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Die Infektion einer Zelle und die Virus-Ausbreitung von Zelle zu Zelle in infiziertem Gewebe oder in der Zellkultur ist abhängig von der Fähigkeit des Virus, die Fusion von Membranen zu induzieren und somit die natürliche Barriere zwischen einzelnen Zellen zu überwinden. Neben den viralen Glykoproteinen sind dabei Proteine in der Membran der Wirtszelle ausschlaggebend für einen erfolgreichen Ablauf dieser Fusionsprozesse. Kürzlich konnten wir mit CD9, einem Mitglied der Tetraspann-Transmembran-Proteinfamilie, ein zelluläres Oberflächenmolekül identifizieren, welches bei einer Infektion von Zellen mit CDV an diesen Fusionvorgängen beteiligt ist: Transfektion eines CD9-Expressionsplasmids in CD9-negative Zellen erhöht deren Infizierbarkeit und CD9-Antikörper inhibieren die Infektion von Zellkulturen mit CDV (OND). In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welcher Mechanismus hinter der Hemmung der CDV-Infektion durch CD9-Antikörper steht. Es besteht keine Korrelation zwischen der Expression von CD9 und der Virusbindung an Zellen besteht. Zudem konnte mit Antikörpern gegen CD9 die Bindung von CDV an Zellen nicht beeinträchtigt werden. Es konnte des weiteren kein unmittelbarer Effekt von CD9-Antikörpern auf die Virusaufnahme, sowie auf die virale mRNA- und Protein-Synthese festgestellt werden. Auch die posttranslationale Modifikation der viralen Proteine, wie die Spaltung des F0-Proteins in F1 und F2, und ihre Expression an der Zelloberfläche verläuft in Gegenwart von mAK K41 normal. Durch Antikörper gegen CD9 wird jedoch die Synzytienbildung in infizierten Zellkulturen stark gehemmt und die Freisetzung neuer Viruspartikel verringert. Untersuchungen der Fusion von uninfizierten mit persistent CDV-infizierten HeLa-Zellen zeigten, dass mAK K41 direkt die CDV-induzierte Zell-Zell-Fusion beeinflusst. Dabei wird aber kein Teilschritt des Fusionsprozesses, wie z.B. die Hemifusion, vollständig blockiert, da die Synzytienbildung selbst durch den Einsatz hoher Konzentrationen an mAK K41 nicht verhindert werden kann. Die Reduktion der Virustiter und der viralen mRNA-Mengen, die man etwa ab 18 Stunden nach Infektion in Gegenwart von mAK K41 beobachtet, entspricht der Reduktion, die man in Gegenwart eines fusionsinhibierenden Peptids (FIP) beobachtet. In beiden Fällen ist diese Reduktion höchstwahrscheinlich ein Sekundäreffekt der Inhibition der Infektionsaus-breitung durch Synzytienbildung.Bei CDV kann zwischen Stämmen, die Synzytien induzieren und Stämmen, die in infizierten Zellkulturen keine oder nur sehr geringe Plaquebildung zeigen, unterschieden werden. Diese Unterschiede basieren auf Sequenzunterschieden in den viralen Glykoproteinen H und F, die bei Morbilliviren für die Art des zytopatischen Effekts verantwortlich sind. Bei den Stämmen, die keine Synzytien induzieren, und dem Wildstamm A75/17 haben Antikörper gegen CD9 keinen inhibierenden Effekt auf die Infektion und es sind in Zellkulturen keine Unterschiede im Infektionsverlauf in An- oder Abwesenheit von mAK K41 zu beobachten. Die Hemmbarkeit einer CDV-Infektion durch CD9-Antikörper ist also abhängig von der Fähigkeit des jeweiligen Stammes Synzytien zu induzieren.Aus den vorliegenden Daten kann geschlossen werden, das CD9-Antikörper spezifisch die CDV-induzierte Zell-Zell-Fusion hemmen, nicht aber die Virus-Zell-Fusion. Im Gegensatz zur Virus-Zell-Fusion scheint die virusstammspezifischen Induktion der Zell-Zell-Fusion, neben dem zellulären Rezeptormolkül noch von weiteren Interaktionen der viralen Hüllproteine mit anderen Zelloberflächenmolekülen abhängig zu sein. Es ist anzunehmen, dass CD9 