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Eine Materialklasse, welche die Vorteile von freier Formbarkeit und Anpassungsfaehigkeit an Knochendefekte mit der exzellenten Biokompatibilitaet von Calciumphosphatverbindungen vereint, sind Calciumphosphatzemente(CPC). Aufgrund ihrer aehnlichen chemischen Zusammensetzung mit der anorganischen Komponente des Knochens werden Calciumphosphate vielfaeltig als Knochenersatzmaterialien eingesetzt. Sie besitzen eine hohe Osteokonduktivitaet und ermoeglichen so die Knochenbildung an der Oberflaeche des Materials. Trotz der grossen Bandbreite von Verbindungen finden nur zwei Hauptgruppen von Calciumphosphaten als Knochenersatz Verwendung: Hydroxylapatit und beta-Tricalciumphosphat. Ziel der voliegenden Arbeit war die Darstellung und Charakterisierung einer Reihe von Calciumorthophosphaten fuer die Anwendung in Knochenersatzwerkstoffen. Die Untersuchungen beschraenkten sich hierbei auf Calciumhydrogenphosphat(DCPA), Tetracalciumphosphat(TTCP), alpha-Tricalciumphosphat, beta-Tricalciumphosphat, die alleine bzw. in Mischung Bestandteile experimenteller und kommerzieller Knochenersatzwerkstoffe sind. Neben der phasenreinen Darstellung der Verbindungen war der Einfluss von Edukteigenschaften(Groessenverteilung) sowie Sinter- bzw. Mahlparametern auf Korngroesse und Verteilung der resultierenden Produkte Gegenstand der Arbeit.
Die den Zellstoffwechsel und das Zytoskelett betreffenden Adaptationsvorgänge in Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung sind von besonderem klinischen Interesse, da Gefäßwandschäden eine entscheidende pathogenetische Relevanz bei der Entstehung vaskulärer Erkrankungen wie z.B. der Arteriosklerose zukommt. Der intrazelluläre Signalweg, über den die Zelle einen rheologischen Reiz in eine entsprechende Zellantwort umsetzt, ist bisher weitgehend ungeklärt geblieben, wobei eine Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration als Signalgeber diskutiert wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen Messplatz zu etablieren, der es gestattet, Veränderungen in der zytosolischen Calciumkonzentration in kultivierten Endothelzellen nach Applikation von Ca2+-erhöhenden Agonisten, Calciumionophoren sowie während rheologischer Beanspruchung in Echtzeit zu dokumentieren. Die Eignung des verwendeten rheologischen Systems für Scherstressexperimente konnte durch die Beobachtung der für Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung typischen zytoskelettalen Umbauvorgänge im Sinne einer Neuordnung der Aktinfilamente mit der Ausbildung von Stressfasern gezeigt werden. Erstmalig konnte dabei auch die Reaktion mikrovaskulärer Endothelzellen der MyEnd-Zelllinie der Maus auf Scherstressbeanspruchung gesehen werden. Bei diesen Zellen konnte eine Vermehrung des F-Aktin-Gehaltes beobachtet werden, im Gegensatz zu kultivierten Endothelzellen des Truncus pulmonalis des Hausschweins blieb aber eine signifikante Bildung von Stressfasern aus. Diese unterschiedliche Verhalten ist wahrscheinlich der andersartigen Zellmorphologie der MyEnd-Zellen zuzuschreiben. Es konnte in zwei verschiedenen Endothelzellsystemen gezeigt werden, daß Gefäßendothelzellen den Kontakt mit verschiedenen endogenen Stimuli bzw. Calciumionophoren mit einer zytosolischen Calciumerhöhung unterschiedlichen Ausmaßes beantworten. Bei einsetzendem oder sich verstärkenden Flüssigkeitsscherstress konnte von uns hingegen keine Calciumantwort beobachtet werden. An der Induktion zytoskelettaler Umbauvorgänge scheint Calcium als Botenstoff in den hier untersuchten Zellsystemen also nicht primär beteiligt zu sein
