Refine
Has Fulltext
- yes (6) (remove)
Is part of the Bibliography
- yes (6)
Document Type
- Doctoral Thesis (6)
Language
- German (6) (remove)
Keywords
- Knorpel (6) (remove)
Testung verschiedener Strategien für die Regeneration von Knorpeldefekten im Ex vivo-Testsystem
(2021)
Die Degeneration des Gelenkknorpels ist Hauptursache für chronische Schmerzen und eine dadurch bedingte Einschränkung der Lebensqualität. Für die Sozialversicherungssysteme ist dies mit steigenden Kosten verbunden. Gegenwärtige Behandlungsoptionen wie die Mikrofrakturierung oder die (matrix-assoziierte) Autologe Chondrozytentransplantation (M-) ACT führen zu einem minderwertigen Reparaturgewebe aus Faserknorpel mit unzureichenden mechanischen Eigenschaften an der Defektstelle. Es besteht ein Bedarf an der Entwicklung und Testung neuer Knorpeltherapien, die ein funktionelles Reparaturgewebe für nachhaltige Beschwerdefreiheit erzeugen. Das hier verwendete kürzlich etablierte osteochondrale Ex vivo-Testsystem (EVTS) eignet sich zur Evaluation unterschiedlicher zellbasierter Behandlungsansätze für die Knorpelregeneration.
Aus der medialen Femurkondyle von Schweinen wurden zylindrische 8 mm große osteochondrale Explantate (OCE) isoliert. Es wurden Knorpel-Knochendefekte und reine Knorpeldefekte kreiert und mit autologen Schweine-Chondrozyten (CZ) bzw. einer Mischung aus CZ und mesenchymalen Stammzellen (MSC) gefüllt, die in Kollagen Typ I Hydrogel eingebettet waren. Nach vierwöchiger Kultivierung wurden die Proben histologisch und immunhistochemisch gefärbt (Safranin-O-Färbung, Kollagen Typ II, Aggrekan), die Zellvitalität (Lebend-Tot-Färbung) überprüft und die extrazelluläre Matrixproduktion analysiert. Nach vierwöchiger Kultur im EVTS in Normoxie und Hypoxie zeigten sich die in Kollagen-I-Hydrogel eingebetteten Zellen lebensfähig. Die Auswertung der verschiedenen Ansätze erfolgte über den standardisierten ICRS-II-Score der International Cartilage Repair Society (ICRS) mit drei unabhängigen Bewertern. Insgesamt resultierten bessere Ergebnisse im Hinblick auf die Matrixsynthese in den Monokulturen aus CZ im Vergleich zu den Co-Kulturen aus CZ und MSCs. Da dieser Unterschied nicht groß war, könnten MSCs zur Einsparung autologer CZ eine Alternative in der Behandlung von Knorpeldefekten darstellen. Hypoxie spielte eine Rolle bei reinen Knorpeldefekten, nicht bei Knorpel-Knochendefekten. Dies bestätigt die Bedeutung des physiologischen hypoxischen Milieus des Gelenkknorpels, das einen niedrigen Sauerstoffgehalt von 2-5
VII
% aufweist. Die Ergebnisse zeigen, dass die unterschiedlichen Faktoren aus Zellkombination, Knorpeldefektgröße und Kultivierung in Hypoxie oder Normoxie Einfluss auf die Ausbildung der extrazellulären Matrix haben. Weiterhin fehlt jedoch das Verständnis für die genauen Mechanismen des Knorpelregenerationsverhaltens. Ex vivo-Testsysteme können dabei helfen ein weiteres Verständnis zu erlangen und entsprechende Behandlungsstrategien zu evaluieren.
Gelenkknorpel besitzt aufgrund seiner avaskulären Natur und der fehlenden mitotischen Aktivität der Chondrozyten bei Schäden kaum Potential zur Selbstheilung. Traumatische Läsionen und degenerative Veränderungen münden im Krankheitsbild der Osteoarthrose, welches mit dem Untergang des Gelenkknorpels einhergeht. Ein neuerer Therapieansatz ist das Tissue Engineering von Gelenkknorpel, wobei jedoch die laterale Integration der Implantate mit dem nativen Knorpelgewebe problematisch bleibt. Ein Adhäsivum kann neben einer adäquaten Sofortadhäsion die Langzeitintegration fördern.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Polyethylenglykol (PEG)-basierte Zweikomponentenkleber, ausgehend vom kommerziell erhältlichen Gewebekleber CoSeal™, auf ihre Eignung für Gelenkknorpel untersucht. Dabei wurde Hyaluronsäure (HA) als physiologischer Bestandteil von Gelenkknorpel in thiolierter Form (HA-SH) als Komponente verwendet und auf seine prointegrativen Eigenschaften untersucht.
