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Identifizierung und Strukturaufklärung von Anthocyanen und ihrer Metabolite erfolgten mit Hilfe der mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion-Elektro-spray-Tan¬dem¬massen¬spektrometrie (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Quantitative Analysen wurden via HPLC-DAD durchgeführt. Die hierzu erforderlichen Referenzverbindungen wurden mittels präparativer HPLC aus Heidelbeeren isoliert (Reinheit zwischen 85,8% und 99,4%). Der Gehalt an Anthocyanen in den untersuchten Heidelbeerfrüchten lag bei 6 g/kg. Bezüglich der mengen¬mäßigen Verteilung dominierten Delphinidin- und Cyanidin¬glykoside vor den Glykosiden von Malvidin, Petunidin und Peonidin. Als konjugierte Zucker¬reste kamen vor allem Glukose und Galaktose vor, der Gehalt an Arabinosiden war weit geringer. Bei oraler Aufnahme erfolgt ein erster Kontakt der Anthocyane mit Speichel. Daher wurde dessen Wirkung auf die Heidelbeeranthocyane in ex vivo-Studien über einen (unphysio-logisch langen) Zeitraum von bis zu 30 Minuten untersucht. Dabei konnte wurde ins-besondere der Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität der Anthocyane aufgezeigt werden. Zur Simulation des Verhaltens von Anthocyanen im Magen wurden die einzelnen Heidelbeeranthocyane mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Hier erwiesen sich alle untersuchten Verbindungen als stabil. Die anschließend von uns mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführten Studien zeigten, dass die Anthocyane unterschiedlich starken Modifizierungen unterlagen. Unter den schwach alkalischen Bedingungen wurden vor allem die Glykoside des Delphinidins schnell abgebaut, aber auch die übrigen Anthocyane erwiesen sich unter diesen Bedingungen als nicht stabil; nach 24 h war kein Anthocyan mehr nachweisbar. Um die Metabolisierungsvorgänge der Anthocyane im Dünn- und Dickdarm zu untersuchen, wurden ex vivo-Inkubationen jeweils mit frischem Ileo- bzw. Kolo¬stoma-beutel¬inhalt durchgeführt. Während die Abbaugeschwindigkeit in der ilealen Flüssigkeit vor allem von der pH-Stabilität des Aglykons abhänig war, konnten im Dickdarm einzig die Arabinoside nach einer Stunde noch alle in geringen Konzentrationen identifiziert werden. Die meisten Glukoside und Galaktoside waren zu diesem Zeitpunkt schon vollständig abgebaut. Da im Darm von einer hydrolytischen Spaltung der Anthocyane in Anthocyanidin und Zucker ausgegangen wird, wurde die Metabolisierung von Anthocyanidinen unter physio-logischen pH-Bedingungen untersucht. Neben der jeweiligen Spaltung in das Benzoe¬säure-derivat des B-Ringes sowie Phloroglucinessigsäure traten verschiedene Poly¬merisierungs¬-produkte auf, deren Strukturen nicht aufgeklärt werden konnten. In einer weiteren Versuchsreihe wurde die renale Ausscheidung von Anthocyanen bei Ileostomieprobanden nach oraler Applikation von 300 g Heidelbeeren über einen Zeitraum von acht Stunden untersucht. Es zeigte sich, dass ein Stoma des terminalen Ileums keinen Einfluss auf die Absorption und Metabolisierung der Anthocyane hatte. Die Bilanzierung der Anthocyane im Urin erfolgte als Äquvalente von Malvidin-3-O-glukosid, da nicht alle Anthocyanmetabolite zur Verfügung standen. Der Zeitpunkt der maximalen renalen Anthocyanausscheidung sowie die Menge der ausgeschiedenen Anthocyane waren starken interindividuellen Schwankungen unterworfen. Das Aus¬sscheidungs¬maximum (tmax) lag zwischen 0,5 und zwei Stunden. Bei der ausge¬schiedenen Menge wurden Werte zwischen 0,007% und 0.019% der auf¬ge¬nommenen Anthocyane ermittelt. Aufgrund der literaturbekannten Unterschiede zwischen den in Serum und Urin gefunden Anthocyanmengen ist davon auszugehen, dass es nach Anthocyanverzehr zu Inter-aktionen mit Proteinen in Blut oder Geweben kommt. Mittels Blutfraktionierung wurde das humane Serumalbumin (HSA) als wichtigster Bindungspartner der Anthocyane im Blut identifiziert. Anhand spektroskopischer Methoden war es möglich, die Bindungs¬parameter zu berechnen. Als Bindungsort wurde der hydrophile Eingang der lipophilen Warfarin-Bindungstasche in der Subdomäne IIA des HSA-Moleküls mittels "molecular modelling" identifiziert. Nasschemische Untersuchungen ergaben, dass die Bindung der Anthocyane an HSA diese vor ihrem pH-abhängigen Abbau schützt. Eine signifikante Herab¬setzung der chemischen Abbaugeschwindig¬keit konnte auch für bovines Serumalbumin beobachtet werden. Diese Erkenntnis ließ sich auf andere, mit dem HSA-Molekül nicht strukurverwandte lebensmittelrelevante Albumine übertragen. So zeigten Anthocyane große Stabilität in Milch und Eiklar, wobei die Stabilisierung auf eine Wechselwirkung mit den Proteinen Laktalbumin und Ovalbumin zurückgeführt werden konnte. Die in dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse hinsichtlich Absorption, Metabolisierung und systemischer Verfügbarkeit im menschlichen Organismus leisten einen Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkungen von Anthocyanen. Die neuen Erkenntnisse der Protein¬bindung sind vor allem für die Bewertung der Verfügbarkeit der Anthocyane in humanem Gewebe relevant.
