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Institute
- Institut für Humangenetik (228) (remove)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Comprehensive Hearing Center, Department of ORL, Plastic, Aesthetic and Reconstructive Head and Neck Surgery, Würzburg, Germany (1)
- DNA Analytics Core Facility, Biocenter, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Department of Animal Ecology and Tropical Biology, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Maastricht University, Maastricht, the Netherlands (1)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs FA-Patienten und eine Patientin, bei der eine Fanconi Anämie ausgeschlossen wurde, auf das Vorhandensein eines Mosaizismus untersucht. Dabei wurde bei allen Patienten eine zytogenetische Chromosomenbruchanalyse durchgeführt und die Ergebnisse mit den Daten der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse verglichen. Bei einer FA-Patientin konnte weder in der Chromosomenbruchanalyse noch in der Zellzyklusanalyse das Vorhandensein eines Mosaizismus nachgewiesen werden. Bei drei FA-Patienten gab es in der Auswertung der Metaphasen auf Chromosomenbrüchigkeit den Hinweis auf das Vorliegen einer Mosaik-Konstellation, wobei dies in einem Fall (Proband 5) besonders ausgeprägt war. Die Zellzyklusanalyse konnte das Vorhandensein eines Mosaizismus jedoch in allen drei Fällen nicht bestätigen. Bei einer FAPatientin zeigten sich die Chromosomen in der Chromosomenbruchanalyse nahezu unauffällig. Die erfolgreiche und komplette Selbstkorrektur spiegelte sich auch eindeutig in der Zellzyklusanalyse wider. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die zytogenetische Chromosomenbruchanalyse zum Nachweis eines Mosaizismus besser geeignet ist als die Zellzyklusanalyse, da sie eine höhere Sensitivität zu haben scheint. Um eine definitive Aussage sowohl über die Sensitivität, als auch die Spezifität beider Untersuchungen machen zu können, ist es nötig FAPatienten im Verlauf mehrmals zu untersuchen. Dabei müsste sowohl eine Chromosomenbruchanalyse als auch eine Durchflusszytometrie durchgeführt werden und die Ergebnisse dann mit dem klinischen Befinden bzw. den Blutwerten (Hämatokrit/Hämoglobinwert, Leukozyten-und Thrombozytenzahl) verglichen werden. Da das Vorhandensein eines Mosaizismus Konsequenzen für die Diagnose und eventuell Therapiefestlegung hat, erscheinen weitere Untersuchungen diesbezüglich sinnvoll.
Sechs verschiedene Tumorzelllinien aus duktalen Pankreaskarzinomen transgener TGFalpha/p53+/-M?se wurden molekular-zytogenetisch durch Spectral Karyotyping analysiert, um Hinweise auf sekund?e genetische Ver?derungen zu erhalten, die f? die Tumorgenese in diesem Mausmodell verantwortlich sind. Es wurden haupts?hlich numerische Abberationen mit hypertriploiden bis hypotetraploiden Karyotypen detektiert, wohingegen durchschnittlich nur 4,3 Strukturaberrationen pro Metaphase nachgewiesen werden konnten. Fast immer stellten sich einige kleine Markerchromosomen dar, die durch SKY nicht eindeutig identifiziert werden konnten. Auff?ligste Ver?derung der Zelllinie TD2 (MMUPaTu7 und 8=7B) war ein gro?s Markerchromosom, dessen proximaler Anteil mit drei charakteristischen dunklen Banden aus Material von Chromosom 11 bestand, w?rend der distale Abschnitt zu Chromosom 5 geh?te. Durch FISH-Analyse mit spezifischen BAC-Proben f? das Chromosom 11 konnte hierf? eine Amplifikation der Kandidatengene Egfr und c-Rel festgestellt werden. Auch in den anderen Zelllinien traten geh?ft Strukuraberrationen des Chromosoms 11 auf, f? die ebenfalls eine Beteiligung dieser Genloci postuliert werden kann. Weitere strukturelle Ver?derungen betrafen Chromosom 15 mit c-Myc-Amplifikationen in Form von extrachromosomalen "double minutes", welche in h?eren Passagen der Zelllinie TD2 als homogeneously stained regions (HSR) integriert an variablen Positionen des Chromosoms 6 sichtbar wurden. In den analysierten Metaphasen trat zus?zlich h?fig ein vergrößertes Chromosom 8 auf, allerdings im Bandenmuster mit unterschiedlichen Amplifikationseinheiten, wobei ein Gewinn des dort lokalisierten Transkriptionsfaktors Jun-B m?lich w?e. F? eine genauere Charakterisierung der in die verschiedenen Strukturaberrationen involvierten Kandidatengene sind gezielte FISH-Analysen mit lokusspezifischen BAC-Proben oder andere weiterf?rende molekular-genetische Untersuchungen erforderlich.
Das Mausmodell war in der Säugetiergenetik schon immer ein interessantes Forschungsobjekt, insbesondere die in bestimmten geographischen Gebieten vorkommenden Mauspopulationen mit zahlreichen Robertson`schen Translokationen. Mit Kreuzungsversuchen von Mauspopulationen mit unterschiedlichen Robertson`schen Translokationen lassen sich chromosomale Interaktionen in der Meiosephase und morphogenetische Auswirkungen von dadurch entstandenen Mono- oder Trisomien untersuchen. Mit Hilfe der Spektralen Karyotypisierung gelang es in dieser Arbeit die chromosomale Anordnung in der Meiose bei Mauspopulationen mit Robertson`schen Translokationen exakt darzustellen. Hierbei wurde diese Technik an Meiosezellen der Maus etabliert. Es konnten dabei interessante Lagebeziehungen zwischen Meioseformationen und frei liegenden Chromosomen beobachtet werden. Auch fiel die erhebliche Stabilität der Multivalent- Formationen der F1- Tochtergeneration auf. Die Spektrale Karyotypisierung erwies sich hierbei als äußerst effizientes Verfahren, das aufgrund seiner relativ unkomplizierten Handhabung, seiner sehr guten Reproduzierbarkeit und universellen Einsetzbarkeit als Screening Verfahren ideal erscheint Um die dabei gewonnenen Ergebnisse richtig interpretieren zu können sind sicherlich weitere Untersuchungen auf molekularer Ebene nötig.
Die klinische Symptomatik verschiedener erblicher Muskelerkrankungen verläuft oft erstaunlich ähnlich mit Muskelschwäche und -schwund als den hervorstechenden Alltagsproblemen. Dem gegenüber sind die genetischen Grundlagen sehr vielfältig mit > 250 bisher identifizierten Genen (musclegenetable.org). Auch innerhalb eines definierten Krankheitsbildes werden verschiedene genetische Ursachen nebeneinander gefunden, was durch die Verknüpfung in einem gemeinsamen Pathomechanismus begründet sein kann. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten dieser genetischen Heterogenität am Beispiel der beiden häufigen Muskelerkrankungen Myotone Dystrophie (DM) und Facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD), bei denen alternative genetische Ursachen, sowie anknüpfende Fragestellungen untersucht wurden.
Das erste Projekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Fragestellungen, welche die DM betreffen. Die DM Typ 1 und Typ 2 (DM1 und DM2) bilden zusammen die häufigste Muskelerkrankung im Erwachsenenalter. Sie ist durch die gemeinsamen Symptome Myotonie, Muskelschwäche und Katarakt sowie die Beteiligung weiterer Organsysteme gekennzeichnet, was sie zu einer multisystemischen Erkrankung macht. Die genetische Ursache liegt für beide Formen in einer Repeatexpansion eines Mikrosatelliten in der untranslatierten Region zweier Gene (DMPK in DM1, CNBP in DM2). Dem gemeinsamen Pathomechanismus liegt eine toxische Funktionsgewinn-Mutation des expandierten RNA-Transkripts zugrunde.
Die beiden bekannten Formen der DM sind phänotypisch häufig nicht unterscheidbar, weshalb in vielen Fällen beide Erkrankungen molekulargenetisch untersucht werden müssen. Dabei ist die Diagnostik der DM durch die Notwendigkeit des Nachweises von sehr großen Repeatexpansionen recht aufwändig und die Bestimmung der Repeatlänge im Fall der DM2 nur eingeschränkt möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Test zum Nachweis der Repeatexpansionen auf der Basis der Methode des Molecular Combing entwickelt, welche den gleichzeitigen Nachweis der beiden Loci von DM1 und DM2 erlaubt und zusätzlich eine direkte Messung der Repeatlänge ermöglicht. Das Molecular Combing ist eine fluoreszenz-mikroskopische Einzelmolekül-Analysemethode, durch die es erstmals möglich wurde, die vermutete somatische Instabilität bei DM2 darzustellen.
Das zweite DM-Teilprojekt beschäftigt sich mit der Identifikation möglicher alternativer genetischer Ursachen für die Erkrankung. Dies wurde anhand einer Kohorte von 138 DM1- und DM2-negativen Indexpatienten mit dem typischen DM-Phänotyp untersucht. Ausgehend von dem gemeinsamen Pathomechanismus wurden die primären Krankheitsgene DMPK und CNBP, sowie CELF1 und MBNL1, welche wichtige Rollen auf sekundärer Ebene des Pathomechanismus spielen, mittels Next Generation Sequencing untersucht. Dabei wurde eine auffällige Variante in DMPK gefunden, keine Varianten in CNBP oder CELF1 und drei Varianten in MBNL1, was auf MBNL1 als Kandidatengen einer alternativen Ursache für DM hinweist. MBNL1 ist ein gewebespezifischer Spleißregulator, welcher einen Wechsel von einem fetalen zu einem adulten Spleißmuster im Muskel steuert. Die Pathogenität einer der Varianten wurde in einem RNA-Spleißassay mit MBNL1-Targetgenen untersucht. Dabei konnten keine spezifischen Spleiß-Effekte festgestellt werden, aber eine Verminderung des Expressionsniveaus im Sinne einer Haploinsuffizienz. Die 3D-Modellierung dieser Variante deutet auf Änderungen der Oberflächenladungen in MBNL1 hin. Der Nachweis der Pathogenität der Varianten und somit die Ursächlichkeit von MBNL1-Mutationen für DM konnte hiermit nicht abschließend geklärt werden. Die gefundenen Ergebnisse regen jedoch hoffentlich zu nachfolgenden Studien an.
Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Fragestellungen um die FSHD. Diese bildet die dritthäufigste Muskelerkrankung, charakterisiert durch eine oft asymmetrische Schwäche der Muskulatur von Gesicht, Schultergürtel und Oberarmen. Genetisch ist die FSHD Typ 1 (FSHD1) mit einer Kontraktion des Makrosatelliten D4Z4 verknüpft, was eine Relaxation der Chromatinstruktur der Region mit sich bringt und damit die ektopische Expression des apoptotisch wirkenden Proteins DUX4 ermöglicht. Die pathogene Ausprägung dieser Funktionsgewinn-Mutation findet dabei nur in Verbindung mit einem FSHD-permissiven Haplotyp statt.
Auf der Grundlage des gleichen Pathomechanismus wurde eine zweite Form der FSHD (FSHD2) vorgestellt, bei der die Chromatinrelaxation unabhängig von der Länge von D4Z4 durch einen Defekt in dem an der DNA-Methylierung beteiligten Gen SMCHD1 assoziiert sein soll. Die Vererbung von FSHD2 verläuft digenisch mit Mutationen in SMCHD1 und dem FSHD-permissiven Haplotyp auf zwei unabhängigen Loci. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Kohorte von 55 FSHD1-negativen Patienten mit dem typischen FSHD-Phänotyp untersucht. Dabei wurden der Haplotyp, die Methylierung von D4Z4 sowie das SMCHD1-Gen analysiert. Es konnten neun Patienten mit einem Defekt in SMCHD1 identifiziert werden. In einer zweiten Kohorte von 45 FSHD1-positiven Patienten wurde untersucht, ob SMCHD1-Mutationen auch in Kombination mit einer Kontraktion von D4Z4 vorkommen. Dieser Fall von FSHD1+2 konnte für drei Patienten gezeigt werden, welche außerdem einen auffällig schweren Phänotyp zeigten. SMCHD1 kann also als Modifier-Gen für die Schwere der Erkrankung bei FSHD1 angesehen werden. Damit wurden insgesamt zwölf SMCHD1-Mutationsträger identifiziert, davon sind zehn der Varianten noch nicht beschrieben worden. Für alle erkrankten Mutationsträger konnte eine Methylierung von D4Z4 ≤ 20 % ermittelt werden, was als diagnostisches Kriterium verwendet werden kann. Mit einem Anteil von 16,3 % Mutationsträger in der FSHD1-negetiven Kohorte bildet FSHD2 einen bedeutenden Anteil an dem Krankheitsbild der FSHD, weshalb die entwickelten Analysen in die Routinediagnostik eingegliedert wurden.
Das zweite Teilprojekt der FSHD beschäftigt sich mit der Funktion des SMCHD1-Gens bei der X-Inaktivierung (XI). Es ist bekannt, dass SMCHD1 bei weiblichen Mäusen an der Aufrechterhaltung der XI mitwirkt. Die Untersuchung der XI bei FSHD2-Frauen ergab eine extreme Verschiebung der erwarteten XI von 50:50 auf 0:100 oder 100:0 bei sechs von 13 Patientinnen. Die übrigen sieben zeigten eine XI im Normalbereich von > 20:80 oder < 80:20. Der Befund der einseitigen Verschiebung könnte auf einen negativen Selektionsdruck gegenüber Zellen mit unvollständiger XI hindeuten. Es wäre interessant zu untersuchen, ob sich der gleiche Effekt auch in einer größeren Kohorte wiederfindet und ob er sich mit der Art der Mutation korrelieren lässt.
ZELLZYKLUSEFFEKTE VON MITOMYCIN C Im Rahmen dieser Arbeit sollten die durch Mitomycin C (MMC) exogen induzierten Zellzyklusstörungen mit den endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fanconi-Anämie in unterschiedlichen Zellsystemen (periphere Blutlymphozyten, lymphoblastoide Zellen und Fibroblasten) verglichen werden. Die Zellzyklusanalysen wurden mit der zweidimensionalen Durchflusszytometrie nach dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren durchgeführt. Mit diesem Verfahren ist es möglich zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen (Ellwart, Stunkel et al. 1981) zu unterscheiden und Verteilungen der Zellen in bis zu vier Zellzyklusphasen mit quantitativer Analyse der Populationen während der G0-G1-, G1-, S- und G2-Phasen zu erfassen (Kubbies 1989). Das Ausscheiden von Zellen aus dem Zellzyklus kann dabei über die Akkumulation in den entsprechenden Phasenanteilen des Zellzyklus erfasst werden. Die Induktion von Zellzyklusstörungen erfolgte mit dem bifunktionellen Alkylanz Mitomycin C. Die Applikation von Mitomycin C (MMC) führte dabei vor allem zu einer dosisabhängigen Zunahme der G2-Phasenanteile der Zellzyklen, was als Akkumulation von Zellen innerhalb dieses Kompartiments zu verstehen ist. Diese Akkumulation konnte bei den durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen mit der abgeleiteten Größe Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) proliferationsunabhängig erfasst werden. Die konzentrationsabhängige Zunahme der G2-Phasenakkumulation und die unterschiedliche Verteilung innerhalb der Zellzyklen wurden mit den beiden Parametern Increased S G2+G2`/GF und Increased S G2/GF festgehalten und ausgewertet. Die Untersuchungen mit peripheren Blutlymphozyten, lymphoblastoiden Zellen (B-LCL) und Fibroblasten von gesunden Kontrollpersonen zeigten, dass sich die durch Mitomycin C induzierten DNA-Schädigungen bei durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen vor allem als G2-Phasenakkumulation darstellen. Demgegenüber lagen die ermittelten Werte der S G2/GF von Fa-Individuen bereits bei Standardzellkulturen über denen der gesunden Versuchspersonen. Vor allem bei den Zellzyklusstudien mit peripheren Blutlymphozyten von Fanconi-Anämie Patienten zeigten sich bereits endogen eine massive Erhöhung der G2-Phasenanteile. Im Vergleich zu den untersuchten Kontrollen war die Mitomycin C induzierte Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen nicht beliebig steigerbar. Die untersuchten Zellsysteme zeigten verschiedene Proliferationsmuster und reagierten mit einer unterschiedlich starken Arretierung von Zellen in den G2-Phasen bei Zugabe von Mitomycin C. Als sensitivste Zellart reagierten subkutane menschliche Fibroblasten bei Applikation von Mitomycin C. Bei den durchgeführten Zellzyklusanalysen zeigte sich aber auch, dass bei hohen Konzentration von Mitomycin C (MMC) die zytoxischen Effekte von Mitomycin C überwiegen und es zu einem starken Rückgang des Zellwachstums kommt. Da die exogen induzierten Zellzyklusstörungen durch Mitomycin C bei gesunden Kontrollpersonen mit den typischen endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fa-Individuen vergleichbar waren, kann als mögliche Ursache für Fanconi-Anämie auf einen DNA-Reparaturdefekt geschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch Zellen von obligat heterozygoten Fa-Individuen mit dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren untersucht. War bei Fa-homozygoten Patienten bereits endogen die Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen deutlich gegenüber den gesunden Kontrollpersonen erhöht, so konnte dies für Fa-heterozygote Individuen nicht gezeigt werden. Die ermittelten Werte der Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) lagen zwar dabei vor allem bei den untersuchten peripheren Blutlymphozyten und subkutanen Fibroblasten etwas über den Kontrollen. Mit den hier vorgelegten Daten aus den Zellzyklusanalysen war aber keine Unterscheidung zwischen den obligat heterozygoten Fa-Individuen und den gesunden Probanden möglich. Die Ergebnisse stehen dennoch im Einklang mit den zytogenetischen Untersuchungen auf erhöhte Chromosomenbruchraten bei Verdacht auf Fanconi-Anämie.
Prerequisite to any biological laboratory assay employing living animals is consideration about its necessity, feasibility, ethics and the potential harm caused during an experiment. The imperative of these thoughts has led to the formulation of the 3R-principle, which today is a pivotal scientific standard of animal experimentation worldwide. The rising amount of laboratory investigations utilizing living animals throughout the last decades, either for regulatory concerns or for basic science, demands the development of alternative methods in accordance with 3R to help reduce experiments in mammals. This demand has resulted in investigation of additional vertebrate species displaying favourable biological properties. One prominent species among these is the zebrafish (Danio rerio), as these small laboratory ray-finned fish are well established in science today and feature outstanding biological characteristics. In this review, we highlight the advantages and general prerequisites of zebrafish embryos and larvae before free-feeding stages for toxicological testing, with a particular focus on cardio-, neuro, hepato- and nephrotoxicity. Furthermore, we discuss toxicokinetics, current advances in utilizing zebrafish for organ toxicity testing and highlight how advanced laboratory methods (such as automation, advanced imaging and genetic techniques) can refine future toxicological studies in this species.
Background
Although Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by mutations in the α-galactosidase A gene (GLA), women may develop severe symptoms. We investigated X-chromosomal inactivation patterns (XCI) as a potential determinant of symptom severity in FD women.
Patients and Methods
We included 95 women with mutations in GLA (n = 18 with variants of unknown pathogenicity) and 50 related men, and collected mouth epithelial cells, venous blood, and skin fibroblasts for XCI analysis using the methylation status of the androgen receptor gene. The mutated X-chromosome was identified by comparison of samples from relatives. Patients underwent genotype categorization and deep clinical phenotyping of symptom severity.
Results
43/95 (45%) women carried mutations categorized as classic. The XCI pattern was skewed (i.e., ≥75:25% distribution) in 6/87 (7%) mouth epithelial cell samples, 31/88 (35%) blood samples, and 9/27 (33%) skin fibroblast samples. Clinical phenotype, α-galactosidase A (GAL) activity, and lyso-Gb3 levels did not show intergroup differences when stratified for X-chromosomal skewing and activity status of the mutated X-chromosome.
Conclusions
X-inactivation patterns alone do not reliably reflect the clinical phenotype of women with FD when investigated in biomaterial not directly affected by FD. However, while XCI patterns may vary between tissues, blood frequently shows skewing of XCI patterns.
Plasma- und Serumproben waren in früheren epidemiologischen Studien häufig das einzige biologische Material, das gesammelt und untersucht wurde. Diese Studien besitzen gerade durch ihren sehr langen Untersuchungszeitraum einen riesigen Informationsgehalt und wären ein unbezahlbarer Schatz für genetische Analysen. Oft ist aufgrund damals mangelnder Akquirierung jedoch keine genomische DNA verfügbar. Um die in Plasmaproben in geringer Menge vorkommende DNA verwenden zu können, extrahierten wir die DNA mit Hilfe von magnetischen Partikeln und setzten sie in eine Whole Genome Amplification (WGA) mittels Φ29-DNA-Polymerase ein. Wir stellten 88 Probenpärchen, bestehend aus einer WGA-Plasma-DNA und der korrespondierenden Vollblut-DNA derselben Person, zusammen und genotypisierten bei diesen neun hochpolymorphe Short Tandem Repeats (STR) und 25 SNPs. Die durchschnittliche innerhalb der Probenpaare auftretende Diskordanzrate betrug 3,8% für SNPs sowie 15,9% für STRs. Basierend auf den Ergebnissen der Hälfte der Probenpaare entwickelten wir einen Ausschlussalgorithmus und validierten diesen in der anderen Hälfte der Probenpaare. Mit diesem ist es möglich, zum Einen diejenigen Proben mit einer guten DNA-Qualität herauszufiltern, um Genotypisierungsfehler zu vermeiden, und zum Anderen jene Proben mit insuffizienter DNA-Qualität auszuschließen. Nachdem Proben, die fünf oder mehr homozygote Loci in dem 9-STR-Markerset aufwiesen, ausgeschlossen wurden, resultierte dies in einer Ausschlussrate von 22,7% und senkte die durchschnittliche Diskordanzrate auf 3,92% für STRs bzw. 0,63% für SNPs. Bei SNPs entspricht dieser Wert ungefähr der Fehlerquote, wie er auch bei Genotypisierungen mit Vollblut-DNA in vielen Laboratorien auftritt. Unsere Methode und das Ausschlusskriterium bieten damit neue Möglichkeiten, um zuverlässige DNA aus archivierten Plasmaproben wiederzugewinnen. Dieser Algorithmus ist auch besser geeignet, als nur die eingesetzte DNA-Menge in die WGA-Reaktion als Kriterium zu benützen.
