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Zahlreiche Studien schreiben Histondeacetylase-Inhibitoren einen Anti-Tumor-Effekt auf verschiedene hämatologische und solide Tumoren durch Apoptoseinduktion, vermehrte Zelldifferenzierung und verminderte Zellproliferation zu. Als Mechanismus wird eine Einflussnahme auf die Genexpression durch Modulation von Histondeacetylasen und deren Auswirkung auf den Acetylierungsstatus von Histonen und Nicht-Histon-Proteinen angenommen. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen des Histondeacetylase-Inhibitors LBH589 auf Proliferation und Differenzierung von Kolonkarzinomzellen und dessen Metastasenzellen in Zellkulturexperimenten zu untersuchen. Die Untersuchungen wurden an Zellen der Zellkulturlinien SW480 (kolorektales Karzinom) und SW620 (Metastase des kolorektalen Karzinoms) durchgeführt. Für die Zellproliferation wurden die Zellen nach entsprechender Vorbehandlung in einer Neubauer-Zellzählkammer ausgezählt. Zur Feststellung des Verlaufs der Zelldifferenzierung diente die Bestimmung der Intestinalen Alkalischen Phosphatase als Marker. Unter LBH589-Inkubation kam es zu einer Hemmung der Zellproliferation sowohl bei SW480-Zellen als auch bei SW620-Zellen. Allerdings ergab sich kein signifikanter Unterschied bei der Auswertung der Kontrolllösungen mit jeweils äquimolaren Mengen DMSO. Daher konnte dem HDAC-Inhibitor LBH589 im Rahmen dieser Arbeit kein sicherer Effekt auf die Inhibition der Zellproliferation zugeschrieben werden. LBH589 hatte keinen nachweisbaren relevanten Einfluss auf die Differenzierung von Zellen der beiden Zelllinien. Allenfalls konnte ein leicht hemmender Einfluss auf die Zelldifferenzierung gezeigt werden, der jedoch nicht signifikant ausfiel. Weitere Untersuchungen sind anzustreben, um den Verlauf der Zellproliferation und weiterer Differenzierungsmarker unter dem Einfluss von LBH589 sowie äquimolaren Mengen DMSO detaillierter zu charakterisieren. Zukünftige Arbeiten zu Histondeacetylase-Inhibitoren und deren Effekt auf Zellen des kolorektalen Karzinoms, sowie Histondeacetylase-Inhibitoren in der Kombinationstherapie von kolorektalen Tumoren sind sicher sinnvoll.
5 bis 10 % aller kolorektalen Karzinome entstehen auf dem Boden einer erblichen Disposition. Bei der Tumorgenese dieser hereditären kolorektalen Karzinome spielen pathogenetisch vor allem Mutationen in DNA-Reparaturgenen eine wichtige Rolle. Ziel dieser Arbeit war es, anhand neuester Literatur darzustellen, welche Bedeutung Funktionsstörungen in DNA-Reparaturgenen als Risikofaktoren bei der Entstehung von erblichen kolorektalen Karzinomen haben.Die meisten Mutationen unter den DNA-Reparaturgenen finden sich in Genen des Mismatch-Reparatursystems. Genetische Keimbahnmutationen in MMR-Genen sind an der Pathogenese von vier verschiedenen Krebssyndromen beteiligt, die zu kolorektalen Karzinomen führen können. Es sind das autosomal-dominant vererbte HNPCC-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hMSH2-, hMSH6-, hMLH3-, hPMS2- und hPMS1-Gen, das autosomal-dominant vererbte Muir-Torre-Syndrom dessen Grundlage Mutationen im hMSH2-, hMLH1- und hMSH6-Gen sind, das autosomal-dominant oder autosomal-rezessiv vererbte Turcot-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hPMS2-, hMSH2- und hMSH6-Gen sowie das autosomal-rezessiv vererbte Mismatch-Repair-Deficiency-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hMSH2-, hMSH6- und hPMS2-Gen. Neben genetischen Mutationen werden auch zunehmend epigenetische Modifikationen entdeckt, die DNA-Reparaturgene durch Promotorhypermethylierung inaktivieren und so an der Pathogenese erblicher kolorektaler Karzinome mitwirken. Bis jetzt sind Epimutationen in den MMR-Genen hMLH1 und hMSH2 in der Literatur beschrieben worden. Auch im DNA-Reparaturgen MGMT, einem Gen aus dem Reversions-Reparatursystem, konnten Epimutationen nachgewiesen werden, die die Entstehung von kolorektalen Tumoren fördern.Funktionsstörungen in DNA-Reparaturgenen des Basen-Exzisions-Reparatursystems sind ebenso an der Tumorgenese des kolorektalen Karzinoms beteiligt. Genetische Keimbahnmutationen im DNA-Reparaturgen MUTYH führen zur MUTYH-assoziierten Polyposis (MAP), einem erblichen Krebssyndrom, mit einem autosomal-rezessiven Erbgang. Genetische Mutationen konnten auch im MBD4-Gen, einem weiteren BER-Gen, in kolorektalen Karzinomen nachgewiesen werden.
