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Ziel der vorliegenden Arbeit war eine vergleichende Analyse von verschiedenen immunologisch relevanten Parametern im Verlauf einer Masern-Erkrankung bzw. nach einer Masern-Vakzinierung im Hinblick auf ein Verständnis der Ursache für die mit einer Masern-Infektion einhergehende Immunsuppression. Dabei wurden Blutproben von Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten nach Auftreten des Exanthems bzw. nach der Impfung untersucht. Zunächst konnte in einer quantitativen Analyse aufgezeigt werden, dass im Rahmen der auftretenden Leukopenie, der prozentuale Anteil distinkter Zelltypen, wie B-, NK-, α/β- und γ/δ-T-Zellen, sowie Monozyten und dendritische Zellen (DCs), sowohl bei Patienten mit akuter Masern-Erkrankung, als auch nach einer Masern-Impfung weitgehend konstant blieb. Für eine Erfassung des Aktivierungsgrades von α/β- und γ/δ-T-Zellen wurde der jeweilige Anteil CD11a-, CD54-, CD69- und CD25-exprimierender CD3-positiver Zellen bei Masernpatienten und Impflingen bestimmt. Dabei ergab sich generell in allen o.g. Untersuchungen für γ/δ-T-Zellen auf der Basis distinkter Aktivierungsmarker ein höherer Prozentsatz positiver Zellen als für α/β-T-Zellen. Es konnte sowohl für α/β-T-Zellen, als auch für γ/δ-T-Zellen ein erhöhter Prozentsatz CD54 (ICAM-1)-exprimierender Zellen und ein deutlich geringerer Anteil CD69-exprimierender α/β-T-Zellen gezeigt werden. Diese Unterschiede blieben über den gesamten Zeitraum (d21 nach Vakzinierung bzw. post Exanthem) erhalten. Desweiteren konnte bei den γ/δ-T-Zellen von Masernpatienten für die CD11a-exprimierenden Zellen eine prozentuale Zunahme festgestellt werden; nicht jedoch bei Impflingen. Den regulatorischen CD4+/CD25+/CTLA-4+ T-Zellen werden suppressive Aktivitäten im Verlauf einer Immunreaktion zugeschrieben. Ein Vergleich der Proben von Masernpatienten in verschiedenen Infektionsstadien ergab, Anzeichen auf zunehmende Aktivität CD4+/CD25+/CTLA-4+ Treg-Zellen. Beim Vergleich der Akutpatienten und Impflinge bei der Produktion von Typ1 IFN im Rahmen der Immunreaktion zeigten die Ergebnisse, dass im Verlauf der Erkrankung die Mengen an Typ1 IFN allmählich abfielen, während sich nach Vakzinierung das Bild uneinheitlich darstellte. Beim Vergleich der Proliferationsfähigkeit der α/β- und der γ/δ-T-Zellen von Masernpatienten und Impflingen zeigte sich im Verlauf der Akuterkrankung eine deutliche Reduktion, während die Ergebnisse der Impflinge weitgehend unverändert bis progredient waren. Für die Ermittlung der Kapazität zur Produktion von inflammatorischen Zytokinen wurden isolierte Monozyten restimuliert und die Produktion von IL-6 mittels ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass die Monozyten von Impflingen im Vergleich zu Kontrollen mit einer erhöhten IL-6 Produktion reagierten. Dagegen war bei den Monozyten von Masern-Patienten die IL-6 Produktion insgesamt supprimiert. Insgesamt zeigen die Befunde, dass eine Reihe von Parametern im Verlauf der Masernerkrankung und nach einer Vakzinierung bemerkenswert unterschiedliche Reaktionsmuster aufweisen.