„Die berufspolitische Situation für die Humangenetischen Institute hat sich an den Universitäten in den letzten zwei Jahren leider nicht verbessert. Vielen Instituten wurde der Zugang zur Erbringung von Kassenleistungen deutlich erschwert bzw. gänzlich entzogen.“ (Grimm, T.; Zerres, K., 2005, S. 41). Eine Analyse der Rechtsform und Aufbauorganisation sowie der Leistungen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg kann als Grundlage dienen, um die Auswirkungen einer entzogenen Kassenzulassung besser verstehen zu können. Zudem ermöglicht eine solche Betrachtung die Ableitung von Erfordernissen, die eine optimale Rechtsform und Aufbauorganisation des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg erfüllen sollte. Zusammenfassend können dann die aktuellen und zukünftigen Rahmenbedingungen für die humangenetische Leistungserbringung bei bestehender Rechtsform und Aufbauorganisation beschrieben werden. Es wird deutlich, dass aufgrund eines drohenden Entzuges der Kassenzulassung eine Gefährdung der Erbringung humangenetischer Leistungen an der Universität Würzburg besteht. Die Finanzierung der erbrachten Leistungen in der Patientenversorgung wird zu ca. 75% von den gesetzlichen Krankenkassen getragen. Ein Wegbrechen eines solchen Leistungsumfanges hätte kaum kompensierbare Auswirkungen auf Forschung, Lehre, Weiterbildung und die Patientenversorgung an sich. Durch die Reformen des SGB aus dem Jahre 2004 sind verschiedene Alternativen zur bestehenden Rechtsform und Aufbauorganisation möglich geworden. Hierbei handelt es sich um Hochschulambulanzen (gem. §117 SGB V), Integrierte Versorgung (gem. §140 SGB V) und Medizinische Versorgungszentren (gem. §95 SGB V). Zudem gibt es die Möglichkeit einer „Praxis im Institut“-Kooperation. Diese Alternativen werden in der hier vorliegenden Arbeit kurz einzeln charakterisiert, um dann eine Bewertung der möglichen Rechtsformen und Aufbauorganisationen gemäß am Institut bestehender Erfordernisse zu ermöglichen. Die vergleichende Betrachtung wird zeigen, dass ein Medizinisches Versorgungszentrum (MVZ) eine gute Möglichkeit darstellt, die beschriebene Problematik zu lösen und die Erfordernisse des Instituts zu erfüllen. Im Anschluss werden die rechtlichen und organisatorischen Ausgestaltungsmöglichkeiten eines MVZs zur Erbringung humangenetischer Leistungen beleuchtet. Hierbei wird im Besonderen auf die gesetzlichen Gründungsvoraussetzungen eingegangen. Die Anforderungen an Gründer, Rechtsform, Leistungserbringer und ärztliche Leitung werden detailliert beschrieben, und die jeweiligen Gestaltungsmöglichkeiten im Hinblick auf die am Institut bestehenden Erfordernisse gewertet. Im Anschluss kann der Zulassungsprozess des MVZs an sich betrachtet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia beschrieben. Hierzu wurden die Daten von 327 Patienten ausgewertet. In 82 Fällen ergab sich eine Bestätigung der Verdachtsdiagnose, in 225 Fällen konnte das Vorliegen dieser Erkrankung ausgeschlossen werden, bei den übrigen untersuchten Fällen ergab die Zellzyklusanalyse Auffälligkeiten hinsichtlich des Proliferationsverhaltens der untersuchten Zellen und/oder ihrer Strahlensensitivität, die eine eindeutige Zuordnung zu einer der beiden Gruppen (AT-postiv/AT-negativ) zunächst nicht gestatteten. Diese Auffälligkeiten lassen sich teils auf technische Probleme (geronnenes Blut, langer Zeitraum zwischen Blutentnahme und Analyse), teils auf biologische Besonderheiten (bestehende Begleiterkrankungen wie Leukämie, Lymphom) zurückführen. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von Lymphozyten ergibt als diagnostisch relevante Parameter den Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) sowie den Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF). Der Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) ist ein Maß für die Stimulierbarkeit der Lymphozyten. Diese Stimulierbarkeit ist bei Zellen von AT-Patienten häufig vermindert, d.h. das Ausmaß der Mitogenantwort gibt ebenso einen Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung AT wie die Strahlensensitivität der Zellen. Letztere wird durch den zweiten der oben angeführten Parameter (G2/GF) repräsentiert. Der für die Erkrankung AT charakteristische Funktionsverlust des ATM-Proteins, welches im unbeeinträchtigten Zustand für die Kontrolle der Reparatur von strahleninduzierten DNA-Schädigungen verantwortlich ist, führt typischerweise zu einer Erhöhung des Anteils von Zellen in der G2-Phase, nachdem diese Zellen ionisierender Strahlung ausgesetzt waren. Die zweidimensionale Auftragung dieser Parameter (G0,G1 gegen G2/GF) erlaubt in der Regel bereits eine guten Abgrenzung der Gruppe der AT-positiven gegen die AT-negativen Fälle. Die Berücksichtigung eines weiteren Parameters, nämlich des AFP-Wertes, gestattet darüberhinaus in mehreren Fällen die Zuordnung der oben erwähnten, zunächst unklaren Fälle zu einer dieser Gruppen. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von bestrahlten Lymphozyten kann daher als Screening-Methode bei der Untersuchung von Patienten mit der Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia als ein dem CSA überlegenes Verfahren angesehen werden. Die Kombination dreier Parameter: 1) Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1), 2) Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF) und 3) AFP-Wert erlaubt hierbei im Rahmen der AT-Diagnostik in >93% der Fälle eine eindeutige Zuordnung zur Gruppe der AT-negativen bzw. AT-positiven Fälle.
Background: Myofibrillar myopathies (MFM) are a group of phenotypically and genetically heterogeneous neuromuscular disorders, which are characterized by protein aggregations in muscle fibres and can be associated with multisystemic involvement.
Methods: We screened a large cohort of 38 index patients with MFM for mutations in the nine thus far known causative genes using Sanger and next generation sequencing (NGS). We studied the clinical and histopathological characteristics in 38 index patients and five additional relatives (n = 43) and particularly focused on the associated multisystemic symptoms.
Results: We identified 14 heterozygous mutations (diagnostic yield of 37%), among them the novel p. Pro209Gln mutation in the BAG3 gene, which was associated with onset in adulthood, a mild phenotype and an axonal sensorimotor polyneuropathy, in the absence of giant axons at the nerve biopsy. We revealed several novel clinical phenotypes and unusual multisystemic presentations with previously described mutations: hearing impairment with a FLNC mutation, dysphonia with a mutation in DES and the first patient with a FLNC mutation presenting respiratory insufficiency as the initial symptom. Moreover, we described for the first time respiratory insufficiency occurring in a patient with the p. Gly154Ser mutation in CRYAB. Interestingly, we detected a polyneuropathy in 28% of the MFM patients, including a BAG3 and a MYOT case, and hearing impairment in 13%, including one patient with a FLNC mutation and two with mutations in the DES gene. In four index patients with a mutation in one of the MFM genes, typical histological findings were only identified at the ultrastructural level (29%).
Conclusions: We conclude that extraskeletal symptoms frequently occur in MFM, particularly cardiac and respiratory involvement, polyneuropathy and/or deafness. BAG3 mutations should be considered even in cases with a mild phenotype or an adult onset. We identified a genetic defect in one of the known genes in less than half of the MFM patients, indicating that more causative genes are still to be found. Next generation sequencing techniques should be helpful in achieving this aim.
Untersuchungen zur Informationsweitergabe in Familien mit erblichem Brust- und Eierstockkrebs
(2021)
Für die hier beschriebene Studie wurde ein Fragebogen erstellt, welcher von 80 Trägerinnen und Trägern einer pathogenen Mutation in den Genen BRCA1 oder BRCA2 ausgefüllt wurde. Die Befragung sollte untersuchen, ob den Befragten das Risiko ihrer Verwandten, ebenso Mutationsträger zu sein, bewusst war. Weiterhin sollte ermittelt werden, ob sie die jeweiligen Risikopersonen darüber informierten. Es zeigte sich, dass den meisten Befragten dieses Risiko bekannt war. Einigen Personen schienen jedoch nicht genau zu wissen, welche Verwandten als „Risikopersonen“ zählen. Insbesondere war nicht allen Befragten die Möglichkeit bewusst, dass auch Männer die Mutation tragen und an ihre Kinder weitergeben sowie selbst an Brustkrebs erkranken können. Weiterhin gaben mehr als ein Viertel der Befragten an, dass sie mindestens ein Familienmitglied, obwohl es ihnen als Risikoperson bekannt war, nicht informierten. Als häufigste Grund hierfür wurde mangelnder Kontakt genannt. Vor dem Hintergrund der Angaben der Befragten sowie der aktuellen Forschungslage werden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten diskutiert, wie die Anzahl der informierten Angehörigen verbessert werden könnte.
Hereditäre Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auffällig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen einiger ausgewählter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgeklärt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte für 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine häufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge Männer weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Veränderungen der zentralen Retina führen. Ungefähr 50 % der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert für ein putatives 224 Aminosäuren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindomänen-Motiv enthält. Discoidindomänen sind in Zelladhäsion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten bestätigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfläche der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der äußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell für die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren führen. Gegenwärtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgeführt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß darüber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein möglicher Therapieansatz für RS auch beim Menschen sein könnte.
Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen über den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße für die Erforschung hereditärer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgewählter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beiträge für die Aufklärung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areoläre Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgeführt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Darüber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine häufige Ursache für den frühzeitigen Verlust der zentralen Sehschärfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region ermöglichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Domäne enthält. Diese Domäne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzveränderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und räumliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus hauptsächlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radiärer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer Ätiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radiäre Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken führte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollständige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandomänen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radiären Drusen zeigten keinerlei Sequenzveränderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der phänotypisch sehr ähnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), führte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Veränderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquitär exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verfügung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radiären Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsfähigkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Domänen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst ermöglichen. Die Einführung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline gehörenden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabhängigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die räumliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der äußeren und inneren Körnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen.
In dieser Arbeit wird anhand eines Würzburger Studienkollektivs von erblich an Brust-und Ovarialkrebs Erkrankten, das 150 Ratsuchende umfasst, das Risikokalkulationsprogramm Cyrillic 2.13 zur Abschätzung von Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeiten bei erblichem Brust- und Ovarialkrebs untersucht. Es werden die vom Programm berechneten Mutationswahrscheinlichkeiten mit dem tatsächlichen Mutationsstatus der Probanden verglichen. Außerdem werden Stammbäume der Probanden auf Angehörige 1. und 2. Generation gekürzt, um zu untersuchen, ob dies die errechneten Ergebnisse beeinflusst. Es zeigt sich hierbei jedoch kein signifikanter Unterschied.
Die Arbeit zeigt, dass die Symptome der HPP sehr variabel und unterschiedlich stark auftreten können. Dies erschwert die klinische Diagnosestellung der Erkrankung. Nahezu alle Patienten berichteten von starken Knochen-, Gelenk,- und Muskelschmerzen, von Karies und Parodontose sowie von vermehrten Frakturen, die zum Teil weitere chronische Schmerzen und Wiederholungsfrakturen erzeugen. Eine deutlich verminderte Leistungsfähigkeit im Vergleich zu Gleichaltrigen wurde ebenso häufig angegeben. Es konnte keine eindeutige Phänotyp - Genotyp Korrelation gefunden werden, allerdings geben die Daten einen deutlichen Hinweis, dass Patienten mit zwei Mutationen am stärksten symptomatisch betroffen sind.
Ebenfalls konnten keine Unterschiede zwischen dominant negativen Mutationen und nicht dominant negativen Mutationen gefunden werden.
Usher syndrome, the most prevalent cause of combined hereditary vision and hearing impairment, is clinically and genetically heterogeneous. Moreover, several conditions with phenotypes overlapping Usher syndrome have been described. This makes the molecular diagnosis of hereditary deaf-blindness challenging. Here, we performed exome sequencing and analysis on 7 Mexican and 52 Iranian probands with combined retinal degeneration and hearing impairment (without intellectual disability). Clinical assessment involved ophthalmological examination and hearing loss questionnaire. Usher syndrome, most frequently due to biallelic variants in MYO7A (USH1B in 16 probands), USH2A (17 probands), and ADGRV1 (USH2C in 7 probands), was diagnosed in 44 of 59 (75%) unrelated probands. Almost half of the identified variants were novel. Nine of 59 (15%) probands displayed other genetic entities with dual sensory impairment, including Alström syndrome (3 patients), cone-rod dystrophy and hearing loss 1 (2 probands), and Heimler syndrome (1 patient). Unexpected findings included one proband each with Scheie syndrome, coenzyme Q10 deficiency, and pseudoxanthoma elasticum. In four probands, including three Usher cases, dual sensory impairment was either modified/aggravated or caused by variants in distinct genes associated with retinal degeneration and/or hearing loss. The overall diagnostic yield of whole exome analysis in our deaf-blind cohort was 92%. Two (3%) probands were partially solved and only 3 (5%) remained without any molecular diagnosis. In many cases, the molecular diagnosis is important to guide genetic counseling, to support prognostic outcomes and decisions with currently available and evolving treatment modalities.
Rare variants in at least 10 genes, including BRCA1, BRCA2, PALB2, ATM, and CHEK2, are associated with increased risk of breast cancer; however, these variants, in combination with common variants identified through genome-wide association studies, explain only a fraction of the familial aggregation of the disease. To identify further susceptibility genes, we performed a two-stage whole-exome sequencing study. In the discovery stage, samples from 1528 breast cancer cases enriched for breast cancer susceptibility and 3733 geographically matched unaffected controls were sequenced. Using five different filtering and gene prioritization strategies, 198 genes were selected for further validation. These genes, and a panel of 32 known or suspected breast cancer susceptibility genes, were assessed in a validation set of 6211 cases and 6019 controls for their association with risk of breast cancer overall, and by estrogen receptor (ER) disease subtypes, using gene burden tests applied to loss-of-function and rare missense variants. Twenty genes showed nominal evidence of association (p-value < 0.05) with either overall or subtype-specific breast cancer. Our study had the statistical power to detect susceptibility genes with effect sizes similar to ATM, CHEK2, and PALB2, however, it was underpowered to identify genes in which susceptibility variants are rarer or confer smaller effect sizes. Larger sample sizes would be required in order to identify such genes.
Background
The vast majority of cases with Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) are caused by a molecular defect in the imprinted chromosome region 11p15.5. The underlying mechanisms include epimutations, uniparental disomy, copy number variations, and structural rearrangements. In addition, maternal loss-of-function mutations in CDKN1C are found. Despite growing knowledge on BWS pathogenesis, up to 20% of patients with BWS phenotype remain without molecular diagnosis.
Case presentation
Herein, we report an Iranian family with two females affected with BWS in different generations. Bisulfite pyrosequencing revealed hypermethylation of the H19/IGF2: intergenic differentially methylated region (IG DMR), also known as imprinting center 1 (IC1) and hypomethylation of the KCNQ1OT1: transcriptional start site (TSS) DMR (IC2). Array CGH demonstrated an 8 Mb duplication on chromosome 11p15.5p15.4 (205,827-8,150,933) and a 1 Mb deletion on chromosome 9p24.3 (209,020-1,288,114). Chromosome painting revealed that this duplication-deficiency in both patients is due to unbalanced segregation of a paternal reciprocal t(9;11)(p24.3;p15.4) translocation.
Conclusions
This is the first report of a paternally inherited unbalanced translocation between the chromosome 9 and 11 short arms underlying familial BWS. Copy number variations involving the 11p15.5 region are detected by the consensus diagnostic algorithm. However, in complex cases which do not only affect the BWS region itself, characterization of submicroscopic chromosome rearrangements can assist to estimate the recurrence risk and possible phenotypic outcomes.
Die Fallbeschreibungen der vorliegenden Arbeit befassen sich mit der Entwicklung von vier Legasthenikern bis in das Erwachsenenalter hinein. Dabei wird besonders auf die schulische und berufliche Entwicklung, die Förderung und Therapie sowie die psychische Situation eingegangen. Anschließend erfolgt ein Vergleich mit weiteren Studien, die Legastheniker über einen längeren Zeitraum begleitet haben. Es wird deutlich, dass die Entwicklung von Kindern mit einer Lese-Rechtschreibstörung entscheidend von verschiedenen Rahmenbedingungen, wie zum Beispiel einer frühen legastheniespezifischen Förderung, einer schulischen Berücksichtigung der Lese-Rechtschreibstörung, der Unterstützung durch die Familie und der Herkunft abhängt. Unter optimalen Rahmenbedingungen haben auch Legastheniker die Chance, einen ihrer Intelligenz entsprechenden Schulabschluss und einen gehobenen Beruf zu erlangen.
Treatment of dysferlinopathy with deflazacort: a double-blind, placebo-controlled clinical trial
(2013)
Background: Dysferlinopathies are autosomal recessive disorders caused by mutations in the dysferlin (DYSF) gene encoding the dysferlin protein. DYSF mutations lead to a wide range of muscular phenotypes, with the most prominent being Miyoshi myopathy (MM) and limb girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B).
Methods: We assessed the one-year-natural course of dysferlinopathy, and the safety and efficacy of deflazacort treatment in a double-blind, placebo-controlled cross-over trial. After one year of natural course without intervention, 25 patients with genetically defined dysferlinopathy were randomized to receive deflazacort and placebo for six months each (1 mg/kg/day in month one, 1 mg/kg every 2nd day during months two to six) in one of two treatment sequences. Results: During one year of natural course, muscle strength declined about 2% as measured by CIDD (Clinical Investigation of Duchenne Dystrophy) score, and 76 Newton as measured by hand-held dynamometry. Deflazacort did not improve muscle strength. In contrast, there is a trend of worsening muscle strength under deflazacort treatment, which recovers after discontinuation of the study drug. During deflazacort treatment, patients showed a broad spectrum of steroid side effects.
Conclusion: Deflazacort is not an effective therapy for dysferlinopathies, and off-label use is not warranted. This is an important finding, since steroid treatment should not be administered in patients with dysferlinopathy, who may be often misdiagnosed as polymyositis.