dabei direkt oder indirekt mit diesen Oberflächenmolekülen interagiert und somit Einfluß auf die Zellfusion hat. Bei der CDV-Infektion bewirken CD9-Antiköper eine Verzögerung der Synzytienbildung, während sie bei der NDV-Infektion zu einer verstärkten Synzytienbildung führen.Neben dem bereits bekannten fusionregulierenden Protein FRP-1/CD98 konnte so mit CD9 ein weiteres Membranprotein identfiziert werden, das an der Regulierung verschiedener viral-induzierter Zellfusionsvorgänge, aber auch an Zellfusionen im Zuge der Zelldifferenzierung und Entwicklung beteiligt ist. Die Regulierung der Fusion scheint aber bei CD9 und FRP-1 auf unterschiedlichen Mechanismen zu beruhen, da Antikörper gegen die beiden Membran-proteine bei NDV-infizierten Zellen die Zell-Zell-Fusion stimulieren, FRP-1-Antikörper aber keinen Einfluß auf die CDV-induzierte Zellfusion haben. Obwohl einige Interaktionspartner von CD9, wie z.B. Integrine, bekannt sind, konnte der Mechanismus der Regulation der Zell-Zell-Fusion durch CD9-Antikörper noch nicht aufgeklärt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten mal Unterschiede in der Virus-Zell- und Zell-Zell-Fusion bei Paramyxoviren auf und ist ein erster Schritt zu einem besseren Ver-ständnis des Unterschiedes zwischen zellulären und viralen Fusionsvorgängen.
Die Aktivierung von Transkriptionsfaktors NF-kB ist ein Charakteristikum viraler Infektionen, einschließlich der Infektion durch Influenza-A-Viren (Hiscott J. et al., 2001). Da die Expression vieler proinflammatorischer und antiviraler Zytokine, wie IFNb oder TNF-a durch NF-kB kontrolliert wird, hat sich ein Konzept entwickelt, welches besagt, dass NF-kB und sein übergeordneter Aktivator IKK wichtige Bestandteile der angeborenen, antiviralen Immunität im Kontext einer Infektion mit RNA-Viren sind (Chu WM. Et al., 1999). Im Gegensatz zu dieser weithin akzeptierten Ansicht, wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB für eine effiziente Influenzareplikation von großer Wichtigkeit ist. Auf einer molekularen Ebene wurde dies durch die NF-kB-abhängige virale Aktivierung des proapoptotischen Faktors TRAIL gezeigt, welcher die Virusvermehrung sowohl auto- als auch parakrin erhöht. Somit kann man sagen, dass NF-kB im Kontext einer Influenza-A-Virusinfektion sowohl proapoptotisch als auch proviral wirkt. Die Induktion der Apoptose ist ein weiteres, charakteristisches Merkmal, das man im Zusammenhang mit Virusinfektionen beobachten kann. Da die Rolle der Apoptose während einer Influenza-A-Virusinfektion noch unklar war, wurde diese Frage adressiert. Dabei wurde versucht mit einem wichtigen, virus-induzierten Apoptose-Effektor, nämlich Kaspase-3 zu interferieren. Überraschenderweise wurde die Influenzavermehrung in Anwesenheit eines Kaspase-3-Inhibitors stark negativ beeinflusst. Im Einklang mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Virustiter in Zellen, in denen XIAP überexprimiert wurde, rückläufig waren. Gegengleich führte Überexpression von Prokaspase-3 zu einem Titeranstieg. Mechanistisch scheint der Blockade der Virusvermehrung eine Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern zu Grunde zu liegen, die die Bildung von reifen Viruspartikel verhindert. Die Erklärung dürfte in der Aktivität von Kaspase-3 zu finden sein, die an dem Abbau von Kernporenkomplexproteinen in apoptotischen Zellen beteiligt ist und was in Folge die freie Diffusion viraler RNPs ermöglichen dürfte. Abschließend entwickelte sich aufgrund der vorliegenden Arbeit eine neue Hypothese über die Rolle des IKK-NF-kB-Signalweges, seinen Einfluss auf die Apoptoseregulation in Influenza-infizierten Zellen und der Auswirkung auf das Virus.
