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Im seltenen Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP) treten aufgrund der Fehlfunktion der Gewebe-unspezifischen Alkalischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) skelettale und dentale Symptome in sehr variabler Ausprägung auf. Der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ist das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen ein erstes Anzeichen dieser Erkrankung. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Modell der HPP etabliert und der Fokus auf die dentalen Aspekte dieser Erkrankung gelegt. Hierzu wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Bereichen analysiert, die bei einer Erkrankung von dieser Mineralisierungsstörung betroffen sind. Es wurden dentale Stammzellen aus der Pulpa (dental pulp stem cells, DPSCs) und dem parodontalen Ligament (periodontal ligament stem cells, PDLSCs) isoliert und im Vergleich zu Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) charakterisiert. Um den Einfluss der Spendervariabilität zu reduzieren, wurden aus dem gesamten dentalen Probenmaterial nur vollständige Probenpaare aus DPSCs und PDLSCs von 5 Spendern für die vergleichenden Analysen verwendet. Die dentalen MSCs konnten somit paarweise direkt miteinander verglichen werden.
DPSCs gelten seit ihrer Entdeckung von Gronthos et al. im Jahr 2000 als geeignete Quelle für die Stammzellgewinnung mit vielversprechenden Anwendungsmöglichkeiten im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen muskuloskelettalen Medizin. PDLSCs sind aufgrund der parodontalen Problematik der HPP von besonderem Interesse in dieser Arbeit. Die Isolation von Stammzellen aus Pulpa und PDL konnte mit dem Nachweis der sogenannten Minimalkriterien für MSCs bestätigt werden.
In diesem durch Enzyminhibition mit Levamisol induzierten in vitro Modell der HPP wurde die TNAP-abhängige Genexpression, die Enzym-Aktivität und das osteogene Differenzierungspotenzial an diesen drei Mineralisierungs-assoziierten MSCs untersucht. Die erweiterte Genexpressionsanalyse in Kooperation mit der Core Unit Systemmedizin der Universität Würzburg mit einer RNA-Sequenzierung der PDLSCs ergab interessante Einblicke in die differentielle Genexpression nach der TNAP-Inhibition während der osteogenen Differenzierung und Ansatzpunkte für weitere Analysen. Die beobachteten Genregulationen waren nach dem derzeitigen Verständnis pathologischer Zusammenhänge nachvollziehbar und simulierten in vitro HPP-relevante Signalwege repräsentativ. Insbesondere die signifikante Genregulation von P2X7 und DMP1, sowie Zusammenhänge aus dem Wnt-Signalweg zeigen hinsichtlich der dentalen Aspekte der HPP neue Ansatzpunkte auf. Die erhöhte P2X7-Expression in diesem in vitro HPP-Modell scheint mit der Parodontitis-Problematik der HPP zu korrelieren und verdeutlicht unter anderem die multifaktorielle Ätiologie und Pathogenese der Parodontitis. Die Tatsache, dass die experimentellen Beobachtungen in Einklang mit dem klinischen Bild der HPP gebracht werden können, bestätigt die Relevanz des hier etablierten in vitro Modells. Zusammenfassend konnten anhand dieses in vitro Modells der HPP neue Aspekte aufgedeckt werden, die nicht nur im Hinblick auf die dentale Problematik der HPP aufschlussreich sind.