The human retina is a multilayered neuroectodermal tissue specialized in the transformation of light energy into electric impulses which can be transmitted to the brain where they are perceived as vision. Since the retina is easily accessible and functional aspects are directly recordable, the study of this tissue has been at the forefront of neuroscience research for over a century. Studies have revealed that the distinct functions of the retina require a large degree of differentiation which is achieved by the coordinated function of approximately 55 different cell types. The highly structured anatomy and the functional differentiation of the retina is a result of its distinctive transcriptome and proteome. Due to the complexity of the retina it has been difficult to estimate the number of genes actively transcribed in this tissue. Great efforts in the elucidation of retinal disease genes have led to the identification of 139 retina disease loci with 90 of the corresponding genes cloned thus far . In contrast to the success in the hereditary disorders, efforts to identify the genetic factors conferring manifestations known as age-related macular degeneration (AMD) have revealed sparse results. AMD is a retinal disease affecting a significant percentage of the older population. This disorder is likely due to exogenic as well as genetic factors. To further our understanding of retinal physiology and facilitate the identification of genes underlying retinal degenerations, particularly AMD, our efforts concentrated on the systematic analysis of the retinal transcriptome. Since approximately half of all retinal degeneration-associated genes identified to date are preferentially expressed in retina, it is plausible that the investigation of gene expression profiles and the identification of retina-expressed transcripts could be an important starting point for characterizing candidate genes for the retinal diseases. The expressed sequence tags approach included the assessment of all retinal expressed sequence tags (EST) clusters indexed in the UniGene database and of 1080 single-pass ESTs derived from an in-house generated human retina suppression subtracted hybridization (SSH) cDNA library. In total, 6603 EST clusters were evaluated during this thesis and detailed in-silico analysis was performed on 750 EST clusters. The expression of the genes was evaluated using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), followed by confirmation using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), as well as conventional and virtual Northern blot analysis. The expression profiling of 337 selected EST clusters led to the identification of 111 transcripts, of which 60 are specific or abundant to the retina, 3 are expressed at high levels in the retinal pigment epithelium (RPE), and 48 are expressed in brain as well as in retina. The EST approach used to select candidate transcripts allowed us to assess the effectiveness of the two available resources, the UniGene database and the retinal SSH (retSSH) cDNA library. From the results obtained, it is evident that the generation of suppression subtracted libraries to identify cell-specific transcripts constitutes the most straight-forward and efficient strategy. In addition to the high percentage of candidate genes that are identified from an SSH cDNA library, it has the added benefit that genes expressed at low levels can be identified. Furthermore, comparison of our retina-enriched gene set with previously published studies demonstrated only limited overlap of the identified genes further confirming the valuable source of retinal genes from our retinal SSH cDNA library. The effort of our and other groups has resulted in the establishment of the full-length coding sequence of 55 of the 111 genes uniquely or preferentially expressed in the retina. Using various methods such as bioinformatical analysis, EST assembly, cDNA library screening, and rapid amplification of cDNA ends (RACE) a number of genes were cloned in the scope of this thesis including C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1, and GRM7. Bioinformatic analyses and cDNA library screening were used to isolate the full-length cDNA sequence and determine the genomic organization of C7orf9, also identified as RFRP. This 1190 bp retina-specific transcript from chromosome 7p15.3 encodes a precursor protein for at least two small neuropeptides, referred to as RFRP-1 and RFRP-3. Since C7orf9 is localized in the critical region for dominant cystoid macular dystrophy (CYMD) its role in the pathology was investigated. Southern blot analysis and sequencing of samples from two affected individuals of the original pedigree used to localize the disease gene excluded the gene from involvement in this disease. Multiple isoforms of the C12orf7 gene were assembled from a number of clones identified from library screenings, PCR amplifications, and RACE experiments. The gene variants, transcribed from chromosome 12q13.13, have been found to be expressed exclusively in retina. Because of the multiple alternative splicing of the gene, we can only speculate about the nature of the protein it encodes. The longest transcript, which includes all six exons plus the last intervening sequence, encodes a 471 aa protein which contains a nuclear localization signal and five ankyrin repeats. The existence of many isoforms is also observed in mouse suggesting that they may have a relevant role in cellular physiology. Five novel splice variants of the glutamate metabotropic receptor 7 (GRM7) resulting from the use of alternative 3’-end exons were identified and characterized. One of the novel variants, GRM7_v3, encodes a 924 aa protein and is therefore the longest putative GRM7 protein reported to date. Even though they are not retina-specific, the isoforms are preferentially expressed in the nervous system. Although the functional properties of the specific carboxyl-termini are still unclear, it is known that axon targeting of GRM7_v1 is mediated by the last 60 aa of the protein. Hence the novel isoforms may direct the protein to specific subcellular localizations. The C1orf32 gene, preferentially expressed in retina, is organized in 10 exons and is transcribed from chromosome 1q24.1. Bioinformatic analyses of the 639 aa putative protein not only identified the mouse and rat orthologous genes but also the LISCH7 gene as a potential member of the same family. Since the LISCH7 protein has been shown to function as a low density lipoprotein receptor, the C1orf32 protein may be involved in retinal lipid homeostasis. Disturbances in lipid metabolism have been proposed as one of the pathways involved in AMD etiology. Thus, the role of C1orf32 in this complex disease should be investigated. Expression analyses of the death-associated protein-like 1 (DAPL1) gene revealed that it is expressed in both the retina and the RPE at high levels. The 552 bp transcript encodes a 107 aa putative protein and is transcribed from chromosome 2q24.1. In-silico analyses identified an additional 12 related proteins from various species which share high similarity constituting a novel protein family. The similarity to the death-associated-protein (DAP) is particularly interesting since this protein has been found to be indispensable for programmed cell death. Therefore, DAPL1 is an excellent candidate for retinal disease as apoptosis is generally the ultimate cause in retinal degeneration. The retina-specific C4orf11 and C14orf29 genes localized on chromosome 4q21.22 and 14q22.1, respectively, are both transcribed in more than one isoform. The encoded proteins do not contain any known domains but because of their retina-specific expression they may be important for proper retinal physiology. As part of the long-term goals of the project, several of the cloned genes are being genotyped to construct single nucleotide polymorphism (SNP) maps. Projects to investigate haplotype frequencies of candidate genes in large cohorts of controls and AMD patients are ongoing. Thus, by establishing a collection of 111 genes expressed exclusively or preferentially in the retina, the present work has laid the foundation for future research in retinal diseases.
This review summarizes important information on the ectoenzyme tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and gives a brief insight into the symptoms, diagnostics, and treatment of the rare disease Hypophosphatasia (HPP), which is resulting from mutations in the TNAP encoding ALPL gene. We emphasize the role of TNAP beyond its well-known contribution to mineralization processes. Therefore, above all, the impact of the enzyme on central molecular processes in the nervous system and on inflammation is presented here.
Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) is a ubiquitously expressed enzyme that is best known for its role during mineralization processes in bones and skeleton. The enzyme metabolizes phosphate compounds like inorganic pyrophosphate and pyridoxal-5′-phosphate to provide, among others, inorganic phosphate for the mineralization and transportable vitamin B6 molecules. Patients with inherited loss of function mutations in the ALPL gene and consequently altered TNAP activity are suffering from the rare metabolic disease hypophosphatasia (HPP). This systemic disease is mainly characterized by impaired bone and dental mineralization but may also be accompanied by neurological symptoms, like anxiety disorders, seizures, and depression. HPP characteristically affects all ages and shows a wide range of clinical symptoms and disease severity, which results in the classification into different clinical subtypes. This review describes the molecular function of TNAP during the mineralization of bones and teeth, further discusses the current knowledge on the enzyme’s role in the nervous system and in sensory perception. An additional focus is set on the molecular role of TNAP in health and on functional observations reported in common laboratory vertebrate disease models, like rodents and zebrafish.
Background
The impact of task relevance on event-related potential amplitudes of early visual processing was previously demonstrated. Study designs, however, differ greatly, not allowing simultaneous investigation of how both degree of distraction and task relevance influence processing variations. In our study, we combined different features of previous tasks. We used a modified 1-back task in which task relevant and task irrelevant stimuli were alternately presented. The task irrelevant stimuli could be from the same or from a different category as the task relevant stimuli, thereby producing high and low distracting task irrelevant stimuli. In addition, the paradigm comprised a passive viewing condition. Thus, our paradigm enabled us to compare the processing of task relevant stimuli, task irrelevant stimuli with differing degrees of distraction, and passively viewed stimuli. EEG data from twenty participants was collected and mean P100 and N170 amplitudes were analyzed. Furthermore, a potential connection of stimulus processing and symptoms of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) was investigated.
Results
Our results show a modulation of peak N170 amplitudes by task relevance. N170 amplitudes to task relevant stimuli were significantly higher than to high distracting task irrelevant or passively viewed stimuli. In addition, amplitudes to low distracting task irrelevant stimuli were significantly higher than to high distracting stimuli. N170 amplitudes to passively viewed stimuli were not significantly different from either kind of task irrelevant stimuli. Participants with more symptoms of hyperactivity and impulsivity showed decreased N170 amplitudes across all task conditions. On a behavioral level, lower N170 enhancement efficiency was significantly correlated with false alarm responses.
Conclusions
Our results point to a processing enhancement of task relevant stimuli. Unlike P100 amplitudes, N170 amplitudes were strongly influenced by enhancement and enhancement efficiency seemed to have direct behavioral consequences. These findings have potential implications for models of clinical disorders affecting selective attention, especially ADHD.
Several attributes intuitively considered to be typical mammalian features, such as complex behavior, live birth and malignant disease such as cancer, also appeared several times independently in lower vertebrates. The genetic mechanisms underlying the evolution of these elaborate traits are poorly understood. The platyfish, X. maculatus, offers a unique model to better understand the molecular biology of such traits. We report here the sequencing of the platyfish genome. Integrating genome assembly with extensive genetic maps identified an unexpected evolutionary stability of chromosomes in fish, in contrast to in mammals. Genes associated with viviparity show signatures of positive selection, identifying new putative functional domains and rare cases of parallel evolution. We also find that genes implicated in cognition show an unexpectedly high rate of duplicate gene retention after the teleost genome duplication event, suggesting a hypothesis for the evolution of the behavioral complexity in fish, which exceeds that found in amphibians and reptiles.
Western societies are steadily becoming older undergoing a clear trend of delayed parenthood. Children of older fathers have an undeniably higher risk for certain neurodevelopmental disorders and other medical conditions. Changes in the epigenetic landscape and especially in DNA methylation patterns are likely to account for a portion of this inherited disease susceptibility. DNA methylation changes during the ageing process are a well-known epigenetic feature. These so-called age-DMRs exist in developmentally important genes in the methylome of several mammalian species. However, there is only a minor overlap between the age-DMR datasets of different studies. We therefore replicated age-DMRs (which were obtained from a genome wide technique) by applying a different technical approach in a larger sample number. Here, this study confirmed 10 age-DMRs in the human and 4 in the bovine sperm epigenome from a preliminary candidate list based on RRBS. For this purpose, we used bisulphite Pyrosequencing in 94 human and 36 bovine sperm samples. These Pyrosequencing results confirm RRBS as an effective and reliable method to screen for age-DMRs in the vertebrate genome. To decipher whether paternal age effects are an evolutionary conserved feature of mammalian development, we compared methylation patterns between human and bovine sperm in orthologous regulatory regions. We discovered that the level of methylation and the age effect are both species-specific and speculate that these methylation marks reflect the lineage-specific development of each species to hit evolutionary requirements and adaptation processes. Different methylation levels between species in developmentally important genes also imply a differing mutational burden, representing a potential driver for point mutations and consequently deviations in the underlying DNA sequence of different species. Using the example of different haplotypes, this study showed the great effect of single base variations on the methylation of adjacent CpGs. Nonetheless, this study could not provide further evidence or a mechanism for the transfer of epigenetic marks to future generations. Therefore, further research in tissues from the progeny of old and young fathers is required to determine if the observed methylation changes are transmitted to the next generation and if they are associated with altered transcriptional activity of the respective genes. This could provide a direct link between the methylome of sperm from elderly fathers and the development potential of the next generation.
Background:
Genetic heterogeneity and consanguineous marriages make recessive inherited hearing loss in Iran the second most common genetic disorder. Only two reported pathogenic variants (c.323G>C, p.Arg108Pro and c.419A>G, p.Tyr140Cys) in the S1PR2 gene have previously been linked to autosomal recessive hearing loss (DFNB68) in two Pakistani families. We describe a segregating novel homozygous c.323G>A, p.Arg108Gln pathogenic variant in S1PR2 that was identified in four affected individuals from a consanguineous five generation Iranian family.
Methods:
Whole exome sequencing and bioinformatics analysis of 116 hearing loss-associated genes was performed in an affected individual from a five generation Iranian family. Segregation analysis and 3D protein modeling of the p.Arg108 exchange was performed.
Results:
The two Pakistani families previously identified with S1PR2 pathogenic variants presented profound hearing loss that is also observed in the affected Iranian individuals described in the current study. Interestingly, we confirmed mixed hearing loss in one affected individual. 3D protein modeling suggests that the p.Arg108 position plays a key role in ligand receptor interaction, which is disturbed by the p.Arg108Gln change.
Conclusion:
In summary, we report the third overall mutation in S1PR2 and the first report outside the Pakistani population. Furthermore, we describe a novel variant that causes an amino acid exchange (p.Arg108Gln) in the same amino acid residue as one of the previously reported Pakistani families (p.Arg108Pro). This finding emphasizes the importance of the p.Arg108 amino acid in normal hearing and confirms and consolidates the role of S1PR2 in autosomal recessive hearing loss.
Background
Terminal deletions of chromosome 4q are associated with a broad spectrum of phenotypes including cardiac, craniofacial, digital, and cognitive impairment. The rarity of this syndrome renders genotype-phenotype correlation difficult, which is further complicated by the widely different phenotypes observed in patients sharing similar deletion intervals.
Case presentation
Herein, we describe a boy with congenital hearing impairment and a variety of moderate syndromic features that prompted SNP array analysis disclosing a heterozygous 6.9 Mb deletion in the 4q35.1q35.2 region, which emerged de novo in the maternal germ line.
Conclusion
In addition to the index patient, we review 35 cases from the literature and DECIPHER database to attempt genotype-phenotype correlations for a syndrome with great phenotypic variability. We delineate intervals with recurrent phenotypic overlap, particularly for cleft palate, congenital heart defect, intellectual disability, and autism spectrum disorder. Broad phenotypic presentation of the terminal 4q deletion syndrome is consistent with incomplete penetrance of the individual symptoms.
Age related macular degeneration (AMD) is the leading cause of visual impairment in the elderly and the major cause of blindness in the developed world. To date, the molecular mechanisms underlying the disease are not well understood although in recent years a primary involvement of the retinal pigment epithelium (RPE) has become evident. The aim of the present study is to systematically analyse genes which are differentially expressed in the RPE, and to assess their possible association with mechanisms and pathways likely to be related to retinal disease, in particular AMD. Towards this goal, 2379 expressed sequence tags (ESTs) were established from an inhouse generated RPE cDNA library. This library was constructed by using the suppression subtraction hybridization (SSH) technique which normalises redundant sequences and ensures enrichment of rare transcripts. In a first phase, 1002 ESTs were sequenced and subjected to comprehensive alignment with public nucleotide and protein databases. A search of the 1002 ESTs against the human genome draft sequence yielded 168 known genes, 51 predicted genes, 15 unknown transcripts and 41 clones with no significant similarity. Reverse Northern blot hybridization was performed for 318 EST clusters to identify abundantly expressed genes in the RPE and to prioritize subsequent analyses. Representative clones were spotted onto a nylon membrane and hybridized with cDNA probes of driver (heart and liver) and tester (RPE) used in the cDNA library construction. Subsequently, 107 EST clusters were subjected to Northern blot hybridizations. These analyses identified 7 RPE-specific, 3 retina-specific, 7 RPE/retina-specific, and 7 tissue restricted transcripts, while 29 EST clusters were ubiquitously expressed, and evaluation was not possible for another 54 EST clusters. Of the 24 transcripts with specific or restricted expression, 16 clones were selected for further characterization. The predicted gene MGC2477 and 2 novel isoforms of the human transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3 (TRPM3) were cloned and further described in detail. In addition, polymorphic variations for these 2 genes as well as for the human MT-Protocadherin gene were determined. For MGC2477, 15 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, with 13 having a frequency of the minor allele greater than 20%. 10 of the 15 SNPs have not been reported in so far in public SNP repertoires. Partial assessment of the TRPM3 gene yielded 35 SNPs. Of these, 30 (85.7%) were highly frequent (0.17-0.5%), and 14 (40%) were novel. The MT-Protocadherin gene revealed 35 SNPs, including 28 (80%) with high frequency of the minor allele. 23 (65.7%) were novel SNPs. These SNPs will be used to construct the most common haplotypes. These will be used in case/control association studies in 400 AMD patients and 200 ethnically and aged matched controls to assess a possible contribution of these genes in the etiology of AMD.
Objective:
To determine the survival in a population of German patients with Duchenne muscular dystrophy.
Patients and methods:
Information about 94 patients born between 1970 and 1980 was obtained by telephone interviews and questionnaires. In addition to age of death or actual age during the investigation, data concerning clinical course and medical interventions were collected.
Results:
67 patients with molecularly confirmed diagnoses had a median survival of 24.0 years. Patients without molecular confirmation (clinical diagnosis only) had a chance of 67 % to reach that age. Grouping of our patient cohort according to the year of death (before and after 2000), ventilation was recognized as main intervention affecting survival with ventilated reaching a median survival of 27.0 years. For those without ventilation it was 19.0 years.
Conclusion and clinical relevance:
our study provides survival data for a cohort of DMD patients in Germany stratified by year of death. Median survival was 24.0 years in patients confirmed by molecular testing. Ventilated patients had a median survival of 27 years. We consider this piece of information helpful in the medical care of DMD patients.
Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.
Background
Fabry disease (FD) is an X‐linked lysosomal storage and multi‐system disorder due to mutations in the α‐galactosidase A (α‐GalA) gene. We investigated the impact of individual amino acid exchanges in the α‐GalA 3D‐structure on the clinical phenotype of FD patients.
Patients and methods
We enrolled 80 adult FD patients with α‐GalA missense mutations and stratified them into three groups based on the amino acid exchange location in the α‐GalA 3D‐structure: patients with active site mutations, buried mutations and other mutations. Patient subgroups were deep phenotyped for clinical and laboratory parameters and FD‐specific treatment.
Results
Patients with active site or buried mutations showed a severe phenotype with multi‐organ involvement and early disease manifestation. Patients with other mutations had a milder phenotype with less organ impairment and later disease onset. α‐GalA activity was lower in patients with active site or buried mutations than in those with other mutations (P < 0.01 in men; P < 0.05 in women) whilst lyso‐Gb3 levels were higher (P < 0.01 in men; <0.05 in women).
Conclusions
The type of amino acid exchange location in the α‐GalA 3D‐structure determines disease severity and temporal course of symptom onset. Patient stratification using this parameter may become a useful tool in the management of FD patients.
Community-acquired (CA) Staphylococcus aureus cause various diseases even in healthy individuals. Enhanced virulence of CA-strains is partly attributed to increased production of toxins such as phenol-soluble modulins (PSM). The pathogen is internalized efficiently by mammalian host cells and intracellular S. aureus has recently been shown to contribute to disease. Upon internalization, cytotoxic S. aureus strains can disrupt phagosomal membranes and kill host cells in a PSM-dependent manner. However, PSM are not sufficient for these processes. Here we screened for factors required for intracellular S. aureus virulence. We infected escape reporter host cells with strains from an established transposon mutant library and detected phagosomal escape rates using automated microscopy. We thereby, among other factors, identified a non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) to be required for efficient phagosomal escape and intracellular survival of S. aureus as well as induction of host cell death. By genetic complementation as well as supplementation with the synthetic NRPS product, the cyclic dipeptide phevalin, wild-type phenotypes were restored. We further demonstrate that the NRPS is contributing to virulence in a mouse pneumonia model. Together, our data illustrate a hitherto unrecognized function of the S. aureus NRPS and its dipeptide product during S. aureus infection.
A growing number of sperm methylome analyses have identified genomic loci that are susceptible to paternal age effects in a variety of mammalian species, including human, bovine, and mouse. However, there is little overlap between different data sets. Here, we studied whether or not paternal age effects on the sperm epigenome have been conserved in mammalian evolution and compared methylation patterns of orthologous regulatory regions (mainly gene promoters) containing both conserved and non-conserved CpG sites in 94 human, 36 bovine, and 94 mouse sperm samples, using bisulfite pyrosequencing. We discovered three (NFKB2, RASGEF1C, and RPL6) age-related differentially methylated regions (ageDMRs) in humans, four (CHD7, HDAC11, PAK1, and PTK2B) in bovines, and three (Def6, Nrxn2, and Tbx19) in mice. Remarkably, the identified sperm ageDMRs were all species-specific. Most ageDMRs were in genomic regions with medium methylation levels and large methylation variation. Orthologous regions in species not showing this age effect were either hypermethylated (>80%) or hypomethylated (<20%). In humans and mice, ageDMRs lost methylation, whereas bovine ageDMRs gained methylation with age. Our results are in line with the hypothesis that sperm ageDMRs are in regions under epigenomic evolution and may be part of an epigenetic mechanism(s) for lineage-specific environmental adaptations and provide a solid basis for studies on downstream effects in the genes analyzed here.
DNA methylation is an epigenetic modification that plays an important role in gene regulation. It can be influenced by stochastic events, environmental factors and developmental programs. However, little is known about the natural variation of genespecific methylation patterns. In this study, we performed quantitative methylation analyses of six differentially methylated imprinted genes (H19, MEG3, LIT1, NESP55, PEG3 and SNRPN), one hypermethylated pluripotency gene (OCT4) and one hypomethylated tumor suppressor gene (APC) in chorionic villus, fetal and adult cortex, and adult blood samples. Both average methylation level and range of methylation variation depended on the gene locus, tissue type and/or developmental stage. We found considerable variability of functionally important methylation patterns among unrelated healthy individuals and a trend toward more similar methylation levels in monozygotic twins than in dizygotic twins. Imprinted genes showed relatively little methylation changes associated with aging in individuals who are >25 years. The relative differences in methylation among neighboring CpGs in the generally hypomethylated APC promoter may not only reflect stochastic fluctuations but also depend on the tissue type. Our results are consistent with the view that most methylation variation may arise after fertilization, leading to epigenetic mosaicism.
Die Jahrtausendwende bildete den Rahmen einer lebhaften Zeit in der Gentherapie. Öffentlichkeitswirksame Berichte von bahnbrechenden Erfolgen schienen die Mühen jahrzehntelanger Grundlagenforschung endlich zu den prognostizierten Ergebnissen geführt zu haben, wenn auch vorerst nur in recht kleinen Nischen des Feldes. Begleitet von geschärfter öffentlicher Aufmerksamkeit, vor allem nach einem Todesfall im Rahmen einer gentherapeutischen Studie, schuf die Publikation des ersten therapeutischen Erfolges bei der „Severe Combined Immuno Deficiency“ (SCID) im Millenniumsjahr eine willkommene Atempause für die somatische Gentherapie. Da bei monogenen Defekten im Gegensatz zu polygenen bzw. multifaktoriell bedingten Leiden die Reparatur des jeweiligen Genlokus theoretisch zu einer vollständigen Korrektur führt, waren erste gentherapeutische Fortschritte vor allem in diesem Feld prognostiziert worden. Allerdings stellten sich diese Überlegungen sehr bald als ein in der täglichen Praxis der Laborarbeit mit immer neuen Hindernissen behaftetes Unternehmen heraus, so dass entgegen vorschnell geäußerter Ankündigungen die erwarteten Lösungen meist nur in Ansätzen zu Stande kamen. Ziel dieser Arbeit ist es, anhand ausgewählter monogener Erbkrankheiten den derzeitigen Stand der somatischen Gentherapie einer eingehenden Analyse zu unterziehen.
