was checked at the Drosophila NMJ. For a in-depth characterisation, electrophysiology along with behavioural setups was employed. In detail, ChR2XXM was found to have a better cellular expression pattern, high spatiotemporal precision, substantial increased light sensitivity and improved affinity to its chromophore retinal, as compared to ChR2. Employing ChR2XXM, effects of latrophilin (dCIRL) on signal transmission in the chordotonal organ could be clarified with a minimum of side effects, e.g. possible heat response of the chordotonal organ, due to high light sensitivity. Moreover, optogenetic activation of the chordotonal organ, in vivo, led to behavioural changes. Additionally, GtACR1 was found to be effective to inhibit motoneuronal excitation but is accompanied by unexpected side effects. These results demonstrate that further improvement and research of optogenetic tools is highly valuable and required to enable researchers to choose the best fitting optogenetic tool to address their scientific questions.
Die Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des glatten Muskeltonus. NO ist einer der wichtigsten vaskulären Faktoren für die Relaxation der Blutgefäße sowie für die Regulation des Blutdruckes und fungiert ebenfalls als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter im gastrointestinalen Trakt. Es wirkt hauptsächlich über die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen führt zu einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). GCKO-Mäuse zeigen keine NO-induzierte Relaxation der vaskulären und gastrointestinalen glatten Muskulatur. Die Mäuse zeigen eine arterielle Hypertonie und eine verlängerte Magen-Darm-Transportzeit, die in eine gastrointestinale Dysfunktion mündet. Allerdings erlaubt eine vollständige Deletion der NO-GC in den Mäusen keine Identifikation des Zell- bzw. Gewebe-Typs, der für den erhöhten Blutdruck und die gastrointestinale Dysfunktion verantwortlich ist. Um die relative Beteiligung der glatten Muskelzellen an der Hypertonie und der gestörten Darm-Motilität zu bestimmen, wurden Glattmuskel-spezifische Knockout-Mäuse für die ß1-Untereinheit der NO-GC (SM-GCKO) generiert. Die SM-GCKO-Mäuse entwickelten im Verlauf der Deletion eine arterielle Hypertonie in Kombination mit einem Verlust der NO-induzierten Glattmuskelrelaxation. Diese Daten zeigen, dass die Deletion der NO-GC in den glatten Muskelzellen völlig ausreichend ist, eine Hypertonie zu erzeugen. Überraschenderweise ist die Darm-Motilität der SM-GCKO-Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen unverändert. In gastrointestinaler Muskulatur exprimieren neben den glatten Muskelzellen auch die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) die NO-GC. Mithilfe einer Cre-spezifischen Maus für ICC wurde eine Mauslinie generiert, der die NO-GC in beiden Zelltypen fehlt. Der gastrointestinale Phänotyp dieser Doppel-Knockouts ähnelt dem der totalen GCKO-Tiere: Die nitrerge Relaxation fehlt und die Magen-Darm-Transportzeit ist verlängert. Zusammenfassend führt eine Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und gleichzeitig in den ICC zu einer vollständigen Unterbrechung der nitrergen Relaxation in GI Trakt.
Network instability dynamics drive a transient bursting period in the developing hippocampus in vivo
(2022)
Spontaneous correlated activity is a universal hallmark of immature neural circuits. However, the cellular dynamics and intrinsic mechanisms underlying network burstiness in the intact developing brain are largely unknown. Here, we use two-photon Ca\(^{2+}\) imaging to comprehensively map the developmental trajectories of spontaneous network activity in the hippocampal area CA1 of mice in vivo. We unexpectedly find that network burstiness peaks after the developmental emergence of effective synaptic inhibition in the second postnatal week. We demonstrate that the enhanced network burstiness reflects an increased functional coupling of individual neurons to local population activity. However, pairwise neuronal correlations are low, and network bursts (NBs) recruit CA1 pyramidal cells in a virtually random manner. Using a dynamic systems modeling approach, we reconcile these experimental findings and identify network bi-stability as a potential regime underlying network burstiness at this age. Our analyses reveal an important role of synaptic input characteristics and network instability dynamics for NB generation. Collectively, our data suggest a mechanism, whereby developing CA1 performs extensive input-discrimination learning prior to the onset of environmental exploration.
Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (Kir), aktuell in die 7 Unterfamilien Kir1-Kir7 eingeteilt, sind an der Regulation einer Vielzahl von Körperfunktionen, beispielsweise Herzfrequenz, Erregbarkeit von Nervenzellen, Tonus von Gefäßmuskelzellen, Hormonsekretion oder Aktivierung von Immunzellen, beteiligt. Für die Kontrolle dieser Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Leitfähigkeit dieser Kanäle beeinflusst werden kann. Die Kir3-Unterfamilie (früher GIRK für G-protein-activated-K+-channels) wird beispielsweise obligat durch die direkte Bindung der beta/gamma-Untereinheit des trimeren Gi/0-Proteins aktiviert (Karschin, 1999). Es gibt Hinweise in der Literatur, dass auch die stark einwärts gleichrichtenden Kanäle der Kir2-Familie durch G-Proteine der Gq-Familie reguliert sein können. Dabei widersprechen sich insbesondere zwei Untersuchungen zur Spezifität der Interaktion (Jones, 1996; Chuang et al., 1997). Ebenso ist der intrazelluläre Signalweg bislang nicht hinreichend geklärt. Um dies genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit die Kir-Kanäle Kir2.1-Kir2.4 jeweils mit 5 verschiedenen Gq-gekoppelten Rezeptoren in Xenopus-Oozyten koexprimiert und mit der Technik der „Zwei-Elektroden-Spannungsklemme“ der Strom über die Kir-Kanäle vor und nach Rezeptoraktivierung mit dem jeweils physiologischen Rezeptoragonisten gemessen. Es zeigte sich, dass ausschließlich Kir2.3 nach Aktivierung des M1-Acetylcholinrezeptors inhibiert wird. Eine Sequenzanalyse zeigte in der Extrazellulärregion von Kir2.3 eine zu den anderen Kir2-Kanälen abweichende Aminosäuresequenz, welche durch Mutation aber als potentielle Bindestelle zur Vermittlung des inhibitorischen Effektes ausgeschlossen werden konnte. Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die Koexpression von Kir2.3 und M1-Acetylcholinrezeptor in bestimmten Gehirnregionen der Kontrolle neuronaler Erregbarkeit dient (Shen et al., 2007), ist es wahrscheinlich, dass derselbe Mechanismus auch in ventrikulären Kardiomyozyten existiert und dort als Schutzmechanismus vor vagaler Überstimulation fungiert.
Die Heterodimerisierung von G- Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) stellt ein aktuelles Forschungsgebiet dar, das molekulare Erklärungsmöglichkeiten für die Vielfalt der Signalwege über solche Rezeptoren aufzeigt. Die genauen Funktionen diese Konstrukte in vivo sind bisher erst in Ansätzen erforscht, ebenso wenig die molekularbiologischen Mechanismen. Für die beiden Serotoninrezeptoren 5-HT1A und 5-HT7 konnte Heterodimerisierung molekular nachgewiesen werden, in ihren physiologischen Mechanismen und Effekten sollte daher eine Charakterisierung vorgenommen werden. Mittels elektrophysiologischer Messverfahren wurden Ströme an dem heterologen Expressionsmodell der Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis mittels Voltage-Clamp Technik an Kaliumionenkanälen (Kir3 und TASK-1) gemessen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die heterodimere Koexpression beider Rezeptoren eine signifikante Reduktion des Rezeptor-aktivierten Kanalstroms im Vergleich zur homomeren Expression zur Folge hatte. Weitere Experimente konnten dann zeigen, dass diese Effekte spezifisch für dieses Rezeptorheterodimer sind, und dass die Effekte von der Dosis bzw. dem Verhältnis der exprimierten cRNA abhängen. In Fluoreszenzmessung konnte zudem gezeigt werden, dass die Reduktion der Stromamplitude in der heterodimeren Expression nicht auf eine Reduktion von Kanalproteinen in der Zellmembran zurückzuführen ist. Zur weiteren Charakterisierung des bisher erst in Ansätzen erforschten 5-HT7 Rezeptors wurde dieser abschließend mit einem ß- adrenergen Rezeptor verglichen, der über den gleichen Signalweg bzw. Ionenkanal funktioniert. Auch hier zeigte sich eine signifikante Reduktion des Kanalstroms beim 5-HT7 Rezeptor. Die physiologische Relevanz dieser Ergebnisse liegt darin begründet, dass ein weiterführendes Verständnis von 5-HT Rezeptor vermittelten Signalwegen, insbesondere von der Bedeutung und den Mechanismen ihrer Heterodimersierung, neue pathophysiologische Zusammenhänge verdeutlicht. Speziell im Hinblick auf Erkrankungen, die mit den 5-HT Rezeptoren assoziiert sind, wie etwa Depressionen und Angststörungen, soll sich hieraus die Möglichkeit spezifischerer Therapien ergeben.
Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a progressive parenchymal lung disease with limited therapeutic treatments. Pathologically altered lung fibroblasts, called myofibroblasts, exhibit increased proliferation, migration, and collagen production, and drive IPF development and progression. Fibrogenic factors such as Platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) contribute to these pathological alterations. Endogenous counter-regulating factors are barely known. Published studies have described a protective role of exogenously administered C-type Natriuretic Peptide (CNP) in pathological tissue remodeling, for example in heart and liver fibrosis. CNP and its cyclic GMP producing guanylyl cyclase B (GC-B) receptor are expressed in the lungs, but it is unknown whether CNP can attenuate lung fibrosis by this pathway. To address this question, we performed studies in primary cultured lung fibroblasts.
To examine the effects of the CNP/GC-B pathway on PDGF-BB-induced collagen
production, proliferation, and migration in vitro, lung fibroblasts were cultured from wildtype control and GC-B knockout mice. Human lung fibroblasts from patients with IPF and healthy controls were obtained from the UGMLC Biobank. In RIA experiments, CNP, at 10nM and 100nM, markedly and similarly increased cGMP levels in both the murine and human lung fibroblasts, demonstrating GC-B/cGMP signaling. CNP reduced PDGF-BB induced proliferation and migration of lung fibroblasts in BrdU incorporation and gap closure assays, respectively. CNP strongly decreased PDGF-BB-induced collagen 1/3 expression as measured by immunocytochemistry and immunoblotting. Importantly, the protective actions of CNP were preserved in IPF fibroblasts. It is known that the profibrotic actions of PDGF-BB are partly mediated by phosphorylation and nuclear export of Forkhead Box O3 (FoxO3), a transcription factor downregulated in IPF. CNP prevented PDGF-BB elicited FoxO3 phosphorylation and nuclear exclusion in both murine and human control and IPF fibroblasts. CNP signaling and functions were abolished in GC-B-deficient lung fibroblasts.
Taken together, the results show that CNP moderates the PDGF-BB-induced activation and differentiation of human and murine lung fibroblasts to myofibroblasts. This effect is mediated CNP-dependent by GC-B/cGMP signaling and FoxO3 regulation. To follow up the patho-physiological relevance of these results, we are generating mice with fibroblast-restricted GC-B deletion for studies in the model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis.
Aims: Cardiac hypertrophy is a common and often lethal complication of arterial hypertension. Elevation of myocyte cyclic GMP levels by local actions of endogenous atrial natriuretic peptide (ANP) and C-type natriuretic peptide (CNP) or by pharmacological inhibition of phosphodiesterase-5 was shown to counter-regulate pathological hypertrophy. It was suggested that cGMP-dependent protein kinase I (cGKI) mediates this protective effect, although the role in vivo is under debate. Here, we investigated whether cGKI modulates myocyte growth and/or function in the intact organism.
Methods and results: To circumvent the systemic phenotype associated with germline ablation of cGKI, we inactivated the murine cGKI gene selectively in cardiomyocytes by Cre/loxP-mediated recombination. Mice with cardiomyocyte-restricted cGKI deletion exhibited unaltered cardiac morphology and function under resting conditions. Also, cardiac hypertrophic and contractile responses to β-adrenoreceptor stimulation by isoprenaline (at 40 mg/kg/day during 1 week) were unaltered. However, angiotensin II (Ang II, at 1000 ng/kg/min for 2 weeks) or transverse aortic constriction (for 3 weeks) provoked dilated cardiomyopathy with marked deterioration of cardiac function. This was accompanied by diminished expression of the \([Ca^{2+}]_i\)-regulating proteins SERCA2a and phospholamban (PLB) and a reduction in PLB phosphorylation at Ser16, the specific target site for cGKI, resulting in altered myocyte \(Ca^{2+}_i\) homeostasis. In isolated adult myocytes, CNP, but not ANP, stimulated PLB phosphorylation, \(Ca^{2+}_i\)-handling, and contractility via cGKI.