Komplexstrukturen können über NMR-Experimente aufgeklärt werden, die intermolekulare Wechselwirkungen über den Raum detektieren können. Meist kommen dabei NOE- bzw. ROE-Experimente und Weiterentwicklungen dieser Sequenzen zum Einsatz. Auch mit einfachen Versuchen, wie der Bestimmung der Veränderung der chemischen Verschiebungen bei Komplexierung, lassen sich wertvolle Strukturinformationen gewinnen. Durch die Bindung eines Liganden an ein Makromolekül ändern sich viele NMR-spezifische Parameter des Liganden. Dazu gehören NMR-Relaxationszeiten und Diffusionskoeffizienten mit deren Hilfe sich Dissoziationskonstanten der Komplexe ermitteln lassen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Möglichkeiten der Identifizierung und Charakterisierung von Ligand-Makromolekül-Interaktionen mittels NMR-Spektroskopie. Drei unterschiedliche Fragestellungen wurden bearbeitet. Einfluss von Harnstoff auf beta-Cyclodextrin-Einschlusskomplexe mit Dipeptiden: Bei kapillarelektrophoretischen Enantiomerentrennungen von Dipeptiden mittels beta-Cyclodextrin kommen häufig sehr hohe Konzentrationen an Harnstoff zum Einsatz, um die Wasserlöslichkeit des beta-CD zu verbessern. Dabei wird die eventuelle Beteiligung des Harnstoffs am Komplex oftmals außer Acht gelassen. Durch den Einsatz unterschiedlichster NMR- und Simulations-Techniken konnte die Beteiligung des Harnstoffs an dem Komplex untersucht und aufgeklärt werden. Relaxationsstudien von Fluorchinolonen mit Micrococcus luteus: Ziel dieser Versuchsreihe war es, anhand von longitudinalen und transversalen Relaxationsmessungen Einblick in das Bindungsverhalten von Fluorchinolonen (Gyrasehemmer) an Bakterienzellen zu erhalten. Mittels der Bestimmung von selektiven 1H-T1-Zeiten in Abhängigkeit des Antibiotikum/Bakterien-Verhältnisses konnten Dissoziationskonstanten der untersuchten Pharmaka an die Bakterienzelle ermittelt werden. Desweiteren wurden 19F-Spin-Spin-Relaxationsexperimente durchgeführt. Proteinbindungsstudien von Gyrasehemmern an BSA: Durch die Bindung von Fluorchinolonen an bovines Serumalbumin ändern sich die scheinbare Molekülmasse und der hydrodynamische Radius des Arzneistoffs stark. Durch selektive T1-Relaxationsmessungen konnten für drei Gyrasehemmer mit unterschiedlichen Proteinbindungseigenschaften die jeweiligen Dissoziationskonstanten an das Albumin ermittelt werden. Eine weitere Möglichkeit Dissoziationskonstanten zu bestimmen war es, Diffusionskoeffizienten bei unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen zu bestimnmen. Über die Ermittlung sogenannter „Affinitätsindices“ war es möglich, die Stärke der Proteinbindung zu charakterisieren. Um den Effekt unterschiedlicher Korrelationszeiten verschiedener Kerne auszumitteln, wurde eine Normalisierung dieser Indices durchgeführt. Auch die Werte dieser Affinitätsindices gaben die Stärke der Proteinbindung der unterschiedlichen Antibiotika sehr gut wider.
A large number of metabolic waste products accumulate in the blood of patients with renal failure. Since these solutes have deleterious effects on the biological functions, they are called uremic toxins and have been classified in three groups: 1) small water soluble solutes (MW < 500 Da), 2) small solutes with known protein binding (MW < 500 Da), and 3) middle molecules (500 Da < MW < 60 kDa). Protein bound uremic toxins are poorly removed by conventional hemodialysis treatments because of their high protein binding and high distribution volume. The prototypical protein bound uremic toxins indoxyl sulfate (IS) and p-cresyl sulfate (pCS) are associated with the progression of chronic kidney disease, cardiovascular outcomes, and mortality of patients on maintenance hemodialysis. Furthermore, these two compounds are bound to albumin, the main plasma protein, via electrostatic and/or Van-der-Waals forces. The aim of the present thesis was to develop a dialysis strategy, based on the reversible modification of the ionic strength in the blood stream by increasing the sodium chloride (NaCl) concentration, in order to enhance the removal of protein bound substances, such as IS and pCS, with the ultimate goal to improve clinical patient outcomes. Enhancing the NaCl concentration ([NaCl]) in both human normal and uremic plasma was efficient to reduce the protein bound fraction of both IS and pCS by reducing their binding affinity to albumin. Increasing the ionic strength was feasible during modified pre-dilution hemodiafiltration (HDF) by increasing the [NaCl] in the substitution fluid. The NaCl excess was adequately removed within the hemodialyzer. This method was effective to increase the removal rate of both protein bound uremic toxins. Its ex vivo hemocompatibility, however, was limited by the osmotic shock induced by the high [NaCl] in the substituate. Therefore, modified pre-dilution HDF was further iterated by introducing a second serial cartridge, named the serial dialyzers (SDial) setup. This setting was validated for feasibility, hemocompatibility, and toxin removal efficiency. A better hemocompatibility at similar efficacy was obtained with the SDial setup compared with the modified pre-dilution HDF. Both methods were finally tested in an animal sheep model of dialysis to verify biocompatibility. Low hemolysis and no activation of both the complement and the coagulation systems were observed when increasing the [NaCl] in blood up to 0.45 and 0.60 M with the modified pre-dilution HDF and the SDial setup, respectively. In conclusion, the two dialysis methods developed to transitory enhance the ionic strength in blood demonstrated adequate biocompatibility and improved the removal of protein bound uremic toxins by decreasing their protein bound fraction. The concepts require follow-on clinical trials to assess their in vivo efficacy and their impact on long-term clinical outcomes.
Furan was recently found to be present in a variety of food items that undergo heat treatment. It is known to act as a potent hepatotoxin and liver carcinogen in rodents. In a 2-year bioassay, chronic furan administration to rats was shown to cause hepatocellular adenomas and carcinomas and very high incidences of cholangiocarcinomas even at the lowest furan dose tested (2.0 mg/kg bw). However, the mechanisms of furan-induced tumor formation are poorly understood. Furan is metabolized by cytochrome P450 (CYP) enzymes, predominantly CYP2E1, to its major metabolite cis-2-butene-1,4-dial (BDA). BDA is thought to be the key mediator of furan toxicity and carcinogenicity and was shown to react with cellular nucleophiles such as nucleosides and amino acid residues in vitro. It is well known that covalent protein binding may lead to cytotoxicity, but the cellular mechanisms involved remain to be elucidated. Since covalent binding of reactive intermediates to a target protein may result in loss of protein function and subsequent damage to the cell, the aim of this study was to identify furan target proteins to establish their role in the pathogenesis of furan-associated liver toxicity and carcinogenicity. In order to identify target proteins of furan reactive metabolites, male F344/N rats were administered [3,4-14C]-furan. Liquid scintillation counting of protein extracts revealed a dose-dependent increase of radioactivity covalently bound to liver proteins. After separation of the liver protein extracts by two-dimensional gel electrophoresis and subsequent detection of radioactive spots by fluorography, target proteins of reactive furan intermediates were identified by mass spectrometry and database search via Mascot. A total of 61 putative target proteins were consistently found to be adducted in 3 furan-treated rats. The identified proteins represent - among