Die Infektion mit MV Wildtypvirus führt zu einer starken Immunsuppression und Sekundärinfektionen, die bei der Immunisierung mit einem attenuierten Vakzinestamm nicht auftreten. In vitro Studien zeigen, dass sowohl MV Wildtyp- als auch Impfstamminfizierte Zellen die Mitogen-induzierte Proliferation von humanen Blutlymphozyten inhibieren. Zur Bestätigung dieser Befunde im Baumwollrattenmodell wurde gezeigt, dass in vitro MV-infizierte Zellen die Proliferation der naiven Milzzellen hemmen und keine Unterschiede zwischen Wildtypen und Impfstämmen bestehen. Im Gegensatz dazu wurden nach intranasaler Infektion von Baumwollratten Unterschiede hinsichtlich der Proliferationsinhibition, Virusreplikation und Ausbreitung zwischen Wildtypvirus WTF und Impfstamm Edm gefunden. Nach intranasaler Infektion mit 105 TCID50 WTF war am Tag 4 die Proliferation bis zu 40% inhibiert. Bis zu 20 Tagen nach Infektion mit WTF wurde eine Proliferationsinhibition gemessen und das Virus in den drainierenden Lymphknoten bis Tag 4 nachgewiesen. Die intranasale Infektion mit Dosen von 103 TCID50 WTF bzw. mit 2-4x106 TCID50 Edm konnten im gleichem Maße die T-Zell- Proliferation hemmen. Somit war eine 1000fach niedrigere Dosis an WTF ausreichend, die gleiche hemmende Wirkung zu erzielen. Der gleiche Effekt wurde bei weiteren Wildtypstämmen (Bilthoven, ICB) und Impfstämmen gefunden. Eine Ursache für den unterschiedlich immunsuppressiven Effekt zwischen Wildtypen und Impfstämmen könnte die unterschiedliche Rezeptornutzung sein. Wildtypviren benutzen CD150 als Rezeptor und Impfstämme sowohl CD150 als auch CD46. Die Impfstämme wurden ursprünglich von Edm Wildtyp durch Passagierung auf Fibroblasten-Zellinien attenuiert und adaptierten an die CD46-Rezeptornutzung. Durch die dabei erfolgte Adaptation an CD46 wurde der Virus attenuiert. Dieses Phänomen konnte auch nach Passagierung eines Wildtypvirus auf verschiedenen Zelllinien gezeigt werden. Der auf lymphoiden Zellen passagierte Wildtyp WTFb und der auf Fibroblasten-Zellen WTFv passagierte haben unterschiedliches immunsuppressives Potential. Interessanterweise zeigte Edm-Wildtyp nach 9 Passagen auf Fibroblasten- Zellinien einen attenuierten Phänotyp im Baumwollrattenmodell. Allerdings revertierte dieser Virus bereits nach 3 Passagen in der Baumwollratte zu einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus. Die Untersuchung der rekombinanten Viren Edm (WTF H), Edm (WTF F) und Edm (WTF H+F) zeigte, dass Impfstämme, welche das Oberflächenprotein H von WTF anstelle des H-Proteins von Edm tragen, proliferationshemmend sind und sich im Organismus ausbreiten. Das F-Protein von Edm oder WTF hatte keinen Einfluß auf Immunsuppression und Virusausbreitung, Die Rückmutation in dem WTF H-Protein an der Aminosäure-Position 481 von Aspargin zu Tyrosin (N481Y) veränderte die Rezeptornutzung von CD46 auf CD150 und den Phänotyp von einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus zu einem nichtimmunsuppressiven, nicht-ausbreitenden Virus. Da die Aminosäureposition 481 einen starken Einfluß auf die Benutzung von CD46 oder CD150 ausübt, scheint somit das HProtein von WTF die immunsuppressive Wirkung und Virusausbreitung maßgeblich zu beeinflussen. Wie beim Menschen konnten in der Baumwollratte MV-infizierte Makrophagen nachgewiesen werden. Durch die Infektion mit einem GFP-MV wurde die Virusreplikation nachgewiesen, das Virus wurde aus Makrophagen rückisoliert und durch Kokultivierung mit Indikatorzellen die Ausprägung des zytopathischen Effektes fluoreszenzmikroskopisch beobachtet. Weitere Untersuchungen zeigten Unterschiede zwischen WTF und Edm-infizierten Makrophagen hinsichtlich der Proliferationsinhibition von Milzzellen. Der direkte Kontakt von Wildtyp WTFinfizierten Makrophagen hemmte die T-Zell-Proliferation. Dagegen wurde durch Edminfizierte Makrophagen keine T-Zell-Proliferationinhibition ausgelöst. Erklären läßt sich das möglicherweise mit dem unterschiedlichen Sekretionsprofil verschiedener Interleukine von WTF und Edm-infizierten Makrophagen, da bei WTF-infizierten Makrophagen eine Unterdrückung der Produktion von IL-12 gefunden wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die im Menschen beobachteten Unterschiede hinsichtlich Virusausbreitung und Immunsuppression zwischen Wildtypenund Impfstämmen mit den Befunden in der Baumwollratte übereinstimmen. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die Interaktion von MV H-Protein und den Rezeptoren mit der Immunsuppression und Virusausbreitung korreliert. Die Unterdrückung der Sekretion von IL-12 in Makrophagen aus der Baumwollratte könnte die Hypothese unterstützen, dass die Immunsuppression während der MV-Infektion durch eine fehlgeleitete Th2-Antwort begünstig wird.
Measles virus (MV) efficiently causes generalized immunosuppression which accounts to a major extent for cases of measles-asscociated severe morbidity and mortality. MV infections alter many functions of antigen presenting cells (APC) (dendritic cells (DCs)) and lymphocytes, yet many molecular targets of the virus remain poorly defined. Cellular interactions and effector functions of DCs and lymphocytes are regulated by surface receptors. Associating with other proteins involved in cell signaling, receptors form part of receptosomes that respond to and transmit external signals through dynamic interctions with the cytoskeleton. Alterations in the composition and metabolism of membrane sphingolipids have a substantial impact on both processes. In this review we focus on the regulation of sphingomyelinase activity and ceramide release in cells exposed to MV and discuss the immunosuppressive role of sphingomyelin breakdown induced by MV.
Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Domänen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivität der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. Übereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte Fähigkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antikörpern-beschichteten Objektträgern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Veränderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin–bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse stört. Trotz der morphologischen Veränderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Moleküls gestört ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollständig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung während der APC/T-Zell-Interaktion interferiert.
Das Masernvirus ist ein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae. Obwohl eine wirksame attenuierte Lebendvakzine erhältlich ist, bleiben Masern eine bedeutende virale Infektionserkrankung, die jährlich ca. eine Millionen Opfer fordert. Trotz einer während der Infektion induzierten protektiven und MV-spezifischen Immunantwort, ruft MV eine generelle Immunsuppression hervor, die zu einer Störung der zellulären Immunantwort führt. Diese Immunsuppression begünstigt bakterielle und virale Superinfektionen, was vor allem in unterentwickelten Ländern begleitet von mangelhafter ärztlicher Versorgung und Unternährung zu einem fatalen Ausgang einer MV-Infektion führt. Die molekularen Grundlagen der MV-assoziierten Immunsuppression sind noch nicht ausreichend verstanden. Dendritische Zellen (DC) gelten als ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Sie sind entscheidend an der Auslösung einer primären, adaptiven T-Zellantwort beteiligt und könnten im Falle einer MV-Infektion somit sowohl eine Rolle in der Induktion der protektiven Immunantwort als auch in der Etablierung der MV-assoziierten Immunsuppression spielen. Tatsächlich sind DC, die in vitro aus humanen Monozyten des peripheren Bluts (MoDC) generiert wurden, durch MV-Stämme infizierbar. Dabei zeigten sogenannte Wildtypstämme im Vergleich mit Vakzinestämmen eine schnellere Inektionskinetik einhergehend mit einem stärkeren zytopathischen Effekt (CPE) in den MoDC-Kulturen. Zudem konnte festgestellt werden, dass eine Infektion der MoDC-Kulturen zu einer Aktivierung und Ausreifung der Zellen führte, wobei es zur Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen kam. Neben Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a) konnte Typ I-Interferon (IFN) nachgewiesen werden, das die Expression des kostimulatorischen Oberflächenmoleküls CD86 induzierte. MV-Infektionen beeinflussten zudem die Sekretion von Interleukin 12 (IL-12), das als ein Schlüsselzytokin für die Polarisierung von T-Zellantworten angesehen wird. Infektionen mit einem prototypischen MV-Vakzinestamm (ED-B) führten unter allen Stimulationsbedingungen zu einer Hemmung oder deutlichen Reduktion der sezernierten Mengen IL-12. Eine Infektion mit dem Wildtypstamm WTF hingegen induzierte bereits ohne weitere Stimulation der MoDC IL-12 und verstärkte die Sekretion an IL-12 nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS). Trotz der zu beobachtenden Aktivierung der MoDC nach Infektion mit MV zeigten diese MoDC-Kulturen in einem funktionellen Test, einer allogenen mixed leukocyte reaction (MLR), keine Stimulation der T-Zellproliferation. Es zeigte sich, dass das Ausbleiben der T-Zellproliferation mit der Zahl an MV-infizierten MoDC korrelierte. MV-infizierte MoDC-Kulturen hemmten zudem die Proliferation von T-Zellkulturen, die mit Phytohämagglutinin (PHA) oder mit Staphylococcusenterotoxin A (SEA) aktiviert worden waren. Diese dominant hemmende Wirkung MV-infizierter MoDC-Kulturen unterblieb, wenn rekombinante MV eingesetzt wurden, denen die MV-spezifischen Glykoproteine H und F fehlten.
