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Einsatz biokompatibler Polymermembranen zur Therapie kongenitaler Bauchwanddefekte im Rattenmodell
(2017)
Kongenitale Bauchwanddefekte sind dramatische Fehlbildungen der vorderen Bauchwand. Zu den Defekten gehören neben der Nabelhernie und dem Blasenextrophie-Komplex im engeren Sinne die Gastroschisis und die Omphalozele. Die Therapie stellt die behandelnden Kinderchirurgen und Neonatologen vor eine große Herausforderung. Methode der Wahl ist der primär operative Bauchdeckenverschluss. Falls aufgrund der Größe des abdominellen Defekts oder der viszeroabdominellen Diskrepanz ein primärer Verschluss nicht möglich ist, wird eine Schusterplastik angelegt oder ein Patch implantiert. Bei den Implantaten unterscheidet man nicht-resorbierbare Materialien wie Polypropylen und Polytetrafluorethylene (GoreTex®) von resorbierbaren Patchs wie zum Beispiel humane Dura, porkine Dünndarmsubmukosa, oder azellularisiertes Rinderperikard (Lyoplant®). Die Ansprüche an ein solches Implantat sind hoch und das perfekte Material wurde bis heute noch nicht gefunden. Ideale Eigenschaften sind eine gute Handhabung und Nähbarkeit, Resorbierbarkeit, Anti-Adhäsivität zum Intestinum, Stabilität und Elastizität sowie die Transplantatakzeptanz.
Ziel dieser Arbeit war die Etablierung bipolarer Polymermembranen zur sicheren und effektiven Therapie kongenitaler Bauchwanddfekten im Rattenmodell. Bei den Polymermembranen handelt es sich um zweischichtige Implantate, welche aus einem Film und einem aufgesponnen Vlies bestehen. Der Film besteht aus dem Resomer LR708, dem linearen PEG-PLA und dem Polyurethan CW1681. Der mittels Electrospinning auf den Film aufgebrachte Vlies ist aus reinem PLA. Die Implantate sind zwischen 20 und 67 µm dick. Als Vergleich diente das bereits im Klein- und Großtiermodell von Meyer et al. etablierte Kollagen-Mesh Lyoplant®.
Als Versuchstiere des Experiments dienten n=34 männliche Wistar Furth Ratten, denen intraoperativ ein 2 x 2 cm großer Bauchwanddefekt zugeführt wurde, der anschließend mit einem gleich großen Patch verschlossen wurde. N=25 Tiere erhielten eine bipolare Polymermebran, n=2 Tiere Lyoplant und n=7 Ratten dienten zur Kontrolle. Nach 21 Tagen fand ein erneuter Eingriff statt. Hierbei wurde das Implantat samt umliegendem Gewebe explantiert und histologisch ausgewertet. Neben der Gewichtszunahme wurden die Ratten auf die Bildung von Hernien und intraabdominellen Adhäsionen sowie auf histologische Veränderungen untersucht. Von n=34 Ratten verstarben n=9 aus unterschiedlichen Gründen. Alle explantierten Wistar Furth Ratten (n=25) zeigten im dreiwöchigen postoperativen Verlauf (Δt=3 Wochen) physiologische Gewichtskurven. Alle Ratten mit Polymer-Implantat entwickelten im dreiwöchigen Verlauf eine abdominelle Hernie sowie Adhäsionen. Eine Zellinfiltration und Gefäßeinsprossung im Sinne einer Neovaskularisation konnte nicht nachgewiesen werden. Die histologische Auswertung ergab eine bindegewebige Veränderung im angren-zenden Gewebe, die zusammen mit der immunhistochemisch gesicherten hohen Anzahl an CD68 positiven Zellen (Makrophagen) einer Immunreaktion über den TH1-Pathway entspricht. Bei fehlender Integration in das Gewebe, kommt dies einer Implantatabstoßung gleich. In den Tieren mit Lyoplant® konnten wir die Ergebnisse von Meyer et al. bestätigen.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass die bipolaren Polymermembranen viele Eigenschaften eines idealen biokompatiblen Materials erfüllen, jedoch aufgrund der fehlenden mechanischen Stabilität nicht zur Therapie von kongenitalen Bauchwanddefekten geeignet sind. Lyoplant® hingegen erwies sich in Bezug auf fehlende Hernienbildung und Adhäsionen, Gefäßeinsprossung und Trans-plantatakzeptanz im Vergleich zu den Polymeren als äußerst gut geeignetes Material. Um das operative Ergebnis weiter zu perfektionieren, könnte die Besiedelung des Kollagen-Meshs mit Stammzellen experimentell getestet werden. Inwieweit Lyoplant® dann für die Therapie der kongenitalen Bauchwanddefekte geeignet ist, müssen weitere klinische Studien zeigen.
Unter dem Namen Avemar sind fermentierte Weizenkeimlinge als onkologisches Supportivprodukt erhältlich. Der hohe Anteil an 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinonen (DMBQ) in Avemar soll für das \(in\) \(vitro\) und \(in\) \(vivo\) belegte antikanzerogene Potential verantwortlich sein. DMBQ wirken über Semichinonradikale bzw. durch Ausbildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Induktion von oxidativem Stress zytotoxisch. Da Tumorzellen empfindlicher auf oxidativen Stress reagieren als gesunde Zellen, kann dies die selektive zytotoxische Wirkung von Avemar erklären.