Phosphat stellt einen essenziellen Bestandteil der Knochenhartsubstanz dar und ist zudem erforderlich, um mesenchymale Stammzellen osteogen zu differenzieren. Bei der Aufklärung molekularer Pathomechanismen von Störungen der Phosphathomöostase wurden in den vergangenen zehn Jahre mehrere Botenstoffe identifiziert, die spezifische Wirkungen auf den systemischen Phosphathaushalt haben. Die als „Phosphatonine“ bezeichneten Substanzen FGF23 (Fibroblastenwachstumsfaktor 23), sFRP4 (secreted frizzled related protein 4), FGF7 (Fibroblastenwachstumsfaktor 7) und MEPE (matrix extracellular phosphoglycoprotein) induzieren eine negative Phosphatbilanz, indem sie an der Niere phosphaturisch wirken. Ziel dieser Arbeit war es, eventuell vorhandene Interaktionen zwischen knochenbildenden Zellen, Phosphat und den inzwischen bekannten Substanzen mit Wirkung auf den Phosphathaushalt zu charakterisieren. Dazu wurden immortalisierte Zelllinien mesenchymaler Stammzellen (hMSC-TERT) und fetaler Osteoblasten (hFOB) konzentrations- und zeitabhängig mit Phosphat stimuliert (von 1,25 mM bis 20 mM, von 0 bis 48 h). Die quantitative real-time-PCR zur relativen mRNA-Quantifizierung wurde dabei in der Arbeitsgruppe als Methode etabliert, um den Einfluss dieser erhöhten Phosphatspiegel im Nährmedium auf die Expression von Genen des Phosphatstoffwechsels und Markern der osteogenen Differenzierung zu analysieren. Untersucht wurden Col1 (Kollagen 1), OC (Osteokalzin), AP (Alkalische Phosphatase) und OP (Osteopontin) als Differenzierungsmarker, Pit-1 (Natrium-Phosphattransporter), sFRP4, MEPE und FGF23 als Schlüsselsubstanzen im Phosphatstoffwechsel sowie Aktin und EF1a als Housekeeping-Gene. Die real-time-PCR wurde mit der SYBR® Green-Methode durchgeführt, die Effizienzbestimmung erfolgte mit LinRegPCR, die Auswertung mit REST© und REST 2005, jeweils für die ermittelte Effizienz und die als optimal angenommene Effizienz (E=2). Zunächst konnte die Expression des Natrium-Phosphattransporters Pit-1 in den Zellen hMSC-TERT und hFOB nachgewiesen werden. Bei beiden Zelllinien zeigte sich, dass die Expression von sFRP4 mit steigender Phosphatkonzentration bzw. steigender Stimulationsdauer nach unten reguliert wird. Beim Vergleich aller stimulierten Proben mit den unstimulierten Kontrollen fiel das Expressionsverhältnis bei hMSC-TERT ungefähr auf die Hälfte des Ausgangswertes (0,52; p<0,05), bei hFOB reduzierte es sich auf zwei Drittel (0,67; p<0,05). Es ist somit anzunehmen, dass Phosphat in der Lage ist, die Genexpression von sFRP4 in hMSC-TERT und hFOB nach unten zu regulieren. Für Pit-1 ergab sich bei hMSC-TERT der Hinweis auf eine gesteigerte mRNA-Expression unter Phosphateinwirkung, für hFOB-Zellen konnte diese Beobachtung nicht gemacht werden. Beide Zelllinien zeigten unter Phosphat-Stimulation und maximaler Einwirkzeit von 48 h kein einheitliches Expressionsmuster, das auf eine beginnende Differenzierung hinweisen würde. Der in dieser Arbeit gefundene Hinweis auf eine Phosphatsensitivität von sFRP4 in mesenchymalen Stammzellen und Osteoblasten lässt somit die Vermutung einer physiologischen Beteiligung von sFRP4 an der Phosphatregulation zu. Es bleibt zu klären, inwieweit andere Phosphatonine an solchen Signalachsen beteiligt sind. Spekuliert werden kann, dass sFRP4 auch als Antagonist des Wnt-Signalweges bei Differenzierungsvorgängen eine größere Rolle spielt als bisher angenommen. Des Weiteren sollte in der vorliegenden Arbeit ein Genexpressionssystem (Tet-On™ Konstrukt) in mesenchymalen adulten Stammzellen (hMSC-TERT) etabliert werden, mit dem im Endzustand die Expression beliebiger Gene Tetracyclin-abhängig induziert werden kann. Diese Arbeiten konnten bis zur ersten Transfektion erfolgreich durchgeführt werden: Für einen Referenz-Vektor zeigte sich eine ausgeprägte Induzierbarkeit durch Doxycyclin. Als erstes Gen sollte sFRP4 überexprimiert werden, das dafür zunächst isoliert, sequenziert und kloniert wurde und nun für den Einsatz in diesem Genexpressionssystem zur Verfügung steht. Die Aufklärung der Regulationsmechanismen und auch der Wirkungsweise von Phosphat wird ein wichtiges Ziel zukünftiger Forschung sein und eventuell neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von krankhaften Abweichungen der Phosphathomöostase eröffnen.
Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob mittels IHH-Gentransfer aus Hüftköpfen gewonnene hMSCs chondrogen im Pelletkultursystem differenziert werden können und ob zugleich durch IHH eine Modulation der hypertrophen Enddifferenzierung der hMSCs in diesem System möglich ist. IHH bestimmt in der Wachstumsfuge zusammen mit PTHrP während der endochondralen Ossifikation die Chondrozytenreifung und -differenzierung entscheidend mit und ist daher ein interessanter Kandidat zur Induktion von hyalinem oder zumindest hyalin-ähnlichem Knorpelgewebe in der stammzellbasierten Gentherapie. Nach Gewinnung und Kultivierung der hMSCs wurden diese mit Ad.GFP, Ad.IHH, Ad.IHH+TGF-β1, Ad.IHH+SOX-9 oder Ad.IHH+BMP-2 transduziert bzw. ein Teil für die Negativkontrolle nicht transduziert und im Anschluss alle Gruppen zu Pellets weiterverarbeitet. Histologische, biochemische sowie molekularbiologische Untersuchungen wurden an verschiedenen Zeitpunkten zur Evaluierung des chondrogenen Differenzierungsgrades sowie der hypertrophiespezifischen Merkmale der kultivierten Pellets durchgeführt. Es konnte durch diese Arbeit sowohl auf Proteinebene als auch auf Genexpressionsebene reproduzierbar gezeigt werden, dass primäre hMSCs im Pelletkultursystem sowohl durch den adenoviralen Gentransfer von IHH allein als auch durch die Co-Transduktionsgruppen IHH+TGF-β1, IHH+SOX-9 und IHH+BMP-2 chondrogen differenziert werden können. Dabei zeigten alle IHH-modifizierten Pellets Col II- und CS-4-positive immunhistochemische Anfärbungen, eine gesteigerte Synthese von Glykosaminoglykanen im biochemischen GAG-Assay sowie eine Hochregulation von mit der Chondrogenese assoziierten Genen. Das Auftreten hypertropher Merkmale bei den chondrogen differenzierten MSCs konnte durch IHH-Gentransfer nach 3 Wochen in vitro-Kultivierung nicht vollkommen unterdrückt werden, war jedoch besonders stark ausgeprägt, wenn BMP-2 co-exprimiert wurde und war etwas weniger evident in der IHH+SOX-9-Gruppe. Dabei zeigte die Ad.IHH+BMP-2-Gruppe sowohl in der ALP-Färbung als auch in dem ALP-Assay und der quantitativen RT-PCR die stärkste Hochregulierung des hypertrophen Markers ALP. Möglicherweise brachte die Überexpression von IHH das fein aufeinander abgestimmte Regulationssystem zwischen IHH und PTHrP aus dem Gleichgewicht und könnte als ein Grund dafür angeführt werden, warum die Hypertrophie im Pelletkultursystem nicht vollkommen supprimiert werden konnte. Es bleibt abzuwarten, ob IHH in vivo die Chondrogenese induzieren und dabei zugleich das Phänomen der chondrogenen Hypertrophie regulieren kann. In der Zukunft würde dies letztlich der stammzellbasierten Knorpelregeneration in vivo zu Gute kommen.
Aus dem Knochenmark isolierte humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) sind als Vorläuferzellen der Osteoblasten an der Knochenformation sowie an der Knochenremodellierung beteiligt und aufgrund ihrer Multipotenz in der Lage, in mesenchymales Gewebe (Knochen, Knorpel, Fett) zu differenzieren. Aufgrund dieser Eigenschaften gelten sie als Quelle der Regeneration und der Heilung im Hinblick auf zellbasierte Therapien zur Behandlung degenerativer Erkrankungen (Arthrose, Osteoporose) des muskuloskelettalen Systems. Die besondere Situation der Geweberegeneration beim älteren Menschen ist gekennzeichnet durch den Anstieg der Produktion von Hemmstoffen der Geweberegeneration und durch verschiedene häufige Mangelzustände wie z.B. den Vitamin D-Mangel. In der vorliegenden Arbeit wurden Modulatoren (Morphogene) untersucht, die in der Lage sind, die hMSC in vitro in ihrem proliferativen, undifferenzierten Zustand (transient amplifying pool) und am Übergang in die Differenzierung und Reifung zu beeinflussen. Ziel war es, durch die Charakterisierung solcher Modulatoren, Verfahren zu etablieren, die zu einer verbesserten Zellqualität bei regenerativen Therapiestrategien führen, sei es in situ oder beim Tissue Engineering. Der Fokus lag auf der Geweberegeneration beim älteren Menschen. Dafür wurden als Morphogene 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25D3), Aktivin A (AA), Myostatin (MSTN) und Low Oxygen (LO) ausgewählt und hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf Stemness, Differenzierung und Seneszenzentwicklung in der Zellkultur getestet. Alle 4 Kandidaten nehmen im menschlichen Organismus wichtige regulatorische Aufgaben ein. 1,25D3 wirkt nicht nur lokal auf Zellen und Gewebe, sondern mit der Mineralisierung des Knochens und der Regulierung des Kalzium- und Phosphatspiegels im Serum auch systemisch. AA und MSTN werden als Mitglieder der TGFβ-Familie mit dem muskuloskelettalen System in Verbindung gebracht, da eine Inaktivierung von MSTN bei Mensch und Tier zu einem deutlichen Anstieg der Skelettmuskelmasse führt. Gleichzeitig fördert ein Aktivin Antagonist, der neue Wirkstoff Sotatercept (ACE-011), die Knochenbildung im Menschen. Mit der Kultivierung der hMSC unter reduzierter Sauerstoffspannung (2,5 % Sauerstoff, LO) sollten Bedingungen in der Zellkultur geschaffen werden, die - im Vergleich zur traditionellen Kultivierung mit einem atmosphärischen Sauerstoffgehalt von 21 % - näher an den physiologischen Gegebenheiten bei der Geweberegeneration sind. Zu Beginn wurde sichergestellt, dass alle 4 Modulatoren die Expression typischer mesenchymaler Oberflächenmarker nicht beeinflussten und die klonogene Kapazität der stimulierten hMSC erhielten. Im Rahmen weiterer Untersuchungen zeigte sich, dass eine permanente 1,25D3 Supplementierung die chondrogene, adipogene und osteogene Differenzierungskapazität der hMSC erhielt und somit den Stammzellcharakter der hMSC nicht beeinträchtigte. Die verstärkte Expression der Quieszenz-assoziierten Gene in 1,25D3 stimulierten hMSC deutete darauf hin, dass sich die hMSC aufgrund der 1,25D3 Supplementation in Richtung Quieszenz verändern. Die permanente 1,25D3 Supplementation übt somit eine vor Alterungsprozessen schützende Wirkung in der Zellkultur aus, indem die Entwicklung replikativer Seneszenz verzögert wird und das multipotente Potential der hMSC erhalten wird. Im Bezug auf die Differenzierungsfähigkeit der Zellen verhielten sich rh AA und rh MSTN konträr. Während eine rh MSTN Stimulation keine Wirkung auf die adipogene und osteogene Differenzierung hatte, schränkte rh AA das adipogene und osteogene Differenzierungspotential der hMSC nahezu vollständig ein und die Zellen wurden in einem Zustand des Prä-Kommittments festgehalten. Da die LO Expandierung die Stemness erhöhte bzw. die Seneszenz reduzierte und die hMSC in einem proliferativen Zustand bei gleichzeitiger Hemmung der Differenzierung arretierte, scheint diese Art der Kultivierung ein besonderer Schutz für die hMSC zu sein. Mit der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, wirksame Morphogene (1,25D3, rh AA, LO) zu finden, die in der Lage sind, modulatorisch auf die hMSC einzuwirken ohne dabei den Stammzellcharakter zu verändern. Durch ihre Modulation kann nicht nur die Qualität der hMSC verbessert werden, sondern je nach Bedarf können auch die verschiedenen Phasen der Geweberegeneration insbesondere beim Übergang vom „transient amplifying pool“ zur Differenzierung gesteuert werden. Diese Ergebnisse können Konsequenzen für die Anwendung haben, bei der in situ Geweberegeneration ebenso wie für das ex vivo Tissue Engineering.
Fragestellung:
Die Therapie von Knochendefekten kritischer Größe mit kompromittiertem Regenerationspotential, stellt ein schwerwiegendes Problem dar. Die Forschung auf dem Gebiet der Knochenheilung hat sich in jüngster Vergangenheit daher auf die Anwendung mesenchymaler Vorläuferzellen (MSZ) zur Stimulierung des Knochenwachstums konzentriert. In der vorliegenden Studie wurde in humanen MSZ eine Überexpression spezifischer Wachstumsfaktoren induziert mit dem Ziel, deren osteogenes Potential zu steigern.
Methodik:
MSZ wurden nach etablierten Protokollen expandiert. Durch adenovirale Transfektion wurde eine überexpression von grün fluoreszierendem Protein (GFP, Kontrolle), indian hedgehog (IHH), bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) und IHH in Kombination mit BMP-2 induziert. Die MSZ wurden für 28 Tage mit osteogenem Differenzierungs- und Kontrollmedium kultiviert. Als weitere Kontrolle dienten native MSZ. Es wurden die Auswirkungen der jeweiligen genetischen Veränderungen auf die metabolische Aktivität (Alamar Blau), die Proliferation (Qubit dsDNA BR), die Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase (ALP)(p-Nitrophenylphosphat), die Mineralisierung (Alizarinrot S, Calcium O-Cresolphthalein) sowie auf die Expression charakteristischer Markergene untersucht (qRT-PCR).
Ergebnis:
In den ersten 72h nach Transfektion konnte eine leichte, im Vergleich zu nativen Zellen nicht signifikante Abnahme der metabolischen Aktivität in allen Gruppen beobachtet werden. Das Proliferationsverhalten transfizierter und nativer MSZ unterschied sich während des Untersuchungszeitraums nicht signifikant. Bei der Analyse der ALP-Aktivität zeigte sich ein typisches Rise-and-Fall Muster. Alle ost Gruppen wiesen sowohl im Assay als auch in der PCR eine signifikant höhere ALP-Aktivität auf. Die Überexpression von BMP-2 und IHH+BMP-2 bewirkte eine signifikant stärkere Mineralisierung an Tag 28. In der PCR zeigte sich für BMP-2 ost und IHH+BMP2 ost ein signifikanter Anstieg der Osteopontin und BMP-2 Expression über die Zeit. Zudem stieg bei allen ost Gruppen die Runx2 Expression bis Tag 21 an.
Schlussfolgerung:
Die virale Transfektion hatte keinen negativen Einfluss auf die metabolische Aktivität der Zellen oder deren Proliferationsverhalten. Die Überexpression von BMP-2 ohne oder in Kombination mit IHH führte zu einer vermehrten Produktion extrazellulärer Matrix und zu einer gesteigerten Genexpression osteogener Marker. Die virale Transfektion stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, das osteogene Potential von MSZ zu steigern.