Zielsetzung: In einer Population im Westen der nigerianischen Stadt Kaduna wurden seit 20-30 Jahren vermehrt Kinder mit einer deformierenden Knochenerkrankung registriert. Ziel der Studie war, eine Diagnose zu stellen und Risikofaktoren für die Erkrankung zu identifizieren. Studiendesign: 26 Familien aus 20 Dörfern wurden in die Studie einbezogen. In einer nicht-randomisierten Fall-Kontroll-Studie wurden 53 erkrankte Kinder mit 48 gesunden sowie 16 fraglich erkrankten Geschwistern anhand ihrer Ergebnisse aus Anamnese, klinischer Untersuchung und Laborchemie miteinander verglichen. Ebenfalls wurden Daten von 24 Vätern und 36 Müttern ausgewertet. Weitere Untersuchungen umfassten Ernährung, Anthropometrie, Umweltfaktoren und Genetik der teilnehmenden Familien. Ergebnisse: Die betroffenen Kinder wiesen deutliche Rachitissymptome auf, bei allen lag eine Kalzium-defiziente Rachitis vor. Zwischen den Laborergebnissen von Fall- und Kontrollgruppe bestanden signifikante Unterschiede, nicht jedoch zwischen der Gruppe der fraglichen Fälle und der Kontrollgruppe. In der Fallgruppe waren die Serumspiegel von Kalzium und 25-Vit. D signifikant niedriger, die Serumspiegel von 1,25-Vit. D, ALP und PTH signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Bei den Eltern zeigten die Mütter insbesondere in der Stillzeit signifikant niedrigere Kalzium- und signifikant höhere 1,25- Vit. D- und PTH-Serumspiegel als die Väter. Als Ursache für den Kalziummangel der Studienteilnehmer konnte eine kalziumarme und phytatreiche Diät der Familien identifiziert werden. Hinweise auf einen gesunkenen Lebensstandard und eine Abnahme der Bodenqualität erklären die in den letzten Jahrzehnten stark gestiegene Prävalenz der Erkrankung. Bei weitgehend gleichen Ernährungs- und Umweltfaktoren innerhalb einer Familie konnten keine individuellen Faktoren identifiziert werden, die bei einzelnen Familienmitgliedern zum Ausbruch der Erkrankung führten. Trotz einzelner Hinweise auf eine mögliche genetische Prädisposition war kein einheitliches Vererbungsmuster in den Stammbäumen der Familien erkennbar. Schlussfolgerung: Neben dem Hauptfaktor einer kalziumarmen Ernährung müssen weitere Faktoren für eine Kalzium-defiziente Rachitis vorliegen. Mehrere Hinweise deuten auf eine multifaktorielle Genese der Erkrankung hin. Die noch offenstehenden Fragen sollten durch weitere Studien geklärt werden, um die richtigen Maßnahmen für Prävention und Therapie zu treffen.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Thema "Die Rolle des Signalmoleküls Ca2+ in der Signaltransduktion der SC-1-induzierten Apoptose" anhand von immunhisto-chemischen, proteinbiochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Methoden erarbeitet. Die SC-1-induzierte Apoptose stellt einen neuen intrinsischen, „death domain“-unabhängigen Signalweg in der Vermittlung des programmierten Zelltodes dar, der über die Bindung dieses Antikörpers an CD55SC-1 ausgelöst wird. Dem Signalmolekül Ca2+ galt besonderes Interesse bei der Charakterisierung der durch SC-1 ausgelösten Signaltransduktion. Nach Aktivierung von CD55SC-1 durch SC-1 steigt das intrazelluläre Ca2+ um Faktor 2,7 an, stabilisiert sich danach auf dem 1,5fachen Ausgangsniveau. Dies hat keinerlei Einfluss auf die Ausführung des Apoptoseprogramms, ist aber maßgeblich in das Expressionsverhalten involviert. Der Ca2+ - Einstrom ist somit nicht direkt in die Ausführung der Apoptose beteiligt, durch die Hochregulation der Expression des Apoptoserezeptors verstärkt es jedoch die Wahrscheinlichkeit der Tumorzelle, den programmierten Zelltod zu vollziehen, da durch die verstärkte Expression dieses Apoptose-induzierenden Rezeptors auch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere SC-1-Antikörper binden können. Da die Quervernetzung mehrerer Rezeptoren mittels des SC-1-Antikörpers in der Apoptoseinduktion von Nöten ist, stellt diese durch Ca2+ getriggerte Überexpression von CD55SC-1 einen essentiellen Bestandteil in der Exekution dieses Selbstmordprogrammes dar. Dieses Ergebnis gibt einen interessanten Einblick in den Signalweg der durch SC-1 induzierten Apoptose. Weiterführende Experimente sind notwendig, um genauere Erkenntnisse dieser einzigartigen Form einer gewebespezifischen Apoptose zu erlangen.