Diese Arbeit analysiert die Serum-Creatin-Kinase Spiegel von Konduktorinnen der Duchenneschen und Beckerschen Muskeldystrophie. Besonderes Augenmerk dieser Arbeit liegt auf den CK-Werten von schwangeren Konduktorinnen für die Muskeldystrophie Duchenne und Becker. Es werden Unterschiede im CK-Wert zwischen Schwangeren und nicht Schwangeren aufgezeigt. Die Berechnung der Odds-Ratio für die Gruppen der schwangeren Frauen soll es ermöglichen, auch nach bereits eingetretener Schwangerschaft, eine möglichst genaue Ermittlung des Carrierstatus durchzuführen. Die CK-Werte wurden auch für nicht schwangere Frauen reevaluiert.
Es wurden retrospektiv über einen Zeitraum von 7 Jahren Daten für die CK-Werte von Frauen gesammelt und ausgewertet, bei denen es innerhalb der Familie zu Fällen von Beckerscher oder Duchennescher Muskeldystrophie kam.
Die Bestimmung der Serum Creatin-Kinase erfolgte nach der von der IFCC empfohlenen Methode bei 37 °C.
Die Auswertung der Daten erfolgte nach folgenden Kriterien. Es wurden folgende Gruppen gebildet: Muskeldystrophie Duchenne, Muskeldystrophie Becker und Kontrollen. Innerhalb dieser Gruppen wurden zwei Altersgruppen gebildet. Die Altersgrenze lag bei 16 Jahren. Schwangere Frauen wurden getrennt von Frauen bei denen keine Schwangerschaft bestand analysiert.
Die gewonnenen Daten wurden nach folgenden Gesichtspunkten ausgewertet:
Die CK-Werte wurden logarithmiert, um einer Normalverteilung zu entsprechen. Die logarithmierten Creatin-Kinase Werte aller Gruppen waren normalverteilt. Die Verteilung der Daten innerhalb der relevanten Gruppen unterschied sich signifikant voneinander.
Die Anzahl der ausgewerteten CK-Werte für die Gruppe der schwangeren BMD Überträgerinnen war deutlich zu klein. Es wurde der Mindestumfang für diese Gruppe ermittelt, um in zukünftigen Analysen signifikante Ergebnisse zu erhalten.
Für die Gruppe der nicht schwangeren Überträgerinnen für die Duchennesche Muskeldystrophie bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen Alter und CK-Wert. Es konnte eine Regressionsgerade bestimmt werden und anhand dieser eine Alterskorrektur durchgeführt werden.
Die Odds Ratio, die anhand des CK-Werts einer Frau errechnet wird, ist ein Element für die individuelle Risikoberechnung. Es ließ sich anhand der statistischen Kennwerte, Mittelwert µ und Standardabweichung σ, der einzelnen Gruppen Formeln zur Berechnung der Odds Ratio herleiten.
Abschließend erfolgte die Berechnung der Sensitivität und Spezifität der CK-Wert Bestimmung.
Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung des Verhältnisses der männlichen und weiblichen Mutationsraten bei der Duchenneschen Muskeldystrophie (DMD), wobei jeweils zwischen Deletionen und Punktmutationen unterschieden wird. Bei der Duchenneschen Muskeldystrophie handelt es sich um eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit. Es existiert derzeit keine kausale Therapie, die Patienten versterben meist im 2. Lebensjahrzehnt. Heterozygote Frauen, die in der Regel phänotypisch gesund sind, kommen als Überträgerinnen der Krankheit in Frage. Bislang gibt es keine absolut verlässlichen direkte Heterozygotentests, es können nicht alle Überträgerinnen identifiziert werden. Stattdessen wird bei einer genetischen Beratung das Risiko einer Frau, Überträgerin zu sein, berechnet. Hierbei werden zunächst mit Hilfe des Familienstammbaums sowie weiteren Phänotypinformationen wie dem Creatinkinase-Wert (CK), Informationen erfasst. Für die Berechnung sind dann die Neumutationsrate für DMD im Allgemeinen sowie das Verhältnis der männlichen (Ny) und weiblichen (My) Mutationsraten Grundlage (k = Ny / My). Die möglichst genaue Kenntnis des genannten Quotienten k ist daher wesentlich für die Ermittlung des Heterozygotenrisikos, um eine kompetente genetische Beratung dieser Frauen zu ermöglichen. Es galt ursprünglich die Annahme Ny = My und somit k =1. Aufgrund der durchgeführten Berechnungen konnte gezeigt werden, dass die Mutationsraten in weiblichen Keimzellen (My) und in männlichen Keimzellen (Ny) nicht, wie anfänglich angenommen, gleich groß sind. Es ist also My ungleich Ny, und somit k ungleich 1. Insbesondere muss hierbei zwischen Deletionen und Punktmutationen unterschieden werden. Es lässt sich sagen, dass für Deletionen My > Ny gilt, während für Punktmutationen My < Ny gilt (k = 3,04 also Ny ca 3 My). Die Ergebnisse zeigen, dass ca. 60% der Punktmutationen in der Spermatogenese entstehen, während fast die Gesamtheit der Deletionen in der Oogenese entsteht. Diese Erkenntnis hat für die humangenetische Beratung einer möglichen Konduktorin für die Duchennesche Muskeldystrophie eine große Bedeutung. Aufgrund unserer Berechnungen können wir davon ausgehen, dass bei Deletionen näherungsweise 50% der Fälle tatsächliche Neumutationen sind, während es sich in 50% der Fälle bei den Müttern um Konduktorinnen handelt. Damit ist die die Zahl der tatsächlichen Neumutationen deutlich höher als durch theoretische Überlegungen früher angenommen (33%), während die Zahl der Konduktorinnen deutlich niedriger ist als angenommen (66%). Für eine Mutter, die ein Kind mit Duchennescher Muskeldystrophie geboren hat, bei dem eine Deletion vorliegt, gilt nun, dass das Risiko, erneut ein krankes Kind zu gebären, signifikant niedriger ist als das geschätzte Risiko unter der Annahme gleicher Mutationsraten in Oogenese und Spermatogenese. Für Punktmutationen können wir davon ausgehen, dass etwa 20% der Fälle tatsächliche Neumutationen sind, während es sich in 80% der Fälle bei den Müttern um Konduktorinnen handelt. Damit ist die die Zahl der tatsächlichen Neumutationen deutlich niedriger, während die Zahl der Konduktorinnen deutlich höher ist als angenommen. Für eine Mutter, die ein Kind mit Duchennescher Muskeldystrophie geboren hat, bei dem eine Punktmutation vorliegt, gilt nun, dass das Risiko, erneut ein krankes Kind zu gebären, deutlich höher ist als zunächst angenommen.
Background
Patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19) who undergo surgery have impaired postoperative outcomes and increased mortality. Consequently, elective and semi-urgent operations on the increasing number of patients severely affected by COVID-19 have been indefinitely postponed.in many countries with unclear implications on disease progression and overall survival. The purpose of this study was to evaluate whether the establishment of a standardized screening program for acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is sufficient to ensure high-quality medical and surgical treatment of COVID-19 and non-COVID-19 patients while minimizing in-hospital SARS-CoV-2 transmission.
Methods
The screening program comprised polymerase chain reaction (PCR) testing of nasopharyngeal swabs and a standardized questionnaire about potential symptoms for SARS-CoV-2 infection. All elective and emergency patients admitted to the surgical department of a tertiary-care hospital center in Lower Franconia, Germany, between March and May 2020 were included and their characteristics were recorded.
Results
Out of the study population (n = 657), 509 patients (77.5%) had at least one risk factor for a potentially severe course of COVID-19 and 164 patients (25%) were active smokers. The average 7-day incidence in Lower Franconia was 24.0/100,000 during the observation period. Preoperative PCR testing revealed four asymptomatic positive patients out of the 657 tested patients. No postoperative SARS-CoV-2 infection or transmission could be detected.
Conclusion
The implementation of a standardized preoperative screening program to both COVID-19 and non-COVID-19 patients can ensure high-quality surgical care while minimizing infection risk for healthcare workers and potential in-hospital transmission.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) is an established optical neuroimaging method for measuring functional hemodynamic responses to infer neural activation. However, the impact of individual anatomy on the sensitivity of fNIRS measuring hemodynamics within cortical gray matter is still unknown. By means of Monte Carlo simulations and structural MRI of 23 healthy subjects (mean age: (25.0 +/- 2.8) years), we characterized the individual distribution of tissue-specific NIR-light absorption underneath 24 prefrontal fNIRS channels. We, thereby, investigated the impact of scalp-cortex distance (SCD), frontal sinus volume as well as sulcal morphology on gray matter volumes (V(gray)) traversed by NIR-light, i.e. anatomy-dependent fNIRS sensitivity. The NIR-light absorption between optodes was distributed describing a rotational ellipsoid with a mean penetration depth of (23.6 +/- 0.7) mm considering the deepest 5% of light. Of the detected photon packages scalp and bone absorbed (96.4 +/- 9: 7)% and V(gray) absorbed (3.1 +/- 1.8)% of the energy. The mean V(gray) volume (1.1 +/- 0.4)cm(3) was negatively correlated (r = - .76) with the SCD and frontal sinus volume (r = - .57) and was reduced by 41.5% in subjects with relatively large compared to small frontal sinus. Head circumference was significantly positively correlated with the mean SCD (r = .46) and the traversed frontal sinus volume (r = .43). Sulcal morphology had no significant impact on V(gray). Our findings suggest to consider individual SCD and frontal sinus volume as anatomical factors impacting fNIRS sensitivity. Head circumference may represent a practical measure to partly control for these sources of error variance.
Background
The spondylodysplastic Ehlers-Danlos subtype (OMIM #130070) is a rare connective tissue disorder characterized by a combination of connective tissue symptoms, skeletal features and short stature. It is caused by variants in genes encoding for enzymes involved in the proteoglycan biosynthesis or for a zinc transporter.
Presentation of cases
We report two brothers with a similar phenotype of short stature, joint hypermobility, distinct craniofacial features, developmental delay and severe hypermetropia indicative for a spondylodysplastic Ehlers-Danlos subtype. One also suffered from a recurrent pneumothorax. Gene panel analysis identified two compound heterozygous variants in the B4GALT7 gene: c.641G > A and c.723 + 4A > G. B4GALT7 encodes for galactosyltransferase I, which is required for the initiation of glycosaminoglycan side chain synthesis of proteoglycans.
Conclusions
This is a first full report on two cases with spondylodysplastic Ehlers-Danlos syndrome and the c.723 + 4A > G variant of B4GALT7. The recurrent pneumothoraces observed in one case expand the variable phenotype of the syndrome.
Rekombinationshäufigkeit in Abhängigkeit vom Entbindungsalter der Mütter für das DMD-Gen (Xp 21.2)
(2006)
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Zusammenhang zwischen Alter und Rekombi-nationsrate für den Duchenne-Muskeldystrophie-Genabschnitt auf dem X-Chromosom (Xp21.2) zu ermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurden von über 200 am Humangenetischen Institut der Universität Würzburg untersuchten Familien 110 informative Stammbäume ausgewertet. Bei diesen Familien waren bereits im Rahmen der genetischen Beratung mehrere flankierende und intragene Marker des DMD-Genes bekannt. Um eine Vergleichbarkeit der einzelnen Personen zu erreichen, wurden die Grenzen des zu untersuchenden DNA-Bereiches bei den Markern DYS I,II,III sowie STR 56 gesetzt. Die Frauen wurden anschließend nach dem Entbindungsalter in drei Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 beinhaltet die unter 30-jährigen, Gruppe 2 die 30- bis 35-jährigen und Gruppe 3 die über 35-jährigen Frauen. Rekombinationen fanden sich in Gruppe 1 bei 17 von 129, in Gruppe 2 bei 9 von 40 und in Gruppe 3 bei 2 von 20 Frauen. Aus diesen Ergebnissen läßt sich χ² mit 2,513 bestimmen. Erst ab einem Wert von 5,99 kann man jedoch von einer Signifikanz sprechen. Somit gibt es keinen Zusammenhang zwischen dem Alter der Frauen bei der Entbindung und der Rekombinationsrate. Aufgrund anderer Arbeiten zum Thema Rekombinationsrate bei Autosomen in Abhängigkeit vom Alter wurde eine Abnahme der Rate im höheren Alter erwartet. Dies konnte jedoch bei der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Mögliche Fehlerquellen liegen hierbei in der stark variierenden Gruppengröße, dem Stichprobenumfang und falsch positiver Zuordnung bei der Phasenfestlegung. Außerdem besteht die Möglichkeit eines unterschiedlichen Rekombinatinsverhaltens bei Gonosomen im Vergleich zu Autosomen. Das Ergebnis dieser Arbeit ist trotz fehlender Signifikanz im Hinblick auf die genetische Beratung so zu beurteilen, daß jüngere Frauen (< 30 Jahre) kein erhöhtes Risiko für eine Rekombination tragen als Ältere (> 35 Jahre) und es damit in der Risikoberechnung bezüglich des Alters keine Unterschiede gibt.
Background:
The etiology of secondary cancer in childhood cancer survivors is largely unclear. Exposure of normal somatic cells to radiation and/or chemotherapy can damage DNA and if not all DNA lesions are properly fixed, the mis-repair may lead to pathological consequences. It is plausible to assume that genetic differences, i.e. in the pathways responsible for cell cycle control and DNA repair, play a critical role in the development of secondary cancer.
Methodology/Findings:
To identify factors that may influence the susceptibility for second cancer formation, we recruited 20 individuals who survived a childhood malignancy and then developed a second cancer as well as 20 carefully matched control individuals with childhood malignancy but without a second cancer. By antibody microarrays, we screened primary fibroblasts of matched patients for differences in the amount of representative DNA repair-associated proteins. We found constitutively decreased levels of RAD9A and several other DNA repair proteins in two-cancer patients, compared to one-cancer patients. The RAD9A protein level increased in response to DNA damage, however to a lesser extent in the two-cancer patients. Quantification of mRNA expression by real-time RT PCR revealed lower RAD9A mRNA levels in both untreated and 1 Gy gamma-irradiated cells of two-cancer patients.
Conclusions/Significance:
Collectively, our results support the idea that modulation of RAD9A and other cell cycle arrest and DNA repair proteins contribute to the risk of developing a second malignancy in childhood cancer patients.
Background: The etiology of secondary cancer in childhood cancer survivors is largely unclear. Exposure of normal somatic cells to radiation and/or chemotherapy can damage DNA and if not all DNA lesions are properly fixed, the mis-repair may lead to pathological consequences. It is plausible to assume that genetic differences, i.e. in the pathways responsible for cell cycle control and DNA repair, play a critical role in the development of secondary cancer. Methodology/Findings: To identify factors that may influence the susceptibility for second cancer formation, we recruited 20 individuals who survived a childhood malignancy and then developed a second cancer as well as 20 carefully matched control individuals with childhood malignancy but without a second cancer. By antibody microarrays, we screened primary fibroblasts of matched patients for differences in the amount of representative DNA repair-associated proteins. We found constitutively decreased levels of RAD9A and several other DNA repair proteins in two-cancer patients, compared to onecancer patients. The RAD9A protein level increased in response to DNA damage, however to a lesser extent in the twocancer patients. Quantification of mRNA expression by real-time RT PCR revealed lower RAD9A mRNA levels in both untreated and 1 Gy c-irradiated cells of two-cancer patients. Conclusions/Significance: Collectively, our results support the idea that modulation of RAD9A and other cell cycle arrest and DNA repair proteins contribute to the risk of developing a second malignancy in childhood cancer patients.
Hepatic stellate cells (HSCs) are also known as lipocytes, fat-storing cells, perisinusoidal cells, or Ito cells. These liver-specific mesenchymal cells represent about 5% to 8% of all liver cells, playing a key role in maintaining the microenvironment of the hepatic sinusoid. Upon chronic liver injury or in primary culture, these cells become activated and transdifferentiate into a contractile phenotype, i.e., the myofibroblast, capable of producing and secreting large quantities of extracellular matrix compounds. Based on their central role in the initiation and progression of chronic liver diseases, cultured HSCs are valuable in vitro tools to study molecular and cellular aspects of liver diseases. However, the isolation of these cells requires special equipment, trained personnel, and in some cases needs approval from respective authorities. To overcome these limitations, several immortalized HSC lines were established. One of these cell lines is CFSC, which was originally established from cirrhotic rat livers induced by carbon tetrachloride. First introduced in 1991, this cell line and derivatives thereof (i.e., CFSC-2G, CFSC-3H, CFSC-5H, and CFSC-8B) are now used in many laboratories as an established in vitro HSC model. We here describe molecular features that are suitable for cell authentication. Importantly, chromosome banding and multicolor spectral karyotyping (SKY) analysis demonstrate that the CFSC-2G genome has accumulated extensive chromosome rearrangements and most chromosomes exist in multiple copies producing a pseudo-triploid karyotype. Furthermore, our study documents a defined short tandem repeat (STR) profile including 31 species-specific markers, and a list of genes expressed in CFSC-2G established by bulk mRNA next-generation sequencing (NGS).
Human growth has an estimated heritability of about 80%-90%. Nevertheless, the underlying cause of shortness of stature remains unknown in the majority of individuals. Genome-wide association studies (GWAS) showed that both common single nucleotide polymorphisms and copy number variants (CNVs) contribute to height variation under a polygenic model, although explaining only a small fraction of overall genetic variability in the general population. Under the hypothesis that severe forms of growth retardation might also be caused by major gene effects, we searched for rare CNVs in 200 families, 92 sporadic and 108 familial, with idiopathic short stature compared to 820 control individuals. Although similar in number, patients had overall significantly larger CNVs \((p-value <1 x 10^{-7})\). In a gene-based analysis of all non-polymorphic CNVs >50 kb for gene function, tissue expression, and murine knock-out phenotypes, we identified 10 duplications and 10 deletions ranging in size from 109 kb to 14 Mb, of which 7 were de novo (p < 0.03) and 13 inherited from the likewise affected parent but absent in controls. Patients with these likely disease causing 20 CNVs were smaller than the remaining group (p < 0.01). Eleven (55%) of these CNVs either overlapped with known microaberration syndromes associated with short stature or contained GWAS loci for height. Haploinsufficiency (HI) score and further expression profiling suggested dosage sensitivity of major growth-related genes at these loci. Overall 10% of patients carried a disease-causing CNV indicating that, like in neurodevelopmental disorders, rare CNVs are a frequent cause of severe growth retardation.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der psychischen Befindlichkeit und anderer gesundheitsbezogenen Konditionen der Frauen und Männer mit familiären Mamma- und Ovarialkarzinomrisiko sowie die Klärung hinsichtlich der Bewältigung und Auswirkung genetischer Risikoinformation. Es wurden Risikowahrnehmung, Informationsstand, Inanspruchnahme der Beratungsangebote sowie der Früherkennungsmaßnahmen, Einstellung gegenüber genetischer Brustkrebsdiagnostik und familiärer/sozialer Kommunikation untersucht. Die vollständig ausgefüllten Fragebögen von Ratsuchenden und Betroffenen, die an der Beratung und Befragung im Zentrum für „Familiären Brust-/Eierstockkrebs“ teilgenommen haben, wurden von uns ausgewertet. Für die beratenden Institutionen ist das Wissen der vielfältigen psychischen und sozialen Folgen bei den Testsuchenden und deren Familien sehr wichtig. Nur so kann das Betreuungskonzept und das Beratungsangebot verbessert werden.