others - enzymes, transport proteins, structural proteins and chaperones. Pathway mapping tools revealed that target proteins are predominantly located in the cytosol and mitochondria and participate in glucose metabolism, mitochondrial β-oxidation of fatty acids, and amino acid degradation. These findings together with the fact that ATP synthase β subunit was also identified as a putative target protein strongly suggest that binding of furan reactive metabolites to proteins may result in mitochondrial injury, impaired cellular energy production, and altered redox state, which may contribute to cell death. Moreover, several proteins involved in the regulation of redox homeostasis represent putative furan target proteins. Loss of function of these proteins by covalent binding of furan reactive metabolites may impair cellular defense mechanisms against oxidative stress, which may also result in cell death. Besides the potential malfunction of whole pathways due to loss of functions of several participating proteins, loss of function of individual proteins which are involved in various cellular processes such as transport processes across the mitochondrial membranes, cell signaling, DNA methylation, blood coagulation, and bile acid transport may also contribute to furan-induced cytotoxicity and carcinogenicity. Covalent binding of reactive metabolites to cellular proteins may result in accumulation of high amounts of unfolded or damaged proteins in the endoplasmic reticulum (ER). In response to this ER stress, the cell can activate the unfolded protein response (UPR) to repair or degrade damaged proteins. To address whether binding of furan reactive metabolites to cellular proteins triggers activation of the UPR, semiquantitative PCR and TaqMan® real-time PCR were performed. In the case of UPR activation, semiquantitative PCR should show enhanced splicing of X-box binding protein-1 (XBP1) mRNA (transcription factor and key regulator of the UPR) and TaqMan® real-time PCR should determine an increased expression of UPR target genes. However, our data showed no evidence for activation of the UPR in the livers of rats treated either with a single hepatotoxic dose or with a known carcinogenic dose for 4 weeks. This suggests either that furan administration does not induce ER stress through accumulation of damaged proteins or that activation of the UPR is disrupted. Consistent with the latter, glucose-regulated protein 78 (GRP78), identified as a target protein in our study, represents an important mediator involved in activation of the UPR whose inhibition was shown to impair induction of the UPR. Thus, adduct formation and inactivation of GRP78 by furan metabolites may disturb activation of the UPR. In addition to impaired activation of UPR, protein repair and degradation functions may be altered, because several proteins involved in these processes also represent target proteins of furan and thus may show impaired functionality. Taken together...
Das Ausmaß der Proteinbindung eines Arzneistoffs hat Auswirkungen auf eine Vielzahl pharmakokinetischer Parameter wie z.B. das Verteilungsvolumen, die Metabolisierung oder Ausscheidung. Da nur der freie, ungebundene Anteil eines Arzneistoffs durch bio-logische Membranen diffundieren kann, ist dieser direkt für die pharmakologische Wirkung verantwortlich. Lediglich diese ungebundenen und damit frei beweglichen Arzneistoffmoleküle sind also in der Lage, an Rezeptoren zu binden und damit einen Effekt auszulösen. Je größer der ungebundene Anteil eines Arzneistoffs ist, desto größer kann auch der Effekt sein, den er zu bewirken vermag. Wird nun diese freie Konzentration verändert, so kann sich demzufolge die Wirkintensität des Arzneistoffs verändern. Daraus folgt, dass die Kenntnis über die Proteinbindung speziell für die Dosisfindung eines Arzneistoffs unerlässlich ist. Diese Zusammenhänge veranschaulichen, welche Bedeutung das Ausmaß der Proteinbindung eines Arzneistoffs hat. Für die Bestimmung der Proteinbindung existiert eine Vielzahl von Methoden. Neben der klassischen Gleichgewichtsdialyse werden vor allem Ultrafiltrationstechniken angewendet. Neuere Verfahren stellen verschiedenste kapillarelektrophoretische Methoden dar. Allen Verfahren ist gemein, dass es sich um In-vitro-Methoden handelt. Als einzige In-vivo-Methode hat sich die Mikrodialyse etabliert. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Bestimmungsmethode für das Ausmaß der Proteinbindungen stellt eine kontinuierliche Variante der Ultrafiltration dar. Mit Hilfe des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es im möglich, mit einem einzigen Experiment Proteinbindungen über einen großen Bereich verschiedener Arzneistoff-Protein-Verhältnisse zu berechnen. Dadurch wird die Bestimmung schneller und auch kostengünstiger. Zusätzlich wurde dieses Verfahren teilweise automatisiert, d.h. die Versuche werden programmgesteuert durchgeführt und ein manuelles Eingreifen ist nur noch an wenigen Stellen eines Versuches notwendig. Die Messanlage zur kontinuierlichen Ultrafiltration wurde nach dem Vorbild der Anlage von Oehlmann aufgebaut und im Zuge dessen fortentwickelt. Herzstück ist die Messzelle aus Plexiglas. Sie besteht aus einem Ober- und einem Unterteil. In diesem befindet sich eine Vertiefung für die Rührscheibe. Beim Zusammenbau werden zwischen die beiden Teile die Filterunterstützung und eine Ultrafiltrationsmembran gelegt. Die Ultrafiltrationsmembran hält hierbei aufgrund ihrer Trenngrenze die Proteinmoleküle in der Messzelle zurück und lässt nur freie Arzneistoffmoleküle durch. Ein Dichtungsring sorgt dafür, dass die Zelle, nachdem sie in einem Gestell fixiert wurde, nach außen hin dicht abschließt. Während eines Versuches werden abwechselnd Arzneistofflösung und reine Pufferlösung durch die Messzelle gepumpt. Am Auslass der Ultrafiltrationszelle wird die Absorption gemessen, die zu Absorptions-Zeit-Diagrammen führen. Wird nun der gleiche Versuch durchgeführt, nachdem eine Proteinlösung in die Messzelle injiziert wurde, verschiebt sich diese Kurve aufgrund der Wechselwirkung zwischen Arzneistoff und Proteinlösung nach rechts. Die Fläche zwischen diesen beiden Kurven kann als Maß für die Proteinbindung herangezogen werden. Für die Auswertung der Versuche wird aus den Messdaten errechnet, wie viel Arzneistoff sich zu jedem Zeitpunkt des Versuchs in der Messzelle befunden hat und wie viel ungebunden vorlag und damit am Detektor messbar ist. Da die Konzentration an Arzneistoff in der Messzelle im Laufe eines Versuches kontinuierlich gesteigert wird, erhält man Bindungsdaten über einen weiten Bereich von Arzneistoff-Protein-Verhältnissen. In dieser Arbeit wurden sowohl Versuche mit Rinderserumalbumin (BSA) als auch mit humanem Serumalbumin (HSA) durchgeführt. Die Standardabweichungen der bestimmten Proteinbindungswerte steigen mit fallender Proteinbindung. Damit sind sie nach außen hin neutral und ihre Löslichkeit sinkt. Wie die Ergebnisse zeigen, konnte dennoch das Ausmaß der Proteinbindung für eine Reihe von Fluorochinolonen bestimmt werden. Zusätzlich wurden mit dem Oxazolidinon Linezolid und dem Ketolid Telithromycin weitere Antibiotika vermessen. Die Proteinbindungen aller untersuchten Arzneistoffe gegenüber HSA stimmen mit Daten aus der Literatur überein. Wie bereits erwähnt lassen sich hierbei kleine Abweichungen sowohl mit unterschiedlichen Bestimmungsmethoden als auch mit verschiedenen eingesetzten Proteinen erklären. Die Literaturdaten geben meist die Plasmaproteinbindung eines Arzneistoffes wider und die Messungen in der vorliegenden Arbeit wurden allesamt mit Albumin, sei es vom Mensch oder Rind, durchgeführt. Da jedoch neben dem Albumin auch noch weitere Bestandteile des Plasmas mit den Arzneistoffmolekülen wechselwirken können, sind unterschiedliche Proteinbindungen zu erwarten.
Bestimmung der Plasmaproteinbindung von niedrig affinen Liganden am Beispiel der Ephedra-Alkaloide
(2021)
Zur Bestimmung der Bindungsaffinität von Liganden zu den Plasmaproteinen, insbesondere Albumin, wurden über die Jahre zahlreiche Methoden entwickelt. Die Grundlage dieser Arbeit war die Bestimmung der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide unter Verwendung einzelner dieser etablierten Methoden. Aufgrund ihres Anwendungsgebiets als Notfallmedikation bei Anästhesie-bedingter Hypotonie und den damit verbundenen Anforderungen an die Pharmakokinetik, sollten die Ephedra-Alkaloide niedrig-affine Liganden der Plasmaproteine darstellen. In der Literatur und in vorhergehenden Arbeiten wurden für die Ephedra-Alkaloide jedoch sehr unterschiedliche, teilweise der Indikation widersprechende Affinitäten bestimmt. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide weiter untersucht und die Affinität zu Albumin bzw. anderen Plasmaproteinen im humanen Serum bestimmt werden. Neben der Affinität sollte auch die Stereoselektivität der Bindung genauer betrachtet werden, die bei der Bindung vieler Wirkstoffe eine Rolle spielt. Als Referenzmethode diente die kontinuierliche Ultrafiltration, die auch schon bei Hörst verwendet wurde.
Folgende Schlussfolgerungen konnten aus den Ergebnissen dieser Arbeit gezogen werden:
1) Die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration zeigten, dass die Ephedra-Alkaloide, Ephedrin und Pseudoephedrin, ein nur geringes Ausmaß an Plasmaprotein-bindung von 4 – 9 % gegenüber bovinem und humanem Serumalbumin zeigen. Eine deutlich höhere Plasmaproteinbindung von 19 – 37 % konnte hingegen bei der Verwendung von humanem Serum bestimmt werden. Die Affinität von Pseudoephedrin war dabei jeweils geringer als die von Ephedrin.