In dieser Arbeit untersuchten wir den Einfluss von Testosteron auf den myokardialen Ischämie- Reperfusions-Schaden und den entsprechenden intrazellulären Calciumstoffwechsel ([Ca2+]i ). Non-orchiektomierte geschlechtsreife männliche Wistar-Ratten wurden zufällig Gruppen mit verschiedener hormoneller Behandlung zugewiesen; einer Placebo-Gruppe, einer Gruppe mit Testosteronundecanoat-Behandlung und einer Gruppe mit 5- Dihydrotestosteron-Behandlung. Zusätzlich wurden in weiteren Serien orchiektomierte Ratten mit Placebo behandelt. Zwei Wochen nach der jeweiligen hormonellen Behandlung wurden die Herzen entnommen und in eine Langendorff-Apparatur platziert. Die isolierten, mit Puffer perfundierten Herzen wurden 30 Minuten lang einer no-flow-Ischämie-Phase und anschließend einer 30minütigen Reperfusionsphase ausgesetzt. Die Wiederherstellung der myokardialen Funktion wurde gemessen durch Untersuchungen des prä- und postischämischen linksventrikulären (LV) systolischen bzw. diastolischen Drucks, des koronaren Perfusiondrucks und der Veränderungen der [Ca2+]i (mittels Aequorin-Lumineszenz-Methode). Calciumregulierende Proteine wurden mittels Westernblotting analysiert. Der Quotient aus linksventrikulärem Gewicht zum Körpergewicht (LVG/KG) stieg unter Testosteronbehandlung im Vergleich zu den orchiektomierten Ratten an. Die Wiederherstellung der kontraktilen Funktion war verbessert bei den mit Testosteron behandelten Tieren: Am Ende der Reperfusion war bei den testosteron-behandelten Ratten der linksventrikuläre systolische Druck höher und der enddiastolische Druck niedriger. Die endischämische [Ca2+]i und die intrazelluläre Calciumüberladung erwiesen sich ebenfalls nach Reperfusion als signifikant niedriger bei den testosteronbehandelten Tieren im Vergleich zu den orchiektomierten Ratten. Jedoch blieben die Niveaus der calciumregulierenden Proteine unberührt. Zusammenfassend kann man nun sagen, dass die Gabe von Testosteron zur Erhaltung der akuten mechanischen myokardialen Funktion nach globaler Ischämie führt. Dieser begünstigende Effekt war mit einer Verminderung der reperfusionsinduzierten intrazellulären Calciumüberladung assoziiert.
Durch die Konzeption des Versuchsaufbaus und der Wahl der Komponenten konnte die aktuelle Arbeit an intakten isolierten Mäuseherzen zeigen, dass unter weitgehend physiologischen in-vitro-Bedingungen die Möglichkeit besteht, mit Hilfe des Biolumineszenzproteins Aequorin Messungen der intrazytoplasmatischen Ca2+- Konzentration während eines einzelnen Herzschlages mit einer Frequenz von 420 Schlägen pro Minute zu gewinnen und diese gleichzeitig in die linksventrikuläre Funktion integrieren zu können. Das wesentliche Ergebnis dieser Arbeit ist dabei, dass während moderater Arbeitsbelastung der Verlust eines effizienten CK-Systems transgener CK-defizienter- Herzen (CKM/Mito-/) hinsichtlich des intramyokardialem Calciumstoffwechsels und der linksventrikulären Funktion durch Adaptionsmechanismen offensichtlich gut kompensiert wird. Allerdings wird in Situationen des Ungleichgewichtes zwischen Energieversorgung und Energieverbrauch, ausgelöst durch Ischämie und anschließende Reperfusion, eine signifikante Verschlechterung der linksventrikulären Funktion und gleichzeitig der Ca2+-Homöostase sichtbar, was einen weiteren Beweis für die enge Beziehung zwischen myokardialer Energetik und des Ca2+-Haushaltes insbesondere in CK-defizienten Herzen unter metabolischem Stress darstellt. Schließlich zeigt die simultane Aufzeichnung des Ca2+-Signals und die Druckentwicklung des linken Ventrikels, dass es schon vor der Entwicklung der ischämischen Kontraktur zur intrazytoplasmatischen Veränderung der Ca2+-Homöostase kommt, die durch eine unzureichende Bereitstellung durch ATP ausgelöst wird und maßgeblich durch das Fehlen eines effizienten Energietransportsystem in Form der Kreatinkinase bedingt sein könnte.