Eine veränderte Expression des Transkriptionsfaktors MYC wird als entscheidender Faktor für Tumorentstehung und -progress im kolorektalen Karzinom gesehen. Somit ist die Hemmung dessen Expression und Funktion ein zentraler Ansatz bei der zielgerichteten Tumortherapie.
Als geeignete Strategie, sowohl die Halbwertszeit als auch die Translation von MYC zu verringern, erschien eine duale PI3K-/mTOR-Hemmung durch den small molecule-Inhibitor BEZ235. Gegenteilig ist jedoch unter Behandlung mit BEZ235 eine verstärkte MYC-Expression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu beobachten. Neben verstärkter Transkription, konnte eine verstärkte IRES-abhängige Translation von MYC nach Hemmung der mTOR-/5´Cap-abhängigen Translation durch BEZ235, als Ursache der MYC-Induktion nachgewiesen werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Induktion von MYC nach PI3K-/mTOR-Hemmung durch eine kompensatorische Aktivierung des MAPK-Signalwegs in Folge einer FOXO-abhängigen Induktion von Rezeptortyrosinkinasen, stattfindet.
Eine mögliche Strategie, diese Feedback-Mechanismen zu umgehen, ist die direkte Hemmung der Translationsinitiation. Hierfür wurden Rocaglamid und dessen Derivat Silvestrol als small molecule-Inhibitoren der eIF4A-Helikase verwendet. Im Gegensatz zur PI3K/mTOR-Hemmung, ist durch eIF4A-Inhibition eine Reduktion der MYC-Proteinexpression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu erreichen – ohne einhergehende MAPK-Aktivierung.
Anhand der Ergebnisse kann postuliert werden, dass Silvestrol das Potential besitzt, sowohl die Cap-/eIF4F-abhängie als auch die somit eIF4A-abhängige IRES-vermittelte Translation von MYC zu hemmen.
Weiterhin kann eine proliferationshemmende Wirkung durch Silvestrol auf Kolonkarzinom-Zellen in vitro, via Zellzyklusarrest und Induktion von Apoptose, gezeigt werden. Dies stellt die Voraussetzung für eine potentielle Eignung als tumorhemmender Wirkstoff in der Therapie des kolorektalen Karzinoms dar.
Das Ziel dieser Arbeit war die Darstellung der Einflüsse verschiedener Interleukine auf die HDGF-Expression in verschiedenen Kolonzelllinien. HDGF stellt einen Wachstumsfaktor dar, der nicht nur physiologisch bei der Entwicklung einiger Gewebe wie der Niere, der Leber und des Darms von Be-deutung ist, sondern auch eine wichtige Rolle in der Karzinogenese verschie-dener Tumoren spielt. Hierzu zählen unter anderem das hepatozelluläre Karzi-nom, das NSCLC und das Melanom. Von besonderer Relevanz ist seine Rolle in der Pathogenese des kolorektalen Karzinoms. Die verwendeten Interleukine (1beta, 4, 5, 8 und 13) zeigen sowohl inhibierende als auch fördernde Eigenschaften in Bezug auf die Karzinogenese von kolorektalen Tumoren. Dies steht im Einklang mit früheren Resultaten der Literatur. Die vier verschiedenen Zelllinien, eine Adenomzelllinie, zwei Adenokarzinomzelllinien sowie eine Zelllinie aus Lymphknotenmetastasenzellen wurden mit den verschiedenen Interleukinen inkubiert und mittels REAL TIME-RT-PCR analysiert. Die Ergebnisdarstellung in Blockdiagrammen zeigt semiquantitativ die relative HDGF-Expression. So lassen sich Aussagen über Anstieg oder Abfall der Expression durch den Einfluss der verschiedenen Interleukine machen. Die hier gezeigten Ergebnisse lassen, wie auch schon teilweise in der Literatur beschrieben, für alle Interleukine außer für IL 1beta, sowohl hemmende als auch tumorunterstützende Effekte beobachten. Interleukin 1beta zeigt in Kongruenz der vorbeschriebenen Studien, im Gegensatz zu den anderen Zytokinen, in allen Zelllinien tumorfördernde Eigenschaften. Für IL 4 ist zunächst in den Adenomzellen ein antitumoröser Effekt zu erkennen, dieser kehrt sich in der Metastasenzelllinie in eine förderndene Wirkung um. In den Adenokarzinomzelllinien sind weder eindeutige suppressive noch unterstützende Wirkungen zu verzeichnen. Über einen Zusammenhang zwischen dem Grad der malignen Transformation und unterschiedlichem Ansprechen auf IL 4 lässt sich jedoch bisher nur spekulieren. Für IL 5 ist ein ähnliches Verhalten zu beobachten. Eine anfängliche inhibitorische Wirkung auf die HDGF-Expression in den Adenomzellen sowie Adenokarzinomzellen kehrt sich in der Metastasenzelllinie in den gegenteiligen Effekt um. Auch hier lässt sich eine Umkehr der ausgelösten Effekte mit fortschreitender maligner Transformation vermuten. IL 8 zeigt kongruente Effekte zu IL 4 und IL 5, jedoch lassen