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Obwohl das Krankheitsbild der HIV-Demenz schon seit über 20 Jahren bekannt ist, sind die Abläufe und Mechanismen, die zur Ausbildung neuropsychiatrischer Defizite führen, noch immer ungeklärt. Um die Ätiologie und Pathogenese der HIV-Demenz verstehen zu können, sind Untersuchungen in einer möglichst frühen, noch asymptomatischen Phase der HIV-Infektion notwendig. Deswegen bietet das SIV/Rhesusaffen-Modell beste Voraussetzungen um die Entstehung der HIV-Demenz genauer zu untersuchen. Es gibt einige Hinweise, dass viele klinische Zeichen der HIV-Demenz mit Veränderungen im dopaminergen System des ZNS einhergehen. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit die Signaltransduktion von Dopamin in den dopaminergen Arealen des Gehirns SIV-infizierter Rhesusaffen untersucht. Die Konzentration des cAMP und die Expression des CREB Proteins erwiesen sich als geeignete Untersuchungsparameter. cAMP dient unter anderem dem Neurotransmitter Dopamin in der postsynaptischen Zelle als sogenannter „second messenger“. CREB ist in der darauffolgenden Transduktionskaskade ein Protein, das die Expression zahlreicher Gene beeinflusst. Die Daten wurden für die Hirnregionen Nucleus accumbens, Corpus amygdaloideum und Putamen erhoben. Nucleus accumbens und Corpus amygdaloideum sind Teile des limbischen Systems, die auch in der Pathophysiologie psychiatrischer Störungen und Suchterkrankungen eine Rolle spielen. Das Putamen ist Teil des Corpus striatum, welches extrapyramidale Bewegungsabläufe beeinflusst. Neben dem Vergleich zwischen Kontrolltieren und SIV-infizierten Rhesusaffen wurden auch die Veränderungen der cAMP bzw. CREB Konzentration bei SIV-infizierten und uninfizierten jeweils mit dopaminergen Medikamenten behandelten Rhesusaffen erfasst. Hierfür wurden einige Tiere mit Selegilin bzw. L-DOPA behandelt. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die Konzentration des gesamt CREB war bei SIV-infizierten Tieren in allen untersuchten Hirnregionen reduziert. Die intrazelluläre Konzentration von cAMP war im Nucleus accumbens sowie im Putamen verringert, blieb im Corpus amygdaloideum SIV-infizierter Rhesusaffen jedoch unverändert. Im Nucleus accumbens stieg der CREB Spiegel bei den SIV-infizierten mit Selegilin behandelten Tieren tendenziell an, die cAMP Konzentration blieb jedoch nahezu unverändert. Im Putamen rief die Behandlung SIV-infizierter Tiere mit Selegilin und L-DOPA eine Erhöhung der CREB Expression hervor. Der cAMP Spiegel im Putamen SIV-infizierter Rhesusaffen wurde von der dopaminergen Medikation nicht beeinflusst. Die mit dopaminergen Medikamenten behandelten Kontrolltiere zeigten im Nucleus accumbens und im Putamen keine wesentlichen Veränderungen, weder in der cAMP Konzentration, noch in der CREB Expression. Im Corpus amygdaloideum blieb die cAMP Konzentration durch die Behandlung SIV-infizierter Rhesusaffen mit Selegilin bzw. L-DOPA unverändert. Die cAMP Konzentration fiel bei den mit Selegilin behandelten Kontrolltieren signifikant ab, stieg jedoch bei den mit L-DOPA behandelten Kontrolltieren an. Der CREB Spiegel hingegen zeigte bei den Kontrolltieren sowie auch bei den SIV-infizierten Tieren mit dopaminerger Behandlung im Corpus amygdaloideum keine signifikanten Veränderungen. Einige Versuchstiere wurden erst im AIDS-Stadium der Infektion getötet. Diese Tiere zeigten verglichen mit den SIV-infizierten Tieren, die bereits im asymptomatischen Stadium der Erkrankung getötet wurden, im Nucleus accumbens, im Corpus amygdaloideum und auch im Putamen bezüglich der cAMP Konzentration keinen signifikanten Unterschied. Diese Ähnlichkeit weist auf pathologische Veränderungen des ZNS hin, die schon im frühen Stadium der Infektion entstehen und möglicherweise den Krankheitsverlauf entscheidend beeinflussen. Die Analyse der Ergebnisse zeigt, dass das Immundefizienzvirus in manchen Hirnregionen erwiesenermaßen Veränderungen der dopaminergen Signaltransduktion hervorruft, die sich allerdings nicht in allen Hirnregionen gleich gestalten. Dies könnte auf die unterschiedliche Verteilung der Dopaminrezeptorgruppen in den untersuchten Hirnregionen zurückzuführen sein. Vor allem das Absinken der CREB Konzentration in Regionen des limbischen Systems und im Putamen in SIV-infizierten Rhesusaffen, weist darauf hin, dass die neuropsychiatrischen Veränderungen im Rahmen der HIV-Infektion einen biologischen Hintergrund haben.