Die Plasmamembran Kalzium-ATPase (PMCA) ist ein in den meisten eukaryontischen Zellen exprimiertes Enzym. Sie katalysiert den Transport von Kalziumionen aus der Zelle und besitzt gegenüber Kalzium eine hohe Affinität jedoch geringe Transportkapazität. Trotz der guten biochemischen Charakterisierung der Pumpe ist ihre Funktion in Zellen wie Kardiomyozyten, die zusätzlich über andere Kalzium-Transportsysteme wie den Natrium/Kalzium-Austauscher verfügen, weiterhin unklar. Erste Ergebnisse aus dem eigenen Labor an PMCA-überexprimierenden L6-Myoblasten zeigten einen Einfluss des Enzyms auf deren Wachstum und Differenzierung. Um diese Erkenntnisse auf den Herzmuskel zu übertragen war im Vorfeld ein transgenes Rattenmodel generiert worden, welches die hPMCA4CI unter einem myokardspezifischen Promotor überexprimierte. Dieses Modell stand für die vorliegende Arbeit zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung. Untersucht wurde zunächst das Wachstumsverhalten von Primärkulturen neonataler Kardiomyozyten unter Stimulation mit fetalem Kälberserum, Noradrenalin und dem Platelet Derived Growth Factor BB, jeweils im Vergleich zwischen transgenen und Wildtyp-Kardiomyozyten. Dabei zeigte sich ein beschleunigtes Wachstum der PMCA-überexprimierenden Zellen. In einem zweiten Ansatz wurden Untersuchungen angestellt, um die subzelluläre Lokalisation der PMCA innerhalb der Herzmuskelzelle aufzudecken. Dabei wurden im Speziellen die Caveolae als Ort der möglichen Lokalisation untersucht, kleine, ca. 50-100 nm große Einstülpungen der Plasmamembran, mit charakteristischer Lipid- und Proteinzusammensetzung, darunter auch viele Rezeptoren und Signaltransduktionsmoleküle. Insgesamt konnte mit den Methoden der Detergenzextraktion, Doppelimmunfluoreszenz, Präparation Caveolae-reicher Membranen und Immunpräzipitation gezeigt werden, dass die PMCA zu einem großen Teil in Caveolae lokalisiert ist. Zusätzlich konnte in der Immunpräzipitation eine Interaktion der PMCA mit dem Caveolae-assoziierten Zytoskelettprotein Dystrophin dargestellt werden. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die PMCA über eine Steuerung der lokalen Kalziumkonzentration im Bereich der Caveolae modulierend in wachstumsregulierende Signaltransduktionswege von Kardiomyozyten eingreifen kann.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen von Aminosäuren (AS) und Proteinen auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Calciumphosphat-Zement in Hinblick auf ihre klinische Verwendbarkeit zu untersuchen. Im Rahmen der Arbeit wurden ein zweikomponentiger Zement bestehend aus Tetracalciumphosphat (TTCP) und Calciumhydrogenphosphat (Monetit, DCPA), sowie zwei einkomponentige Zemente aus mechanisch aktiviertem alpha-Tricalciumphosphat (alpha-TCP) bzw. beta-Tricalciumphosphat (beta-TCP) verwendet. Die Zemente wurden mit verschiedenen Aminosäuren und Proteinen durch Zusatz zur flüssigen Zementphase modifiziert. Untersuchte Qualitätsparameter waren die Abbindezeit nach Gillmore, die mechanische Stabilität sowie die Phasenzusammensetzung nach Aushärtung und Änderungen der Oberflächenladung und des pH-Werts der Zementpartikel nach Modifikation. Die Abbindezeit wurde mittels der Gillmor-Nadel-Methode untersucht. Hierbei zeigten sich teilweise deutlich verlängerte Abbindephasen wie z.B mit Arginin (ST = 18 min) auf das Vierfache des Zementnormwertes. Eine Abhängigkeit der Abbindezeit von der Konzentration konnte nur für TTCP-DCPA-Zement mit Proteinen nachgewiesen werden. Untersuchungen der Partikelladung der Zementbestandteile über das Zeta-Potential ergaben für Arginin in Verbindung mit allen Zementen die höchsten Potentiale von bis zu -35,1 ± 1,1 mV, was über die verstärkten Abstoßungskräfte der CPC-Partikel die Verlängerung der Abbindezeiten erklärt. Die Bestimmung der pH-Werte der suspendierten Zementpartikel in Aminosäurelösungen ergab für alle Proben basischere pH-Werte als die jeweiligen isoelektrischen Punkte der Aminosäuren. Dies bedingt, dass alle Verbindungen in deprotonierter Form vorliegen. Die Ermittlung der Druck- und Zugfestigkeit der Zemente erfolgte im standardisierten Verfahren nach Verdichtung der Zementpaste. Die Druckfestigkeit (CS) der unmodifizierten Zemente lag