sich für IL 8 in der Literatur bisher nur tumorunterstützende Wirkungen finden. Hier lässt sich in den Adenomzellen eine suppressive Wirkung verzeichnen, wohingegen in den beiden Adenokarzinomzelllinien fördernde Effekte beobachtet werden. In der Metastasenzelllinie lassen sich jedoch weder positive noch negative Auswirkungen feststellen. Des Weiteren spiegeln auch die Ergebnisse des Einflusses von IL 13 die Vielgestaltigkeit der Wirkweisen dieses Interleukins dar, mit tumorhemmenden Effekten in den Adenom- sowie Metastasenzellen und fördernder Wirkung in den HT29-Zellen. Über die genauen Mechanismen, inwiefern ein Interleukin die Expression von HDGF hochreguliert oder supprimiert, kann zum momentanen Zeitpunkt nur spekuliert werden. Es kann jedoch vermutet werden, dass ein gewisser Zu-sammenhang zwischen dem Grad der malignen Transformation und der Wirk-weise der Interleukine existiert. Entscheidend sind hier sicherlich klonal erwor-bene Alterationen einzelner Signalkaskaden. Festzuhalten ist zum einen, dass bis auf IL 1beta für alle Zytokine der Einfluss auf HDGF vom jeweiligen Zellsystem abhängt. Diese Ergebnisse machen eine Schlüsselrolle von HDGF eher unwahrscheinlich, vielmehr scheint seine Regulation hier in teilweise komplexe Regulationsmechanismen mit eingebunden zu sein. Dass diese Alterationen möglicherweise auch im Rahmen der Karzinogenese bzw. der Akquise der Metastasierungsfähigkeit entstehen könnten, zeigen die teilweise bestehenden Unterschiede zwischen der verwendeten Adenomzelllinie und den Karzinomzelllinien respektive zwischen Karzinom- und Metastasenzelllinie. Die beschriebenen Ergebnisse geben einen Anhaltspunkt, in welche Richtung die einzelnen Interleukine wirken, zumindest in wie weit hier ein Einfluß auf die Transkription von HDGF als Surrogatmarker der Mitogenese erfolgt. Um die Komplexität und Vielfalt der Effekte von Interleukinen in Bezug zu Tumorstadium, Invasivität sowie Metastasierungsfähigkeit in Einklang zu bringen, bedarf es jedoch weiterführender Studien. Es lies sich zeigen, dass die angewendeten Interleukine generell Einfluss auf die Expressionshöhe von HDGF in verschiedenen Kolonzelllinien haben und als exogene Faktoren in die Regulation eingreifen können. Dies könnte ein weiterer Ansatz zur Etablierung immunmodulatorischer Therapieoptionen in soliden Neoplasien in der Zukunft sein.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Gewebe von jeweils 15 kolorektalen MSI- und CSIPrimärtumoren, sowie 3 MSI- und 2 CSI-Tumorzelllinien mittels SNP-Arrayanalyse molekulargenetisch auf uniparentale Disomie (UPD) untersucht. Es konnte bestätigt werden, dass die uniparentale Disomie ein wichtiger Mechanismus zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen zu sein scheint. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur in MSI-Tumoren, sondern auch in CSI-Tumoren UPD nachgewiesen werden konnte, wobei der UPD-Anteil an identifizierten LOH-Regionen in MSI-Tumoren mit 94% gegenüber 41% in CSI-Tumoren deutlich höher lag. Interessanterweise wurde auch in 68% der korrespondierenden MSI- und in 27% der entsprechenden CSINormalgewebe UDP festgestellt, was daraufhin deutet, dass hier möglicherweise schon kanzerogene Vorstufen vorliegen. Die Verteilung der UPDs in den 15 Tumorproben der jeweiligen Tumortypen (MSI und CSI) war innerhalb der einzelnen Proben und innerhalb der einzelnen Chromosomen sehr heterogen, es wurden jedoch gemeinsam Regionen mit UPD gefunden. Bei 27% der MSI-Tumoren wurde eine neue Kandidatenregion auf Chromosom 6 (6pter-p22) identifiziert, die auch einige potentielle Tumorkandidatengene, wie das Tumorsuppressorgen NOL7 oder den Transkriptionsfaktor AP2a enthält. In CSI-Tumoren waren die monoallelischen Regionen mit 59% hauptsächlich durch Deletionen charakterisiert, während die MSITumore im Gegensatz nur 3% Deletionen aufwiesen. In CSI-Tumoren fielen insbesondere vier Bereiche auf den Chromosomen 18, 17, 8 und 22 durch allelische Verluste auf und bestätigen damit eine Reihe von früheren Ergebnissen. In bestimmten Regionen (z.B. 22q12.1) wurden sowohl Deletionen als auch UPD festgestellt. Die Region 5q22.2 war fast auschließlich von uniparentaler Disomie betroffen. Ob die UPD vor allem in frühen Stadien der Kolonkarzinogenese eine Rolle spielt und in späteren Stadien eher in chromosomaler, bzw. Mikrosatelliteninstabilität vorkommt, werden weitere Studien zeigen müssen.