Die Beteiligung von DMBQ am antiproliferativen Effekt von Avemar und die Wirkung von Avemar auf den Stoffwechsel maligner Zellen sind derzeit nicht eindeutig geklärt. Die antiproliferativen Eigenschaften von Avemar und DMBQ als Reinsubstanz wurden miteinander verglichen. Hierzu wurden DMBQ in einer zu Avemar mit 0,04% Benzochinonen äquimolaren Konzentration von 24 μmol/L eingesetzt.
Die Ergebnisse der Arbeit lassen den Schluss zu, dass der starke zytotoxische Effekt von Avemar bei BxPc-3 Zellen auf einen DMBQ-induzierten oxidativen Stress zurückzuführen ist. Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle wurde für BxPc-3 Zellen bei der Inkubation mit DMBQ eine 20-fache bzw. mit Avemar eine 40-fache Zunahme des ROS-Indikators 2',7'-Dichlorofluorescein gemessen. Im Westernblot ließ sich bei BxPc-3 Zellen das Enzym DT-Diaphorase, welches die Zellen vor Benzochinon-induziertem oxidativem Stress schützt, nicht nachweisen. In Zellen der anderen beiden Zelllinien konnte das Enzym nachgewiesen werden. Das mangelnde Schutzsystem gegenüber DMBQ-induziertem oxidativen Stress könnte demzufolge den DMBQ vermittelten zytotoxischen Effekt von Avemar in BxPc-3 Zellen erklären. Zusätzlich zum zytotoxischen Effekt wies Avemar zwei weitere antiproliferative Effekte auf: Zytostase bei 23132/87 Zellen und Wachstumsverzögerung bei HRT-18 Zellen. Beide antiproliferativen Effekte waren auf die Beeinflussung des Zellmetabolismus zurückzuführen. Avemar verringerte den zellulären Glukoseverbrauch von HRT-18 Zellen um 69% und von 23132/87 Zellen um 99%. In 23132/87 Zellen korrelierte der verringerte Glukoseverbrauch mit einer Abnahme von ATP um 70% und einem Zellzyklusarrest in der G\(_2\)/M Phase. Der durch die Inkubation von HRT-18 Zellen mit Avemar ausgelöste verringerte Glukoseverbrauch beeinflusste hingegen weder den ATP-Gehalt noch den Zellzyklus, induzierte aber Autophagie. Dies ließ sich zeigen durch morphologische Veränderungen wie die Bildung von intrazellulären Vakuolen und durch den Nachweis des Autophagiemarkers LC3-II. Die Wertigkeit dieses Phänomens für die zytotoxischen Eigenschaften von Avemar ist in weiteren Untersuchungen zu klären.
Die antiproliferativen Eigenschaften von Avemar führen zu Veränderungen im Zellmetabolismus von gastrointestinalen Tumorzellen. Ausschlaggebend dafür, welcher der drei antiproliferativen Effekte von Avemar (zytotoxisch, zytostatisch oder wachstumsverzögernd) dominiert, sind vermutlich zelleigene Schutzsysteme und metabolische Charakteristika der Zellen. Avemar weist ein breites Spektrum antiproliferativer Effekte auf, deren Einfluss auf Zellfunktion und Zellstoffwechsel im Detail noch weiter untersucht werden sollte.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte des neurotrophen Faktors GDNF auf die Struktur und Funktion der intestinalen Epithelbarriere untersucht. Zellkulturen mit Caco2 beziehungsweise HT29B6 dienten als Modellsysteme für die Epithelschicht der Darmschleimhaut. Transwellsassays und TER-Messungen mittels ECIS-Gerät fungierten als zentrale Untersuchungsmethoden zur Evaluation der funktionellen Barriereeigenschaft der Zellmonolayer. Die morphologischen und quantitativen Veränderungen von Zelljunktionsproteinen wurden mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbungen beziehungsweise Western Blot-Untersuchungen dargestellt. Um Migration- und Proliferationsverhalten nach Verletzung des Zellmonolayers zu untersuchen, führten wir in vitro-Scratch-Assays durch.
Zunächst wurde bestätigt, dass intestinale Epithelzellen die GDNF-Rezeptoren GFRα1, GFRα2 und RET exprimieren. Es zeigte sich sowohl in Immunfärbungen gegen Junktionsproteine als auch in Permeabilitätsmessungen, dass GDNF zu einer verstärkten Differenzierung der intestinalen Epithelbarriere führt. In Inhibitions- und Aktivierungsexperimenten mit verschiedenen Mediatoren wurde als zugrunde liegender Mechanismus die Inaktiverung der p38 MAPK durch GDNF identifiziert. Weiterhin zeigten Versuche mit epithelialen Wundheilungsassays, dass GDNF, über eine cAMP/PKA-abhängige Induktion der Proliferation, zu einer Verbesserung der Wundheilung führt. In Immunfärbungen und Western Blot-Analysen wurde beobachtet, dass auch intestinale Epithelzelllinien in der Lage sind GDNF zu synthetisieren.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der neurotrophe Faktor GDNF direkt auf die Differenzierung und Proliferation von kultivierten Enterozyten Einfluss nehmen kann. Die Tatsache, dass intestinale Epithelzellen selbst GDNF synthetisieren und sezernieren können, weist auf einen neuen autokrinen- oder parakrinen Wirkmechanismus des neurotrophen Faktors hin.