bei 64,1 ± 3,0 MPa (alpha-TCP), 51,8 ± 4,1 MPa (beta-TCP) und 83 ± 10 MPa (TTCP-DCPA). Es zeigte sich, dass Albumin und Fibrinogen zu einer Verringerung der Zementstabilität führen. Die Zugabe von Aminosäuren zu alpha-und beta-TCP Zementen erbrachte gleichbleibende bzw. verringerte Festigkeiten. Bei TTCP-DCPA-Zement verursachte die Modifikation mit einigen Aminosäuren höhere Festigkeiten bis 133,4 ± 4,2 MPa (CS) durch 20% Glycin Zusatz, erklärbar durch eine höhere Dichte und damit geringere Porosität der Zementmatrix. Rasterlektronenmikroskopische Untersuchungen der TTCP-DCPA-Zementtextur zeigten zusätzlich eine Veränderung des mikrostrukuturellen Aufbaus der Zementmatrix. Durch infrarotspektrometrische Untersuchung der abgebundenen Zemente konnte gezeigte werden, dass alle Aminosäuren als chemisch nicht gebundene Additive in der Zementmatrix vorliegen und sich mit Wasser auswaschen lassen. Eine Umsetzung der Zementreaktanden zu nanokristallinem Hydroxylapatit konnte durch die röntgendiffraktometrische Untersuchung für alle Formulierungen gezeigt werden. Die Verbesserungen der Zementeigenschaften einiger Proben sind im Bezug auf den klinischen Einsatz interessant, da sich so die Indikationsbreite der verstärkten CPC erweitern ließe, beispielsweise auf gering kraft-belastete Defekte im Bereich der oberen Extremitäten oder der Halswirbelsäule. Weiterführende Untersuchungen müssten sich vor allem mit dem Mechanismus der beobachteten Zementverstärkung beschäftigen. Hierfür müssten oberflächensensitive Verfahren zur Charakterisierung der Wechselwirkung von Zementpartikel und Aminosäure, beispielsweise Festkörper -NMR, zum Einsatz kommen.
Bestimmung des Zetapotentials von Calcium-Phosphat-Partikeln in wässriger und organischer Phase
(2006)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung des Zetapotentials von Calciumphosphaten, um Aussagen über die elektrostatische Stabilisierung der Partikel in flüssiger Phase und damit verbundener Prozesse, wie Agglomeration, Adsorption oder die rheologischen Eigenschaften von Pulversuspensionen machen zu können. Für den Herstellungs- und Verarbeitungsprozess feinkörniger Calciumphosphat-Zementmischungen spielt das Zetapotential eine entscheidende Rolle. Die Mahlung der Edukte, beispielsweise DCPA, muss zur Erreichung hoher Endfeinheiten in flüssiger Phase erfolgen. Verwendung finden hierbei verschiedene Suspensionsmedien, wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol. Suspensionsmedien, die zu einem hohen Zetapotential der Partikeloberfläche führen (Wasser, Alkohol/H3PO4), minimieren die Agglomeration der Partikel und führen zur gewünschten Spaltung von Partikeln und nicht von Agglomeraten. So kann DCPA in Wasser (Zetapotential -18.4mV) bis zu einer mittleren Korngröße von 0.6µm nach 24h aufgemahlen werden, während Isopropanol (Zetapotential -2.8mV) nur eine Endfeinheit von ca. 2µm der mittleren Korngröße ergibt. Das Zetapotential spielt auch bei der anschließenden Verarbeitung der Zementpasten im Hinblick auf die rheologischen Eigenschaften eine große Rolle. Durch Modifikation der Zementpaste mit mehrwertigen Anionen, etwa Alkaliphosphaten, können hohe Potentiale der Partikeloberfläche im Bereich von -30mV bis -45mV eingestellt werden. Die Partikelaufladung führt zu einer verbesserten Dispergierung feiner Partikel und zu einer Viskositätsabnahme der Zementpaste analog zur Wirkung von Alkalicitraten. Auch die Modifikation der Zemente mit Antibiotika führt teilweise zu starken Änderungen des Zetapotentials. Bei Verwendung von Gentamicinsulfat ist sie sogar mit einer Ladungsumkehr der Partikeloberfläche verbunden. In nachfolgenden Untersuchungen konnte dieses Verhalten mit Änderungen der Abbindeeigenschaften der Zemente in Zusammenhang gebracht werden. Die Bestimmung des Zetapotentials stellt somit einen nützlichen Parameter zur Abschätzung der Verarbeitungseigenschaften von Calciumphosphat-Pulversuspensionen dar. Durch Modifikation der flüssigen Phase mit Additiven kann Einfluss auf das Zetapotential genommen und so die rheologischen Eigenschaften der Suspension eingestellt werden, etwa um injizierbare Calciumphosphat-Zemente für eine minimal-invasive Applikation der Zementpaste herstellen zu können.
Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält.
In der vorliegenden Studie wurde die Remineralisationswirkung von Fruchtgummiprodukten, die mit einer neuartigen calciumhaltigen Salzhydratschmelze angereichert waren, vergleichend in-vitro und in-situ getestet. Als Vergleich diente ein handelsübliches Fruchtgummiprodukt ohne Zusatz der zu testenden Salzhydratschmelze. Die remineralisierende Wirkung der calciumreichen Salzhydratschmelze beruhte auf dem Prinzip der forcierten dynamischen Remineralisation. Um die Mineralisationseffekte messbar zu machen, wurden künstliche, standardisiert hergestellte Schmelzplättchen den unterschiedlichen Fruchtgummiprodukten ausgesetzt und die Mineralisationseffekte in regelmäßigen Abständen gravimetrisch und radiographisch gemessen, sowie abschließend einer Härtemessung unterzogen. Dabei ergaben sich zusammengefasst folgende Resultate, die die Quantität an eingebautem Mineral betreffen: 1.Der Effekt aller salzhydratschmelzehaltigen Fruchtgummis ist signifikant größer als der der Plazebopräparate 2.Die schmelzehaltigen Fruchtgummis bewirken einen signifikant größeren Mineraleinbau als herkömmliche Fluoridpräparate in Zahnpasten, wie aus früheren gleichgearteten Untersuchungen abgeleitet werden kann. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass trotz des Verzehrs zuckerhaltiger Fruchtgummiprodukte das Gleichgewicht zwischen Demineralisation und Remineralisation an der Zahnoberfläche nicht nur statiönär gehalten wird, sondern sogar zugunsten der Remineralisation verschoben wird, sofern die Fruchtgummiprodukte mit einer calciumhaltigen Salzhydratschmelze angereichert sind.
Licht- und Redoxregulation von Calcium-permeablen Kanälen in Arabidopsis thaliana Mesophyllzellen
(2003)
1. Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana sind mit Hyperpolarisations-ab-hängigen, Calcium-permeablen Kanälen ausgestattet. In Ca2+-haltigen Lösungen folgte die Nullstromspannung der Nernst-Spannung mit 27 mV bei einer zehnfachen Erhöhung der Ca2+-Konzentration. Die Sequenz an relativen Stromamplituden ergab Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). Der makroskopische Strom wurde auf der Basis einer 7,2 ± 1 pS-Leitfähigkeit bei einer Pipettenlösung mit 10 mM Ba2+ in der cell-attached Konfiguration gebildet. Die Kanäle waren sensitiv gegenüber Lanthan und Gadolinium, wobei die Stromamplitude bei 100 µM Lanthan um 97,2 ±7 % und bei 100 µM Gadolinium um 95,2 ± 7 % reduziert wurde. 2. Blaulicht induzierte den Hyperpolarisations-abhängigen, Calcium-permeablen Kanal in dunkeladaptierten, intakten Mesophyll-Protoplasten. Die Aktivierung war zeitabhängig und der Stromanstiegs erreichte eine Sättigung nach 11-16 Minuten. Weiterhin wurde bestimmt, dass eine Kanalaktivität erst bei einer Intensität an Blaulicht > 50 µmol/m2s1 induziert wird. Aufgrund der Tatsache, dass der photosynthetische Elektronentransport-Entkoppler DCMU die Aktivierung nicht verhinderte, konnte eine Beteiligung des Photosyntheseapparates ausgeschlossen werden. Eine Inhibierung der Aktivierung nach Inkubation mit dem Kinase-Inhibitor K252a war ein erster Hinweis für die Beteiligung von Phototropinen als relevante Blaulicht-Rezeptoren, da Phototropine eine Kinase-Funktion besitzen. Diese Hypothese bestätigte sich nach Überprüfung der Phototropin-knockout-Mutanten phot1-5 und phot1-5 phot2-1. Da die Aktivierung in phot1-5 reduziert war, und in phot1-5 phot2-1 keine Aktivierung der Kanäle durch Blaulicht mehr möglich war, konnte auf eine überlappende Funktion beider Photorezeptoren bezüglich der Aktivierung von Calcium-permeablen Kanälen geschlossen werden. Dagegen konnte eine Beteiligung weiterer Blaulicht-Rezeptoren, der Cryptochrome, ausgeschlossen werden. 