Bei Wahlreaktionszeitaufgaben werden während eines fehlerinduzierenden Paradigmas im Frontallappen Potentialänderungen erzeugt. Diese im EEG sichtbaren Potentiale werden ereignis-korrelierte Potentiale (EKP´s) genannt. Bei den EKP´s nach Fehleingaben ist besonders die „error-related negativity“ (ERN) sowie die Positivität P300 (Pe) hervorzuheben. In dieser Arbeit wurde die ERN sowie die Pe bei 39 Probanden untersucht und genauer klassifiziert. Zusätzlich wurde mit Hilfe der Quellenlokalisationsmethode LORETA dreidimensional die genaue Lokalisation der ERN bestimmt. Auf der Suche nach Beeinflussungsfaktoren der ERN-Amplitude wurden bei den Probanden verschiedene Persönlichkeitsmerkmale sowie die Genpolymorphismen des 5-HTTs (5-Hydroxythryptophantransporter), des D4(Dopamin)-Rezeptors und der MAO A (Monoaminooxidase A) bestimmt und nach möglichen Zusammenhängen zwischen diesen Faktoren gesucht. Es ergab sich ein signifikanter Unterschied (Z = - 2,00, p < 0,05) für zwei nach Geschlecht und Alter angepassten Gruppen des 5-HTT-Polymorphismus in der Höhe der ERN-Amplitude. So hatten Probanden mit ein oder zwei Kopien des kurzen Allels (S/S, S/L) des 5-HTT-Polymorphismus eine höhere Ausbildung der ERN-Amplitude (- 5,44 µV ± 2,99 µV) als Probanden mit zwei Kopien des langen Allels (L/L: - 3,77 µV ± 2,53 µV). Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass Probanden mit einer oder zwei Kopien des kurzen Allels des 5-HTT-Polymorphismus (S/S, S/L: 15,86 ± 3,82) niedrigere Werte für das Persönlichkeitsmerkmal NA (negativer Affekt) besaßen (Z = - 2,899, p < 0,005, L/L: 20,82 ± 5,12). Zwischen der Höhe der ERN-Amplitude und den Werten der Persönlichkeitsmerkmale ergab sich hingegen kein signifikanter Zusammenhang. Somit scheint der 5-HTT-Polymorphismus mit einer erhöhten Ansprechbarkeit des Vorderhirns sowie einem negativeren Affekt einherzugehen. Außerdem stützen diese Ergebnisse die Vorstellung, dass die Funktion des präfrontalen Kortex von der genetischen Variation des Serotonintransporters beeinflusst wird.
Ausführung und Verhinderung einer motorischen Antwort sind Vorgänge, die sich in der Lokalisation von aktivierten Arealen im Gehirn deutlich voneinander unterscheiden. Zu deren Untersuchung kann die Inhibition und Exekution von motorischen Antworten durch Tests wie den Continuous Performance Test (Go-Nogo-Paradigma) ausgelöst werden. Um für die Identifikation unterschiedlicher aktivierter Areale im Gehirn die hohe zeitliche Auflösung EEG-basierter Daten nutzen zu können, benötigt man ein Verfahren zur dreidimensionalen Quellenlokalisation. Das Problem der eindeutigen lokalen Zuordnung von aktivierten Quellen im EEG wird durch Näherungsberechnungen wie LORETA (Low resolution electromagnetic tomography) zu lösen versucht. Für die Anwendung von LORETA existiert bisher kein Standard hinsichtlich Elektrodenzahl und Mittelung von Elektroden (Regularisierung). Dadurch entstanden die Leitfragen der Untersuchung nach Veränderung der Ergebnisse durch unterschiedliche Elektrodenanzahl oder Verwendung der Regularisierung. Zusätzlich wurde der Einfluss der Berechnung des Global Field Power - Peaks betrachtet, anhand dessen der genaue Zeitpunkt der Bildberechnung bestimmt wird. Die aus diesen systematisch variierten Parametern resultierenden Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen der bisherigen EEG- und fMRI-Studien verglichen.
