Refine
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- yes (3)
Year of publication
- 2006 (3) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (3)
Language
- German (3) (remove)
Keywords
- Candida albicans (3) (remove)
Der Hefepilz Candida albicans ist Teil der natürlichen Mikroflora auf den Schleimhäuten des Verdauungs- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Allerdings kann C. albicans vor allem in immunsupprimierten Patienten auch schwerwiegende Infektionen verursachen. Diese reichen von oberflächlichen Mykosen bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen. C. albicans besitzt eine Reihe von Eigenschaften, die es diesem opportunistisch humanpathogenen Pilz ermöglichen unterschiedliche Wirtsgewebe zu kolonisieren und zu infizieren. Ein wichtiger Virulenzfaktor sind sekretorische Aspartylproteasen (SAPs), die von einer großen Genfamilie von zehn SAP-Genen codiert werden. Die SAPs werden während der Infektion differentiell exprimiert und übernehmen unterschiedliche Rollen im Infektionsverlauf. So tragen sie zur Adhärenz bei, können Wirtsbarrieren und Moleküle der Wirtsimmunabwehr zerstören oder liefern Nährstoffe, indem sie Proteine abbauen. Unter den zehn SAP-Genen ist SAP2 für ein Wachstum von C. albicans auf Proteinen als alleiniger Stickstoffquelle verantwortlich. Allerdings ist wenig über die Regulation der SAP2-Expression und über die Aufnahme der proteolytischen Abbauprodukte in die Zelle bekannt. In dieser Arbeit wurde eine Familie von Oligopeptidtransportern von C. albicans funktionell analysiert. Da aus früheren Arbeiten bekannt war, dass SAP2 durch Peptide mit mindestens acht Aminosäuren induziert werden kann, könnten einzelne Mitglieder dieser Familie neben der Transportfunktion auch eine Sensorfunktion für Peptide übernehmen und somit über einen Signalweg SAP2 induzieren. In der Genomsequenz von C. albicans wurden neben dem bereits beschriebenen OPT1-Gen sieben weitere Gene identifiziert, deren Genprodukte signifikante Homologie zu Opt1p aufwiesen und die deshalb als OPT2-OPT8 bezeichnet wurden. Um die Rolle dieser putativen Oligopeptidtransporter bei der SAP2-Induktion und beim Transport der durch Sap2p-Aktivität bereitgestellten proteolytischen Abbauprodukte zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die OPT-Gene spezifisch deletiert waren. Zu diesem Zweck wurde eine Methode zur gezielten Geninaktivierung etabliert, die auf einem neuen, recycelbaren dominanten Selektionsmarker (caSAT1) beruht, der Resistenz gegen Nourseothricin verleiht. Die “SAT1-Flipping“-Strategie kann direkt in C. albicans Wildstämmen angewendet werden und umgeht somit alle Probleme, die mit der Verwendung von auxotrophen Ausgangsstämmen verbunden sind. Alle Mutanten, in denen jeweils eines der OPT-Gene inaktiviert war, verhielten sich wie der Wildtyp und zeigten keinen Wachstumsdefekt auf bovinem Serumalbumin (BSA) als alleiniger Stickstoffquelle, während eine sap2-Nullmutante unter diesen Bedingungen nicht wachsen kann. Somit ist kein einzelnes OPT-Gen für C. albicans notwendig, um auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle zu wachsen. Dagegen zeigten opt123-Triplemutanten ähnlich wie die sap2-Mutante einen starken Wachstumsdefekt auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle, der durch Reintegration einer intakten Kopie von OPT1, OPT2 oder OPT3 wieder aufgehoben werden konnte. Der Wachstumsdefekt der opt123-Triplemutanten war nicht auf eine fehlende Induktion von SAP2 zurückzuführen, sondern auf das Unvermögen dieser Mutanten, die durch den proteolytischen Abbau von BSA entstandenen Peptide zu transportieren. Mit Hilfe von Reportergenen konnte gezeigt werden, dass die einzelnen OPT-Gene differentiell exprimiert werden. Während keines der Gene in einem Vollmedium (YPD) exprimiert wurde, wurde eine starke Induktion von OPT1 und OPT3 in Gegenwart von BSA als alleiniger Stickstoffquelle beobachtet. Nach Expression von OPT4 und OPT5 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors in den opt123-Triplemutanten konnte deren Wachstumsdefekt auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle ebenfalls kompensiert werden, während die zusätzliche Deletion dieser Gene in den dabei entstandenen opt1234-Quadruple- und opt12345-Quintuplemutanten den Wachstumsdefekt noch verstärkte. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die Gene OPT1-OPT5 für funktionelle Oligopeptidtransporter codieren. Weitere Experimente zeigten, dass die Oligopeptidtransporter unterschiedliche Substratpräferenzen haben. Während das Tetrapeptid LWMR für Stämme, die spezifisch OPT3, OPT4, oder OPT5 exprimierten, ein besseres Substrat war als das Tetrapeptid LSKL, konnten Stämme, die spezifisch OPT2 exprimierten, das LSKL-Peptid verwerten, nicht aber das LWMR-Peptid. Experimente mit Peptiden definierter Länge und Zusammensetzung wiesen außerdem darauf hin, dass die Oligopeptidtransporter in der Lage sind, auch längere Peptide mit bis zu mindestens acht Aminosäuren zu transportieren. Die Evolution einer Genfamilie, die für Oligopeptidtransporter mit unterschiedlicher Substratpräferenz codieren, hat deshalb vermutlich dazu beigetragen, dass C. albicans Proteine sehr effizient als Stickstoffquelle verwerten und sich an die Nahrungsbedingungen in verschiedenen Wirtsnischen optimal anpassen kann.
Der Hefepilz Candida albicans kommt bei den meisten gesunden Menschen als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten des Verdauungs- und Urogenitaltraktes vor, kann aber insbesondere bei immunsupprimierten Patienten sowohl lokal beschränkte mukokutane als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen verursachen. C. albicans zeichnet sich durch eine große morphologische Variabilität aus, die dazu beiträgt, dass der Pilz viele unterschiedliche Wirtsnischen erfolgreich besiedeln und infizieren kann. Neben dem durch Umweltsignale gesteuerten Wechsel zwischen Hefe- und Hyphenform kann C. albicans auch spontan und reversibel von der normalen Hefemorphologie (white) in eine sogenannte opaque-Zellform wechseln. Das white-opaque-Switching tritt nur bei Stämmen auf, die homozygot für den mating-type-Lokus (MTLa oder MTL) geworden sind, und ermöglicht das Mating von opaque-Zellen komplementären Paarungstyps. Da white- und opaque-Zellen unterschiedlich gut an bestimmte Wirtsnischen angepasst sind, scheint das white-opaque-Switching auch eine Bedeutung in der Pathogenität des Pilzes zu haben, und es ist von großem Interesse herauszufinden, wie dieser komplexe Prozess gesteuert wird. Die genetische Analyse von C. albicans ist durch das Fehlen einer haploiden Phase und durch eine Abweichung vom universalen Codon-Gebrauch in diesem Pilz erschwert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur gezielten Geninaktivierung und andere Werkzeuge für die funktionelle Genanalyse in C. albicans entwickelt. Die Möglichkeiten zur kontrollierten Genexpression sind jedoch noch begrenzt. In dieser Arbeit wurde deshalb ein System etabliert, das eine Tetrazyklin-induzierbare Expression von Genen in den verschiedenen morphologischen Formen von C. albicans und unabhängig von den Wachstumsbedingungen erlaubt. Zu diesem Zweck wurde eine Kassette konstruiert, die einen an C. albicans adaptierten, reversen Tetrazyklin-abhängigen Transaktivator (rtTA) enthält und in die Zielgene unter Kontrolle eines rtTA-abhängigen Promotors inseriert werden können. Nach Integration der Kassette ins C. albicans-Genom wird der Transaktivator konstitutiv exprimiert und ermöglicht die Induktion des Zielgens durch Zugabe von Doxyzyklin. Mit Hilfe des GFP-Reportergens wurde bestätigt, dass dieses Tet-On-System eine effiziente, Doxyzyklin-induzierbare Genexpression in Hefe-, Hyphen- und opaque-Zellen von C. albicans erlaubt. Die Tetrazyklin-induzierte Expression eines dominant-negativen CDC42-Allels blockierte in Hefezellen die Ausbildung von Knospen und resultierte in vergrößerten, mehrkernigen Zellen, während die Expression des NRG1-Repressors das filamentöse Wachstum unter allen getesteten Hypheninduktionsbedingungen effizient inhibierte. Eine Expression des MTLa1-Gens unter Kontrolle des Tet-abhängigen Promotors in opaque-Zellen eines MTL-Stammes führte zum Switching der Zellen in die white-Phase, was darauf hinwies, dass der nach dem Mating von a- und -opaque-Zellen gebildete a1/2-Repressorkomplex das Switching in die white-Phase bewirkt. Dagegen induzierte die Expression des MTLa2-Transkriptionsfaktors in -opaque-Zellen das Shmooing, das normalerweise durch das Pheromon des Matingpartners ausgelöst wird. Die Expression der site-spezifischen FLP-Rekombinase unter Kontrolle des Tet-abhängigen Promotors ermöglichte eine Tetrazyklin-induzierbare Deletion von essentiellen Genen und damit die Herstellung von konditional letalen Mutanten. In Kombination mit dem dominanten caSAT1-Selektionsmarker konnte das Tet-On-System auch in C. albicans-Wildtypstämmen eingesetzt werden und stellt daher eine vielseitig verwendbare Methode zur funktionellen Genanalyse und zur Manipulation des zellulären Verhaltens von C. albicans dar. In weiteren Experimenten wurde die Rolle des globalen Transkriptionsrepressors Tup1, der in heterozygoten MTLa/-C. albicans-Stämmen das filamentöse Wachstum inhibiert, und der phasenspezifischen Gene WH11 und OP4 beim white-opaque-Switching untersucht. Die Deletion des TUP1-Gens im MTL-Stamm WO-1 bewirkte, dass die Mutanten keine white- oder opaque-Zellen mehr bilden konnten. Stattdessen produzierten sie vier unterschiedliche Zell- und Koloniephänotypen, die ein verändertes Expressionsmuster von white- und opaque-spezifischen Genen zeigten und zwischen denen sie spontan und reversibel wechseln konnten. Interessanterweise waren drei der vier Varianten zum Mating mit MTLa-opaque-Zellen fähig und bildeten rekombinante Nachkommen. Diese Ergebnisse zeigten, dass Tup1 zwar auch in MTL-Zellen für die Aufrechterhaltung der normalen Zellmorphologie und Genexpression wichtig ist, jedoch nicht für das Switching an sich. Die Deletion des white-spezifischen Gens WH11 im Stamm WO-1 hatte keinen erkennbaren Effekt auf die Zell- und Koloniemorphologie von white- und opaque-Zellen, die phasenspezifische Genexpression oder die Frequenz des Switchings. Ein ähnliches Ergebnis wurde nach Inaktivierung des opaque-spezifischen OP4-Gens erhalten, und die Deletion von OP4-Gen hatte auch keinen Effekt auf das Mating der opaque-Zellen. Allerdings zeigten opaque-Zellen der op4-Mutanten ein im Vergleich zum Wildtyp verlangsamtes Wachstum bei niedrigen Temperaturen und bildeten spontan einen weiteren Koloniephänotyp aus. Die phasenspezifischen Gene WH11 und OP4 sind daher nicht notwendig für das white-opaque-Switching und haben vermutlich spezifischere Funktionen in der Ausprägung des phasenspezifischen Phänotyps.
In den letzten Jahren haben Pilzinfektionen zugenommen und bakterielle Infektionen nahezu überholt, wofür vor allem der massive Einsatz von Medikamenten sowie operative Eingriffe verantwortlich sind. Einer der gefährlichsten Auslöser schwerer Pilzinfektionen, die innere Organe schädigen und sehr schwer zu behandeln sind, ohne dabei den Wirtsorganismus zu schädigen, ist der opportunistische Hefepilz Candida albicans. Da aufgrund der immer größer werdenden Zahl von Resistenzen von Candida albicans nur ein relativ kleines Repertoire für die Therapie zur Verfügung steht, war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Synthese einer Reihe peptidischer Inhibitoren mit elektrophilen Bausteinen als potentielle irreversible Inhibitoren der sekretorischen Aspartat-Proteasen (SAPs) des Hefepilzes Candida albicans und deren Testung an dem am stärksten exprimierten SAP-Isoenzym SAP2 sowie anderen Proteasen. Dabei sollte geklärt werden, ob neben der HIV-1-Protease auch andere Aspartat-Proteasen durch cis-konfigurierte Epoxide