Eine Masernvirus- (MV) Infektion induziert eine effiziente virus-spezifische Immunantwort. Aber parallel erfolgt eine generelle Suppression immunologischer Funktionen, die sekundäre Infektionen ermöglichen und verstärken kann. Eine Lymphopenie und die ex vivo beobachtete stark verminderte proliferative Antwort peripherer Lymphozyten auf polyklonale oder antigenspezifische Aktivierung gilt als zentraler Befund für diese Immunsuppression. Bislang konnte in vitro keine Interferenz mit dem von den MV-Glykoproteinen generierten negativen Proliferationssignal nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Befunde zeigen jedoch, daß der MV induzierte Proliferationsarrest unter bestimmten Bedingungen in IPP/IL-2 (Isopentenylpyrophosphat und Interleukin-2) stimulierten gd T Zellen aufgehoben werden kann. Die Sensitivität der gd T Zellen gegenüber dem von den MV-Glykoproteinen vermittelten Signal gleicht der der konventionellen T Zellen. Dennoch reicht der Kontakt zu Monozyten und mit dem MV Vakzinestamm Edmonston (ED)-infizierten B Zellen oder dendritischen Zellen (DC) aus, eine ungehemmte Expansion der g9d2 T Zellen zu induzieren. Durch eine Interaktion mit ED-infizierten B Zellen und DC reagieren Monozyten wahrscheinlich mit einer Regulation stimulatorischer oder inhibitorischer Oberflächenmoleküle, die bei dem Kontakt mit gd T Zellen einen additiven Stimulus liefert, der das negative Proliferationssignal von MV neutralisiert. Auch Funktionen antigenpräsentierender Zellen (APC) scheinen differentiell durch MV-Stämme regulierbar zu sein. Die Erkennung von molekularen Mustern von Pathogenen über die Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLR) ist eine wichtiger Schritt bei der Aktivierung einer Immunantwort durch APCs. Nachdem die Fähigkeit, mikrobieller Produkte APC über TLRs zu aktivieren, dokumentiert ist, sind nur zwei virale Proteine bekannt, die mit TLR4 interagieren. Mithilfe transgener Reporterzellen konnte demonstriert werden, daß MV-Wildtypstämme, nicht aber Vakzinestämme humanes und murines TLR2, wahrscheinlich mit CD14 als Korezeptor, und nicht TLR4, aktivieren. Die TLR2 agonistische Eigenschaft konnte dem MV-Wildtyp Hämagglutininprotein (H) zugeordnet werden. Der Austausch einer einzigen Aminosäure im WTF-H, Asparagin zu Tyrosin an der Positon 481, welche in an CD46 adaptierten Vakzinestämmen zu finden ist, reichte für den Verlust TLR agonistischer Aktivität aus. Auch in humanen Monozyten konnten Viren, die das authentische WTF-H Protein enthielten, die Expression TLR responsiver Gene wie IL-6 induzieren. Gleichzeitig verursachte die Aktivierung der Monozyten durch die TLR Agonisten, einschließlich der Wildtyp MV, die Expression des allgemeinen MV Rezeptors CD150, der von ruhenden Monozyten nicht exprimiert wird. Die Spezifität der WTF-H und TLR2 Interaktion konnte durch blockierende Antikörper und TLR2-/- Mäuse, die kein IL-6 nach Stimulation mit WTF freisetzen, gezeigt werden. Die Fähigkeit von MV-Wildtypstämmen TLR2 zu aktivieren, könnte wesentlich zu der Immunaktivierung, aber auch zur Ausbreitung und Pathogenese der Infektion beitragen und die Attenuierung von Vakzinestämmen erklären. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Hinweise auf eine MV-stammspezifische Aktivierung angeborener Immunantworten, welche die adaptive Immunität modulieren können.