Migräne wird gegenwärtig als multifaktorielle Erkrankung mit komplexem Vererbungsmodus verstanden. In einer Assoziationsstudie wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht, inwiefern ein hochpolymorpher CAG-repeat-tragender Abschnitt des KCNN3-Gens zur Entstehung von sporadischer Migräne mit bzw. ohne Aura beiträgt. Der methodische Teil dieser Arbeit beinhaltete die Etablierung neuer Methoden zum Nachweis von triplet-repeat-Längenpolymorphismen. Dabei wurde getestet, ob sich die Real-Time-PCR mit Schmelzkurvenanalyse und die SYBR-Gold-Färbemethode als Alternative zur standardmäßig verwendeten Polymerasekettenreaktion mit nachfolgender vertikaler Polyacrylamidgelelektrophorese und Nachweis mittels Autoradiographie eignen. Da KCNN3 auf dem zur familiären hemiplegischen Migräne gekoppelten Genabschnitt auf Chromosom 1q21.3 liegt, sein Genprodukt – ein Kalzium-aktivierter Kaliumkanal – eine wichtige Rolle bei der Modulation neuronaler Erregungsmechanismen spielt und durch den CAG-Polymorphismus einen wichtigen Mikrosatellitenmarker einerseits und einen funktionell bedeutenden Bereich andererseits beinhaltet, erschien es als geeignetes Kandidatengen zur Untersuchung einer möglichen Assoziation mit Migräne. Im Rahmen der Assoziationsstudie wurden 190 Migränepatienten und 232 Kontrollpersonen hinsichtlich ihrer 2[CAG]n-tragenden Allele des KCNN3 genotypisiert. Nachfolgend wurde die Verteilung der Genotyp- und Allelfrequenzen in der Fall- und in der Kontrollgruppe miteinander verglichen. Hierbei zeigte sich, dass Träger eines seltenen Allels mit 15 CAGs signifikant häufiger an Migräne mit und ohne Aura erkranken. Bezüglich aller anderen Allele wurde keine Assoziation mit Migräne gefunden. Dies spricht dafür, dass KCNN3 an der Pathogenese der Migräne beteiligt ist, ihm aber lediglich eine untergeordnete Rolle zukommt. KCNN3 wurde somit als ein Kandidatengen für Migräne bestätigt, das durch funktionelle Analysen und weitere genetische Untersuchungen eingehender betrachtet werden sollte.
Neuromelanin (NM) is a complex polymer pigment found in catecholaminergic neurons of the human substantia nigra and locus ceruleus. The structure of this molecule is poorly characterised, and the physiological function of it in the brain is unknown. In vitro data, based upon synthetic dopamine melanins (DAM), suggest that these pigments may exhibit radical scavenging properties, but in the presence of iron, DAM acts as a proxidant. These data suggested that NM may be associated with the especial vulnerability of pigmented dopaminergic cells in Parkinson´s disease (PD), a disorder in which nigral iron levels are increased and the relatively specific loss of the pigmented neurons of the substantia nigra. Given the rarity of NM, and the difficulty of isolating this material from the human brain, all functional studies of NM published to date have utilised a synthetic dopamine melanin in place of the native pigment. In the current work we investigated the effects of NM from the healthy human brain and synthetic DAM on cell health and oxidative status in human-derived cell lines. Methods SK-N-SH, a human neuroblastoma cell line, and U 373, a human glioblastoma cell line was chosen to represent human neuronal and glial cell types. NM was isolated from the SN of adult human subjects from Australia and Germany with no history of neurological or neurodegenerative diseases. Synthetic DAM was prepared by autooxidation of dopamine. DAM and NM samples were added to the cultures with fresh media to final concentrations of 0.05 or 0.1 mg/ml. In some experiments cells were incubated with Fenton reagent (400µM FeSO4 plus 200µM H2O2) in the presence or absence of melanin or the iron chelator desferoxamine mesylate (100µM). The cells were incubated at 37 °C at 5% CO2 for varying periods of time as described. Lactate dehydrogenase (LDH) activity and