irreversibel hemmbar sind, ob andere elektrophile Ringe sowie elektronenarme Michael-Systeme in der Lage sind, als irreversible Aspartat-Protease-Inhibitoren zu fungieren, und ob die Z-Konfiguration der Olefine für die Hemmung von Aspartat-Proteasen ebenso wichtig ist wie die cis-Konfiguration bei Epoxiden. Die Aziridin-2-carboxylat-Bausteine wurden als Racemate über Cromwell-Synthese gewonnen und die Aziridin-2,3-dicarboxylat-Bausteine stereoselektiv aus Tartraten dargestellt. Die Oxiran-2-carboxylat-Bausteine wurden enantioselektiv ausgehend von Threonin bzw. als Racemate über Darzens-Glycidester-Synthese dargestellt. Die Synthese der Oxiran-2,3-dicarboxylat-Bausteine gelang mittels tertButylhydroperoxid / BuLi aus den Maleaten. Die Z-Olefinbausteine wurden durch Kupplung von Alkoholen bzw. AS an Maleinsäureanhydrid erhalten oder über Wittig- bzw. Horner-Wadsworth-Emmons-Reaktion dargestellt. Die Kupplung von AS bzw. Peptiden an die elektrophilen Bausteine erfolgte mit gängigen AS- / Peptidkupplungsmethoden. Die als irreversible Inhibitoren der SAP2 konzipierten Verbindungen wurden in einem neu entwickelten fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre SAP2-Hemmung getestet. Dazu wurde ein Verdünnungsassay nach Kitz und Wilson durchgeführt und die zunehmende Fluoreszenz durch das Spaltprodukt der enzymatischen Hydrolyse des Substrats bei 540 nm detektiert (Anregung 355 nm). Als Substrat diente das Undecapeptid Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe / Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH (/ markiert die Spaltstelle). Von den Inhibitoren wurden IC50-, k2nd- und, falls möglich, ki- und Ki-Werte ermittelt. Von den 41 an der SAP2 getesteten AS- / Peptid-verknüpften Verbindungen stellen die beiden Aziridine A-07 und A-08 mit k2nd-Werten im mittleren fünfstelligen Bereich [M-1min-1] die besten Inhibitoren dar. Bis auf zwei Verbindungen zeigen alle aktiven Verbindungen an der SAP2 sinkende IC50-Werte bei längerer Inkubationszeit und somit eine zeitabhängige und irreversible Hemmung. Zur Untersuchung der Selektivität wurden die Verbindungen mittels kontinuierlicher Assays an den Cystein-Proteasen Cathepsin B (human), Cathepsin L (Paramecium tetraurelia) und Rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense) getestet. Als Substrat wurde dabei Cbz-Phe-Arg-AMC verwendet. Erfreulicherweise waren bis auf das E-konfigurierte Olefin E-Ol-04 alle Verbindungen an den Cystein-Proteasen inaktiv. Die Ergebnisse zeigen, dass neben den HIV-Proteasen auch die sekretorische Aspartat-Protease SAP2 durch cis-konfigurierte Epoxide irreversibel hemmbar ist. Desweiteren zeigt sich, dass mit Aziridinen auch andere elektrophile Ringe als irreversible Aspartat-Protease-Inhibitoren fungieren können. An der SAP2 zeigen sich die Aziridine sogar aktiver. Auch elektronenarme Michael-Systeme sind in der Lage Aspartat-Proteasen zu hemmen, auch wenn ihre Hemmung deutlich schwächer ist als die der Aziridine. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass nicht, wie angenommen, die Z-Konfiguration der Olefine entscheidend ist, sondern dass E-Olefine sogar bessere Hemmungen aufweisen. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Joachim Morschhäuser und Dr. Peter Staib vom Institut für Molekulare Infektionsbiologie der Universität Würzburg, konnte gezeigt werden, dass die Aziridine A-07 und A-08 neben dem isolierten Enzym auch die SAP2-Produktion in Candida albicans-Zellkulturen hemmen ohne auf die Pilzzellen toxisch zu wirken. Neben der Hemmung der SAP2 wirken die Aziridine A-07 und A-08 auch antiplasmodial. Bei Testungen am Malaria-Erreger Plasmodium falciparum zeigten beide Aziridine einen IC50-Wert im unteren mikromolaren Bereich. Der Grund der Hemmung des Parasiten ist jedoch noch unklar, da A-07 und A-08 weder an den isolierten Cystein-Proteasen des Malaria-Erregers Falcipain 2 und 3 aktiv sind, noch dessen Aspartat-Protease Plasmepsin II hemmen.