Der den CoSeal™-Komponenten entsprechende 4-Succinimidyl-Glutarat/4-Thiol-PEG (4SG/4T-PEG)-Kleber hatte sich trotz seiner hohen Sofortadhäsionskraft auch nach der Substitution des 4T-PEG mit HA-SH als zu schnell in flüssiger Umgebung degradierend gezeigt, um eine suffiziente Langzeitintegration zu erreichen. Durch die Verwendung der langsamer degradierenden funktionellen 4-Succinimidyl-Carbonat-PEG (4C-PEG)-Komponente konnte die Langzeitadhäsionskraft in Kombination mit 4-Amin-PEG (4A-PEG) durch die stabilere Amid-Bindung zum einen und in Kombination mit HA-SH zum anderen signifikant gesteigert werden. Immunhistochemisch konnten bei beiden HA-haltigen Klebern Zeichen von Knorpelintegration nachgewiesen werden, während der 4C/4A-PEG-Kleber keine Integrationszeichen aufwies. Im 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT)-Assay war bei keinem Adhäsivum eine zytotoxische Wirkung zu erkennen.
Insgesamt bieten die untersuchten PEG-basierten Adhäsiva im Vergleich zu den weitverbreiteten Fibrinklebern eine deutlich höhere Sofortadhäsion, welche vergleichbar mit glutaraldehydbasierten Klebern ist. Allerdings können die initialen adhäsiven Kräfte, trotz histologisch nachweisbaren Integrationszeichen bei Inkorporation von HA, nicht langfristig aufrechterhalten werden, so dass Fibrinkleber weiterhin die Spitzengruppe in Sachen Langzeitadhäsion bilden. Da PEG eine ausgezeichnete Biokompatibilität, einfache Anwendbarkeit und zahlreiche weitere chemische Anpassungsmöglichkeiten zur Feinabstimmung der Degradationseigenschaften bietet, ist in Zukunft ein erfolgreicher Einsatz auch im Bereich von Gelenkknorpel denkbar.
Für die experimentelle Untersuchung von Adhäsiva und Gelenkknorpel werden biomechanische Versuchsmodelle benötigt. Der Tensile-Test des Sandwich-Modells konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich etabliert und ein Protokoll festgelegt werden. In einem vergleichenden Versuch mit dem Push-Out-Test des Disc-Ring-Modells, welches als Referenzmodell dient, konnte in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Qualität der Messergebnisse die Gleichwertigkeit gezeigt werden. Insgesamt bietet er eine gute Alternative zum Push-Out-Test, um weiterführende Fragestellung, wie z.B. extrinsische Kraftwirkungen auf das Konstrukt, zu untersuchen.
Osteoarthrose ist eine häufige Erkrankung des Menschen, die mit einer deutlichen Morbidität und körperlichen Einschränkungen assoziiert ist. Weil Knorpelgewebe avaskulär ist und die Chondrozyten sich in einem postmitotischen Zustand befinden, besitzt Knorpel nur sehr geringes Selbstheilungspotenzial. Es gibt momentan keine effektive Therapie der Arthrose. Obwohl regenerative Ansätze mit dem Tissue Engineering von Knorpelgewebe vielversprechende Therapiealternativen darstellen, stellt die mangelnde laterale Integration von Knorpelgewebe ein chronisches Problem dar, das die Implantation von Knorpelkonstrukten vor Schwierigkeiten stellt. Die optimale Integrationsmethode sollte das Gewebe stark verbinden, klinisch schnell und einfach angewendet werden können, ein hohes Maß an Biokompatibilität besitzen und außerdem die Gewebereparatur fördern. In dieser Arbeit wurden natives Fibrinogen und unmodifizierte Gelatine in gelöster Form mittels einer neuartigen und schnellen Photooxidationsmethode unter Verwendung von Rutheniumkomplexen und Licht aus dem sichtbaren Spektrum zu Klebern vernetzt. Dabei ließ sich feststellen, dass insbesondere der Kleber aus Ruthenium und Gelatine Potenzial besitzt, Einsatz als Bioadhäsivum im Bereich Tissue Engineering von Knorpelgewebe zu finden. Ausschlaggebend dafür ist die Herstellung einer suffizienten Sofortadhäsion zwischen gegenüberliegenden Knorpelflächen einerseits, sowie die Förderung der Langzeitintegration andererseits, die für eine Stimulierung der Gewebereparatur im echten Knorpeldefekt vielversprechend ist. Weitere Forschung ist jedoch nötig, um die Abgrenzung der mechanischen Integration gegenüber der Kontrollgruppe besser zu unterstreichen und das Material weiteren Untersuchungen wie einer Analyse des Quellverhaltens zu unterziehen. Schließlich sollte das regenerative Potenzial des Gewebeklebers in in vivo Tiermodellen weiter systematisch untersucht werden. Zudem lieferte diese Arbeit vielversprechende Ergebnisse für den potenziellen Einsatz von RuGel im Bereich hydrogelbasiertes Tissue Engineering.
Wirkung von WISP-3 auf dedifferenzierte Chondrozyten und mesenchymale Stammzellen
Degenerative Gelenkerkrankungen (Arthrosen) sind einige der häufigsten Ursachen für eine Vorstellung und Beratung in der allgemeinmedizinischen Praxis. Der Großteil der über 65-jährigen ist davon betroffen, wenn auch die Symptome in ihrer Ausprägung stark variieren können. Eine ursächliche Therapie ist bisher nicht bekannt. Es wird symptomatisch behandelt und versucht, die Symptome zu lindern und den Progress der Erkrankung zu verlangsamen. Dabei entstehen dem Gesundheitssystem durch die hohe Prävalenz nicht unerhebliche Kosten für Medikamente, Physiotherapie, Operationen und Reha-Aufenthalte.
Arthrosen beruhen auf Knorpelschädigungen, die ohne Therapie immer weiter fortschreiten können und zu Schmerzen, Bewegungseinschränkung und Verformung des Gelenks führen können. Diese Knorpelschädigungen können auf verschiedenen Ursachen beruhen wie z.B. zu hoher Belastung (bei Adipositas), Traumata oder Erkrankungen des Skelettsystems. Neue Behandlungsansätze werden mit zunehmendem Durchschnittsalter der Bevölkerung immer wichtiger werden.
Ein Ansatzpunkt ist die weitere Erforschung von Proteinen wie z.B. WISP-3, die einen positiven Effekt auf die Knorpelhomöostase bewirken. Die Bedeutung von WISP-3 fiel bei der Erforschung der Progressiven Pseudorheumatoiden Dysplasie auf, einer seltenen Gelenkerkrankung, die v.a. bei Kindern auftritt. Dabei treten auf Grund von Mutationen von WISP-3 Störungen in der Knorpelhomöostase und Gelenkarchitektur auf, die sogar eine Therapie mittels Gelenkersatz notwendig machen können.
In unseren Versuchen zeigte sich, dass WISP-3 in Verbindung mit Wachstumsfaktoren eine positive Wirkung auf das Wachstum und die Differenzierung von dedifferenzierten Chondrozyten aufweist. Somit werden neue Forschungsansätze in der Arthrosetherapie aufgezeigt. Für die weitere Forschung kann auch auf mesenchymale Stammzellen zurückgegriffen werden, die vielversprechende Aussichten besonders im Tissue Engineering bieten.
Für die gesamte CCN-Familie ergeben sich noch weitere vielfältige Forschungsmöglichkeiten, wie z.B. in der Therapie von Mamma-, Gebärmutter- oder Nierenzellkarzinomen.
In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass plastik-adhärent wachsende, multipotente Vorläuferzellen, die eine für MSCs charakteristische Kombination von Oberflächenantigenen tragen, aus allen vier untersuchten Geweben des arthrotischen Hüftgelenks isoliert werden konnten. MSC-ähnliche Zellen können somit nicht nur in der Spongiosa und im Gelenkknorpel, sondern auch in der anterioren Gelenkkapsel und dem Ligamentum capitis femoris (LCF) des arthrotisch veränderten menschlichen Hüftgelenks nachgewiesen werden.
Die FACS Analyse der Oberflächenantigene auf Zellen, die aus den vier unterschiedlichen Geweben eines beispielhaft gewählten Spenders isoliert wurden, zeigte eine deutliche Expression der Antigene CD44, CD73, CD90 und CD105. Unabhängig vom Nativgewebe zeigten somit alle untersuchten Zellen ein für MSCs charakteristisches, aber nicht spezifisches Profil an Antigenen auf ihrer Oberfläche. Eine Übereinstimmung mit den ISCT Kriterien für MSCs war aufgrund der fehlenden Kontrolle hämatopoetischer Marker nicht möglich.
Die multipotente Differenzierung der isolierten Zellen erfolgte mithilfe spezifischer Differenzierungsmedien in Monolayer-Kulturen oder für die chondrogene Differenzierung in dreidimensionalen Pellet-Kulturen. Nach 21 Tagen konnten in allen differenzierten Kulturen histologisch und immunhistochemisch klare Zeichen der Osteo- und Adipogenese detektiert werden, während die Auswertung spezifischer Markergene eine klare Steigerung der Expression dieser im Vergleich zu den Negativkontrollen zeigte.