Lipid peroxidation were measured. Hydroxyl radical production in the cultures was estimated used a modification of the salicylic acid spin-trapping method. All experiments were performed three times in triplicate and analysed using regression analysis and one- or two-way Analysis of Variance followed by Bonferroni’s t test corrected for multiple comparisons as appropriate. Results Following 24 hr incubation, both the native NM and the synthetic DAM pigment could be seen as electron dense granules both within the cell bodies of the SK-N-SH and U373 cells. The melanin was incorporated into the cell via an invagination of the cell membrane. DAM but not NM significantly increased the LDH activity and lipid peroxidation as well as the hydroxyl radical production. Co-incubation of Fenton reagent with either DAM or NM resulted in additive effects, compared to the levels elicited by Fenton reagent and the melanins alone. When added the iron chelator desferoximine together with Fenton reagent attentuated lipid peroxidation and hydroxyl radical production to control levels. In contrast, lipid peroxidation and hydroxyl radical production in U373 cells exposed to NM or DAM did not differ to that measured in untreated cells. Discussion Human neuron-derived cell line is a useful approach to address the effects of NM on dopaminergic neuron function. This is the first work to use internalised NM isolated from the healthy human brain as a model of intraneuronal pigment in vitro. Cell line functional studies showing cellular changes induced by DAM but not NM demonstrated that DAM is relatively toxic to cells but not NM. DAM represents a poor functional model of NM in that it displays a marked toxicity unrepresentative of the effects of the native melanin. Both NM and DAM were unable to attentuate the toxic effects of the added oxidative stimulus, this probably due to the exceeding the chelating capacity of NM. Future studies should point to the characterization and role of NM under in vivo conditions. The development of strategies to protect the neuromelanin in dopaminergic neurons may have important therapeutic implications not only for PD.
Die Panikstörung ist charakterisiert durch plötzlich einsetzende Angstzustände und betrifft Frauen häufiger als Männer. Panikattacken setzen selten vor der Pubertät oder nach der Menopause ein, was einen Einfluss von Östrogenen oder Östrogenrezeptoren (ESR) nahe legt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Rolle von Östrogenrezeptor α und β (ESRα and β) Genvarianten bei Panikpatienten. Hauptziele waren die Aktualisierung der genomischen Organisation der ESR sowie die Untersuchung von bekannten sowie neuen Sequenzvarianten in einer Fall-Kontroll-Studie. Die Polymorphismen wurden mit MspI (ESRα), XbaI (ESRα), PvuII (ESRα), AluI (ESRß) und Fnu4HI (ESRß) Endonukleasen in PCR-basierten RFLP-Assays untersucht. Die Studienstichprobe umfasste 90 Patienten mit Panikstörung sowie 92 gesunde Kontrollpersonen, die nach Alter und Geschlecht den Patienten vergleichbar waren. Bei den untersuchten Genvarianten war keine signifikante Assoziation mit der Panikstörung feststellbar. Für den Fnu4HI-Polymorphismus konnte allerdings eine grenzwertig signifikante Assoziation (p=0,07) mit der Panikstörung in Kombination mit Agoraphobie gefunden werden. Außerdem wurde ein polymorpher ESRα Mikrosatellit identifiziert, der möglicherweise in weiteren Studien als genetischer Marker dienen kann. Die oben dargestellten Ergebnisse legen einen Einfluss von ESRß-Varianten auf dem Chromosom 14 als Teil einer komplexen genetischen Prädisposition für Panikerkrankung nahe. Die aktualisierte genomische Organisation der ESRα und β zeigt viele neue Polymorphismen auf und wird beim Verständnis des Einflusses der genetischen Information auf östrogen-vermittelte nukleäre und nicht-nukleäre Signaltransduktion hilfreich sein.