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat in viele Gebiete der modernen Medizin und Biologie Einzug gehalten. Ein wichtiges Anwendungsfeld hat sie in der pränatalen Diagnostik gefunden. An kultivierten Interphasekernen sowie Metaphasechromosomen eingesetzt kann sie zusätzliche Informationen zur zytogenetischen Analyse liefern. Chromosomenspezifische Sonden können auch auf native Fruchtwasserzellen, Chrorionzottenzellen und fetale Blutzellen hybridisiert werden. Seit einigen Jahren wird FISH an unkultivierten Amniozyten bei bestimmten Indikationen ergänzend zur herkömmlichen Chromosomenanalyse durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Prozentsätze der Kerne mit disomem (2 Signale) und aberrantem (z.B. 3 Signale bei Trisomie) Signalmuster analysiert. Für eine zuverlässige Information müssen mindestens 50 Kerne pro Sonde ausgewertet werden. Bei weniger als 10 Prozent aneuploiden Kernen wird das Ergebnis als unauffällig gewertet, bei mehr als 60 Prozent aberranten Kernen als auffällig und dazwischen als uneindeutig bzw. kontrollbedürftig. Die konventionelle Chromosomenanalyse erfordert in der Regel ein 2-3wöchige Zellkultur. Das Ergebnis der FISH-Analyse ist dagegen nach 1-3 Tagen erhältlich, verkürzt so die für die werdende Mutter oft quälende Wartezeit beträchtlich und ist damit besonders für Hochrisikogruppen geeignet. Mit FISH für die Chromosomen 13, 18, 21 und XY können können bis zu 90 Prozent der im 2. Trimenon erwarteten Chromosomenanomalien diagnostiziert werden. 10-15 Prozent der Anomalien, z.B. strukturelle Aberrationen können mit dieser Methode grundsätzlich nicht erfasst werden. Technische Probleme, wie z.B. Versagen der Hybridisierung, eine zu geringe Anzahl auswertbarer Kerne oder eine Kontamination der nativen Fruchtwasserprobe mit Zellen mütterlichen Ursprungs können die Aussagekraft des Tests beträchtlich herabsetzen. In der vorliegenden Arbeit werden die ersten 129 FISH-Untersuchungen an unkultivierten Fruchtwasserproben, die am Institut für Humangenetik in Würzburg in der klinischen Diagnostik durchgeführt wurden, retrospektiv aufbereitet. Die einzelnen Fälle werden nach den oberngenannten Kriterien in Gruppen mit unauffälligen, auffälligen und problematischen FISH-Befunden aufgeteilt. Der Anteil der letztgenannten Gruppe ist recht groß: In lediglich 20 Prozent (n=26) der Fälle konnten 50 Zellkerne pro Sonde ausgewertet werden, in 22 Prozent (n=28) der Fälle war das Ergebnis mit 10-60 Prozent aberranten Kernen uneindeutig und in 26 Prozent (n=33) der Fälle schlug die Hybridisierung für mindestens eine Sonde fehl. Dennoch konnten 79 Prozent (15/19) der erkennbaren Anomalien korrekt identifiziert werden: 5 Trisomie 21-Fälle, darunter eine Robertson-Translokation, 3 Trisomie 18-Fälle, 4 Fälle mit Triploidie, 2 Fälle mit Monosomie X und eine Fall mit dem Chromosomensatz 48, XXY, +21. Nicht diagnostiziert wurden aufgrund von fehlgeschlagener Hybridisierung 2 Fälle mit Trisomie 21 und ein Fall mit Trisomie 13. ein Fall von Trisomie 18 zeigte ein unauffälliges Signalmuster. Es traten keine falsch positiven Befunde auf. Fünf Fälle mit strukturellen Aberrationen entgingen der FISH-Analyse. In der folgenden Arbeit werden die Anzahl auswertbarer Kerne, die Signalverteilung in den verschiedenen Gruppen, Probleme bei Hybridisierung oder Auswertung und beeinflussende Faktoren wie Indikation, Gestationsalter, Farbe und Menge des Fruchtwassers beschrieben. In der Diskussion wird auf grundsätzliche technische Besonderheiten der FISH-Analyse eingegangen, wie z.B. Sondenqualität, Gestationsalter und Zellzahl. Das Problem der Kontamination der Fruchtwasserproben mit mütterlichen Zellen wird erläutert. Anschließend wird nochmals auf die pathologischen, problematischen und diskrepanten FISH-Befunde eingegangen. Daten und Erfahrungen verschiedener Arbeitsgruppen aus der Literatur werden jeweils berücksichtigt und mit den eigenen Daten in Beziehung gesetzt. Sensitivität und Spezifität der Methode werden diskutiert. FISH kann eine wertvolle Ergänzung zum Goldstandard der pränatalen Diagnostik und insbesondere der psychischen Entlastung der Patientin dienen. Einen vollständigen Ersatz der konventionellen Technik kann sie wegen der oben erwähnten Limitationen nicht bieten. Die Entscheidung über die Anwendung der FISH-Diagnostik, wie auch der Pränataldiagnostik überhaupt, sollte der betroffenen Frau überlassen werden und erst nach ausführlicher Information über Vor- und Nachteile sowie mögliche Konsequenzen, im Idealfall im Rahmen einer Genetischen Beratung, erfolgen.
Seit der Entdeckung des ersten Gens für den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schlüssel-Enzym für die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zusätzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anfällt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen führen zu einem signifikanten Effekt auf die benötigte Coumarin-Dosis und die Stabilität der Hämostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1“ (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit völlig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellulären Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein können. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke Ähnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivität, wobei die Affinitäten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich höher sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen führt in beiden Proteinen zu einem fast vollständigen Verlust der Aktivität. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 – wie VKORC1 – in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine ähnliche Struktur, die gleiche zelluläre Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivität hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen könnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out Mäusen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem für Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als Köder 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferhäufigkeit und funktioneller Überlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation näher untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke Überschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies könnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, führt aber auch zu neuen Hypothesen bezüglich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1“ (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals Würzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein“ (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP führen zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die Ähnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch überhöhte Dosierung von Coumarinen während der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nicht bestätigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bedürfen weiterführender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen wäre auch eine kritische Betrachtung der übrigen 85 primären Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.
Primäre Mikrozephalie (MCPH) ist eine heterogene, autosomal rezessive Störung des Menschen, die durch eine enorme Reduzierung des Hirnvolumens und variable geistige Behinderung ohne zusätzliche neurologische Defizite charakterisiert ist. Fünf einzeln ursächliche Gene sind bislang identifiziert. Zelluläres Merkmal von Patienten mit biallelischen Mutationen im MCPH1-Gen ist die vorzeitige Chromosomenkondensation in der G2-Phase des Zellzyklus sowie die verzögerte Chromosomendekondensation in der darauf folgenden G1-Phase (PCC-Syndrom). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass MCPH1 für zwei Haupttranskripte kodiert: Full-length-MCPH1 und ein Transkript ohne die Sequenz der letzten fünf Exons (MCPH1De9-14). Das vom Full-length-Transkript kodierte Polypeptid enthält eine N-terminale und zwei C-terminale BRCT-Domänen, während der MCPH1De9-14-Isoform die beiden C-terminalen BRCT-Domänen fehlen. Beide Varianten zeigen eine ähnliche Höhe der Gewebe-spezifischen Expression und sind in bestimmten fötalen Organen stärker vertreten als in adulten. Beide Isoformen werden während des Zellzyklus antagonistisch reguliert. Beide sind Zellkern-spezifische Proteine. Drei Kernlokalisierungssequenzen wurden in silico identifiziert. Die funktionelle Untersuchung dieser Signale ergab, dass zwei von ihnen unabhängig voneinander den Kerntransport des Proteins bewerkstelligen können. Die alleinige Expression der jeweiligen Variante ist ausreichend, um die defekte Chromosomenkondensation in MCPH1-defizienten Zellen zu komplementieren. Fehlende Komplementation mit der Deletionsvariante MCPH1De1-7 weist die N-terminale Region von MCPH1 als unentbehrlich zur Verhinderung von PCC aus. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine redundante Funktion der beiden Isoformen in der Regulierung der Chromosomenkondensation hin. Im Gegensatz dazu verhalten sie sich unterschiedlich im Bezug auf die DNA-Schadensantwort. Während Full-length-MCPH1 in strahlungsinduzierten Reparaturfoci lokalisiert werden kann, wird für MCPH1De9-14 keine Kolokalisierung mit phosphoryliertem H2AX nach DNA-Schadensinduktion beobachtet. Zusammenfassend kann man feststellen, dass das MCPH1-Gen für unterschiedliche Isoformen mit differenzieller Regulation auf RNA-Ebene und verschiedenen Funktionen auf Protein-Ebene kodiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erleichtern das Verständnis der diversen Funktionen von MCPH1 in der Zelle.
Background
There is no international consensus up to which age women with a diagnosis of triple-negative breast cancer (TNBC) and no family history of breast or ovarian cancer should be offered genetic testing for germline BRCA1 and BRCA2 (gBRCA) mutations. Here, we explored the association of age at TNBC diagnosis with the prevalence of pathogenic gBRCA mutations in this patient group.
Methods
The study comprised 802 women (median age 40 years, range 19-76) with oestrogen receptor, progesterone receptor, and human epidermal growth factor receptor type 2 negative breast cancers, who had no relatives with breast or ovarian cancer. All women were tested for pathogenic gBRCA mutations. Logistic regression analysis was used to explore the association between age at TNBC diagnosis and the presence of a pathogenic gBRCA mutation.
Results
A total of 127 women with TNBC(15.8%) were gBRCA mutation carriers (BRCA1: n = 118, 14.7%; BRCA2: n = 9, 1. 1%). The mutation prevalence was 32.9% in the age group 20-29 years compared to 6.9% in the age group 60-69 years. Logistic regression analysis revealed a significant increase of mutation frequency with decreasing age at diagnosis (odds ratio 1.87 per 10 year decrease, 95% CI 1.50-2.32, p < 0.001). gBRCA mutation risk was predicted to be > 10% for women diagnosed below approximately 50 years.
Conclusions
Based on the general understanding that a heterozygous mutation probability of 10% or greater justifies gBRCA mutation screening, women with TNBC diagnosed before the age of 50 years and no familial history of breast and ovarian cancer should be tested for gBRCA mutations. In Germany, this would concern approximately 880 women with newly diagnosed TNBC per year, of whom approximately 150 are expected to be identified as carriers of a pathogenic gBRCA mutation.
Male breast cancer (mBC) is associated with a high prevalence of pathogenic variants (PVs) in the BRCA2 gene; however, data regarding other BC predisposition genes are limited. In this retrospective multicenter study, we investigated the prevalence of PVs in BRCA1/2 and 23 non-BRCA1/2 genes using a sample of 614 patients with mBC, recruited through the centers of the German Consortium for Hereditary Breast and Ovarian Cancer. A high proportion of patients with mBC carried PVs in BRCA2 (23.0%, 142/614) and BRCA1 (4.6%, 28/614). The prevalence of BRCA1/2 PVs was 11.0% in patients with mBC without a family history of breast and/or ovarian cancer. Patients with BRCA1/2 PVs did not show an earlier disease onset than those without. The predominant clinical presentation of tumor phenotypes was estrogen receptor (ER)-positive, progesterone receptor (PR)-positive, and HER2-negative (77.7%); further, 10.2% of the tumors were triple-positive, and 1.2% were triple-negative. No association was found between ER/PR/HER2 status and BRCA1/2 PV occurrence. Comparing the prevalence of protein-truncating variants (PTVs) between patients with mBC and control data (ExAC, n = 27,173) revealed significant associations of PTVs in both BRCA1 and BRCA2 with mBC (BRCA1: OR = 17.04, 95% CI = 10.54–26.82, p < 10\(^{−5}\); BRCA2: OR = 77.71, 95% CI = 58.71–102.33, p < 10\(^{−5}\)). A case-control investigation of 23 non-BRCA1/2 genes in 340 BRCA1/2-negative patients and ExAC controls revealed significant associations of PTVs in CHEK2, PALB2, and ATM with mBC (CHEK2: OR = 3.78, 95% CI = 1.59–7.71, p = 0.002; PALB2: OR = 14.77, 95% CI = 5.02–36.02, p < 10\(^{−5}\); ATM: OR = 3.36, 95% CI = 0.89–8.96, p = 0.04). Overall, our findings support the benefit of multi-gene panel testing in patients with mBC irrespective of their family history, age at disease onset, and tumor phenotype.
Prenatal stress-induced programming of genome-wide promoter DNA methylation in 5-HTT-deficient mice
(2014)
The serotonin transporter gene (5-HTT/SLC6A4)-linked polymorphic region has been suggested to have a modulatory role in mediating effects of early-life stress exposure on psychopathology rendering carriers of the low-expression short (s)-variant more vulnerable to environmental adversity in later life. The underlying molecular mechanisms of this gene-by-environment interaction are not well understood, but epigenetic regulation including differential DNA methylation has been postulated to have a critical role. Recently, we used a maternal restraint stress paradigm of prenatal stress (PS) in 5-HTT-deficient mice and showed that the effects on behavior and gene expression were particularly marked in the hippocampus of female 5-Htt+/- offspring. Here, we examined to which extent these effects are mediated by differential methylation of DNA. For this purpose, we performed a genome-wide hippocampal DNA methylation screening using methylated-DNA immunoprecipitation (MeDIP) on Affymetrix GeneChip Mouse Promoter 1.0 R arrays. Using hippocampal DNA from the same mice as assessed before enabled us to correlate gene-specific DNA methylation, mRNA expression and behavior. We found that 5-Htt genotype, PS and their interaction differentially affected the DNA methylation signature of numerous genes, a subset of which showed overlap with the expression profiles of the corresponding transcripts. For example, a differentially methylated region in the gene encoding myelin basic protein (Mbp) was associated with its expression in a 5-Htt-, PS- and 5-Htt × PS-dependent manner. Subsequent fine-mapping of this Mbp locus linked the methylation status of two specific CpG sites to Mbp expression and anxiety-related behavior. In conclusion, hippocampal DNA methylation patterns and expression profiles of female prenatally stressed 5-Htt+/- mice suggest that distinct molecular mechanisms, some of which are promoter methylation-dependent, contribute to the behavioral effects of the 5-Htt genotype, PS exposure and their interaction.
Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repräsentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der öffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleinsäuresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, über eine Kombination aus computergestützter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten für VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fettsäuredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), während ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentität zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine präzise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollständige genetische Charakterisierung der genannten Fettsäuredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabhängig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufklärung der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen.
Polyploidy in Amphibia
(2015)
This review summarizes the current status of the known extant genuine polyploid anuran and urodelan species, as well as spontaneously originated and/or experimentally produced amphibian polyploids. The mechanisms by which polyploids can originate, the meiotic pairing configurations, the diploidization processes operating in polyploid genomes, the phenomenon of hybridogenesis, and the relationship between polyploidization and sex chromosome evolution are discussed. The polyploid systems in some important amphibian taxa are described in more detail.
Fanconi anaemia (FA) is an inherited disease with bone marrow failure, variable congenital and developmental abnormalities, and cancer predisposition. With improved survival, non-haematological manifestations of FA become increasingly important for long-term management. While renal abnormalities are recognized, detailed data on patterns and frequency and implications for long-term management are sparse. We reviewed clinical course and imaging findings of FA patients with respect to renal complications in our centre over a 25-year period to formulate some practical suggestions for guidelines for management of renal problems associated with FA. Thirty patients including four sibling sets were reviewed. On imaging, 14 had evidence of anatomical abnormalities of the kidneys. Two cases with severe phenotype, including renal abnormalities, had chronic kidney disease (CKD) at diagnosis. Haematopoietic stem cell transplantation was complicated by significant acute kidney injury (AKI) in three cases. In three patients, there was CKD at long-term follow-up. All patients had normal blood pressure. Evaluation of renal anatomy with ultrasound imaging is important at diagnostic workup of FA. While CKD is uncommon at diagnosis, our data suggests that the incidence of CKD increases with age, in particular after haematopoietic stem cell transplantation. Monitoring of renal function is essential for management of FA. Based on these long-term clinical observations, we formulate some practical guidelines for assessment and management of renal abnormalities in FA.
The effect of late parenthood on the offspring´s physical and mental health status has recently become an increasingly important topic of discussion. Studies on neurodevelopmental disorders in children of older parents (Naserbakht et al., 2011) outline the negative consequences of aging fathers as unpredictable compared to the better-understood unfavorable maternal influences (Cedars et al. 2015). This may be due to the fact that lifelong production of male gametes becomes more susceptible to error, not only for somatic mutations. Non-genomic mechanisms such as epigenetic methylation also alter DNA dynamically throughout life (Jones et al., 2015) and influence the aging human sperm DNA (Jenkins et al., 2014). These methylation changes may be transmitted to the next generation via epigenetic inheritance mechanisms (Milekic et al., 2015), which may negatively impact the sensitive epigenetic regulation of cell differentiation in the embryonic period (Curley et al., 2011; Spiers et al., 2015). Accordingly, Nardone et al. (2014) reported several hypomethylated regions in autistic patients, illustrating potential epigenetic influences on the multifactorial pathogenesis of neuropsychiatric disorders. In the present study, the methylation status of five gene regions in the sperm DNA of males of different ages was analyzed by two techniques - pyrosequencing and deep bisulfite sequencing. Two gene regions, FOXK1 and DMPK, showed a highly significant age-related methylation loss and FOXK1 a reduced methylation variation at the level of single alleles. In addition, the examined gene region of FOXK1 showed significant methylation changes in the fetal cord blood DNA of the respective offspring of the sperm donor. This fact suggests a transfer of age-related methylation loss to the next generation. Interestingly, a methylation analysis at the level of single alleles showed that the methylation loss was inherited exclusively by the father. FOXK1 is a transcription factor that plays an important role in the epigenetic regulation of the cell cycle during embryonic neuronal development (Huang et al., 2004; Wijchers et al., 2006). For this reason, the methylation status of FOXK1 in the blood of autistic patients and an age- and sex-matched control group was investigated. While both groups showed age-associated FOXK1 methylation loss, a faster dynamics of methylation change was observed in the autistic group. Although further studies are needed to uncover inheritance mechanisms of epigenetic information, the present results show an evident influence of age-related methylation changes on offspring. When advising future fathers, it is important to consider how the paternal epigenome is altered by aging and can have a negative impact on the developing embryo.
The transcription factor 12 (tcf12) is a basic Helix-Loop-Helix protein (bHLH) of the E-protein family, proven to play an important role in developmental processes like neurogenesis, mesoderm formation, and cranial vault development. In humans, mutations in TCF12 lead to craniosynostosis, a congenital birth disorder characterized by the premature fusion of one or several of the cranial sutures. Current research has been primarily focused on functional studies of TCF12, hence the cellular expression profile of this gene during embryonic development and early stages of ossification remains poorly understood. Here we present the establishment and detailed analysis of two transgenic tcf12:EGFP fluorescent zebrafish (Danio rerio) reporter lines. Using these transgenic lines, we analyzed the general spatiotemporal expression pattern of tcf12 during different developmental stages and put emphasis on skeletal development and cranial suture patterning. We identified robust tcf12 promoter-driven EGFP expression in the central nervous system (CNS), the heart, the pronephros, and the somites of zebrafish embryos. Additionally, expression was observed inside the muscles and bones of the viscerocranium in juvenile and adult fish. During cranial vault development, the transgenic fish show a high amount of tcf12 expressing cells at the growth fronts of the ossifying frontal and parietal bones and inside the emerging cranial sutures. Subsequently, we tested the transcriptional activity of three evolutionary conserved non-coding elements (CNEs) located in the tcf12 locus by transient transgenic assays and compared their in vivo activity to the expression pattern determined in the transgenic tcf12:EGFP lines. We could validate two of them as tcf12 enhancer elements driving specific gene expression in the CNS during embryogenesis. Our newly established transgenic lines enhance the understanding of tcf12 gene regulation and open up the possibilities for further functional investigation of these novel tcf12 enhancer elements in zebrafish.
Defects of platelet intracellular signaling can result in severe platelet dysfunction. Several mutations in each of the linked genes FERMT3 and RASGRP2 on chromosome 11 causing a Glanzmann‐like bleeding phenotype have been identified so far. We report on novel variants in two unrelated pediatric patients with severe bleeding diathesis—one with leukocyte adhesion deficiency type III due to a homozygous frameshift in FERMT3 and the other with homozygous variants in both, FERMT3 and RASGRP2 . We focus on the challenging genetic and functional variant assessment and aim to accentuate the risk of obtaining misleading results due to the phenomenon of genetic linkage.
CDC14A encodes the Cell Division Cycle 14A protein and has been associated with autosomal recessive non-syndromic hearing loss (DFNB32), as well as hearing impairment and infertile male syndrome (HIIMS) since 2016. To date, only nine variants have been associated in patients whose initial symptoms included moderate-to-profound hearing impairment. Exome analysis of Iranian and Pakistani probands who both showed bilateral, sensorineural hearing loss revealed a novel splice site variant (c.1421+2T>C, p.?) that disrupts the splice donor site and a novel frameshift variant (c.1041dup, p.Ser348Glnfs*2) in the gene CDC14A, respectively. To evaluate the pathogenicity of both loss-of-function variants, we analyzed the effects of both variants on the RNA-level. The splice variant was characterized using a minigene assay. Altered expression levels due to the c.1041dup variant were assessed using RT-qPCR. In summary, cDNA analysis confirmed that the c.1421+2T>C variant activates a cryptic splice site, resulting in a truncated transcript (c.1414_1421del, p.Val472Leufs*20) and the c.1041dup variant results in a defective transcript that is likely degraded by nonsense-mediated mRNA decay. The present study functionally characterizes two variants and provides further confirmatory evidence that CDC14A is associated with a rare form of hereditary hearing loss.
Inherited cardiomyopathies are characterized by clinical and genetic heterogeneity that challenge genetic diagnostics. In this study, we examined the diagnostic benefit of exome data compared to targeted gene panel analyses, and we propose new candidate genes. We performed exome sequencing in a cohort of 61 consecutive patients with a diagnosis of cardiomyopathy or primary arrhythmia, and we analyzed the data following a stepwise approach. Overall, in 64% of patients, a variant of interest (VOI) was detected. The detection rate in the main sub-cohort consisting of patients with dilated cardiomyopathy (DCM) was much higher than previously reported (25/36; 69%). The majority of VOIs were found in disease-specific panels, while a further analysis of an extended panel and exome data led to an additional diagnostic yield of 13% and 5%, respectively. Exome data analysis also detected variants in candidate genes whose functional profile suggested a probable pathogenetic role, the strongest candidate being a truncating variant in STK38. In conclusion, although the diagnostic yield of gene panels is acceptable for routine diagnostics, the genetic heterogeneity of cardiomyopathies and the presence of still-unknown causes favor exome sequencing, which enables the detection of interesting phenotype–genotype correlations, as well as the identification of novel candidate genes.
The research that is compiled in this thesis can be divided in two parts. The first part, consisting of four chapters, is centered around the role of epigenetic dysregulation in the etiopathophysiology of sporadic alzheimer's disease (sAD). In addition to providing insights into the most recent developments in neuroepigenomic studies of this disease, the first part of the thesis also touches upon remaining challenges, and provides a future outlook on possible developments in the field. The second part, which includes three more chapters, is focused on the application of induced pluripotent stem cell (iPSC)-based disease models for the study of AD, including but not limited to mechanistic studies on epigenetic dysregulation using this platform. Aside from outlining the research that has been conducted using iPSC-based models for sAD to date, the second part of the thesis also provides insights into the acquisition of disease-relevant neural cultures based on directed differentiation of iPSCs, and furthermore includes an experimental approach for the establishment of such a model system.