Die Rolle von bakteriellen DNA-Sequenzen (CpG) bei der Immuntherapie von retroviralen Infektionen
(2003)
Mit dieser Arbeit wird zum ersten Mal der therapeutische Einsatz von immunstimulativer DNA mit CpG-Motiv (CpG-ODN) bei einer akuten Virusinfektion beschrieben. Als experimentelles Modell wurde das Friend Virus (FV), ein muriner Retroviruskomplex, verwendet. Das FV kann in Mäusen eine tödlich verlaufende Erythroleukämie induzieren. Durch die Immuntherapie mit CpG-ODN in der akuten Phase einer FV-Infektion konnten 74% der Mäuse vor der Entstehung der Virus-induzierten Leukämie geschützt werden. Dieser Schutz ging einher mit der Reduktion der Viruslast im Blut und in der Milz der Tiere und wurde durch CpG-ODN induzierte FV-spezifische CD8+-Zellen vermittelt. FV-neutralisierende Antikörper und natürliche Killerzellen waren dagegen am CpG-ODN induzierten Schutz nicht beteiligt. Der Einsatz von CpG-ODN als Paraimmunisierung (unspezifische Immunisierung vor einer Infektion) verursachte hingegen einen schwereren FV-induzierten Leukämiever-lauf als in infizierten Mäusen ohne vorherige Behandlung. Die prophylaktische CpG-ODN Gabe führte sogar dazu, dass FV-resistente Mäuse empfänglich für eine FV-vermittelte Leukämie wurden. Der negative Effekt der prophylaktischen ODN-Behandlung wurde durch die CpG-ODN induzierte Proliferation der wichtigsten Ziel-zellen des FV (Ter119+- Erythrozytenvorläuferzellen und B-Zellen) verursacht. Durch die Stimulierung dieser Zellen konnte das Virus schneller replizieren, so dass das Immunsystem der Mäuse nicht mehr in der Lage war das Virus zu kontrollieren. Untersuchungen zum therapeutischen Einsatz von CpG-ODN in der späten, leukämi-schen Phase der Infektion zeigten, dass sich CpG-ODN auch für die Bekämpfung von FV-induzierten Tumorzellen einsetzen lassen. Das die CpG-ODN Behandlung von viralen Infektionen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen führen kann, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden. Die CpG-ODN Behandlung stellte einerseits eine effektive Immuntherapie gegen die FV-induzierte Erkrankung dar, andererseits konnte sie die Viruserkrankung auch verstär-ken. Essentiell für den Erfolg der ODN-Behandlung war der richtige Behandlungs-zeitpunkt nach Infektion. Da viele Virusinfektionen durch eine CD8+ CTL-Aktivität kontrolliert werden und CpG-ODN Virus-spezifische CTL Antworten verstärken, ist der Einsatz von CpG-ODN für Behandlungen von Virusinfektionen im allgemeinen sehr interessant. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte eine transkutane Vakzinierung (Impfung über die Haut) gegen Retrovirus-induzierte Erkrankungen etabliert werden. CpG-ODN dienten dabei als starkes Adjuvants zur Induktion einer zellulären Immunantwort. Für die Imp-fung wurden FV-spezifische T-Zell-Epitope (CTL- und T-Helferzell-Peptide) als Anti-gene eingesetzt. Die transkutane Immunisierung schützte Mäuse vor einer FV-induzierten Leukämie. Der durch die Vakzine vermittelte Schutz reichte jedoch nicht aus, um eine persistierende Infektion mit FV zu verhindern. Die Ergebnisse der im-munologischen Untersuchungen zeigten, dass der Impfschutz von FV-spezifischen CD8+-Zellen vermittelt wurde. Die Studie belegt, daß eine nicht invasive Impfung durchaus in der Lage ist, einen Schutz gegen eine Retrovirus-induzierte Erkrankung zu vermitteln.
