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Angeborene Immunität des Menschen : Kreuzreaktionen tumorspezifischer monoklonaler IgM-Antikörper
(2007)
Die von CD5-positiven B-Zellen produzierten natürlichen Antikörper sind humorale Bestandteile des angeborenen Immunsystems. Sie kommen im Körper bereits vor, ohne dass ein Antigen-Kontakt stattgefunden hat und dienen dazu, den Organismus schnell und effektiv vor eindringenden Pathogenen zu schützen, möglichst noch bevor die erworbene Immunabwehr aktiviert werden muss. Zudem werden körpereigene Moleküle erkannt, die normalerweise geschützt intrazellulär vorliegen und erst bei Zellnekrose freigesetzt und so dem Immunsystem zugänglich gemacht werden. Außerdem konnten mit Hilfe der humanen Hybridoma Technologie aus Krebspatienten und gesunden Probanden natürliche Antikörper isoliert werden, die transformierte Zellen erkennen und beseitigen. Die natürlichen Antikörper sind keimbahncodiert und erhöhen im Gegensatz zu Antikörpern der erworbenen Immunabwehr nicht ihre Variabilität durch Mutationsereignisse und Reifung. In früheren Studien wurde beobachtet, dass natürliche Antikörper nicht spezifisch ein Antigen binden, sondern dass bestimmte häufig vorkommende und in der Evolution konservierte Antigen-Muster erkannt werden. Daraus folgerte man, dass natürliche Antikörper ihre Antigene „unspezifisch“ binden, so dass sich eine Vielzahl von Kreuzreaktionen mit verschiedenen Antigenen ergibt. Derartige Kreuzreaktionen der natürlichen Antikörper wurden bereits 1986 beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war zu zeigen, dass es innerhalb der natürlichen Antikörper verschiedene Pools mit unterschiedlichen Aufgaben gibt und dass natürliche Antikörper nicht wahllos beliebige Antigene binden, sondern dass sich ihr Reaktionsmuster aus ihrer Aufgabe innerhalb des menschlichen Immunsystems ergibt. Es wurden anhand des ELISA-Verfahrens Kreuzreaktionen der natürlichen Antikörper mit humaner DNA, körpereigenen Zytoskelettproteinen (Actin, Myosin, Keratin, Desmin, Vimentin) und Molekülen untersucht, die die innate Immunabwehr über Toll-like-Rezeptoren aktivieren können (LPS, LTS, PGN, Flagellin, HSP 70, bakterielle DNA, H.pylori-CagA und -VacA). Es konnte gezeigt werden, dass den 17 untersuchten Antikörpern CM-1, CM-2, LM-1, M6, NORM-1, NORM-2, NORM-3, NORM-4, PAM-1, PM-1, PM-2, SAM-1, SAM-3, SAM-4, SAM-5, SAM-6, SC-1 hauptsächlich die Aufgabe zukommt, transformierte Zellen zu beseitigen. Ihre Reaktionsweise ist also nicht „unspezifisch“, sondern „oligospezifisch“ innerhalb ihres Aufgabenbereichs. Zudem fiel in früheren Studien eine deutliche Korrelation zwischen der Anzahl durchgemachter Mutationen und dem Reaktionsmuster der Antikörper mit Tumorzellen auf: keimbahncodierte Antikörper ohne Mutationen reagierten immer mit einem breiten Spektrum verschiedener Tumore oder sogar Vorläuferläsionen, wohingegen das Spektrum der Reaktionen mit steigender Zahl von Mutationen abnahm. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Antigen-Antikörper-Reaktionen konnte kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Reaktionsweise und dem genetischen Ursprung oder der Anzahl durchgemachter Mutationen hergestellt werden.
Der humane, monoklonale IgG Antikörper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunität dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden können. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und näher charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei über ein affinitätschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS über die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antikörper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr häufig bei den natürlichen IgM Antikörpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antikörpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zelluläre Prozesse ausübt. Durch die Bindung hemmte der Antikörper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem für metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antikörperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladhäsion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellulären Prozesse sind wichtig für sich im Körper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgeführten Analysen handelte es sich um vom Antikörper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Bindungsverhalten des Antikörpers genauer charakterisieren zu können. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antikörper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antikörpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen ermöglicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunität als auch neue Optionen für die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellulären, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue Möglichkeit für Diagnostik- und Therapieansätze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen ermöglicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentitäten könnte diese Zielstruktur für die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilität und Tumorzelladhäsion, könnte der BARB-4 Antikörper besonders für die Prävention einer Metastasierung von Bedeutung sein.