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Insulin-produzierende Zellen als Ersatz für die beim Diabetes mellitus Typ 1 zerstörten Betazellen stellen einen hochattraktiven Forschungsansatz dar. Ziel dieser Arbeit war, Insulin-positive Zellen aus in vitro modifizierten Blutmonozyten zu gewinnen. Blutmonozyten sind nicht nur, wie bereits seit längerem bekannt, in der Lage, sich in Makrophagen und dendritischen Zellen zu differenzieren, sondern auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen, wie z.B. Insulin-produzierender Zellen. Für die optimale Zelltherapie ist zu fordern, dass die gewünschten Zellen in vivo nicht nur ihre Funktion beibehalten, sondern dass von diesen Zellen auch kein immunologisches Risiko für den Patienten ausgeht. Eine dauerhafte Immunsuppression, wie sie für die Vollorgantransplantation notwendig ist, ist für Zelltransplantate nicht angebracht. Hier besteht Übereinkunft, dass Immunsuppressiva, wenn überhaupt, nur kurzfristig einzusetzen sind. Blutmonozyten lassen sich einfach gewinnen und stünden somit als autologer Zellersatz für eine mögliche Zelltherapie zur Verfügung. Ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit war, die in vitro Differenzierung von Blutmonozyten zu charakterisieren. Dabei sollte die Expression von Insulin, Gluka¬gon und dem Glukosetransporter Glut-2 nachgewiesen werden. Auch morpho¬logische Veränderungen während der Kultur sollten beobachtet werden. Die kultivierten Monozyten entwickelten sich mit zunehmender Kulturdauer eindeutig zu Makrophagen. Dabei waren zwei verschiedene Zellmorphologien zu unterscheiden: Der erste Zelltyp (Typ 1) war oval mit Ausläufern. Der zweite Zelltyp (Typ 2) war sehr groß, teilweise mit einem Durchmesser von über 500 μm, häufig von ovaler Form und polynukleär. Dieser Zelltyp wies zudem häufig einen breiten, um das Kerngebiet gruppierten Saum auf. Mit zunehmender Kulturdauer dominierte dieser Zelltyp die Kultur. Der Großteil der Typ 1-Zellen blieb CD14 positiv. Gab es CD14-negative Zellen in der Kultur, so gehörten sie mit großer Wahrscheinlichkeit zu den Typ 2-Zellen. Nur in den in vitro modifizierten, nicht aber in den frisch isolierten Monozyten waren Insulin, C-Peptid, Glukagon und GLUT-2 immunhistochemisch nachzu¬weisen. Mit zunehmender Kulturdauer dominierten stark adhärente Makrophagen die Kultur. Das aus ca. 5x106 Monozyten isolierte Insulin senkte den Blutzuckerspiegel diabetischer Mäuse innerhalb einer Stunde nach Injektion um 66,1±12,8 Prozent (n=5). Zum Vergleich: 170 pg Humaninsulin senkten den Blutzuckerspiegel um 84,2±8,4 Prozent (n=4). Insulin-negative Monozyten beeinflussten nicht den Blutzuckerspiegel diabeticher Mäuse. Zudem lassen erste elektronenmikroskopische Aufnahmen von in vitro modifizierten Monozyten Insulin-haltige Vesikel erkennen. Zum jetzigen Zeitpunkt ist gesichert, dass in vitro modifizierte Monozyten über biologisch aktives Insulin verfügen, das den Blutzuckerspiegel diabetischer Tiere senkt. Der Nachweis von C-Peptid deutet zudem darauf hin, dass es sich hierbei um de novo Insulin handelt. Dies bedeutet, dass das Insulin-Gen in den in vitro modifizierten Monozyten aktiv ist und sie Insulin mRNA exprimieren, die anschließend in Insulin translatiert wird. Der elektronenmikroskopische Nachweis Insulin-haltiger Granula deutet außerdem darauf hin, dass diese Zellen Insulin speichern können. Inwieweit sie jedoch auch zur Glukose-ab¬hängigen Insulin-Ausschüttung in der Lage sind, ist in weiteren Experimenten zu überprüfen.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind starke Suppressoren des Immunsystems. Für die immunsupressive Wirkung werden lösliche Faktoren propagiert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob neben den bekannten Sekretionsfaktoren stromaler Stammzellen wie RANK/RANKL/OPG, TNFα, IFNγ und verschiedene Interleukine, andere Sekretionsfaktoren eine immunmodulatorische Wirkung auf monozytäre Zellen haben. Als Sekretionsprodukt wurde hCyr61 untersucht, das im Überstand von mit TNFα behandelten humanen fetalen Osteoblasten (hFOB) nachgewiesen worden war. Das zur CCN-Familie gehörende Protein hCyr61 ist an der Angiogenese beteiligt, wird im Kallus während der Frakturheilung vermehrt exprimiert und hat, wie zwischenzeitlich nachgewiesen wurde, einen deutlichen Effekt auf die Differenzierung endothelialer Vorläuferzellen aus monozytären Zellen. In den hier beschriebenen Experimenten wurden sowohl monozytäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC), als auch THP1-Zellen auf die Veränderung der CD14-, 80-, 83- und 86- Expression unter Stimulation mit und ohne Il-4, GM-CSF und hCyr61 untersucht. Die Expressionsänderung wurde mittels konventioneller PCR, real-time PCR und FACS-Analyse untersucht. In allen drei Nachweismethoden zeigte sich ein Verlust typisch monozytärer Marker wie CD14 unter Stimulation mit hCyr61. Der Verlust an CD14 scheint bei PBMC deutlicher als bei THP1-Zellen, was möglicherweise durch die oben beschriebene endotheliale Differenzierung erklärt wird. THP1-Zellen befinden sich bereits in einer höheren Differenzierungsstufe, sodass sie ihr monozytäres Commitment nicht vollständig verlieren.