Fanconi Anämie (FA) gehört zu den seltenen Chromsomeninstabilitäts-Syndromen. Ursächlich für die Erkrankung sind biallelische Mutationen mit autosomal rezessiver Vererbung in einem der bisher bekannten 21 Genen (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U und –V). Eine Ausnahme stellen FANCB und FANCS dar, die X-chromosomal rezessiv bzw. mit einem dominant negativen Effekt vererbt werden. Die Genprodukte sind als Teil des FA/BRCA-DNA-Reparatur Netzwerks bei der Beseitigung von DNA-Interstrang-Quervernetzungen (ICL) involviert. ICLs führen zu einer Stagnation der Replikationsgabel und blockieren somit wichtige zelluläre Prozesse wie Replikation und Transkription, sodass eine Aufrechterhaltung der Genomstabilität nicht mehr gewährleistet ist.
FA ist gekennzeichnet durch angeborene Fehlbildungen, fortschreitendes Knochenmarkversagen und eine erhöhte Prädisposition gegenüber Krebserkrankungen. Die Diagnose basiert auf phänotypischen Auffälligkeiten und wird auf zellulärer Ebene durch die Hypersensititvät gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen wie Mitomycin C (MMC) bestätigt. Da nicht jeder Patient einer bisher bekannten Komplementationsgruppe zugeordnet werden kann und herkömmliche molekulare Diagnostikverfahren mit der steigenden Anzahl an FA-Genen mühsam, zeitaufwändig und teuer geworden sind, war es nötig, neue molekulare Verfahren wie Whole Exome Sequencing (WES) zu etablieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential dieser Methode im Bezug auf die FA-Genotypisierung erforscht. Bei der Suche nach einer optimalen Anwendung des WES, untersuchten wir verschiedene Anreicherungs- und Sequenziertechniken. Dennoch führen Fehler in den Datenbanken sowie Pseudogene zu falschen Dateninterpretationen und –darstellungen und stellen somit eine Herausforderung dar. Trotzdem zeigen unserer Daten, dass WES eine wertvolle Methode in der Molekulardiagnostik von FA ist. Dies bestätigte sich durch die Zuordnung mehrerer, vorher unklassifizierter FA-Patienten zu den bekannten Komplementationsgruppen und der Ergänzung eines siebten Patienten zum Subtyp FA-P, im Rahmen von zwei Next Generation Sequencing (NGS) Publikationen.
Außerdem wurden mit Hilfe von WES zwei neue FA-Gene (FANCQ und FANCW) im Rahmen dieser Arbeit gefunden, wobei XPF (FANCQ) das erste Gen überhaupt war, welches anhand von NGS detektiert wurde. ERCC4/XPF ist eine strukturspezifische Endonuklease, die durch ein Gen kodiert wird, welches bereits vorher mit den Krankheiten Xeroderma Pigmentosum (XP) und dem segmentalen XFE progeroid Syndrom in Verbindung gebracht wurde. Unsere Daten zeigen, dass abhängig von der Mutation in XPF, Patienten eine der drei unterschiedlichen Funktionsstörungen aufweisen. Dies hebt die multifunktionale Stellung der XPF Endonuklease im Rahmen der Genomstabilität und von humanen Erkrankungen hervor. Das zweite Gen, das während dieser Arbeit entdeckt wurde, ist die WD40-Domäne tragende E3 Ubiquitin Ligase RFWD3, die kürzlich mit DNA Reparatur und insbesondere HR verknüpft wurde. Wir konnten zeigen, dass eine RFWD3 Mutation in der WD40-Domäne bei einem FA-Patienten mit der genetischen Erkrankung Fanconi Anämie assoziiert ist. Die HR ist in RFWD3 (FANCW) mutierten Zellen gestört, was auf einer verminderten Relokalisation von mutiertem RFWD3 an das Chromatin und einer defekten Interaktion mit RPA beruht. Des Weiteren weisen Rfwd3 defiziente Mäuse typische Merkmale anderer FA-Mausmodelle auf, wie verminderte Fertilität, ovarielle und testikuläre Atrophie sowie eine reduzierte Lebenserwartung.
Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass neue molekulare Ansätze wie NGS ein wertvolles Hilfsmittel in der FA-Diagnostik sind um bisher unklassifizierte Patienten einer Komplementationsgruppe zuordnen zu können. Zudem konnten mit Hilfe dieser Technik zwei neue Gene identifiziert werden. Deren Charakterisierung trägt zu einer Vervollständigung und weiteren Aufklärung des FA/BRCA-DNA-Reparatur-Netzwerks bei.
The chromosomes of the turnip-tailed gecko Thecadactylus rapicauda from the Falcón State in northern Venezuela were examined by means of conventional staining, a variety of banding techniques and in situ hybridization with an 18S + 28S rDNA probe. In female specimens, C-banding analyses detected a cryptic W sex chromosome-associated interstitial heterochromatic segment which is absent in the Z sex chromosome. These ZW sex chromosomes are considered to be in a nascent stage of morphological differentiation and are absent in T. rapicauda collected in Guatemala. The amount, location and fluorochrome affinities of constitutive heterochromatin, the position of the nucleolus organizer region, and the genome sizes of female and male individuals were determined. The previously published cytogenetic data on T. rapicauda are discussed.
In der vorliegenden Arbeit wurden aus den Testzentren Würzburg und Wien DNA-Proben von Patienten, die im Laufe einer Anästhesie eine maligne Hyperthermie (MH) entwickelt hatten, und deren Angehörigen auf MH-verursachende Mutationen im Gen für den Ryanodinrezeptor 1 (RYR 1) untersucht. Es wurde dabei eine Hotspotregion des RYR 1 ausgewählt, für die bereits im Vorfeld mehrere Mutationen bekannt waren. Das Screening wurde mit Hilfe der Methode single-stranded conformation polymorphism (SSCP) durchgeführt. Eine dem abweichenden Laufverhalten eventuell zugrunde-liegende Mutation wurde anschließend durch die automatische Sequenzierung identifiziert. Unter 190 Patienten aus 126 Familien konnte in 18 Fällen eine Mutation gefunden werden. Das entspricht einer Detektionsrate von 14,29%. Insgesamt traten 10 verschiedene Mutationen auf, von denen eine (G6377A) vorher noch nicht beschrieben war. Die Mutationshäufigkeiten unterschieden sich zum Teil erheblich innerhalb der beiden untersuchten Populationen und im Vergleich zu Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen. Alle Indexpatienten und viele Angehörige hatten sich bereits einem in-vitro-Kontrakturtest (IVCT) zur Diagnostik der MH unterzogen. So konnten die Ergebnisse des IVCT mit denen der genetischen Untersuchung verglichen werden. Es fand sich eine gute Übereinstimmung, die die Zuverlässigkeit des IVCT stützt. Begleitend zur Screeninguntersuchung wurden die Methoden SSCP und automatische Sequenzierung hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit im Screening großer Patientenkollektive bewertet. Bei vergleichbarer Sicherheit ist mit dem SSCP in kürzerer Zeit bei geringerem Kostenaufwand eine größere Anzahl an Patientenproben auswertbar. Der Stellenwert der genetischen Diagnostik bei der MH wurde als ideale Methode zur Identifikation betroffener Familienmitglieder in MH-Familien mit bekannter Mutation bestätigt.
The ERCC4 protein forms a structure-specific endonuclease involved in the DNA damage response. Different cancer syndromes such as a subtype of Xeroderma pigmentosum, XPF, and recently a subtype of Fanconi Anemia, FA-Q, have been attributed to biallelic ERCC4 gene mutations. To investigate whether monoallelic ERCC4 gene defects play some role in the inherited component of breast cancer susceptibility, we sequenced the whole ERCC4 coding region and flanking untranslated portions in a series of 101 Byelorussian and German breast cancer patients selected for familial disease (set 1, n = 63) or for the presence of the rs1800067 risk haplotype (set 2, n = 38). This study confirmed six known and one novel exonic variants, including four missense substitutions but no truncating mutation. Missense substitution p.R415Q (rs1800067), a previously postulated breast cancer susceptibility allele, was subsequently screened for in a total of 3,698 breast cancer cases and 2,868 controls from Germany, Belarus or Russia. The Gln415 allele appeared protective against breast cancer in the German series, with the strongest effect for ductal histology (OR 0.67; 95%CI 0.49; 0.92; p = 0.003), but this association was not confirmed in the other two series, with the combined analysis yielding an overall Mantel-Haenszel OR of 0.94 (95% CI 0.81; 1.08). There was no significant effect of p.R415Q on breast cancer survival in the German patient series. The other three detected ERCC4 missense mutations included two known rare variants as well as a novel substitution, p.E17V, that we identified on a p.R415Q haplotype background. The p.E17V mutation is predicted to be probably damaging but was present in just one heterozygous patient. We conclude that the contribution of ERCC4/FANCQ coding mutations to hereditary breast cancer in Central and Eastern Europe is likely to be small.
Multicolor spectral analysis (spectral karyotyping) was applied to mitotic and male diakinetic chromosomes of hybrid mice carrying a unique system of 18 autosomal Robertsonian translocation chromosomes with alternating arm homologies. Only the autosomes 19 and the XY sex chromosomes are excluded from these Robertsonian translocations. The translocations, previously identified by conventional banding analyses, could be verified by spectral karyotyping. Besides the Robertsonian translocations, no other interchromosomal rearrangements were detected. In diakineses of male meiosis, the 18 metacentric Robertsonian translocation chromosomes form a very large meiotic ‘superring'. The predictable, specific order of the chromosomes along this ‘superring' was completely confirmed by multicolor spectral analysis. In the majority of diakineses analyzed, the free autosomal bivalent 19 and the XY sex bivalent form a conspicuous complex which tightly associates with the 12;14 Robertsonian translocation chromosome in the ‘superring'.
Die Fanconi-Anämie ist eine autosomal-rezessiv vererbte Krankheit, die mit progredientem Knochenmarksversagen, Fehlbildungen und Tumoren einhergeht. Diagnostiziert wird diese Krankheit durch eine vermehrte Chromosomenbrüchigkeit nach Behandlung mit Diepoxybutan oder Mitomycin C oder durch einen erhöhten Anteil von Zellen in der G2-Phase in der Durchflußzytometrie. Bei einigen Patienten wurden Verläufe mit stabilen Blutbildern beschrieben. Als Erklärung wurde das Vorhandensein einer Mosaikkonstellation bei diesen Patienten diskutiert. Hier wird ein FA-Patient der Komplementationsgruppe A beschrieben, bei dem es im Alter von 2 Jahren zu einer Thrombozytopenie kam und ein dysplastisches Knochenmark vorlag. Zusätzlich liegt bei dem Patienten noch ein Wachstumshormonmangel bei dysplastischer Hypophyse vor. Im Alter von 3 ½ Jahren kam es zu einer deutlichen Stabilisierung des Blutbildes; auch fand sich bei wiederholten Knochenmarkspunktionen ein normozelluläres Mark. Nachdem zuvor die Diagnose FA mittels Chromosomenbruchanalyse und Durchflußzytometrie gestellt und später durch Untersuchung von Fibroblasten bestätigt worden war, stellte sich jetzt die Frage eines Mosaiks. Weitere Zellzyklusanalysen ergaben annähernd normale Befunde. Bei einer weiteren, im Alter von 6 Jahren durchgeführten Chromosomenbruchanalyse zeigte sich eine bimodale Verteilung der MMC-Sensitivität. Auf Grund dieser Bimodalität, also der Koexistenz von defekten und intakten Zellen, kann von der Existenz einer Mosaikkonstellation ausgegangen werden, die für das Auftreten intakter Zellen verantwortlich ist und dadurch zu einer Stabilisierung des Blutbildes geführt hat. Die erste Mutation des Patienten wurde auf Exon 10 gefunden, wo anstelle von Glutaminsäure ein Stopcodon gebildet wird. Ob die Mosaikkonstellation im vorliegenden Fall durch intragenes Crossover oder Genkonversion entstanden ist, kann erst nach der Identifizierung der Mutation auf dem zweiten Allel des Patienten abgeklärt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Krankenblätter 366 kleiner Frühgeborener (Schwangerschaftswochen (SSW) 23/0 bis 32/0), die im Zeitraum von 1995 bis 2001 in der Frauenklinik des Klinikums Süd Nürnberg aus Einlingsschwangerschaften geboren wurden, retrospektiv ausgewertet. 136 Schwangere wurden nach einem vorzeitigen Blasensprung entbunden. 16 Kinder sind innerhalb der Neonatalperiode gestorben. Erfasst wurden zum einen wichtige prä- und peripartale Faktoren, u.a. mütterliches Alter und Risiko,Schwangerschaftsalter, Indikation zur Schwangerschaftsbeendigung und Entbindungsmodus, und zum anderen fetale Outcome-Parameter wie Gewicht, Apgar Score, Nabelarterien-pH-Wert, Base Excess und Intubation. Darüber hinaus wurden für jedes Kind die Morbiditätsdiagnosen und bei gestorbenen Kindern die Todesursachen aufgenommen. In 37 % der Fälle lag der Frühgeburt ein vorzeitiger Blasensprung zugrunde, in 31 % eine vorzeitige Wehentätigkeit. Die übrigen 32 % wurden durch maternofetale Pathologie hervorgerufen. Das Gewicht der Frühgeborenen lag zu 75 % unter 1500 g. In einer schweren Azidose befanden sich 6 % der Kinder. Eine starke Abhängigkeit der Outcome-Parameter von Poleinstellung und Entbindungsmodus war nicht zu beobachten. Frühgeborene nach fetaler Entbindungsindikation wiesen ein schlechteres Outcome auf als nach maternaler Indikation. Von den beobachteten Krankheiten kam das Atemnotsyndrom am häufigsten vor (in 63 % der Fälle), bei 20 % der Kinder III.-IV. Grades. Hochgradige Retinopathie (Grade III-IV) wurde in 5,4 %, retrolentale Fibroplasie in 0,6 % der Fälle diagnostiziert. Ein Drittel der Kinder erkrankten an einer Sepsis. Bei 18 % entwickelte sich im Verlauf eine bronchopulmonale Dysplasie. Schwere Hirnblutungen (III.-IV. Grades) erlitten 4,5 % der Frühgeborenen, periventrikuläre Leukomalazie 3,6 % und nekrotisierende Enterokolitis 1,5 %. Die genannten Krankheiten traten mit zunehmendem Schwangerschaftsalter weniger häufig auf. Die Prognose verbesserte sich besonders stark in den SSW 28-30. 6 von 16 Todesfällen (38 %) entfielen auf die ersten 24 Lebensstunden. Die Todesursachen waren Unreife/Mangelgeburt (31 %), Sepsis (31 %), Fehlbildungen und intrauterine Asphyxie (jeweils 13 %). Die neonatale Mortalitätsrate nahm mit zunehmendem Geburtsgewicht deutlich ab: Von 33 % für Frühgeborene unter 500 g, auf 3 % ab 1000 g. Die mittlere Latenzperiode nach einem vorzeitigen Blasensprung betrug 9,1 Tage (in 90 % der Fälle bis zu 3 Wochen, Maximum: 10 Wochen). Kinder beider betrachteter Gruppen von 23-28 und 29-32 SSW profitierten vom angewendeten konservativen Management: Bezüglich der Lungenreife war eine klare Verbesserung zu beobachten, falls die RDS-Prophylaxe 48 Stunden vor der Geburt abgeschlossen war. Sepsis kam zwar in der Gruppe mit niedrigerem Gestationsalter häufiger vor, war jedoch nicht direkt abhängig von der Latenzperiode. Im Vergleich mit anderen aktuellen Studien lagen die in dieser Arbeit festgestellten Morbiditätsraten etwa gleichauf. Die Kinder des eigenen Kollektivs entwickelten aber seltener intraventrikuläre Hämorrhagie und periventrikuläre Leukomalazie. Die starke Abnahme von Morbidität und Mortalität mit zunehmendem Schwangerschaftsalter wird in den Vergleichsstudien ähnlich berichtet. Eine nicht vernachlässigbare Überlebenschance kann bereits ab 23 SSW gegeben sein (4 von 6 dieser Kinder überlebten die Neonatalperiode). Die Chancen auf ein gesundes Überleben jedoch steigen besonders in den SSW 28-30. Daher ist in den sehr frühen SSW die Prolongation der Schwangerschaft zu empfehlen.
We describe monozygotic twins discordant for childhood leukemia and secondary thyroid carcinoma. We used bisulfite pyrosequencing to compare the constitutive promoter methylation of BRCA1 and several other tumor suppressor genes in primary fibroblasts. The affected twin displayed an increased BRCA1 methylation (12%), compared with her sister (3%). Subsequent bisulfite plasmid sequencing demonstrated that 13% (6 of 47) BRCA1 alleles were fully methylated in the affected twin, whereas her sister displayed only single CpG errors without functional implications. This between-twin methylation difference was also found in irradiated fibroblasts and untreated saliva cells. The BRCA1 epimutation may have originated by an early somatic event in the affected twin: approximately 25% of her body cells derived from different embryonic cell lineages carry one epigenetically inactivated BRCA1 allele. This epimutation was associated with reduced basal protein levels and a higher induction of BRCA1 after DNA damage. In addition, we performed a genome-wide microarray analysis of both sisters and found several copy number variations, i.e., heterozygous deletion and reduced expression of the RSPO3 gene in the affected twin. This monozygotic twin pair represents an impressive example of epigenetic somatic mosaicism, suggesting a role for constitutive epimutations, maybe along with de novo genetic alterations in recurrent tumor development.
Im Zeitraum 2000 - 2004 wurden dem Institut für Humangenetik der Universität Würzburg insgesamt 12.049 Patienten zur molekulargenetischen Diagnostik zugewiesen. Anforderungen zum Ausschluss von FGFR-/TWIST-Defekten machen hierbei 6% des gesamten Patientenguts aus (714 untersuchte Patienten). Innerhalb der Krankheitsgruppe der FGFR-/TWIST-Defekte steht die molekulargenetische Bestätigung bzw. der Ausschluss eines Muenke-Syndroms mit 219 Patienten im Zeitraum 2000-2004 an erster Stelle. An zweiter Stelle folgt das Saethre-Chotzen-Syndrom mit 180 untersuchten Patienten. Am dritthäufigsten wurden Anfragen zur molekulargenetischen Diagnostik bei Verdacht auf ein Crouzon-/bzw. Pfeiffer-Syndrom (152 Patienten) gestellt. Die Zahl der Anforderungen blieb im Fünfjahresverlauf relativ konstant, d. h. es gab in Bezug auf die Anzahl der untersuchten Patienten/Jahr nur geringfügige Fluktuationen. Die Anforderungen einer molekulargenetischen Diagnostik bei klinischem Verdacht auf FGFR-/TWIST- Defekte kamen schwerpunktmäßig aus Würzburg, München, Ansbach, Erfurt und Berlin. Am häufigsten konnte die klinische Verdachtsdiagnose beim Apert-Syndrom durch den Mutationsnachweis im FGFR2-Gen bestätigt werden (in 67% der Fälle). An zweiter Stelle, d. h. in 33% der Fälle, konnte durch die molekulargenetische Diagnostik des FGFR3-Gens die Verdachtsdiagnose der Achondroplasie bestätigt werden. Am dritthäufigsten, d.h. in 20% der Fälle konnten die Genanalysen die Verdachtsdiagnose Crouzon-/bzw. Pfeiffer-Syndrom bestätigen. Die grössten differentialdiagnostischen Schwierigkeiten bestehen klinischerseits offenbar beim Muenke-Syndrom (FGFR3) sowie beim Saethre-Chotzen-Syndrom (TWIST1) und der Hypochondroplasie (FGFR3). Bei diesen Entitäten konnte die klinische Verdachtsdiagnose lediglich in weniger als 15% der Fälle auf der molekulargenetischen Ebene bestätigt werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen die ausgeprägte phänotypische Variabilität die bei den einzelnen Erkrankungen besteht. Die molekulargenetische Bestätigung bzw. der Ausschluss der klinischen Verdachtsdiagnose bildet die Grundlage für Prognose und Therapie der Patienten. Dies wird insbesondere hinsichtlich der Implikationen der molekulargenetischen Differenzierung zwischen den phänotypisch ähnlichen Kraniosynostose-Syndromen (Saethre-Chotzen vs. Muenke) deutlich. Z. B. kennzeichnen progressive multisuturale Fusionen das Saethre-Chotzen-, nicht jedoch das Muenke-Syndrom. Wegen des hohen Risikos einer rekurrenten intrakraniellen Hypertension benötigen SCS-Patienten im Kindesalter eine regelmässige Kontrolle.