Respiratorische Infektionen sind bei Kindern der Hauptgrund für eine ärztliche Konsultation. In den meisten Fällen werden sie durch virale Erreger ausgelöst. Häufig nachgewiesene respiratorische Viren sind RSV, Adenovirus und Influenza-Virus. In den letzten Jahren wurden weitere Viren als Auslöser von ARI erkannt, so auch die humanen Parechoviren (hPeV), welche zur Familie der Picornaviridae gehören. Um Daten über die Prävalenz, die vorherrschenden Genotypen sowie über die Epidemiologie und Klinik von hPeV-Infektionen in Deutschland zu erhalten, wurde eine Real-Time-PCR etabliert und validiert, um hPeV-RNA in klinischem Probenmaterial nachweisen zu können. Insgesamt wurden 800 NRS aus der Universitätskinderklinik Würzburg aus dem Zeitraum zwischen Januar 2002 und September 2005 untersucht. In 16 der untersuchten Proben ließ sich hPeV-RNA nachweisen (Prävalenz 2%). Von den nachgewiesenen hPeV ließen sich insgesamt 11 Proben als hPeV 1 identifizieren sowie jeweils eine Probe als hPeV 3, hPeV 4 und hPeV 6 einordnen. Alle Kinder waren unter fünf Jahre alt, 56% der Patienten waren weiblich. Die Isolate wurden vor allem in den Monaten zwischen November und März detektiert (n = 14), jedoch auch im April und Juni. Die Koinfektionsrate mit RSV, Adenovirus Parainfluenzaviren, Influenzaviren sowie hBoV und WUPyV lag bei 56%. Die Entlassdiagnose lautete bei zwei Kindern ‚Infekt der oberen Atemwege‘ und bei 14 Kindern ‚Infekt der unteren Atemwege‘. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei hospitalisierten Kindern mit akuten Atemwegsinfekten im Großraum Würzburg hPeV hauptsächlich im Alterssegment unter 2 Jahren vorkommt, hierbei vornehmlich der Genotyp hPeV 1. Insgesamt spielt hPeV jedoch bei viralen respiratorischen Infektionen bei Kindern eine eher untergeordnete Rolle. Obwohl die hPeV-Infektion im KIndesalter häufig ist führt sie nicht unbedingt zu einer Atemwegserkrankung oder einer Hospitalisierung.
Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind.
Das humanes WU Polyomavirus wurde im Jahr 2007 als ein neues Virus in Proben des Respirationstraktes beschrieben und gehört zur Familie der Polpymaviridae. Das Ziel der Arbeit war es, eine WUPyV-rea-time-PCR zu etablieren und zu evaluieren und mit dieser neuen Methode WUPyV-DNA in Nasenrachenskreten (NRS) zu detektieren und zu quantifizieren. Insgesamt wurden 1232 NRS von Patientin mit akuten respiratoischen Erkrankungen, die an der Universitätskinderklinik Würzburg im Zeitraum von Januar 2002 bis September 2005 und Januar 2007 bis July 2007 stationär behandelt worden waren, auf WUPyV-DNA getestet. Zusätzlich wurden 14 Serum- und 14 Stuhlproben von Kindern mit WUPyV-DNA-pos. NRS getestet. Mit der real-time PCR wurde WUPyV-DNA in 5,2 % der 1232 NRS detektiert. Der Viruslastmedian aller WUPyV-positiven NRS betrug 950 Kopien/m. Neben einigen sehr hohen Viruslasten (4,7 % > E9 Kopien/ml) wurden vor allem niedirge Viruslaten (51,6 % < 1000 Kopien/ml) mit der WUPyV-real-time PCR nachgewiesen. Es ergaben sich keine statistisch signifikanten Zusammenhänge zwischen der Viruslast und der Koinfektionen mit anderen respiratorischen Viren, mit klinischer Diagnose, mit dem Alter der infizierten Kinder und mit dem jahreszeitlichen Auftreten. In 3 der 14 Serum und 2 der 14 Stuhlproben konnte WUPyV-DNA detektiert werden. Virämische Kinder hatten tendenzen zu höhrer Viruslast im NRS.Weitere Studien sind notwendig um die pathogenetische Relevanz des WUPyV für den Menschen zu untersuchen. Die in dieser Arbeit etablierte real-time PCR zur WUPyV-Quantifizierung kann dabei zur Anwendung kommen.