Histologische und immunhistochemische Auswertungen bestätigten auch eine erfolgreiche chondrogene Differenzierung der Zell-Pellets aus Spongiosa, Knorpel und Kapsel. Lediglich in den chondrogen differenzierten Zell-Pellets aus dem LCF konnte immunhistochemisch keine Bildung des knorpelspezifischen Matrixproteins Col II nachgewiesen werden. Mikroskopisch zeigten vor allem die differenzierten MSC-Pellets aus Spongiosa und Knorpel morphologisch eine starke Ähnlichkeit zu hyalinem Knorpelgewebe. Trotz dieser Abstufungen zeigten sich für die relative Expression der chondrogenen Markergene AGG, Col II und Sox-9 keine signifikanten Unterschiede zwischen den differenzierten MSC-Kulturen der vier unterschiedlichen Nativgewebe. Ein positiver Nachweis des Markers Col X wies nach 27 Tagen sowohl in differenzierten als auch in undifferenzierten Pellet-Kulturen auf eine leichte chondrogene Hypertrophie hin. Zusammenfassend zeigten sich keine signifikanten Unterschiede im Hinblick auf das osteogene und adipogene Differenzierungspotential aller untersuchten Zellen. Während das chondrogene Differenzierungspotential der Zellen aus Spongiosa, Knorpel und Kapsel sich aus histologischer und immunhistochemischer Sicht ähnelte, zeigten Pellets aus dem LCF ein schwächeres chondrogenes Differenzierungspotential in vitro.
Obwohl somit erstmals MSC-ähnliche Zellen aus dem LCF und Gewebsproben, die neben dem Stratum synoviale auch das Stratum fibrosum der Hüftgelenkskapsel beinhalteten, charakterisiert wurden, sind weitere wissenschaftliche Arbeiten notwendig, um das multipotente Differenzierungspotential dieser Zellen zu optimieren.
Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob mittels IHH-Gentransfer aus Hüftköpfen gewonnene hMSCs chondrogen im Pelletkultursystem differenziert werden können und ob zugleich durch IHH eine Modulation der hypertrophen Enddifferenzierung der hMSCs in diesem System möglich ist. IHH bestimmt in der Wachstumsfuge zusammen mit PTHrP während der endochondralen Ossifikation die Chondrozytenreifung und -differenzierung entscheidend mit und ist daher ein interessanter Kandidat zur Induktion von hyalinem oder zumindest hyalin-ähnlichem Knorpelgewebe in der stammzellbasierten Gentherapie. Nach Gewinnung und Kultivierung der hMSCs wurden diese mit Ad.GFP, Ad.IHH, Ad.IHH+TGF-β1, Ad.IHH+SOX-9 oder Ad.IHH+BMP-2 transduziert bzw. ein Teil für die Negativkontrolle nicht transduziert und im Anschluss alle Gruppen zu Pellets weiterverarbeitet. Histologische, biochemische sowie molekularbiologische Untersuchungen wurden an verschiedenen Zeitpunkten zur Evaluierung des chondrogenen Differenzierungsgrades sowie der hypertrophiespezifischen Merkmale der kultivierten Pellets durchgeführt. Es konnte durch diese Arbeit sowohl auf Proteinebene als auch auf Genexpressionsebene reproduzierbar gezeigt werden, dass primäre hMSCs im Pelletkultursystem sowohl durch den adenoviralen Gentransfer von IHH allein als auch durch die Co-Transduktionsgruppen IHH+TGF-β1, IHH+SOX-9 und IHH+BMP-2 chondrogen differenziert werden können. Dabei zeigten alle IHH-modifizierten Pellets Col II- und CS-4-positive immunhistochemische Anfärbungen, eine gesteigerte Synthese von Glykosaminoglykanen im biochemischen GAG-Assay sowie eine Hochregulation von mit der Chondrogenese assoziierten Genen. Das Auftreten hypertropher Merkmale bei den chondrogen differenzierten MSCs konnte durch IHH-Gentransfer nach 3 Wochen in vitro-Kultivierung nicht vollkommen unterdrückt werden, war jedoch besonders stark ausgeprägt, wenn BMP-2 co-exprimiert wurde und war etwas weniger evident in der IHH+SOX-9-Gruppe. Dabei zeigte die Ad.IHH+BMP-2-Gruppe sowohl in der ALP-Färbung als auch in dem ALP-Assay und der quantitativen RT-PCR die stärkste Hochregulierung des hypertrophen Markers ALP. Möglicherweise brachte die Überexpression von IHH das fein aufeinander abgestimmte Regulationssystem zwischen IHH und PTHrP aus dem Gleichgewicht und könnte als ein Grund dafür angeführt werden, warum die Hypertrophie im Pelletkultursystem nicht vollkommen supprimiert werden konnte. Es bleibt abzuwarten, ob IHH in vivo die Chondrogenese induzieren und dabei zugleich das Phänomen der chondrogenen Hypertrophie regulieren kann. In der Zukunft würde dies letztlich der stammzellbasierten Knorpelregeneration in vivo zu Gute kommen.