Neurochemische und autoradiographische Untersuchungen von Serotonin-Transporter-Knockout-Mäusen
(2004)
Um die Auswirkungen der allelischen Expressionsvariabilität des 5-HTT auf das Gehirn zu untersuchen, wurde eine transgene 5-HTT-Knockout-Maus entwickelt, die als Grundlage der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit diente. Vor allem aufgrund der Assoziation des kurzen Allels des 5-HTT-Promotorpolymorphismus mit M. Alzheimer wurde die Untersuchung der Mäusegehirne im Hinblick auf Veränderungen von Metaboliten des oxidativen Stresses, der als ein ätiopathogenetischer Faktor bei der Entstehung des M. Alzheimer gilt, vorgenommen. Zudem wurden aufgrund der vielfältigen Interaktionen des serotonergen Systems mit den Systemen der Neurotransmitter Adenosin und Glutamat sowie aufgrund der Bedeutung des serotonergen Systems für affektive Erkrankungen autoradiographische Untersuchungen mit der Fragestellung nach Veränderungen auf Rezeptorebene im adenosinergen und glutamatergen System durchgeführt. Zur Detektion oxidativer Veränderungen wurde mit Hilfe des Malondialdehyd-Assays die Substanz Malondialdehyd als Marker für die Lipidperoxidation gemessen. Die Autoradiographie wurde mittels radioaktiv markierter Liganden für die Adenosin A1- und A2A-Rezeptoren, sowie für NMDA-, AMPA- und Kainat-Rezeptoren als Vertreter der ionotropen Glutamatrezeptoren durchgeführt. Bei der Untersuchung der Lipidperoxidation ergab sich ein signifikanter Anstieg des oxidativen Stresses im Hirnstammbereich – dem Ursprungsort der serotonergen Neurone – bei 5-HTT-Knockout-Mäusen im Vergleich zu Wildtypmäusen. Bei den heterozygoten 5-HTT-defizienten Mäusen zeigte sich lediglich eine Tendenz zu erhöhten oxidativen Veränderungen. Diese Befunde stimmen mit Ergebnissen von Untersuchungen an post-mortem Gehirnen von Alzheimer-Patienten überein. Dort wurde in früheren Arbeiten ebenfalls eine Zunahme der Lipidperoxidation gefunden, begleitet von einer Degeneration serotonerger Raphe-Neurone und dem damit einhergehenden Untergang serotonerger Terminalen in verschiedenen serotonergen Projektionsgebieten, sowie dem Auftreten neurofibrillärer Bündel und seniler Plaques in der Raphe. Der Nachweis der erhöhten Lipidperoxidation bei 5-HTT-Knockout-Mäusen erhärtet somit den Verdacht, dass das kurze Allel des 5-HTTLPR, welches mit einer geringeren Expression von 5-HTT einhergeht, einen Risikofaktor für die Entstehung von late-onset Alzheimer-Demenzen (mit spätem Beginn) darstellt. Bei 5-HTT-Knockout Mäusen besteht eine signifikante Hoch-Regulation der Adenosin A1-Rezeptoren im Nucleus raphe dorsalis. Auberdem zeigt sich ein Trend zur Herunter-Regulation der Adenosin A2A-Rezeptoren im Nucleus accumbens. In diesem Zusammenhang ist wichtig, dass Adenosin A1-Agonisten und Adenosin A2A-Antagonisten zu einer Reduktion der Freisetzung des potentiell neurotoxischen Neurotransmitters Glutamat führen. Auberdem bewirken Adenosin A1-Agonisten durch eine Hyperpolarisation eine Anhebung der Erregungsschwelle des Neurons und eine verminderte Bildung freier Radikale. Zudem induziert Adenosin die Synthese und Freisetzung von neurotrophen Faktoren und Zytokinen durch Gliazellen. Adenosin A2A-Antagonisten erhöhen zudem die Konzentration extrazellulären 5-HT´s. Die autoradiographischen Befunde können somit einerseits eine neuroprotektive Antwort auf die Erhöhung des oxidativen Stresses darstellen und zum anderen gegenregulatorisch auf die erhöhten extrazellulären 5-HT-Spiegel der 5-HTT-Knockout-Mäuse wirken. In der vorliegenden Arbeit konnten somit pathophysiologische und adaptive Veränderungen nachgewiesen werden, die die Bedeutung des serotonergen Systems für neurodegenerative Prozesse und den M. Alzheimer unterstützen.