Background: In principle, the elimination of malignancies by oncolytic virotherapy could proceed by different mechanisms - e.g. tumor cell specific oncolysis, destruction of the tumor vasculature or an anti-tumoral immunological response. In this study, we analyzed the contribution of these factors to elucidate the responsible mechanism for regression of human breast tumor xenografts upon colonization with an attenuated vaccinia virus (VACV). Methods: Breast tumor xenografts were analyzed 6 weeks post VACV infection (p.i.; regression phase) by immunohistochemistry and mouse-specific expression arrays. Viral-mediated oncolysis was determined by tumor growth analysis combined with microscopic studies of intratumoral virus distribution. The tumor vasculature was morphologically characterized by diameter and density measurements and vessel functionality was analyzed by lectin perfusion and extravasation studies. Immunological aspects of viral-mediated tumor regression were studied in either immune-deficient mouse strains (T-, B-, NK-cell-deficient) or upon cyclophosphamide-induced immunosuppression (MHCII+-cell depletion) in nude mice. Results: Late stage VACV-infected breast tumors showed extensive necrosis, which was highly specific to cancer cells. The tumor vasculature in infected tumor areas remained functional and the endothelial cells were not infected. However, viral colonization triggers hyperpermeability and dilatation of the tumor vessels, which resembled the activated endothelium in wounded tissue. Moreover, we demonstrated an increased expression of genes involved in leukocyte-endothelial cell interaction in VACV-infected tumors, which orchestrate perivascular inflammatory cell infiltration. The immunohistochemical analysis of infected tumors displayed intense infiltration of MHCII-positive cells and colocalization of tumor vessels with MHCII+/CD31+ vascular leukocytes. However, GI-101A tumor growth analysis upon VACV-infection in either immunosuppressed nude mice (MHCII+-cell depleted) or in immune-deficient mouse strains (T-, B-, NK-cell-deficient) revealed that neither MHCII-positive immune cells nor T-, B-, or NK cells contributed significantly to VACV-mediated tumor regression. In contrast, tumors of immunosuppressed mice showed enhanced viral spreading and tumor necrosis. Conclusions: Taken together, these results indicate that VACV-mediated oncolysis is the primary mechanism of tumor shrinkage in the late regression phase. Neither the destruction of the tumor vasculature nor the massive VACV-mediated intratumoral inflammation was a prerequisite for tumor regression. We propose that approaches to enhance viral replication and spread within the tumor microenvironment should improve therapeutical outcome.
Virale Reaktivierungen treten im Rahmen der Immundefizienz und Immunsuppression nach allogener Stammzelltransplantation häufig auf und können zu schwerwiegenden Komplikationen führen. Ziel dieser retrospektiven Studie war die Charakterisierung von viralen Reaktivierungen im ersten Jahr nach allogener Stammzelltransplantation, die Identifikation von Risikofaktoren sowie die Untersuchung des Einflusses viraler Reaktivierungen auf das Transplantationsoutcome. 107 pädiatrische allogene Stammzelltransplantationen im Zeitrahmen von Januar 2005 bis Dezember 2015 wurden in diesem Zusammenhang auf Infektionen mit dem Epstein-Barr Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), Humanen Herpesvirus 6 (HHV 6), Herpes simplex Virus (HSV), Varicella zoster Virus (VZV) und Adenovirus (ADV) untersucht.