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Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) Kanäle sind Ionenkanäle in der Plasmamembran und erlauben einen nicht selektiven Ca2+-Einstrom in die Zelle. Durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GqPCRs) wird dieser Ca2+-Einstrom erhöht, wodurch über Calmodulin, die Phosphatase Calcineurin aktiviert wird. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) wird durch Calcineurin dephosphoryliert und wandert in den Nucleus, wo er mit anderen Transkriptionsfaktoren interagiert und Hypertrophie-induzierende Gene aktiviert. TRPC3 ist hierbei eine der relevantesten Isoformen für die Entwicklung einer Myokardhypertrophie, wie sie im Rahmen zahlreicher kardiovaskulärer Erkrankungen zu finden ist. Eine kardiale Hypertrophie ist an der Pathogenese der Herzinsuffizienz beteiligt und stellt somit einen wichtigen Risikofaktor für den plötzlichen Herztod dar. Aus diesem Grund ist es von besonderer Bedeutung die Regulation von TRPC3 Kanälen und deren Einfluss auf hypertrophe Prozesse genauer zu untersuchen.
In Vorversuchen wurde FK506 bindendes Protein 52 (FKBP52) als neuer Interaktionspartner von TRPC3 im Herzen gefunden. Die dabei gefundene FKBP52-Bindestelle von TRPC3 lag erstaunlicherweise außerhalb der zu erwartenden Bindestelle mit den vermeintlichen FKBP Bindemotiven.
FKBP52 ist ein Immunophilin, das als cis/trans Isomerase fungiert und dadurch an der Regulation von verschiedenen Ionenkanälen beteiligt ist, darunter auch TRPC-Kanäle. Es zeigte sich, dass alle Domänen von FKBP52, bis auf die TPR3-Domäne und der C Terminus, in der Lage waren, mit TRPC3 zu interagieren. Aufgrund der Funktion der FKBPs und der Tatsache, dass TRPC3 eine Rolle in der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie spielt, sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob FKBP52 die Aktivität und die nachgeschalteten hypertrophen Signalwege von TRPC3 beeinflusst.
Die Downregulation von FKBP52 führte zu einer verstärkten TRPC3-abhängigen hypertrophen Antwort in neonatalen Rattenkardiomyozyten (engl. neonatal rat cardiomyocytes, NRCs). Der gleiche Effekt war sowohl in NRCs und in adulten Rattenkardiomyozyten (engl. adult rat cardiomyocytes, ARCs) zu sehen, wenn Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPIase) defiziente Mutanten von FKBP52 überexprimiert wurde. Verkürzte FKBP52 Mutanten erhöhten ebenfalls die TRPC3-abhängige Aktivität von Calcineurin, was durch eine verstärkte Translokation von NFAT in den Nucleus von NRCs zu sehen war. Außerdem konnte in NRCs und in menschlichen embryonalen Nierenzellen (engl. human embryonic kidney cells, HEK 293 Zellen), die die PPIase defizienten Mutanten exprimierten, ein erhöhter Ca2+-Einstrom in die Zelle beobachtet werden. Das gleiche war nach Downregulation von FKBP52 in HEK 293 Zellen, die TRPC3 überexprimieren (T3.9 Zellen), zu sehen. Eine funktionelle Interaktion von FKBP52 und TRPC3 konnte auch in elektrophysiologischen Messungen bestätigt werden. Nach der Interaktion von TRPC3 mit den FKBP52 Mutanten zeigte sich eine erhöhte TRPC3-Aktivität.
Die Daten zeigen somit, dass TRPC3-Kanäle durch FKBP52 reguliert werden und diese Regulation abhängig von der PPIase Funktion ist. Eine Interaktion von TRPC3 mit vollfunktionsfähigem FKBP52 könnte vor einer Ca2+-Überlastung und einer damit einhergehenden pathologischen Hypertrophie des Herzens schützen.
Das atriale natriuretische Peptid (ANP) beeinflusst den arteriellen Blutdruck und das intravasale Volumen durch Stimulation der intrazellulären Produktion von cGMP über den membranständigen Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptor. ANP stimuliert außerdem die Angiogenese und ist am Wachstum der Kardio-myozyten beteiligt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die dynamische Interaktion zwischen den rezeptoraktivierten Kationenkanälen Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6) und dem GC-A-Rezeptor untersucht. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass ANP über GC-A den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in Kardiomyozyten auf cGMP-unabhängige Weise stimuliert. Um eine mögliche direkte Interaktion von TRPC3/C6 und GC-A zu zeigen, wurde TRPC3 oder C6 mit Flag-GC-A in HEK293-Zellen koexprimiert. Die Membranfraktion der Zellen wurde nach Immunpräzipitation mit einem anti-Flag-Antikörper im Western Blot untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRPC3/C6 unabhängig von ANP mit GC-A ko-immunpräzipitieren. Die Interaktion erfolgte auch mit einem modifizierten GC-A-Rezeptor, dem die Cyclase-Domäne fehlt. Um die Interaktion in Kardiomyozyten zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit einer Überproduktion von HA-GC-A in Kardiomyozyten verwendet. Auch bei diesem Modell konnte mittels anti-HA- Antikörper die Koimmunpräzipitation von GC-A und TRPC3/C6 nachgewiesen werden. Schließlich wurden FRET-basierte Untersuchungen durchgeführt, um die lokale Nähe von GC-A und TRPC3 zu beweisen und eine mögliche ANP-induzierte Konformationsänderung zu untersuchen. Die Koexpression von GC-A-CFP und TRPC3-YFP in HEK293 Zellen führte zu einem FRET-Signal, welches durch ANP konzentrationsabhängig (1-100 nM) gesenkt wurde. Die Gabe des membranpermeablen cGMP-Analagons 8-Br-cGMP führte dagegen zu keiner Veränderung des FRET-Signals. Die Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein eines stabilen Proteinkomplexes von GC-A und TRPC3, der für den neuen cGMP-unabhängigen Signalweg von GC-A ausschlaggebend ist. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Rolle von ANP/GC-A für die Insulinausschüttung der pankreatischen β-Zellen. Es ist bereits bekannt, dass GC-A in den β-Zellen exprimiert wird und dass ANP an isolierten Langerhans’schen Inseln das β-Zell-Wachstum und die Insulinsekretion moduliert. Um langfristig die Bedeutung von ANP für die systemische Glukose-Homöostase zu ergründen, wurde ein Mausmodell mit einer β-Zell-spezifischen GC-A-Deletion generiert. Der Nachweis des konditionellen GC-A knock out (KO) erfolgte mittels genomischer PCR und Immunhistochemie. Eine Detektion von GC-A in den Langerhans’schen Inseln auf Proteinebene war leider nicht möglich. Aber es konnte gezeigt werden, dass der β-Zell-spezifische KO zu keiner Expressionsänderung von GC-A in anderen Geweben führte. Auch der Blutdruck und das Herzgewicht der KO Mäuse blieb unauffällig. Zur Untersuchung der Bedeutung von ANP für die Insulinausschüttung unter pathologischen Bedingungen wurden KO- und Kontrolltiere für 12 Wochen einer fettreichen Ernährung (60% Fett) ausgesetzt um einen Prädiabetes auszulösen. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie wurden orale Glukose-Toleranz-Tests (oGTT), Blutdruckmessungen und Gewichtsbestimmungen durchgeführt. Bereits vor der Studie wurde beobachtet, dass der Nüchternglukosewert in den weiblichen KO-Mäusen leicht erhöht ist. Daher wurden die oGTT‘s in der Studie geschlechtsspezifisch ausgewertet. Am Ende der Studie zeigten alle Mäuse eine vergleichbare insuffiziente Blutzuckerregulierung. Der Blutdruck war sowohl in KO- als auch in Kontrolltieren um ca. 60% erhöht. Einigen Tieren wurde das Pankreas entnommen und für immunhistologische Zwecke präpariert. Die morphometrische Auswertung der Pankreas-Schnitte ergab eine signifikant vergrößerte durchschnittliche Inselfläche und eine erhöhte durchschnittliche β-Zellfläche der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die β-Zellen der KO-Tieren waren im Vergleich zu den Kontrollen hypertroph. Die Studie zeigt also, dass die Deletion von GC-A in den β-Zellen unter pathologischen Bedingungen zu einer Hypertrophie der β-Zellen führt und zu einem geringeren Schutz gegen die Ausbildung eines Prädiabetes beiträgt. Eine mögliche verstärkte periphere Insulinresistenz in den KO-Tieren ist auch nicht auszuschließen. Weitere Studien an dem neuen Mausmodell könnten die Bedeutung des ANP/GC-A-Systems für die Insulinausschüttung näher ergründen und dadurch eventuell neue Therapieansätze für Diabetes mellitus Typ 2 bringen.