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Der menschliche Organismus muss sich permanent mit pathogenen und nicht pathogenen Krankheitserregern auseinandersetzen. Hierzu stehen ihm verschiedene Systeme der Immunabwehr zur Verfügung, zu denen auch antimikrobielle Peptide (AMP) gehören, deren Wirkungsspektrum sich von Bakterien über Pilze bis hin zu Viren erstreckt. Die AMP sind nicht nur in der Lage Krankheitserreger direkt abzutöten, sondern darüber hinaus auch konzentrationsabhängig modulierend auf das adaptive Immunsystem einzuwirken, wie zum Beispiel über chemotaktische Effekte auf Lymphozyten. Den AMP, von denen beim Menschen bisher 6 alpha- und 4 betha Defensine sowie ein Cathelicidin (LL-37/hCAP-18) bekannt sind, kommt somit eine potentielle Schlüsselrolle in der Regulation der Immunabwehr zu. Bislang ist wenig über die Regulation der AMP bekannt, von denen einige konstitutiv expremiert werden, andere wiederum erst nach Stimulation, wie zum Beispiel Besiedlung mit bestimmten Keimen, vom jeweiligen Organ produziert und freigesetzt werden. Das Verständnis über die Wirkungsweise und die Regulation der AMP könnte möglicherweise der Klärung der Pathogenese von Erkrankungen dienen., bei denen eine bakterielle Mitbeteiligung nachgewiesen wurde, wie etwa den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Des Weiteren kommt den AMP aufgrund der komplexen Wirkung gegen Krankheitserreger auch eine potentielle therapeutische Rolle zu, welche auch in der vorliegenden Dissertation untersucht werden sollte. Hierzu wurden die Effekte von Liganden des peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) auf die Expression von LL-37 untersucht, da bei einigen dieser Liganden, insbesondere den aus der oralen Therapie des Diabetes mellitus Typ II bekannten Thiazolidindionen sowohl in der klinischen Beobachtung als auch im Tiermodell eine entzündungshemmende Wirkung nachgewiesen wurde. Die Gruppe der PPAR gehört zur Familie der Kernrezeptoren und wird in drei Subtypen alpha, betha und gamma unterteilt, wobei das größte Forschungsinteresse PPAR gamma zukommt. In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass Agonisten für PPAR gamma, wie Ciglitazone oder Rosiglitazone, und auch Antagonisten, wie das eingesetzte BADGE, einen modulierenden Effekt auf die Expression von LL-37 in Coloncarcinomzelllinien und Prämonozyten haben. Es zeigte sich, dass es unter Einwirkung von PPAR gamma- Agonisten zu einer signifikanten Reduktion der LL-37 Expression kam. Dieser Effekt konnte ebenfalls in der Koinkubation mit Butyrat, einer kurzkettigen Fettsäure, die einen bekannten Induktor für LL-37 darstellt, beobachtet werden, wobei die Butyrat- induzierte LL-37 Expression durch beide Thiazolidindione signifikant gehemmt wurde. Darüber hinaus wurde auch die durch Butyrat bedingte Steigerung der Differenzierungsrate der Versuchszellen durch PPARg- Agonisten signifikant reduziert. Analog zu diesen Ergebnissen führte der Einsatz von BADGE zu einer signifikanten Steigerung der LL-37 Expression, wobei dieses Ergebnis mit einem anderen PPAR gamma- Antagonisten nicht bestätigt werden konnte und somit auch eine BADGE spezifische Wirkung darstellen könnte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Modulation der LL-37 Expression nicht eindeutig mit der PPARg- Aktivität im Zellkern der Versuchszellen korreliert, was somit eher dafür spricht, dass der modulierende Effekt von PPAR gamma- Liganden auf die LL-37 Expression über einen von PPAR gamma unabhängigen Signalweg zustande kommt. Zusammenfassend hemmen die Thiazolidindione jedoch die LL-37 Expression in vitro, was eine entzündungs-hemmende Wirkung dieser Medikamente vermitteln könnte, da es über die Konzentrationsänderung von LL-37 zu einem Eingriff in die Modulation des spezifischen Immunsystems kommen kann. Um eine sichere Aussage darüber treffen zu können, ob die beobachtete antiinflamatorische Wirkung der Thiazolidindione über eine Expressionsänderung der AMP zustande kommt, müssen weiterführende Studien durchgeführt werden.
