Refine
Has Fulltext
- yes (6) (remove)
Is part of the Bibliography
- yes (6)
Document Type
- Doctoral Thesis (6)
Language
- German (6) (remove)
Keywords
- ANP (6) (remove)
Institute
Mit dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ANP über die Aktivierung der endothelialen Guanylyl Cyklase A (GC-A) akut die Permeabilität für Albumin an postkapillären Venolen stimuliert. Durch diesen Mechanismus ist ANP neben der chronischen auch an der akuten Reduktion des Plasmavolumens und des systolischen arteriellen Blutdrucks beteiligt. Aufgrund der wichtigen extrarenalen endothelialen Effekte stellt ANP das einzige hypovolämische Hormon im Organismus dar und ist somit ein bedeutender physiologischer Regulator der transvaskulären Volumenhomöostase. Jedoch sind diese Effekte deutlich von denen der vasoaktiven Substanzen, wie z. B. Histamin oder Thrombin und anderer diuretisch wirkender Substanzen, wie z. B. Schleifendiuretika, abzugrenzen. Vermutlich wird der permeabilitätssteigernde Effekt von ANP durch die beobachtete gesteigerte PKG- und PKA-abhängige Phosphorylierung von VASP vermittelt, wodurch möglicherweise die parazelluläre Permeabilität selektiv für Albumin gesteigert wird. Den gegenregulatorischen Mechanismus zur endothelialen GC-A stellt der NPR-C dar. Durch diesen erfolgt eine verminderte PKA- und PKG-abhängige Phosphorylierung von VASP, was durch die ANP-Infusion an EC GC-A KO Mäusen beobachtet wurde und zu einer Reduktion der physiologischen Permeabilität für Albumin an den postkapillären Venolen führen könnte. Somit wird wahrscheinlich durch diesen Mechanismus das Plasmavolumen, aber nicht der systolische arterielle Blutdruck in vivo gesteigert und eine übersteigerte Reaktion der GC-A verhindert. Aufgrund der enormen Bedeutung des ANP/GC-A Systems für die Modulation der endothelialen Permeabilität und die akuten sowie chronischen Regulation des Plasmavolumens und arteriellen Blutdrucks besitzt es bei Dysfunktion eine bedeutende klinische Relevanz. Denn durch eine verminderte Sekretion von ANP oder der Dysfunktion des endothelialen GC-A-Rezeptors, durch verschiedene Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) oder Desensitisierung, kann dieses System an der Entstehung der essentiellen Hypertonie oder der Hypervolämie bzw. Hypernatriämie bei herzinsuffizienten Patienten beteiligt sein.
Das atriale natriuretische Peptid (ANP) beeinflusst den arteriellen Blutdruck und das intravasale Volumen durch Stimulation der intrazellulären Produktion von cGMP über den membranständigen Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptor. ANP stimuliert außerdem die Angiogenese und ist am Wachstum der Kardio-myozyten beteiligt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die dynamische Interaktion zwischen den rezeptoraktivierten Kationenkanälen Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6) und dem GC-A-Rezeptor untersucht. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass ANP über GC-A den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in Kardiomyozyten auf cGMP-unabhängige Weise stimuliert. Um eine mögliche direkte Interaktion von TRPC3/C6 und GC-A zu zeigen, wurde TRPC3 oder C6 mit Flag-GC-A in HEK293-Zellen koexprimiert. Die Membranfraktion der Zellen wurde nach Immunpräzipitation mit einem anti-Flag-Antikörper im Western Blot untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRPC3/C6 unabhängig von ANP mit GC-A ko-immunpräzipitieren. Die Interaktion erfolgte auch mit einem modifizierten GC-A-Rezeptor, dem die Cyclase-Domäne fehlt. Um die Interaktion in Kardiomyozyten zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit einer Überproduktion von HA-GC-A in Kardiomyozyten verwendet. Auch bei diesem Modell konnte mittels anti-HA- Antikörper die Koimmunpräzipitation von GC-A und TRPC3/C6 nachgewiesen werden. Schließlich wurden FRET-basierte Untersuchungen durchgeführt, um die lokale Nähe von GC-A und TRPC3 zu beweisen und eine mögliche ANP-induzierte Konformationsänderung zu untersuchen. Die Koexpression von GC-A-CFP und TRPC3-YFP in HEK293 Zellen führte zu einem FRET-Signal, welches durch ANP konzentrationsabhängig (1-100 nM) gesenkt wurde. Die Gabe des membranpermeablen cGMP-Analagons 8-Br-cGMP führte dagegen zu keiner Veränderung des FRET-Signals. Die Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein eines stabilen Proteinkomplexes von GC-A und TRPC3, der für den neuen cGMP-unabhängigen Signalweg von GC-A ausschlaggebend ist. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Rolle von ANP/GC-A für die Insulinausschüttung der pankreatischen β-Zellen. Es ist bereits bekannt, dass GC-A in den β-Zellen exprimiert wird und dass ANP an isolierten Langerhans’schen Inseln das β-Zell-Wachstum und die Insulinsekretion moduliert. Um langfristig die Bedeutung von ANP für die systemische Glukose-Homöostase zu ergründen, wurde ein Mausmodell mit einer β-Zell-spezifischen GC-A-Deletion generiert. Der Nachweis des konditionellen GC-A knock out (KO) erfolgte mittels genomischer PCR und Immunhistochemie. Eine Detektion von GC-A in den Langerhans’schen Inseln auf Proteinebene war leider nicht möglich. Aber es konnte gezeigt werden, dass der β-Zell-spezifische KO zu keiner Expressionsänderung von GC-A in anderen Geweben führte. Auch der Blutdruck und das Herzgewicht der KO Mäuse blieb unauffällig. Zur Untersuchung der Bedeutung von ANP für die Insulinausschüttung unter pathologischen Bedingungen wurden KO- und Kontrolltiere für 12 Wochen einer fettreichen Ernährung (60% Fett) ausgesetzt um einen Prädiabetes auszulösen. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie wurden orale Glukose-Toleranz-Tests (oGTT), Blutdruckmessungen und Gewichtsbestimmungen durchgeführt. Bereits vor der Studie wurde beobachtet, dass der Nüchternglukosewert in den weiblichen KO-Mäusen leicht erhöht ist. Daher wurden die oGTT‘s in der Studie geschlechtsspezifisch ausgewertet. Am Ende der Studie zeigten alle Mäuse eine vergleichbare insuffiziente Blutzuckerregulierung. Der Blutdruck war sowohl in KO- als auch in Kontrolltieren um ca. 60% erhöht. Einigen Tieren wurde das Pankreas entnommen und für immunhistologische Zwecke präpariert. Die morphometrische Auswertung der Pankreas-Schnitte ergab eine signifikant vergrößerte durchschnittliche Inselfläche und eine erhöhte durchschnittliche β-Zellfläche der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die β-Zellen der KO-Tieren waren im Vergleich zu den Kontrollen hypertroph. Die Studie zeigt also, dass die Deletion von GC-A in den β-Zellen unter pathologischen Bedingungen zu einer Hypertrophie der β-Zellen führt und zu einem geringeren Schutz gegen die Ausbildung eines Prädiabetes beiträgt. Eine mögliche verstärkte periphere Insulinresistenz in den KO-Tieren ist auch nicht auszuschließen. Weitere Studien an dem neuen Mausmodell könnten die Bedeutung des ANP/GC-A-Systems für die Insulinausschüttung näher ergründen und dadurch eventuell neue Therapieansätze für Diabetes mellitus Typ 2 bringen.
Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Darüber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazelluläre Domäne der GC-A wird intrazellulär, durch die katalytische Domäne des Rezeptors, der sekundäre Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erhöhte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors führen. Der Verlust der Funktionsfähigkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellulär lokalisierten Aminosäuren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung möglicher Interaktionspartner in vivo könnte der Grundstein für neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine kürzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminosäuren verkürzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellulären Domänen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellulären Domäne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdomäne befindet. Oberflächenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfläche von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen präsentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellulären cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die Fähigkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpräzipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression für GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus für die Verringerung der Sensitivität des GC-A-Rezeptors gegenüber ANP darstellen.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer Überexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es ermöglicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu können um danach Analysen zu posttranslationalen Veränderungen und möglichen Interaktionspartnern durchzuführen. Zunächst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zusätzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz für die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingefügt. Die Expression und Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsfähigkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpräzipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an Mäusen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpräzipitationen, überprüft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, Überexpression des Rezeptors. Dieser konnte über das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die Überexpression funktionsfähiger GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie schützt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer Überexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern ähnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des Überexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkanälen TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die Möglichkeit die Epitope und das murine Überexpressionsmodell auch zukünftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktion von ANP und Ang II im Bereich der blutdruckbestimmenden Widerstandsgefäße zu untersuchen. Ein besonderer Augenmerk wurde hierbei auch auf die Bedeutung von RGS2 gerichtet. Durch das Zusammenspiel der beiden funktionellen Antagonisten ANP und Ang II wird der Blutdruck reguliert. ANP und Ang II üben hierbei jeweils gegenteilige Effekte aus. Ang II hat vasokonstriktorische Effekte auf die Blutgefäße, vermindert die Natriurese und Diurese und erhöht den Sympathikustonus. ANP hingegen besitzt blutdruckmindernde Effekte, hervorgerufen durch Vasodilatation, gesteigerte Diurese, die Erhöhung der endothelialen Durchlässigkeit und der Hemmung des Sympathikustonus. Da nichts über die Interaktion dieser beiden Hormone in der Mikrozirkulation bekannt ist, wurden im Rahmen der Dissertation intravitalmikroskopische Studien der Mikrozirkulation des Musculus cremaster der Maus, in Anlehnung an der von Baez (1973) publizierten Methode, durchgeführt. Darüber hinaus wurden auch die Effekte von Ang II und ANP auf den Blutdruck durch invasive Blutdruckmessung untersucht. Der Durchmesser von präkapillären Arteriolen des M. cremaster wurde vor und während lokaler Superfusion von Ang II oder ANP gemessen. Ang II löste eine konzentrationsabhängige stabile Konstriktion aus. Bei der ausschließlichen Superfusion von ANP in verschiedenen Konzentrationen hingegen, zeigte sich kein Effekt auf den basalen Vasotonus. ANP war jedoch in der Lage, an Ang II vorkontrahierten Arteriolen, den konstriktorischen Effekt von Ang II aufzuheben und sogar darüber hinaus eine ausgeprägte Vasodilatation zu bewirken. Dieser Effekt konnte auch bei der invasiven Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen werden. Der durch Ang II ausgelöste Blutdruckanstieg wurde durch die zusätzliche Infusion von ANP gemindert. Ang II aktiviert die Kontraktion von glatten Gefäßmuskelzellen durch den Gαq-gekoppelten AT1-Rezeptor. RGS2 hingegen ist ein negativer Regulator von Gαq. Da von RGS2 bekannt ist, dass er von cGKI phosphoryliert und stimuliert wird (Osei-Owusu et al., 2007), stellte sich die Frage, ob ANP über RGS2 dem vasokonstriktiven Effekt von Ang II entgegenwirkt. Bei den Versuchen an RGS2-KO Mäusen zeigt sich hierbei, dass ANP nicht mehr in der Lage ist, den vasokonstriktiven Effekt von Ang II aufzuheben. Daraus ist nun der Schluss zu ziehen, dass RGS2 eine bedeutende Rolle für die Wechselwirkung zwischen ANP und Ang II in der Mikrozirkulation spielt und somit eine wichtige Aufgabe bei der Regulation des peripheren Widerstands und des Blutdrucks hat.
In diesem Projektteil charakterisierten wir mittels vergleichenden Analysen an Mäusen mit konditioneller, herzspezifischer Deletion der GC-A (CM GC-A KO; (Holtwick et al., 2003; Kilic et al., 2005 und 2007)) und Kontrolltieren die zellulären Mechanismen, welche bei Dysfunktion des ANP/GC-A-Systems die Entwicklung von Herzhypertrophie begünstigen. Wir untersuchten, ob/wie ANP die kardialen Effekte von -adrenerger versus Ang II/AT1 (Gs versus Gq-mediierter) Stimulation beeinflusst. Zunächst kombinierten wir an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten elektrophysiologische Messungen der L-Typ Ca2+ Ströme (LTCS, mittels voltage-clamp Messungen in Kooperation mit Herrn Dr. M. Kruse und Herrn Prof. O. Pongs am Zentrum für Molekulare Neurobiologie, Universität Hamburg), fluorometrische Messungen der intrazellulären Calcium-Transienten (mittels Indo-1 AM) und Messungen der Kontraktilität (Zellverkürzung, mittels edge detection). Diese ex vivo Untersuchungen zeigten, dass Isoproterenol (ISO) und Ang II die LTCS, [Ca2+]i und Kontraktilität isolierter adulter Myozyten stimulieren. Interessanterweise hemmt ANP/GC-A die Effekte von Ang II, nicht aber die Effekte von ISO. Um der Bedeutung dieser Interaktion zwischen ANP und Ang II für die Entwicklung einer pathologischen Herzhypertrophie ...
Sowohl der ANP und BNP bindende Guanylylzyklase-A-Rezeptor, als auch der CNP bindende Guanylylzyklase-B-Rezeptor auf den die Endothelzellen ummantelnden Perizyten sind für eine normale postnatale Gefäßentwicklung in der Netzhaut der Maus von entscheidender Bedeutung. Eine perizytenspezifische Deletion der Guanylylzyklase-Rezeptoren führt in Mäusen zu einer signifikanten Verminderung der postnatalen Ausdehnung sowie der Dichte des Gefäßnetzes. Dies ist nicht auf eine Verminderung der Bedeckung des Endothels durch Perizyten zurückzuführen. Weiterhin geht diese Rezeptordeletion mit einer geschlechterunabhängigen Erhöhung des systolischen Blutdrucks einher. Die intrazelluläre Weiterleitung, des durch die natriuretischen Peptide ausgelösten cGMP-Signals erfolgt über die cGMP-abhängige Proteinkinase Typ I (cGKI).