3. Neben Blaulicht aktivierten auch reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) Hyper-polarisation-abhängige, Calcium-permeable Kanäle. Protoplasten mit intaktem Cytoplasma (cell-attached Konfiguration) zeigten nach Applikation von 5 mM H2O2 eine zeitabhängige Aktivierung der Lanthan-sensitiven Kanäle. Eine Sättigung des Stromanstiegs wurde nach ca. 25 Minuten erreicht. Neben dem Wildtyp (Col-0) wurde die Mutante dnd1 hinsichtlich Calcium-permeabler Kanäle überprüft. Sie besitzt einen nicht-funktionellen putativen cyclisch-Nukleotid-aktivierten Kanal, CNGC2, und zeigt Phänotypen bei der Pathogenabwehr. Eine histochemische DAB-Färbung ergab, dass dnd1 eine dem Wildtyp vergleichbare ROS-Produktion nach Inokulation mit avirulenten Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB besitzt. Da eine ROS- bzw. H2O2-Produktion, ein wichtiger initiierender Schritt bei Abwehrmechanismen, in der Mutante nicht beeinträchtigt war, wurde überprüft, ob ROS-aktivierte, Calcium-permeable Kanäle in dnd1 beobachtet werden konnten. Nach Applikation von 5 mM H2O2 zu intakten Protoplasten wurde keine dem Wildtyp vergleichbare Aktivierung Calcium-permeabler Kanäle festgestellt. Daraufhin konnte spekuliert werden, dass CNGC2 im Wildtyp den Calcium-permeablen Kanal repräsentiert. Eine Blaulicht-Aktivierung der Calcium-permeablen Kanäle in der Kanal-Mutante war jedoch möglich, was die Frage aufkommen ließ, ob es sich um verschiedene Kanäle mit denselben elektrophysiologischen Charakteristika handelt, oder ob es sich bei dem H2O2-aktivierten und dem Blaulicht-aktivierten Kanal um denselben Kanal handelt, der durch verschiedene Signalketten angeschaltet wird. Cyclische Nukleotide (cAMP) konnten die Kanäle in Wildtyp-Protoplasten nicht aktivieren, was dagegen sprach, dass es sich um CNGC2 handelte. Eine Inhibierung der H2O2-aktivierten Ströme durch den Calmodulin-Inhibitor W7 wies auf eine Beteiligung eines Calmodulin-abhängigen Schritts in der Signalkette hin. Untersuchungen des Calcium-permeablen Kanals in der outside-out Konfiguration mit einer dem Cytoplasma ähnlichen internen Lösung ergab, dass eine Kanalaktivität durch eine erhöhte Calcium-Konzentration (21 µM) bei Vorhandensein von Calmodulin induziert werden konnte. Cyclische Nukleotide aktivierten wie erwartet keine Hyperpolarisation-abhängigen, Calcium-permeablen Kanäle. Dies deutete darauf hin, dass CNGC2 die Calcium-permeablen Kanäle über einen Ca2+/Calmodulin-abhängigen Schritt in einer H2O2-induzierten Signalkette regulieren könnte. Lokalisationsstudien mit einem GFP-CNGC2-Fusionskonstrukt (CNGC2::mGFP4 /pPILY) zeigten, dass der Kanal in vivo im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sein könnte. Dies bestätigte die Hypothese, dass CNGC2 nicht den Calcium-permeablen Kanal in der Plasmamembran repräsentiert und dass der Verlust der Kanalaktivität in dnd1 in einer beeinträchtigten Signalkette zu suchen ist.
Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden.