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Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 beschrieben, nachdem der Erreger aus dem Lungengewebe eines Patienten isoliert wurde, der an einer schweren atypischen Pneumonie erkrankt war. Das Bakterium zeichnet sich durch ein duales Wirtssystem aus und kann sich sowohl in Protozoen als auch in humanen Zellen vermehren. Ein Ziel dieser Arbeit war es, wichtige Faktoren einer Legionelleninfektion seitens der Wirtszelle zu betrachten. Als Wirtsmodell diente die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum. Mit Hilfe eines von Patrick Farbrother (Universität Köln) etablierten Dictyostelium DNA-Microarrays mit 5906 genspezifischen Sonden, wurde die Genexpression von D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion durch L. pneumophila untersucht. Zur Kontrolle dienten uninfizierte Zellen, und Zellen, die mit L. hackeliae bzw. einer dotA-Mutante von L. pneumophila koinkubiert wurden. Diese beiden Stämme weisen eine verminderte Pathogenität bzw. ein deletiertes Pathogenitätsgen auf. Für den Zeitpunkt 24 h nach Infektionsbeginn wurden 140 Gene gefunden, die in D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion mit L. pneumophila differentiell exprimiert werden. Einige Gene codieren bereits bekannte Proteine von D. discoideum. Dazu gehören das RtoA (ratioA, Fusion von Vesikeln), Discoidin I, CotB (spore coat Protein SP70) und die lysosomale α-Mannosidase. Mit Hilfe von Homologie-Suchen konnte weiteren unbekannten Proteinen eine Funktion zugeteilt werden. Hierzu zählen die Chaperone ClpB (heat shock protein Hsp104), β’-COP (coat protein) und drei calciumbindende Proteine. Nach Einteilung in funktionelle Kategorien, konnte gezeigt werden, dass viele Gene reguliert werden, deren Produkte am Aminosäure-Metabolismus beteiligt sind oder bei denen es sich um ribosomale Proteine handelt. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das Nramp-Protein von D. discoideum näher untersucht. Nramp transportiert zweiwertige Kationen über die phagosomale Membran. Es konnte festgestellt werden, dass die Aufnahme von L. pneumophila und M. avium in eine nramp-Mutante deutlich reduziert ist. Allerdings ist eine vermehrte Replikation von Legionellen und Mykobakterien in der Wirtsmutante zu beobachten. In Zusammenarbeit mit Salvatore Bozzaro (Turin, Italien) konnte gezeigt werden, dass während einer Infektion mit L. pneumophila die nramp-Expression sinkt und bereits nach 48 h annähernd keine nramp-RNA im Northern-Blot nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu bleibt die nramp-Expression während einer Infektion mit M. avium relativ konstant. In Infektionsstudien konnte nachgewiesen werden, dass sich die Endozytobionten TUME1, UWE25 und UWC6 in D. discoideum vermehren können. Mit Hilfe von spezifischen Cy3-markierten 16S-rRNA Sonden wurde die intrazelluläre Zunahme der Bakterien über 48 h beobachtet. Zum Zeitpunkt 48 h nach Inokulation konnte eine erhöhte Anzahl der drei Endozytobionten in D. discoideum festgestellt werden. Anhand von elektronenmikro-skopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass die Stämme TUME1 und UWE25 im Zytoplasma des Wirtes von membranösen Strukturen eng umschlossen sind. UWC6 konnte sowohl in Vakuolen als auch frei im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Lokalisierung der Endozytobionten entspricht ihrer Lokalisierung in ihren natürlichen Wirten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Funktionsanalyse des Mip-Proteins aus L. pneumophila. Das Mip-Protein von Legionella gehört in die Klasse der FK506-Bindeproteine. Es besitzt Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität und bildet Homodimere. Mip kann an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen binden, speziell an das Collagen IV. Mit Hilfe von Transwell-Versuchen konnte festgestellt werden, dass Mip für die Penetration von Legionella durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen verantwortlich ist. Die Penetrationsfähigkeit konnte nach Hemmung der PPIase-Aktivität durch FK506 bzw. Rapamycin gehemmt werden. Ebenso waren Legionellen nach Hemmung der Serinproteaseaktivitäten im Transwell-System nicht mehr in der Lage die Barriere aus Epithelzellen mit extrazellulärer Matrix zu durchwandern. Mit Hilfe von Degradationsassays mit S35-markierter extrazellulärer Matrix konnte gezeigt werden, dass mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix degradieren können. Nach Hemmung der PPIase-Aktivität bzw. Serinproteaseaktivität konnten mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix nicht mehr degradieren.
Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist.