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Der brustgewebsspezifische Metabolismus des weiblichen Sexualhormons 17β-Estradiol (E2) spielt eine wichtige Rolle bei der Brustkrebsentstehung. In der Brust wird E2 durch die humanen Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CYP) Isoenzyme 1A1 (hCYP1A1) und 1B1 (hCYP1B1) zu 2-Hydroxy (2-OH) und 4-HO-E2 oxidiert und vorrangig durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) entgiftet. Bei unzureichender O-Methylierung können diese Catecholestrogene zu elektrophilen Chinonen oxidiert werden, welche mit der DNA reagieren und somit Mutationen induzieren können. Eine niedrige COMT-Aktivität, durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, könnte daher die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen beeinflussen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Hemmung der COMT-Aktivität auf die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen untersucht. Zu diesem Zweck wurden der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Test und der Mikrokern-Test eingesetzt. Die Untersuchungen erfolgten in kultivierten Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-Zellen) und in V79-Zellen, die mit hCYP1A1 transfiziert wurden. Begleitend zu den Mutagenitätsuntersuchungen wurde das Metabolitenprofil der Testsubstanzen anhand von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie bestimmt.
Nach Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 wurde dieses vollständig zu dessen Methylcatecholen umgesetzt, ab 2,5 µM hingegen war zusätzlich 2 HO-E2 im Medium nachweisbar. Demnach war die Hemmung der COMT-Aktivität bei der Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 vollständig und ab 2,5 µM partiell. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität war 2 Methoxyestradiol der Hauptmetabolit.
2-HO-E2 induzierte im Konzentrationsbereich 0,08 µM - 5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mutantenfrequenz im hprt-Lokus von V79-Zellen. Im Gegensatz hierzu induzierte 2 HO-E2 ab 2,5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, mindestens eine Verdreifachung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation, wobei dieser Effekt ohne Inhibierung der COMT-Aktivität stärker ausgeprägt war.
Über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich (5 - 40 µM) wurde 4 HO-E2 zu dessen beiden Methylcatecholen umgesetzt, wobei 4-Methoxyestradiol den größten Anteil der detektierten Verbindungen (≥ 86%) ausmachte. Nach der Behandlung mit 3,5-Dinitrocatechol waren keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar, weswegen von einer vollständigen Hemmung der COMT-Aktivität im gesamten getesteten Konzentrationsbereich auszugehen war.
4-HO-E2 induzierte über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich keine Genmutationen im hprt-Lokus. Erst nach Hemmung der COMT-Aktivität und Behandlung mit 20 µM 4 HO-E2 wurde eine Verdreifachung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität induzierte 4 HO E2 ab 20 µM eine Verdopplung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation.
Im Kulturmedium der V79 hCYP1A1-Zellen, die mit 0,1 und 1 µM E2 für bis zu drei Wochen behandelt wurden, machten über die gesamte Versuchsdauer E2 (> 86%) und Estron (> 10%, bezogen auf die Summe aller Peakflächen) den größten Anteil der detektierten Verbindungen aus. Wie erwartet, waren nach Hemmung der COMT-Aktivität keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar.
Die durchgehende, zwei- und dreiwöchige Behandlung mit jeweils 0,1 und 1 µM E2 bewirkte keine Induktion von Genmutationen im hprt-Lokus. Demgegenüber erhöhte sich die Mutantenfrequenz nach Hemmung der COMT-Aktivität und dreiwöchiger Behandlung mit 0,1 µM E2 um Faktor 4 im Vergleich zur Kontrollpopulation. Was die Mikrokerninduktion betrifft, so wurde nach 24-stündiger Inkubation mit 0,1 und 1 µM E2, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet.
Über die gesamte Dauer der Mutagenitätstests von E2 und dessen Catecholestrogenen unterschieden sich die Zellzyklusverteilung, die Wachstumskurven und die Koloniebildungsfähigkeit zum Zeitpunkt der Selektion, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, nicht statistisch signifikant von denjenigen der Kontrollpopulationen. Demnach war von einer sicheren Detektion von Mutationen im HPRT-Test und im Mikrokerntest auszugehen.
Zusammenfassend bestätigen die durchgeführten Untersuchungen, dass die zelluläre COMT-Aktivität eine essentielle Rolle zur Entgiftung mutagener Catecholestrogene spielt. Eine hundertprozentige Inhibierung der Aktivität dieses Enzyms führt zur Induktion von Genmutationen durch 4 HO-E2 in V79-Zellen ohne CYP-Aktivität und durch E2 in V79-Zellen, die hCYP1A1 exprimieren. Demnach könnte eine Reduktion der COMT-Aktivität durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, die Induktion von Genmutationen durch E2 und dessen Catecholestrogenen begünstigen.