2) Diese Ergebnisse mit humanem Serum und die Tatsache, dass Albumin vorwiegend saure Stoffe bindet, legen nahe, dass die Ephedra-Alkaloide vermehrt an andere Plasmaproteine in Serum binden. Erste Messergebnisse mit saurem α1 Glykoprotein bestätigen diese Vermutung.
3) Eine Stereoselektivität konnte nur in geringem Maß bei (+) Ephedrin beobachtet werden, wobei der Unterschied nur im Serum signifikant ist. Pseudoephedrin dagegen zeigte keinerlei Stereoselektivität. Diese Beobachtung passt zu den Schlussfolgerungen der Pfeiffer‘schen Regel zur Stereoselektivität einer Bindung.
4) Andere Sympathomimetika mit einer zusätzlichen Phenolgruppe im Molekül zeigen eine ähnlich niedrige Affinität zu Albumin von ca. 10 %. Eine zusätzliche Phenolgruppe scheint die sauren Eigenschaften des Liganden nicht ausreichend zu erhöhen, um die Affinität zu Albumin signifikant zu steigern.
5) Das tertiäre Kohlenstoffatom am Stickstoff des Ephedrins scheint in gewisser Weise an der Bindung zu Albumin beteiligt zu sein. Sympathomimetika mit einer zusätzlichen Methylgruppe an diesem Kohlenstoffatom, wie Ephedrin, Pseudoephedrin und Oxilofrin, zeigen eine größere Streuung der Messergebnisse. Eine zusätzliche Methylgruppe in dieser Position scheint die Bindung daher sterisch zu hindern.
6) Die Ergebnisse der diskontinuierlichen Ultrafiltration bestätigen weitestgehend die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration
7) Eine Bestimmung des Ausmaßes der Plasmaproteinbindung von niedrig-affinen Stoffen ist mit den anderen orthogonalen Methoden ACE, NMR und iTC nicht möglich. Diese drei verwendeten Methoden trennen nicht wie die klassischen Methoden den gebundenen vom ungebundenen Wirkstoff, sondern beruhen auf einer Veränderung bestimmter Messparameter: bei der ACE die Migrationszeit, bei der NMR-Spektroskopie die chemische Verschiebung der Signale bzw. der Diffusionskoeffizient und bei der iTC die frei werdende Bindungswärme. Bei allen drei Methoden war die Änderung der Messgröße aufgrund der niedrigen Plasmaproteinbindung zu gering, um auswertbar zu sein.
8) Eine Störgröße bei die orthogonalen Methoden war vielfach auch das Albumin selbst bzw. dessen Eigenschaften. Bei der Affinitäts-Kapillarelektrophorese sind physiologische HSA-Konzentrationen wegen des starken Basislinienrauschens nicht messbar. Zudem bewirkt der Albuminzusatz im Trennpuffer eine Viskositätsänderung, die den EOF verlangsamt und so die Messung stört. Bei der NMR-Spektroskopie können wegen der Überlagerung der Signale durch die breiten Albuminbanden weder Veränderungen in der chemischen Verschiebung noch des Diffusionskoeffizienten zuverlässig bestimmt werden. In der iTC erschwerte die Schaumbildung der Lösung, die durch die Oberflächenaktivität des Albumins verursacht wird, die Messung.
In dieser Arbeit konnte somit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide mit verschiedenen Methoden erfolgreich bestimmt werden. Damit bestätigte diese Arbeit, dass die Ephedra-Alkaloide, wie deren Indikation vermuten lässt, zu den niedrig affinen Liganden des Albumins zählen. Um genauer eingrenzen zu können durch welche Plasmaproteine im Blutserum die Ephedra-Alkaloide transportiert werden, sollten die Untersuchungen zum sauren α1-Glykoprotein fortgesetzt und gegebenenfalls durch weitere Bestimmungen mit anderen Plasmaproteinen ergänzt werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben auch gezeigt, dass viele der unzähligen Methoden zur Untersuchung der Plasmaproteinbindung bei der Bestimmung von niedrig affinen Liganden ihre Grenzen haben. Nach wie vor sind zur Bestimmung einer niedrigen Bindungsaffinität weiterhin die klassischen Methoden, wie die kontinuierliche Ultrafiltration, Mittel der Wahl. Nicht zuletzt deshalb erfreuen sich diese Methoden auch heute noch großer Beliebtheit.