Conclusion: These results indicate that the loss of cGKI in cardiac myocytes compromises the hypertrophic program to pathological stimulation, rendering the heart more susceptible to dysfunction. In particular, cGKI mediates stimulatory effects of CNP on myocyte \(Ca^{2+}_i\) handling and contractility.
Die im Rahmen der Arbeit erzielten Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse über einen neuen Sternzellsubtyp der murinen Leber. Bei Gewebeverletzung differenzieren Sternzellen im Allgemeinen zu Myofibroblasten, welche Extrazellulärmatrix produzieren. Des Weiteren sind Sternzellen die Perizyten der Leber und spielen eine Rolle in der Angiogenese und Gefäßremodellierung.
Der in präliminären Untersuchungen identifizierte Sternzellsubtyp zeichnet sich durch die Expression von tdTomato in Abhängigkeit des SMMHC-Promotors aus (SMMHC/tdTomato\(^+\) Sternzellen). In dieser Arbeit wurden SMMHC/tdTomato\(^+\) Sternzellen immunhistochemisch unter physiologischen und fibrotischen Bedingungen untersucht.
Mit Hilfe von Lineage Tracing konnte zunächst die Zellmauserung der SMMHC/tdTomato\(^+\) Sternzellen gezeigt werden. Durch Leberzonen-spezifische Marker wurde daraufhin nachgewiesen, dass SMMHC/tdTomato\(^+\) Sternzellen in Zone 1 des Leberazinus lokalisiert sind, weswegen diese Zellen im Weiteren „Zone 1-HSC“ genannt wurden. Als potenzielle Progenitorzellnische der Zone 1-HSC wurde das Portalfeld eingegrenzt.
Außerdem wurde die Funktion der Zone 1-HSC in der CCl\(_4\)-induzierten Leberfibrose untersucht. Es stellte sich heraus, dass Zone 1-HSC bereits früh in der Fibrose die Zonierung verlieren und diese auch nach Regenerationszeit nicht wiederhergestellt wird. Es wurde nachgewiesen, dass Zone 1-HSC nicht zu Myofibroblasten differenzieren. Stattdessen spielen Zone 1-HSC möglicherweise eine Rolle in der sinusoidalen Kapillarisierung in Folge einer CCl\(_4\)-induzierten Fibrose.
The voltage –gated calcium channel, Cav1.2, and the plasma membrane calcium ATPase, PMCA4b, play important roles in excitable and non-excitable cells. The central function of Cav1.2 is to regulate the calcium entry into cells upon depolarization, while PMCA4b is responsible for calcium extrusion and has an influence on cellular calcium homeostasis. Both proteins control fundamental functions in the heart and brain, but the specific functions and the precise mechanisms are still investigated. In order to identify new interaction partners that may regulate the activities of the Cav1.2 and the PMCA4b, we used three independent assays and co-localization studies. The assays, which were used are PDZ domain arrays (testing 124 different PDZ domains), GST pull-downs, and conventional immunoprecipitation assays. In the PDZ arrays, strongest interactions with Cav1.2 and PMCA4b were found for the PDZ domains of MAST-205, MAGI-1, MAGI-2, MAGI-3, and ZO-1. Additionally, we established interactions between Cav1.2 and the PDZ domains of NHERF1/2, Mint-2, and CASK. PMCA4b was observed to interact with Mint-2, and its interactions with Chapsyn-110 and CASK were confirmed. Furthermore, we validated interaction of Cav1.2 and PMCA4b with NHERF1, CASK, MAST-205 and MAGI-3 via immunoprecipitation. We also demonstrated direct interaction of the C-terminus of Cav1.2 and the PDZ domain of nNOS. We assumed that nNOS overexpression would reduce Ca2+ influx through Cav1.2. To address this question, we measured Ca2+ currents in stably transfected HEK 293 cells expressing the Cav1.2 (α1b and β2a subunit of the smooth muscle L-type calcium channel) and nNOS. It has been shown that NO modulates ion channel activity by nitrosylation of sulfhydryl groups on the channel protein. So we propose that the interaction between the C-terminus of Cav1.2 and the PDZ domain of nNOS inhibits the currents by an S-nitrosylation of the channel protein. All these interactions connect both proteins to signaling networks involved in signal transmission, cell adhesion, and apoptosis, which may help provide new hints about the physiological functions of Cav1.2 and PMCA4b in intra- and intercellular signaling.