Central Core Disease (CCD) ist eine neuromuskuläre Erkrankung aus dem Formenkreis der kongenitalen Myopathien. Die Symptomatik umfaßt eine verzögerte motorische Entwicklung, eine nicht bis schwach progrediente Schwäche der Extremitätenmuskulatur mit Betonung der distalen, unteren Gliedmaßen sowie Defekte des Skelettapparates wie Kyphoskoliosen, Kontrakturen und Fußanomalien. Die Zentralfibrillen-Myopathie, wie man die Erkrankung im Deutschen nennt, imponiert durch eine mehr oder minder regelmäßige Assoziation mit der Veranlagung zur Malignen Hyperthermie (MHS), die wiederum von Mutationen im Ryanodinrezeptorgen (RYR1), einem sarkoplasmatischen Calciumkanal, verursacht wird. In genetischen Familienanalysen wurde die CCD ebenfalls zum RYR1-Gen auf dem Humanchromosom 19q13.1 kartiert, womit dieses Gen zum Kandidatengen für CCD avancierte. Es wurden in einigen wenigen Familien Mutationen im RYR1-Gen gefunden, die man für ursächlich für die Ausprägung der CCD hält. Mittlerweile häuften sich aber Hinweise, daß die CCD, ebenso wie die MHS heterogene Ursachen haben kann und damit die Rolle des RYR1-Gens als Kandidat für das CCD-Gen zunehmend in Frage gestellt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Feinkartierung von CCD-Familien vorangetrieben, indem neue Familien gesammelt wurden und ein neuer, zusammengesetzter Mini-/ Mikrosatelliten-Marker charakterisiert wurde, der für die Feinkartierung an CCD-Familien eingesetzt werden konnte. Des weiteren wurden neuere Mikrosatelliten-Marker des Genethon-Konsortiums angewendet und die Koppelung der CCD-Familien zu Chromosom 19q13.1 konnte bestätigt werden, allerdings mit einigen Ausnahmen, so daß bei CCD ebenfalls heterogene Ursachen angenommen werden können. Ein weiteres Kandidatengen wurde mit dem MYH7-Gen für die beta-Kette des schweren Myosins auf Chromosom 14 vorgeschlagen, dies konnte aber weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Um die Rolle des RYR1-Gens für die CCD zu eruieren wurden die häufigsten bisher bei MHS-Familien gefundenen RYR1-Mutationen an CCD-Patienten untersucht. Lediglich in einer CCD/MHS-Familie konnte eine bereits bekannte Mutation bestätigt werden, das RYR1-Gen konnte nicht als verursachendes Gen der CCD bestätigt werden, allerdings konnte nicht das komplette Gen untersucht werden, aufgrund der großen Anzahl von Exons und der Größe des Gens. Ein zweiter Teil der Arbeit bestand in der Suche nach neuen Transkripten aus Muskelgewebe in der genomischen Region 19q13.1 mit dem Endziel der Erstellung einer Transkriptionskarte dieser Region. Hier kam die cDNA-Selektion zur Anwendung mit einer PCR-amplifizierten cDNA-Bibliothek aus Muskelgewebe sowie ein gut charakterisiertes Cosmid-Contig aus dem Bereich des RYR1-Gens. Es konnte lediglich ein kurzes Transkript isoliert werden, das auf den genomischen Ursprung zurückkartiert, aber es konnte nicht näher charakterisiert werden. Der dritte Teil der Arbeit stand im Zeichen der Kandidatengensuche im betreffenden Abschnitt q13.1 des Chromosoms 19. Anhand von genetischen Karten und Gendatenbanken sollten Gene gesucht werden, die in diesen Bereich kartieren und eine Expression im Skelettmuskel aufweisen und damit als Kandidat für die CCD in Frage kommen. Es wurden zwei Gene für nukleär codierte Untereinheiten der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase untersucht. Von dem Gen, das die muskelspezifische Isoform von COX VIIa codiert, konnte die genomische Sequenz und die Exon-Intron Struktur ermittelt werden sowie eine Promotor-Analyse anhand einer Datenbanksuche durchgeführt werden. Der Vergleich mit der Sequenz des homologen Gen des Rindes ergab, daß es sich um ein evolutionär konserviertes Gen handelt mit dem typischen Eigenschaften eines Haushaltsgens. Ein weiteres Kandidatengen stellt das Gen für die kleine Untereinheit des Calpains dar, das möglicherweise direkt in die elektromechanische Koppelung zwischen Nerv und Muskel involviert ist und mit dem Ryanodinrezeptor interagiert. CCD-Patienten wurden mit der SSCP-Methode (Single-stranded conformation polymorphism) auf Mutationen in den Exons sowohl des COX7A1-Gens als auch des CANPS-Gens untersucht. In beiden Fällen konnten keine Mutationen gefunden werden. Die Suche nach dem CCD-Gen ist also nach wie vor offen.
Das Hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die für die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimhäute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgelöst und manifestieren sich häufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottisödem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalität aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgewählte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingefügt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivitäts-Assays überprüft. Während bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalität für das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivitäten bestätigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeinträchtige Aktivitäten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen dürften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss über die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verfügbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindomäne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollständig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten Fällen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationsträger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivitätsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein nützliches Hilfsmittel um die Kausalität von Missense-Mutationen aufzuklären und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminosäuren im C1-INH-Protein.
Vitamin K ist ein essentieller Cofaktor für die posttranslationale Gamma-Carboxylierung von sog. Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren, Knochenproteinen, Zellwachstum-regulierenden und weiteren Proteinen mit noch unbekannter Funktion. Defekte im Vitamin K-Stoffwechsel führen einerseits zu zwei verschiedenen Formen des familiären Mangels aller Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren (VKCFD1 und 2) und andererseits zur Resistenz oder Hypersensitivität gegenüber Cumarinderivaten, wie Warfarin, die als Vitamin K-Antagonisten zur Antikoagulationstherapie bei thromboembolischen Erkrankungen, aber auch zur Bekämpfung von Ratten und Mäusen eingesetzt werden. Die Aufklärung und Charakterisierung der molekularen Ursachen dieser Erkrankungen wird in dieser Doktorarbeit anhand von Veröffentlichungen dokumentiert. Ausgehend von der Charakterisierung zweier Familien mit dem VKCFD2-Phänotyp, wird die Kartierung des VKCFD2-Locus auf dem kurzen Arm von Chromosom 16 beschrieben. Durch eine systematische Mutationssuche in der ca. 130 Gene umfassenden Kandidatenregion von Chromosom 16 konnte das für diese Erkrankung und die Warfarinresistenz ursächliche Gen ausfindig gemacht werden. Dabei handelt es sich um das Gen für die entscheidende Komponente der Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1), die den Recycling-Prozess von Vitamin K im sog. Vitamin K-Zyklus katalysiert. Die Charakterisierung des VKORC1-Proteins umfasst dessen subzelluläre Lokalisation, den Vergleich orthologer Proteine in verschiedenen Species und die funktionelle Charakterisierung von rekombinant exprimiertem VKORC1. Durch positionsspezifische Mutagenesen und anschließende Expression in humanen Nierenzellen konnten mehrere für die Funktion der VKORC1 relevante Aminosäuren identifiziert werden. Die posttranslationale Modifikation der Vitamin K-abhängigen Proteine wird von der Gamma-Glutamyl-Carboxylase (GGCX) katalysiert. Defekte in diesem Enzym wurden von zwei verschiedenen Arbeitsgruppen als Ursache für die erste Form der VKCFD-Erkrankung nachgewiesen. In dieser Doktorarbeit werden drei weitere, von unserer Arbeitsgruppe identifizierte Mutationen im GGCX-Gen beschrieben, unter denen sich ein nachgewiesener Founder-Effekt an Position 485 des Proteins befindet. Die Arg485Pro-Variante wurde rekombinant in Insektenzellen exprimiert und konnte mittels kinetischer Studien als VKCFD1-verursachende Mutation verifiziert werden.
Mutationen im C1-Inhibitor(C1-INH)-Gen manifestieren sich in Form autosomal dominant vererbter Angioödeme (hereditäres Angioödem (HAE)), wobei zwei Typen unterschieden werden. Während der HAE-Typ I mit einer Häufigkeit von 85% auftritt und durch erniedrigte C1-INH-Plasmaspiegel mit daraus resultierender niedriger Aktivität gekennzeichnet ist, liegt beim HAE-Typ II ein in seiner inhibitorischen Funktion eingeschränktes neben dem intakten Protein vor. Beide Typen unterscheiden sich nicht hinsichtlich ihrer klinischen Symptomatik und können zur Ausbildung eines lebensbedrohlichen Larynxödems führen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die molekulargenetischen Ursachen des hereditären Angioödems untersucht. Mit Hilfe der DGGE als Screeningverfahren zur Mutationssuche im C1-Inhibitor-Gen wurde eine effiziente Methode etabliert, die eine Detektion von Punktmutationen, kleinen Deletionen und Insertionen ermöglichte. In deren Anschluss konnte durch Sequenzierung eine genaue Charakterisierung der Mutationen erfolgen. Im untersuchten Patientenkollektiv wurden 23 Mutationen bei Patienten mit HAE-Typ I identifiziert, von denen 19 bisher nicht bekannt waren. Dabei handelt es sich um 9 Missense- und 2 Nonsense-Mutationen, 5 kleine Deletionen (1-3 bp) sowie 3 Spleissmutationen, aus denen z. T. mit hoher Wahrscheinlichkeit ihre Bedeutung für die Ausbildung eines HAE erklärbar ist, wobei die Beurteilung der Kausalität der identifizierten Mutationen sich nach dem Mutationstyp und der Mutationslokalisation im Gen richtet. Erst durch die Charakterisierung des zugrundeliegenden Gendefekts wird eine Sicherung der Diagnose HAE und der Ausschluss anderer Differentialdiagnosen ermöglicht und führt damit zu einer Steigerung der Behandlungssicherheit betroffener Patienten.
Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine führt zu einer frühzeitigen Neurodegeneration in Mäusen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellulärer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- Mäusen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erhöht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erhöhten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E lässt eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung während der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten.
In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5’-3’ helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as “partner and localizer of BRCA2”. In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research.
Best disease (OMIM 153700) is an early-onset, autosomal dominant maculopathy characterized by egg yolk-like lesions in the central retina. The disease gene, the vitelliform macular dystrophy gene type 2 (VMD2), encodes a 585-aa VMD2 transmembrane protein, termed bestrophin. The protein is predominantly expressed on the basolateral side of the retinal pigment epithelium (RPE) and is thought to be involved in the transport of chloride ions. Bestrophin as well as three closely related VMD2-like proteins (VMD2L1-L3) contain multiple putative transmembrane (TM) domains and an invariant tripeptide (RFP) motif in the N-terminal half of the protein. This and the tissue-restricted expression to polarized epithelial cells are typical features of the VMD2 RFP-TM family. Best disease is predominantly caused by missense mutations, clustering in four distinct „hotspots“ in the evolutionary highly conserved N-terminal region of the protein. To further augment the spectrum of mutations and to gain novel insights into the underlying molecular mechanisms, we screened VMD2 in a large cohort of affected patients. In total, nine novel VMD2 mutations were identified, raising the total number of known Best disease-related mutations from 83 to 92. Eight out of nine novel mutations are hotspot-specific missense mutations, underscoring their functional/structural significance and corroborating the dominant-negative nature of the mutations. Of special interest is a one-basepair deletion (Pro260fsX288) encoding a truncated protein with a deletion of an important functional domain (TM domain four) as well as the entire C-terminal half of bestrophin. For the first time, a nonsense mutation leading to a 50 % non-functional protein has been identified suggesting that on rare occassions Best disease may be caused by haploinsufficiency. Molecular diagnostics strongly requires a reliable classification of VMD2 sequence changes into pathogenic and non-pathogenic types. Since the molecular pathomechanism is unclear at present, the pathogenicity of novel sequence changes of VMD2 are currently assessed in light of known mutations. We therefore initiated a publicly accessible VMD2 mutation database (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html) and are collecting and administrating the growing number of mutations, rare sequence variants and common polymorphisms. Missense mutations may disrupt the function of proteins in numerous ways. To evaluate the functional consequences of VMD2 mutations in respect to intracellular mislocalization and/or protein elimination, a set of molecular tools were generated. These included the establishment of an in vitro COS7 heterologous expression assay, the generation of numerous VMD2 mutations by site-directed mutagenesis as well as the development of bestrophin-specific antibodies. Surprisingly, membrane fractionation/Western blot experiments revealed no significant quantitative differences between intact and mutant bestrophin. Irrelevant of the type or location of mutation, incorporation of mutant bestrophin to the membraneous fraction was observed. Thus, impaired membrane integration may be ruled out as causative pathomechanism of Best disease consistent with a dominant-negative effect of the mutations. In a different approach, efforts were directed towards identifying and characterizing the VMD2 RFP-TM protein family in mouse. While clarification of the genomic organization of murine Vmd2 was required as basis to generate Vmd2-targeted animals (see below), the study of closely related proteins (Vmd2L1, Vmd2L2 and Vmd2L3) may provide further clues as to the function of bestrophin. For this, biocomputational as well as RT PCR analyses were performed. Moreover, the novel genes were analyzed by real time quantitative RT PCR, displaying predominant expression in testis, colon and skeletal muscle of Vmd2, Vmd2L1 and Vmd2L3 transcripts, respectively as well as in eye tissue. Interestingly, neither an ORF was determined for murine Vmd2L2 nor was the transcript present in a panel of 12 mouse tissues, suggesting that murine Vmd2L2 may represent a functionally inactive pseudogene. The murine Vmd2L3 gene, as its human counterpart, is a highly differentially spliced transcript. Finally, generating mouse models of Best disease will provide essential tools to investigate the pathophysiology of bestrophin in vivo. We have initiated the generation of two different mouse lineages, one deficient of Vmd2 (knock-out) and the other carrying a human disease-related mutation (Tyr227Asn) in the orthologous murine gene (knock-in). Genetic engineering of both constructs has been achieved and presently, four ES clones harboring the homologous recombination event (Vmd2+/-) have been isolated and are ready for the subsequent steps to generate chimeric animals. The resulting mouse lineages will represent two key models to elucidate the functional role of bestrophin in Best disease, in RPE development and physiology.
Complex chromosome rearrangements (CCRs) are currently defined as structural genome variations that involve more than 2 chromosome breaks and result in exchanges of chromosomal segments. They are thought to be extremely rare, but their detection rate is rising because of improvements in molecular cytogenetic technology. Their population frequency is also underestimated, since many CCRs may not elicit a phenotypic effect. CCRs may be the result of fork stalling and template switching, microhomology-mediated break-induced repair, breakage-fusion-bridge cycles, or chromothripsis. Patients with chromosomal instability syndromes show elevated rates of CCRs due to impaired DNA double-strand break responses during meiosis. Therefore, the putative functions of the proteins encoded by ATM, BLM, WRN, ATR, MRE11, NBS1, and RAD51 in preventing CCRs are discussed. CCRs may exert a pathogenic effect by either (1) gene dosage-dependent mechanisms, e.g. haploinsufficiency, (2) mechanisms based on disruption of the genomic architecture, such that genes, parts of genes or regulatory elements are truncated, fused or relocated and thus their interactions disturbed - these mechanisms will predominantly affect gene expression - or (3) mixed mutation mechanisms in which a CCR on one chromosome is combined with a different type of mutation on the other chromosome. Such inferred mechanisms of pathogenicity need corroboration by mRNA sequencing. Also, future studies with in vitro models, such as inducible pluripotent stem cells from patients with CCRs, and transgenic model organisms should substantiate current inferences regarding putative pathogenic effects of CCRs. The ramifications of the growing body of information on CCRs for clinical and experimental genetics and future treatment modalities are briefly illustrated with 2 cases, one of which suggests KDM4C(JMJD2C) as a novel candidate gene for mental retardation.
Background
BRCA1 and, more commonly, BRCA2 mutations are associated with increased risk of male breast cancer (MBC). However, only a paucity of data exists on the pathology of breast cancers (BCs) in men with BRCA1/2 mutations. Using the largest available dataset, we determined whether MBCs arising in BRCA1/2 mutation carriers display specific pathologic features and whether these features differ from those of BRCA1/2 female BCs (FBCs).
Methods
We characterised the pathologic features of 419 BRCA1/2 MBCs and, using logistic regression analysis, contrasted those with data from 9675 BRCA1/2 FBCs and with population-based data from 6351 MBCs in the Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) database.
Results
Among BRCA2 MBCs, grade significantly decreased with increasing age at diagnosis (P = 0.005). Compared with BRCA2 FBCs, BRCA2 MBCs were of significantly higher stage (P for trend = 2 × 10−5) and higher grade (P for trend = 0.005) and were more likely to be oestrogen receptor–positive [odds ratio (OR) 10.59; 95 % confidence interval (CI) 5.15–21.80] and progesterone receptor–positive (OR 5.04; 95 % CI 3.17–8.04). With the exception of grade, similar patterns of associations emerged when we compared BRCA1 MBCs and FBCs. BRCA2 MBCs also presented with higher grade than MBCs from the SEER database (P for trend = 4 × 10−12).
Conclusions
On the basis of the largest series analysed to date, our results show that BRCA1/2 MBCs display distinct pathologic characteristics compared with BRCA1/2 FBCs, and we identified a specific BRCA2-associated MBC phenotype characterised by a variable suggesting greater biological aggressiveness (i.e., high histologic grade). These findings could lead to the development of gender-specific risk prediction models and guide clinical strategies appropriate for MBC management.
Trisomy 22 is a common trisomy in spontaneous abortions. In contrast, live-born trisomy 22 is rarely seen due to severe organ malformations associated with this condition. Here, we report on a male infant with complete, non-mosaic trisomy 22 born at 35 + 5 weeks via caesarean section. Peripheral blood lymphocytes and fibroblasts showed an additional chromosome 22 in all metaphases analyzed (47,XY,+22). In addition, array CGH confirmed complete trisomy 22. The patient’s clinical features included dolichocephalus, hypertelorism, flattened nasal bridge, dysplastic ears with preauricular sinuses and tags, medial cleft palate, anal atresia, and coronary hypospadias with scrotum bipartitum. Essential treatment was implemented in close coordination with the parents. The child died 29 days after birth due to respiratory insufficiency and deterioration of renal function. Our patient’s history complements other reports illustrating that children with complete trisomy 22 may survive until birth and beyond.
Introduction
Miyoshi myopathy, a type of distal myopathy with predominant involvement of the posterior calf muscles, has been assigned to mutations in the dysferlin gene. However, many of the late-onset limb-girdle and distal myopathies that resemble dysferlinopathy or Miyoshi myopathy remain unclassified, even after extensive immunohistological and genetic analysis.
Case presentation
We report the case of a 59-year-old Caucasian man with distal myopathy and exercise-induced myalgia, preferentially of the leg muscles, closely resembling the Miyoshi phenotype. Magnetic resonance imaging of his calf muscles showed typical fatty replacement of the medial heads of the gastrocnemius muscles and soleus muscles, with progression to the adductor longus muscles over a time course of two years. However, genetic analysis revealed that the phenotype of our patient was not related to a mutation in the dysferlin gene but to a novel homozygous splice mutation in the anoctamin 5 gene. Mutations in the anoctamin 5 gene have so far been identified only in some cases of limb-girdle and distal myopathy. Mutations in the anoctamin 5 gene have been assigned to limb-girdle muscular dystrophy type 2L, while distal Miyoshi-like phenotypes have been classified as Miyoshi myopathy type 3.
Conclusion
The case presented in this report further strengthens the underlying genetic heterogeneity in Miyoshi myopathy-like phenotypes and adds another family to non-dysferlin, Miyoshi myopathy type 3 of late-onset. Furthermore, our case supports the recent observation that anoctamin 5 mutations are a primary cause of distal non-dysferlin myopathies. Therefore, given the increasing number of anoctamin 5 mutations in Miyoshi-like phenotypes, genetic analysis should include an anoctamin 5 screen in late-onset limb-girdle and distal myopathies.
Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessive, im Falle der Untergruppe FA-B X-chromosomale Erbkrankheit, die mit chromosomaler und genomischer Instabilität verbunden ist und sich durch große phänotypische und genetische Heterogenität auszeichnet. Symptomatisch sind Knochenmarksversagen, eine Vielfalt angeborener Fehlbildungen, die weit überdurchschnittliche Disposition für akute myeloische Leukämie (AML), Plattenepithelkarzinome (SCC) sowie eine zelluläre Hypersensitivität gegenüber DNA Doppelstrangvernetzenden Substanzen. FA wird kompliziert durch ein progressives Knochenmarksversagen. Die FA Proteine sind essentiell für die interstrand crosslink (ICL) repair sowie an anderen DNA Reparatursystemen, beteiligt. Bisher wurden hauptsächlich Regulationsmechanismen untersucht, die die FA Proteine betreffen. Die Regulation der Transkripte war bisher nahezu unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der sogenannten FA core complex Gene untersucht. Dabei handelt es sich um acht Gene, deren Produkte im Falle eines DNA Schadens den ersten Proteinkomplex des FA/BRCA Signalweges bilden. Für diese acht Gene wurden in dieser Arbeit die Promotoren identifiziert und ihr Aktivierungspotential charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass diese ein starkes Potential für die Transkriptionsinitiierung besitzen. Des Weiteren zeigten sich Gemeinsamkeiten in Form von Sequenzmotiven sowie Transkriptionsfaktorbindestellen, die in allen core complex Genen nahezu identisch waren. Durch diese Analysen ergaben sich Hinweise, dass die untersuchten Gene durch Mitglieder des JAK/ STAT (STAT1/4) sowie des TGF-b Signalwegs (SMAD1/4) reguliert werden. Funktionelle Untersuchungen mittels siRNA sowie Fibroblastenzelllinen, die biallelische FANCA Mutationen trugen, bestätigten diese Verbindungen. So hatte der knockdown der entsprechenden Transkriptionsfaktoren einen reduzierenden Einfluss auf die Transkriptmenge der core complex Gene. FANCA-mutierte Zelllinen weisen reduzierte mRNAs von STAT und SMAD auf. Darüber hinaus fanden sich signifikante Änderungen der Transkriptmenge in 112 verschiedenen Mitgliedern dieser Signalwege in den FA-A Zellinien. Eines dieser Mitglieder, IRF1, zeigte fast identische Ergebnisse wie sie bei STAT1/4 sowie SMAD1/4 beobachtet werden konnten. Die vorliegende Arbeit trägt dazu bei, die transkriptionelle Regulation der core complex Gene besser zu verstehen. Die auffälligen Gemeinsamkeiten ihrer Regulation liefern neue Argumente für eine Koevolution dieser Gene.