Aspekte der Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung mittels kontinuierlicher Ultrafiltration
(2013)
Die Plasmaproteine dienen dem Körper u.a. als Transportproteine. Dem Serumal-bumin kommt hierbei die größte Bedeutung zu. Aufgrund seiner Aufgabe weist es eine Reihe unterschiedlicher Bindungsstellen für eine Vielzahl unterschiedlichster Liganden auf, wobei die Bindung von Substanzen sowohl an spezifischen Stellen als auch unspezifisch erfolgen kann. Das Ausmaß dieser Bindungen hat Einfluss auf andere pharmakokinetische Parameter, wie die Bioverfügbarkeit und die Elimination eines Arzneistoffes. Treten mehrere Stoffe in Wechselwirkung mit dem Albumin, so können sich diese gegenseitig in ihrer Bindung beeinflussen. Das Ausmaß der Beeinflussung ist von der Höhe der Bindung der einzelnen Stoffe und dem zugrunde liegenden Bindungsmechanismus abhängig. Die klinische Relevanz der Beeinflussung hängt von der therapeutischen Breite und von zusätzlich auftretenden Wechselwirkungen, der Substanzen wie z.B. wechselseitige Inhibition der Stoffwechselenzyme der Substanzen ab. Für die experimentelle Bestimmung der Proteinbindung stehen eine Reihe von Me-thoden zur Verfügung, die sich im Messprinzip, dem apparativen Aufwand und der Simulation der physiologischen Bedingungen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde die kontinuierliche Ultrafiltration verwendet. Diese stellt die Bedingungen im Körper nach und ermöglicht die Bindungskinetik besser zu betrachten als andere Verfahren, da durch die Titration des Albumins mit der Arzneistofflösung die Wechselwirkung zwischen Arzneistoff und Protein über einen breiten Konzentrationsverlauf beobachtet werden. Die Methode wurde von Heinze etabliert, von Albert weiterentwickelte und jetzt opti-miert. Durch die Konstruktion neuer Messzellen sowie der Entwicklung eines neuen Puffersystems konnte sie für Substanzen zugänglich gemacht werden, die aufgrund ihrer hohen Lipophilie und ihrer starken Adsorption an die Messzellen bisher nicht messbar waren. Darüber hinaus wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt: a) Es wurde die gegenseitige Verdrängung von zwei Arzneistoffen aus der Proteinbindung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich eine Reihe basischer Arzneistoffe durch saure Arzneistoffe verdrängen ließ, so z.B. Imipramin HCl durch Phenprocoumon. Das dem Phenprocoumon strukturell sehr ähnliche Warfarin rief diese Verdrängung hingegen nicht hervor. Tryptophan, das in HPLC Experimenten die Bindung von Imipramin HCl verringerte [117], hatte im Ultrafiltrationsexperiment keinen Einfluss auf dessen Bindung. Die gegenseitige Beeinflussung zweier Stoffe kann folglich sehr unterschiedlich sein und ist schwer vorhersagbar. Des Weiteren sind die Ergebnisse solcher Bestimmungen stark von der gewählten Methode abhängig und dadurch nur schwer zu vergleichen. Aufgrund der komplexen und uneinheitlichen Wechselwirkungen der basischen und sauren Arzneistoffe in Bezug auf ihre Bindung, kann davon ausgegangen werden, dass basische Arzneistoffe eine Bindestelle an Albumin besitzen. Jedoch lässt sich aus der vorliegenden Messung nicht beurteilen, wie spezifisch basische Stoffe an Albumin binden. b) Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Derivate des Acetylcysteins, die kovalent an Cys34 binden können, unterschiedliche Veränderung im Bindungsverhalten von Albumin hervorrufen. So nahm die Bindung des Diphenhydraminhydrochlorids in Gegenwart von äquimolaren Mengen Acetylcystein und Cysteamin ab, während die Anwesenheit von Acetylcysteamin den gegenteiligen Effekt hatte. Dies zeigt, dass der Veränderung der Bindung ein komplexerer Zusammenhang als die reine Belegung des Cys34 zugrunde liegen muss. c) Unterschiede in der Proteinbindung von Ephedrin und seiner Stereoisomere konnten mittels kontinuierlicher Ultrafiltration bestätigt werden. Die Abweichungen in den Ergebnissen in Bezug auf andere Bestimmungsmethoden [130-132] zeigten erneut, wie stark die Messung der Proteinbindung von den Versuchsbedingungen abhängt. d) Für die Messung des antiinfektiven Bisnaphthalimids MT02 wurde eine Messzelle aus PVDF konstruiert, die weniger Wechselwirkungen mit adsorbierenden Arzneistoffen zeigt. Aufgrund der Unbeständigkeit der Substanz unter den Versuchsbedingungen war die Messung dennoch nicht möglich. e) Die Proteinbindung des Naphthylisochinolins GB AP05 konnte mit Hilfe der bereits erwähnten neu konstruierten Messzelle bestimmt werden. Die Bindung war deutlich höher als bei anderen Vertretern dieser Gruppe. Die Ursache hierfür könnte in der Adsorption der Substanz