Verletzungen des vorderen Kreuzbandes gehören zu häufigsten Verletzungen des menschlichen Bandapparates. Da das vordere Kreuzband über ein schlechtes intrinsisches Heilungspotenzial verfügt, ist heutzutage die chirurgische Rekonstruktion mittels Sehnentransplantaten die Therapie der Wahl. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Fragestellung, ob es möglich ist, ein Kreuzband-Konstrukt aus mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und einem Kollagen Typ I-Hydrogel herzustellen und wie die Einwirkung von mechanischem Stress die Struktur und Eigenschaften eines solchen Bandäquivalentes verändert. Dafür wurden MSCs und endständige Knochenblöcke in ein Kollagen Typ I-Hydrogel eingebracht. Das Konstrukt wurde zunächst eine Woche horizontal kultiviert, um den Zellen eine Umwandlung des Gels und eine Anheftung der Knochenblöcke zu ermöglichen. Anschließend wurde über 2 Wochen eine zyklische Dehnung in einem speziell dafür entworfenen Bioreaktur auf das Konstrukt ausgeübt. Histochemische ( HE, Masson-Goldner, Azan, Sirius-Red) und immunhistochemische (Kollagen I und III, Fibronektin, Vimentin und Elastin) Färbungen zeigten eine Induktion der Matrixproduktion mit wellenförmig in Achse des Zuges ausgerichteten Kollagenfasern, die Zellkerne stellten sich elongiert dar. RT-PCR-Analysen zeigten ebenso eine deutlich vermehrte Expression der oben genannten Fibroblastenmarker. Bei ungedehnten, horizontal kultivierten Kontrollkonstrukten waren keinerlei Veränderungen der Matrix zu erkennen. Das Konstrukt war jedoch nicht stabil genug, um für die klinische Anwendung zum Einsatz zu kommen.
Der Meniskus gleicht die Inkongruenz der beiden Gelenkpartner im Kniegelenk aus und führt somit zu einer Reduktion der Knorpelbelastung. Aufgrund der eingeschränkten Selbstheilungsfähigkeit des bradytrophen Meniskusgewebes bleibt bei Verletzung oft nur die operative Teilresektion als Therapie der Wahl. In dieser in vitro Untersuchung erfolgte die Implantation eines mit mesenchymalen (MSZ) Stammzellen beladenem Polylaktid-Kollagen-I-Hydrogel. Die MSZ zeigten eine in der Histologie und PCR nachgewiesene chondrogene Differenzierungspotenz innerhalb des Polylaktidkonstruktes. Innerhalb des Stanzdefektes konnte eine Anhaftung der MSZ an das Meniskusgewebe sowie die Ausbildung einer stabilen Kollagen-I-Matrix gezeigt werden. Die Arbeit stellt die Grundlage für eine spätere tierexperimentelle Studie dar.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind multipotente adulte Stammzellen. Sie können aus einer Vielzahl verschiedener Gewebe isoliert werden, z.B. aus Knochenmark (BM), Fettgewebe (AT) und Nabelschnurblut (CB). Besondere Bedeutung haben MSCs als mögliche Zellquelle für neuartige klinische Stammzelltherapien, da sie relativ einfach aus adulten Patienten isoliert und in vitro expandiert werden können. Grundlage für die erforschten Therapieansätze ist häufig das Entwicklungspotential der MSCs. Es umfasst mesenchymale Zelltypen wie Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten, aber auch nicht-mesenchymale Zelltypen wie z.B. Hepatozyten oder Nervenzellen. Das Entwick-lungspotential von MSCs zu nicht-mesenchymalen Zelltypen ist jedoch umstritten und viele Differenzierungswege sind bisher nur in vitro gezeigt. Außerdem ist unklar, ob MSCs aus verschiedenen Ursprungsgeweben dasselbe Entwicklungspotential besitzen. Ein Ziel dieser Arbeit war deshalb das in vivo Differenzierungspotential von CB-, AT- und BM-MSCs vergleichend zu untersuchen. Dazu wurden die MSCs in murine Tag-3-Blastozysten injiziert. Diese wurden dann in Foster-Mäuse transferiert und die daraus entstandenen Embryonen am Tag 16 der Embryonalentwicklung (E16.5) analysiert. Dazu wurde gDNA aus verschiedenen embryonalen Geweben isoliert und mittels humanspezifischer quantitativer real-time PCR (qPCR) die Verteilung sowie das Ausmaß der humanen Donorkontribution bestimmt. Außerdem sollte der Differenzierungsstatus der humanen Zellen mittels in situ Hybridisierung und Antikörperfärbung analysiert werden...
Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen die Grundlage der Knochenformation dar, indem sie als multipotente Zellen in viele, für die Knochenhomöostase benötigte Zelltypen differenzieren können, wie z.B. Osteoblasten. Während der Alterung des Menschen kommt es zu einem Ungleichgewicht zwischen Knochenaufbau und Knochenabbau, resultierend in einer verringerten Knochenmasse. Noch ist unklar, ob MSC an dem verminderten Knochenaufbau direkt beteiligt sind, indem sie z.B.im Laufe der Zeit Funktionsstörungen akkumulieren oder in die Seneszenz eintreten, und somit nicht mehr als Stammzellpool für die Osteoblastendifferenzierung zur Verfügung stehen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Genexpressionsmuster gealterter Zellen mittels Mikroarray-Analysen untersucht, um die Alters-bedingten Veränderungen detektieren zu können. Hierfür wurde ein in-vitro-Alterungsmodell von humanen MSC (hMSC) etabliert, um die seneszenten Zellen mit hMSC früher Kultivierungspassagen zu vergleichen. Auch Zellen aus Spendern hohen Alters wurden untersucht, um einen Vergleich zwischen ex-vivo- und in-vitro-gealterten hMSC anstellen zu können. Da Osteoporose eine polygenetische Erkrankung des gealterten Knochens darstellt, wurden auch mit hMSC aus Osteoporose-Patienten Genexpressionsanalysen durchgeführt. Die Mikroarray-Analysen und anschließende systembiologische Auswertung zeigten, dass in-vitro-gealterte, seneszente hMSC starke Veränderungen im Transkriptom aufweisen, die auf Defizite in der Proliferation, Differenzierungskapazität und Migration schließen lassen. Neben bekannten Markern für replikative Seneszenz konnten in hMSC auch neue detektiert werden, wie z.B. HELLS, POU5F1 (OCT4) und FGFR2, deren Expression mit der Seneszenz abnimmt, oder CDH1 und PSG5, deren Expression zunimmt. Gene für Akute-Phase-SAA wurden stark erhöht exprimiert vorgefunden. Bei der funktionellen Charakterisierung konnte jedoch gezeigt werden, dass SAA1 und SAA1 durch Stress induziert werden, der der Seneszenz vorausgeht, und dass sie die Mineralisierung bei der osteogenen Differenzierung von hMSC fördern. Akute-Phase-SAA könnten somit eine Verbindung zwischen Alterung bzw. Inflammation und extra-skelettaler Verkalkung darstellen, die im Alter häufig auftritt, z.B. in Form von Arteriosklerose. In-vivo-gealterte hMSC wiesen ebenfalls Defizite im Expressionsmuster von Proliferations- und Migrations- relevanten Genen auf. Des Weiteren konnten nur wenige Gemeinsamkeiten zwischen in-vivo-gealterten hMSC und in-vitro-gealterten hMSC festgestellt werden. Dies lässt vermuten, dass die in-vivo-Alterung nicht zwangsläufig zu seneszenten Stammzellen führt, da Alterung eines Organismus ein multizellulärer Prozess ist, der durch viele Faktoren beeinflusst wird, wie z.B. Akkumulation von Mutationen und Krebsabwehr. Auch osteoporotische hMSC wiesen Veränderungen im Genexpressionsmuster auf, die mit den Daten zur in-vivo-Alterung verglichen wurden, um die rein Alters-assoziierten Änderungen herausfiltern zu können. Die übrig gebliebenen Gene repräsentierten Veränderungen allein aufgrund der Krankheit. Osteoporose bewirkte somit distinkte Genexpressions-änderungen in hMSC, die auf Förderung der Osteoklastogenese und Defizite in Proliferation, Migration und Differenzierungskapazität schließen lassen. Es konnten vielversprechende Kandidaten-gene für osteoporotische hMSC gefunden werden. Die prämature Expression des WNT-Inhibitors SOST (Sclerostin) und die Überexpression des BMP-Signalweg-Inhibitors MAB21L2 deuten auf eine Autoinhibition der Stammzellen hin, die letztlich die gestörte Knochenformation bei Alters-assoziierter Osteoporose begründen könnte. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass intrinsische Defizite von Stammzellen an der Pathophysiologie von Alterung und Osteoporose beteiligt sind. Sie eröffnet tiefgreifende Einblicke in die systembiologischen Veränderungen in Stammzellen aufgrund von Alterung oder Osteoporose, und setzt somit einen soliden Grundstein für weiterführende Analysen.