Im ersten Teil dieser Arbeit wird überprüft, inwieweit bei einer Patientengruppe, die molekulargenetisch negativ auf fazioscapulohumerale Muskeldystrophie untersucht wurde, differentialdiagnostisch eine myotone Dystrophie in Frage kommt. Der zweite Abschnitt hat zum Ziel, zu kontrollieren, ob im Patientenkollektiv derer, die negativ auf eine häufige Mutation im -Sarkoglycangen (Adhalingen) getestet wurden, differentialdiagnostisch eine fazioscapulohumerale Muskeldystrophie in Betracht zu ziehen ist.
Das Cornelia-de-Lange-Syndrom (CdLS) ist ein angeborenes Fehlbildungs- und Retardierungssyndrom, dessen Diagnose ausschließlich klinisch gestellt wird, wobei die charakteristischen Gesichtszüge, Fehlbildungen der oberen Extremitäten, Minderwuchs und geistige Behinderung wichtige Kriterien sind. Seit den Erstbeschreibungen wurden viele Arbeiten über dieses Syndrom veröffentlicht, die sich jedoch meist auf Erfahrungen mit Kindern beschränken. Ziel dieser Arbeit ist es, jugendliche und erwachsene Patienten mit CdLS zu beschreiben, um durch einen Einblick in ihre Biographie die Kenntnisse über diese Erkrankung zu stabilisieren und betroffenen Familien die Mannigfaltigkeit des Syndroms zu veranschaulichen. In einem weiteren Abschnitt werden Fälle aus der Literatur vorgestellt, in denen die Problematik der Schwangerschaft von Patientinnen mit CdLS und die Vererbbarkeit der Erkrankung besondere Beachtung findet. Die Adressen der Probanden stellte der Arbeitskreis „Cornelia de Lange-Syndrom e.V.“ zur Verfügung. Dieser Verein ist eine Initiative betroffener Familien, die deutschlandweit tätig ist und derzeit über 80 Patienten mit der Diagnose CdLS erfaßt hat. Anhand der Angaben aus Fragebögen und telefonischen Gesprächen mit den Eltern werden 17 Probanden beschrieben.
Isolation of a Cancer-Associated Microchromosome in the Sperm-Dependent Parthenogen Poecilia formosa
(2011)
In the asexual all-female fish species Poecilia formosa, the Amazon molly, supernumerary chromosomes have frequently been found in both laboratory-reared and wild-caught individuals. While wild-caught individuals with B chromosomes are phenotypically indifferent from conspecifics, individuals carrying B chromosomes from recent introgression events in the laboratory show phenotypic changes. Former analyses showed that the expression of a pigment cell locus is associated with the presence of these B chromosomes. In addition, they contain a so far unidentified locus that confers a higher susceptibility to tumor formation in the presence of pigmentation pattern. Isolation by microdissection and hybridization to metaphase chromosomes revealed that they contain one or several sequences with similarity to a highly repetitive pericentromeric and subtelomeric sequence in A chromosomes. Isolation of one particular sequence by AFLP showed that the B chromosomes contain at least 1 copy of an A-chromosomal region which is highly conserved in the whole genus Poecilia, i.e. more than 5 million years old. We propose it to be a single copy sequence.
Die LGMD ist eine seltene Erbkrankheit der Muskelfasern, die zur Abnahme der Muskelmasse und der Muskelkraft führt. Das Institut der Humangenetik der Universität Würzburg ist eine der wenigen Stellen in Deutschland, die die molekulargenetische Diagnostik der LGMD 1B, 1C, 2A, 2B, 2D und 2I anbietet. Demnach liegen hier viele Daten vor und anhand dieser Daten konnten die Inzidenzen dieser Formen für Deutschland geschätzt werden. Zur Schätzung der LGMD-Inzidenz wurde eine andere Erkrankung herangezogen, die ähnlich selten auftritt wie die LGMD: DM1 und DM2. Die Schätzung ergab eine Inzidenz von 1: 33 000 für die autosomal-rezessiven Formen der LGMD und eine Inzidenz von 1: 272 000 für die autosomal-dominanten Formen der LGMD für Deutschland. Vergleicht man diese Daten mit den Daten aus der Weltliteratur , sieht man, dass die Häufigkeiten nahezu identisch sind.
Hypophosphatasia (HPP) is a rare genetic disease with diverse symptoms and a heterogeneous severity of onset with underlying mutations in the ALPL gene encoding the ectoenzyme Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP). Considering the establishment of zebrafish (Danio rerio) as a new model organism for HPP, the aim of the study was the spatial and temporal analysis of alpl expression in embryos and adult brains. Additionally, we determined functional consequences of Tnap inhibition on neural and skeletal development in zebrafish. We show that expression of alpl is present during embryonic stages and in adult neuronal tissues. Analyses of enzyme function reveal zones of pronounced Tnap-activity within the telencephalon and the mesencephalon. Treatment of zebrafish embryos with chemical Tnap inhibitors followed by axonal and cartilage/mineralized tissue staining imply functional consequences of Tnap deficiency on neuronal and skeletal development. Based on the results from neuronal and skeletal tissue analyses, which demonstrate an evolutionary conserved role of this enzyme, we consider zebrafish as a promising species for modeling HPP in order to discover new potential therapy strategies in the long-term.
Background
Inherited pathogenic variants in BRCA1 and BRCA2 are the most common causes of hereditary breast and ovarian cancer (HBOC). The risk of developing breast cancer by age 80 in women carrying a BRCA1 pathogenic variant is 72%. The lifetime risk varies between families and even within affected individuals of the same family. The cause of this variability is largely unknown, but it is hypothesized that additional genetic factors contribute to differences in age at onset (AAO). Here we investigated whether truncating and rare missense variants in genes of different DNA-repair pathways contribute to this phenomenon.
Methods
We used extreme phenotype sampling to recruit 133 BRCA1-positive patients with either early breast cancer onset, below 35 (early AAO cohort) or cancer-free by age 60 (controls). Next Generation Sequencing (NGS) was used to screen for variants in 311 genes involved in different DNA-repair pathways.
Results
Patients with an early AAO (73 women) had developed breast cancer at a median age of 27 years (interquartile range (IQR); 25.00–27.00 years). A total of 3703 variants were detected in all patients and 43 of those (1.2%) were truncating variants. The truncating variants were found in 26 women of the early AAO group (35.6%; 95%-CI 24.7 - 47.7%) compared to 16 women of controls (26.7%; 95%-CI 16.1 to 39.7%). When adjusted for environmental factors and family history, the odds ratio indicated an increased breast cancer risk for those carrying an additional truncating DNA-repair variant to BRCA1 mutation (OR: 3.1; 95%-CI 0.92 to 11.5; p-value = 0.07), although it did not reach the conventionally acceptable significance level of 0.05.
Conclusions
To our knowledge this is the first time that the combined effect of truncating variants in DNA-repair genes on AAO in patients with hereditary breast cancer is investigated. Our results indicate that co-occurring truncating variants might be associated with an earlier onset of breast cancer in BRCA1-positive patients. Larger cohorts are needed to confirm these results.
Fungal microorganisms frequently lead to life-threatening infections. Within this group of pathogens, the commensal Candida albicans and the filamentous fungus Aspergillus fumigatus are by far the most important causes of invasive mycoses in Europe. A key capability for host invasion and immune response evasion are specific molecular interactions between the fungal pathogen and its human host. Experimentally validated knowledge about these crucial interactions is rare in literature and even specialized host pathogen databases mainly focus on bacterial and viral interactions whereas information on fungi is still sparse. To establish large-scale host fungi interaction networks on a systems biology scale, we develop an extended inference approach based on protein orthology and data on gene functions. Using human and yeast intraspecies networks as template, we derive a large network of pathogen host interactions (PHI). Rigorous filtering and refinement steps based on cellular localization and pathogenicity information of predicted interactors yield a primary scaffold of fungi human and fungi mouse interaction networks. Specific enrichment of known pathogenicity-relevant genes indicates the biological relevance of the predicted PHI. A detailed inspection of functionally relevant subnetworks reveals novel host fungal interaction candidates such as the Candida virulence factor PLB1 and the anti-fungal host protein APP. Our results demonstrate the applicability of interolog-based prediction methods for host fungi interactions and underline the importance of filtering and refinement steps to attain biologically more relevant interactions. This integrated network framework can serve as a basis for future analyses of high-throughput host fungi transcriptome and proteome data.
Fungal infections are a major global health burden where Candida albicans is among the most common fungal pathogen in humans and is a common cause of invasive candidiasis. Fungal phenotypes, such as those related to morphology, proliferation and virulence are mainly driven by gene expression, which is primarily regulated by kinase signaling cascades. Serine-arginine (SR) protein kinases are highly conserved among eukaryotes and are involved in major transcriptional processes in human and S. cerevisiae. Candida albicans harbors two SR protein kinases, while Sky2 is important for metabolic adaptation, Sky1 has similar functions as in S. cerevisiae. To investigate the role of these SR kinases for the regulation of transcriptional responses in C. albicans, we performed RNA sequencing of sky1Δ and sky2Δ and integrated a comprehensive phosphoproteome dataset of these mutants. Using a Systems Biology approach, we study transcriptional regulation in the context of kinase signaling networks. Transcriptomic enrichment analysis indicates that pathways involved in the regulation of gene expression are downregulated and mitochondrial processes are upregulated in sky1Δ. In sky2Δ, primarily metabolic processes are affected, especially for arginine, and we observed that arginine-induced hyphae formation is impaired in sky2Δ. In addition, our analysis identifies several transcription factors as potential drivers of the transcriptional response. Among these, a core set is shared between both kinase knockouts, but it appears to regulate different subsets of target genes. To elucidate these diverse regulatory patterns, we created network modules by integrating the data of site-specific protein phosphorylation and gene expression with kinase-substrate predictions and protein-protein interactions. These integrated signaling modules reveal shared parts but also highlight specific patterns characteristic for each kinase. Interestingly, the modules contain many proteins involved in fungal morphogenesis and stress response. Accordingly, experimental phenotyping shows a higher resistance to Hygromycin B for sky1Δ. Thus, our study demonstrates that a combination of computational approaches with integration of experimental data can offer a new systems biological perspective on the complex network of signaling and transcription. With that, the investigation of the interface between signaling and transcriptional regulation in C. albicans provides a deeper insight into how cellular mechanisms can shape the phenotype.
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 5-Methylcytosin Immunofärbung zytogenetische Analysen an Metaphasechromosomen aus der Mitose, an Interphase-Zellen verschiedener Organe und an Meiose-Stadien der Maus (Mus musculus) zur Detektion hypermethylierter DNA durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine C-Bänderung an Metaphasechromosomen und Meiose-Stadien zum Nachweis von konstitutivem Heterochromatin.
Thrombocytopenia and pancytopenia, occurring in patients with Fanconi anemia (FA), are interpreted either as progression to bone marrow failure or as developing myelodysplasia. On the other hand, immune thrombocytopenia (ITP) represents an acquired and often self-limiting benign hematologic disorder, associated with peripheral, immune-mediated, platelet destruction requiring different management modalities than those used in congenital bone marrow failure syndromes, including FA. Here, we describe the clinical course of two independent FA patients with atypical – namely immune – thrombocytopenia. While in one patient belonging to complementation group FA-A, the ITP started at 17 months of age and showed a chronically persisting course with severe purpura, responding well to intravenous immunoglobulins (IVIG) and later also danazol, a synthetic androgen, the other patient (of complementation group FA-D2) had a self-limiting course that resolved after one administration of IVIG. No cytogenetic aberrations or bone marrow abnormalities other than FA-typical mild dysplasia were detected. Our data show that acute and chronic ITP may occur in FA patients and impose individual diagnostic and therapeutic challenges in this rare congenital bone marrow failure/tumor predisposition syndrome. The management and a potential context of immune pathogenesis with the underlying marrow disorder are discussed.
Das Hauptziel der medizinischen Genetik ist es, die Ursachen für genetisch hervorgerufene Krankheiten zu finden, um eine bessere Behandlung der Patienten zu gewährleisten, sei es um die Medikamente auf den Metabolismus des Individuums anzupassen oder natürlich dazu, um die Krankheit selbst zu behandeln und in Zukunft auch heilen zu können. Um dieses Ziel zu erreichen werden immer neue Technologien entwickelt, die mit Hilfe von bereits etablierten Methoden auf ihre Eignung hin überprüft werden müssen. Eine der neuesten Entwicklungen stellt die Array-Technologie dar. In dieser Studie wurde versucht zu überprüfen, inwieweit diese neue Methode zur Analyse von einzelnen bis wenigen Patienten mit bestimmten Syndromen geeignet ist. Dafür wurden mehrere Patienten mir sehr unterschiedlichen Phänotypen ausgesucht, die verschiedene Ursachen und Entstehungsmechanismen der genetischen und phänotypischen Veränderung vermuten ließen. Die erste hier dargestellte Publikation beschreibt einen Fall mit einer einseitigen Schalleitungsschwerhörigkeit, der mit einer Translokation der(18)t(18;22) mit der involvierten Deletion 22pter→q11.21, sowie den darin enthaltenden Genen der CES-Region, erklärt wurde. Der in der zweiten Publikation beschriebene Fall mit MR und Verhaltensauffälligkeiten wurde mit einer intragenischen Mikrodeletion im Gen IL1RAPL1 korreliert. Zwei Fälle autoimmunbedingten Leberversagens bei einem Phelan-McDermid Syndrom wurden in der dritten Publikation primär auf eine Deletion des Gens PIM3 zurückgeführt. Ein autistischer Junge mit einer Entwicklungsverzögerung und gewalttätigen Ausbrüchen zeigte in der vierten Publikation ein sehr komplexes Rearrangement mit mehreren Brüchen im Gen CNTNAP2 und Deletionen anderer Gene, die zusammen für den Phänotyp verantwortlich sein können. Keine Mikrodeletion, sondern eine Epimutation in Chromosom 14q32.2 war die Ursache für die Adipositas mit einer Sprachentwicklungsverzögerung bei einem Jungen, der in der fünften Publikation beschrieben ist. Um die o. g. genetischen Veränderungen zu finden, wurden verschiedene Methoden wie die GTG-Bänderung, FISH, MLPA und verschiedene Array-Systeme verwendet. Mit jeder von diesen Methoden konnten neue und einander ergänzende Daten zu den genetischen Veränderungen eines Individuums gewonnen werden. Keine der Methoden konnte für sich allein ein vollständiges Bild liefern. Die GTG-Bänderung zeigt zwar das ganze Genom, hat aber die Limitierung der niedrigen Auflösung. Sie konnte dennoch Anhaltspunkte für höherauflösende Untersuchungsmethoden geben. Dazu gehörte die FISH, die entweder zur feineren Auflösung der Bänderungsdaten oder zur Bestätigung von Array-Befunden verwendet wurde. Die MLPA wurde unterstützend auf der Suche nach sehr kleinen Veränderungen in eingegrenzten Regionen eingesetzt. In einigen der beschriebenen Fälle wurden trotz eines negativen Bänderungsbefundes aufgrund des auffälligen Phänotyps genetische Ursachen vermutet, und daher feiner auflösende Methoden eingesetzt. Die am höchsten auflösenden Array-basierten Methoden wurden eingesetzt, wenn ansonsten keine Ergebnisse zu erzielen waren, oder eine feinere Auflösung der vorhandenen Daten erreicht werden sollte. Anschließend konnten die Erkenntnisse über die Veränderungen mit dem Phänotyp korreliert werden, um ein Kandidatengen oder eine Kandidatengenregion zu ermitteln. Aufgrund der großen Datenmenge aus den Array-Experimenten, waren zur Entscheidung über die Relevanz der Daten bezüglich der Entstehung des Phänotyps umfassende Datenbank- und Literatur-Recherchen notwendig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Array-Technologie einen großen Fortschritt darstellt, in der Suche nach Ursachen für genetische Erkrankungen. Sie hat aber technische Limitierungen und um das Problem der Phänotyp-Genotyp-Korrelation zu vereinfachen, werden weltweit noch viele Daten gesammelt werden müssen. Das ist eine Frage der Zeit und der Weiterentwicklung geeigneter Technologien.
Zerebrale kavernöse Malfomationen (CCM) sind vaskuläre Fehlbildungen im Gehirn. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte, blutgefüllte Gefäße mit einschichtigem Endothel, denen Merkmale ausgereifter Blutgefäße fehlen. Die klinischen Symptome reichen von Kopfschmerz bis hin zu hämorraghischem Schlaganfall. Eine genaue Vorhersage des Krankheitsverlaufs ist nicht möglich und die neurochirurgische Dissektion ist in der Regel die Therapieform der Wahl. Die genauen molekularen Mechanismen der CCM-Pathogenese sind unbekannt. CCMs treten sporadisch oder familiär gehäuft auf und folgen einem autosomal-dominanten Erbgang. Drei krankheitsverursachende Gene wurden in familiären CCMs identifiziert: CCM1/KRIT1, CCM2/MGC4607 und CCM3/PDCD10. Da Patienten mit einer Mutation in einem der drei CCM-Gene denselben klinischen Phänotyp aufweisen, wurde angenommen, dass die CCM-Proteine (CCM1, CCM2 und CCM3) Bestandteile eines molekularen Signalwegs sind. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass CCM3 mit CCM2 interagiert und zusammen mit CCM1 einen ternären Proteinkomplex bildet. Untersuchungen mit der humanen in-frame CCM2-Deletionsmutante CCM2:p.P11_K68del belegten, dass CCM2 das zentrale Gerüstprotein des CCM1/CCM2/CCM3-Proteinkomplexes ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass CCM3 an die Serin/Threonin-Kinase STK25 und an die Fas-assoziierte Phosphatase-1 (FAP-1) bindet. STK25 phosphoryliert CCM3 am Serin 39 und am Threonin 43. Die katalytische Domäne von FAP-1 dephosphoryliert CCM3. Untersuchungen mit der einzig bekannten humanen CCM3-Deletionsmutante, der aufgrund einer in-frame Deletion von Exon 5 im CCM3-Gen 18 Aminosäuren (CCM3:p.L33_K50del) fehlen, belegten zudem, dass in vitro dephosphoryliertes CCM3 Bestandteil des ternären CCM-Proteinkomplexes ist. Während STK25 die Deletionsmutante nicht mehr binden und phosphorylieren konnte, war die Interaktion mit CCM2 und die Bildung des ternären CCMKomplexes nicht beeinträchtigt. Somit könnte CCM3 über die Dephosphorylierung durch FAP-1 und die Phosphorylierung durch STK25 funktionell reguliert werden. Es stellte sich zudem heraus, dass CCM3 durch Induktion von oxidativem Stress mittels H2O2-Behandlung in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen herunterreguliert wird. Die in dieser Arbeit beschriebene Charakterisierung von CCM3-Interaktionen bringt CCM3 über seine Interaktionspartner erstmals in Zusammenhang mit molekularen Signalwegen, die an Prozessen der Angiogenese und vaskulären Entwicklung beteiligt sind. Die Ergebnisse liefern wichtige Hinweise für die Entschlüsselung der pathogenen Mechanismen zerebraler kavernöser Malformationen und stellen einen ersten Schritt dar, um andere Behandlungsansätze als den bisher angewandten chirurgischen Eingriff, der multiple Risiken birgt, entwickeln zu können.
Ungefähr 1 -3 Lebendgeborene von 1000 sind von einer Hörstörung betroffen, wovon etwa 60% der Fälle genetisch bedingt sind und in der Mehrzahl einem autosomal rezessiven Erbgang unterliegen. Die Ursachen dieser, zumeist das Innenohr betreffenden, Schallempfindungsstörungen sind äußerst heterogen. Rund 50 Gene konnten bisher mit angeborener, nicht-syndromaler Schallempfindungsschwerhörigkeit in kausalen Zusammenhang gebracht werden, mit GJB2 als dem bislang bedeutendsten, das für bis zu 50% aller Fälle verantwortlich ist. Die Identifizierung weiterer Hörstörungsgene und deren Charakterisierung war Gegenstand dieser Arbeit. Dafür wurden Positionsklonierungsverfahren einerseits und Patienten-screenings andererseits, angewandt. Wir fanden eine homozygote, reziproke Translokation 46,XY,t(10;11),t(10;11) bei einem Patienten mit kongenitaler Schallempfindungsschwerhörigkeit. Beide Eltern und vier weitere Geschwister waren heterozygote Träger der Translokation. Nach der Einengung der Bruchpunktregionen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von spezifischen BAC-Klonen, konnte der exakte Bruchpunkt mittels Vektor-Ligation der Fusionsfragmente und anschließender Sequenzierung bestimmt werden. PDZD7 ist ein PDZ-Domänen-kodierendes Gen auf Chromosom 10, das durch die Translokation beim Patienten zerrissen ist. PDZD7 ist ein Paralog zu den PDZDomänen enthaltenden Genen Harmonin und Whirlin. Mutationen in beiden Genen können kongenitale nicht-syndromale Taubheit und das Usher-Syndrom verursachen, eine Erkrankung mit Taub- und Blindheit. Funktionelle Protein-Protein Interaktionsstudien und Genexpressionsmessungen konnten zeigen, dass PDZD7 mit den beiden Usher-Proteinen interagiert und im menschlichen Innenohr exprimiert wird. Diese Daten unterstützen eine starke Evidenz für PDZD7 als syndromales und nicht-syndromales Hörstörungsgen. Weiterhin wurden durch Screenings eines Hörstörungspatientenkollektives (n=534) genetische und epigentische, möglicherweise pathogene Mechanismen charakterisiert. Diese Screenings wurden für PDZD7, CX30, CX30.3, CX43 (Exomsequenzierung); OTOF, KCNE1 (SNP-Typisierung); del(chr13:19,837,344- 19,968,698) (Deletionsscreening) und GJB2 (Promotermethylierung) durchgeführt.