an die Messzellen begründet sein. Da GB AP05 stark an den Kunststoff PMMA binden kann, der aufgrund seiner Beschaffenheit vorwiegend Wasserstoffbrückenbindungen für eine Adsorption bereitstellen kann, ist eine hohe Bindung an Albumin, das eine Vielzahl von Bindestellen mit unterschiedlichen chemischen Gruppen aufweist, nicht unwahrscheinlich. f) Für eine Reihe von Fluorchinoloncarboxamiden wurde das Ausmaß ihrer Protein-bindung bestimmt. Dieses lag in fast allen Fällen bei 80 % oder höher. Die einzigen Ausnahmen, GHQ237Ox und GHQ243Ox, legen den Schluss nahe, dass eine basi-sche Seitenkette in Position 1 und das Fehlen des Fluorsubstituenten in Position 6 die Bindung reduzieren können. Da nicht alle Substanzen in der Pufferlösung gelöst werden konnten, wurde neben dem bereits durch Albert etablierten DMSO-haltigen Puffer ein Polysorbat 20 haltiger entwickelt, in dem hoch lipophile Substanzen mizellar gelöst werden können. Durch Bestimmung der Proteinbindung von Carbamazepin konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit der Mizellen keinen Einfluss auf die Bindung hat, d.h. im Umkehrschluss dass die Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung geeignet ist.
A closer look at long-established drugs: enantioselective protein binding and stability studies
(2023)
The aim of this work was to investigate older, established drugs. The extent of the protein binding of chiral ephedra alkaloids to AGP and of ketamine to albumin was determined. Since enantiomers of these drugs are individual available, the focus was on possible enantioselective binding and structural moieties involved in the binding.
Previously published work suggested that ephedrine and pseudoephedrine can bind stereoselectively to proteins other than albumin in serum. For the determination of the extent of protein binding, the established ultrafiltration with subsequent chiral CE analysis was used. To determine the influence of basicity on binding, the drugs methylephedrine and norephedrine were also analyzed. Drug binding to AGP increased with increasing basicity as follows: norephedrine < methylephedrine < ephedrine < pseudoephedrine. pKaff was determined both graphically using the Klotz plot and mathematical indicating a low affinity of the ephedra alkaloids to AGP. Using STD-NMR spectroscopy experiments the aromatic protons and the C-CH3 side chain were shown to be most strongly involved in binding, which could be confirmed by molecular docking experiments in more detail. For all drugs, van der Waals-, π π , cationic interactions, hydrogen bonds, and a formation of a salt bridge were observed. The individual enantiomers showed no significant differences and thus the binding of ephedra alkaloids to AGP is not significant.
In contrast to the ephedra alkaloids, the possible enantioselective binding to albumin was investigated for R and S ketamine. Again, ultrafiltration followed by CE analysis was performed. The binding of ketamine to one main binding site could be identified. A non-linear fit was used for the determination of pKaff. Using the NMR methods STD-NMR, waterLOGSY-NMR, and CPMG-NMRspectroscopy: the aromatic protons as well as the protons of the NCH3 methyl group showed the largest signal intensity changes, while the cyclohexanone protons showed the smallest changes. pKaff was also determined by the change in the chemical shift at different drug-protein ratios. These obtained values confirm the values obtained from ultrafiltration. Based on this, ketamine is classified as a low-affinity ligand to albumin. There were no significant differences between the individual enantiomers and thus the binding of ketamine to albumin is not a stereoselective process.
Using statistical design of experiments an efficient chiral CE method for determining the extent of protein binding of R and S ketamine to albumin was developed and validated according to ICH Q2 (R1) guideline.
The stability of ketamine was also investigated because a yellowish discoloration of an aqueous solution of ketamine developed under heat. XRPD investigations showed the same crystal structure for all batches examined. An untargeted screening using LC HRMS as well as LC UV measurements showed no degradation of ketamine or the presence of impurities in stress and non-stressed ketamine solutions, confirming the stability of ketamine under the stress conditions investigated. The lower the quality of the water used in the stress tests, the more intense the yellow discoloration occurred. The impurity or the mechanism that causes the yellow discoloration could not be identified.