Die Wundheilung im Kolon ist ein wichtiges Thema in der Medizin, da sich dieser Prozess durch die besonderen Ausgangsbedingungen, wie etwa hohe Bakterienlast, ein hoher intraluminaler Druck und niedrigere Sauerstoffspannung von der viel untersuchten kutanen Wundheilung unterscheidet. Auch sind die Folgen einer Dehiszenz im Anastomosenbereich ungleich gravierender, besteht doch das Risiko einer Peritonitis, die mit hoher Letalität verbunden ist. Ziel dieser Arbeit war es, die komplikationslose Wundheilung über einen langen Zeitraum zu beobachten. Anhand des Verlaufs einer Vielzahl von für die Wundheilung wesentlichen Zytokinen sollte die Wundheilung am Kolon möglichst ausführlich untersucht werden. Im Rahmen meiner Fragestellung wurden 100 männliche Wistarratten unter anderem mit einer Anastomose am Übergang von Kolon sigmoideum zum Rektum versehen. Die Tiere waren in verschiedene Gruppen aufgeteilt und wurden je nach Gruppe zu einem der sechs verschiedenen Zeitpunkte (0, 3, 7, 14, 30 und 90 Tage post Operationem) getötet und die Anastomose wurde entnommen. Das Anastomosengewebe wurde für immunhistologische und ELISA Untersuchungen verwendet. Durch den langen Untersuchungszeitraum konnten nicht nur die initialen Phasen der Wundheilung, sondern auch die Phase der Bindegewebsbildung erfasst werden. Es wurden immunhistochemische Färbungen und ELISA-Analysen von verschiedenen proinflammatorischen (TNF-alfa, IFN-gamma), chemotaktischen (RANTES, MIP-2, MCP-1), angiogenetischen (VEGF, PDGF-B, FGF-2) und antiinflammatorischen (IL-10, IL-13) Zytokinen und TGF-beta1 durchgeführt. Dabei wurde eine insgesamt verzögerte Wundheilung festgestellt. Es zeigte sich eine wesentlich verlängerte inflammatorische Phase sowie eine verlängerte proliferative Phase. Erst von Tag 30 bis 90 kehrten die meisten Parameter wieder auf ein mehr oder minder normales Niveau zurück. Erwartungsgemäß waren die meisten histologisch positiven Zellen in der Anastomose selbst zu finden. Die Zellzahlen der Zellmarker ließen sich gut mit den Zytokinen in Einklang bringen. Jedoch ließen sich Zellzahlen und Zytokinkonzentration meist nicht korrelieren. Es traten mit IFN-gamma und RANTES zwei Zytokine auf, die im kutanen Modell nicht beobachtet wurden. IFN-gamma hemmt die meisten Zellen, die im Rahmen der proliferativen Phase benötigt werden und könnte ein Grund für die verlängerte inflammatorische Phase sein. Aus diesen Untersuchungen lässt sich schließen, dass die komplikationslose kolonische Wundheilung grundsätzlich mit der kutanen vergleichbar ist. Die Ergebnisse und Erkenntnisse aus dieser Arbeit werden jetzt als Grundlage für ein Modell mit erhöhter Dehiszenzwahrscheinlichkeit verwendet. Damit soll ein besseres und systematisches Verständnis für die Pathogenese der Anastomoseninsuffizienz gewonnen werden. So wird es möglich, auf histologischer Ebene und auf Proteinebene die Unterschiede zwischen komplikationsloser und komplikationsbehafteter Anastomosenheilung zu beobachten, sind die klinischen Folgen bei einer Leckage doch in vielen Fällen verheerend. Zudem wird es dann möglich sein, systematischer zu ergründen, wie etwa intraoperativ eingebrachte Zytokine oder zytokingetränkte Fäden das Wundmilieu verändern und beeinflussen.
The cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A (CIP2A) is an oncogenic factor that stabilises the c-Myc protein. CIP2A is overexpressed in several tumours, and expression levels are an independent marker for long-term outcome. To determine whether CIP2A expression is elevated in colon cancer and whether it might serve as a prognostic marker for survival, we analysed CIP2A mRNA expression by real-time PCR in 104 colon cancer samples. CIP2A mRNA was overexpressed in colon cancer samples and CIP2A expression levels correlated significantly with tumour stage. We found that CIP2A serves as an independent prognostic marker for disease-free and overall survival. Further, we investigated CIP2A-dependent effects on levels of c-Myc, Akt and on cell proliferation in three colon cancer cell lines by silencing CIP2A using small interfering (si) and short hairpin (sh) RNAs. Depletion of CIP2A substantially inhibited growth of colon cell lines and reduced c-Myc levels without affecting expression or function of the upstream regulatory kinase, Akt. Expression of CIP2A was found to be dependent on MAPK activity, linking elevated c-Myc expression to deregulated signal transduction in colon cancer.
Recent advances in the in vitro characterization of human adult enteric neural progenitor cells have opened new possibilities for cell-based therapies in gastrointestinal motility disorders. However, whether these cells are able to integrate within an in vivo gut environment is still unclear. In this study, we transplanted neural progenitor-containing neurosphere-like bodies (NLBs) in a mouse model of hypoganglionosis and analyzed cellular integration of NLB-derived cell types and functional improvement. NLBs were propagated from postnatal and adult human gut tissues. Cells were characterized by immunohistochemistry, quantitative PCR and subtelomere fluorescence in situ hybridization (FISH). For in vivo evaluation, the plexus of murine colon was damaged by the application of cationic surfactant benzalkonium chloride which was followed by the transplantation of NLBs in a fibrin matrix. After 4 weeks, grafted human cells were visualized by combined in situ hybridization (Alu) and immunohistochemistry (PGP9.5, GFAP, SMA). In addition, we determined nitric oxide synthase (NOS)-positive neurons and measured hypertrophic effects in the ENS and musculature. Contractility of treated guts was assessed in organ bath after electrical field stimulation. NLBs could be reproducibly generated without any signs of chromosomal alterations using subtelomere FISH. NLB-derived cells integrated within the host tissue and showed expected differentiated phenotypes i.e. enteric neurons, glia and smooth muscle-like cells following in vivo transplantation. Our data suggest biological effects of the transplanted NLB cells on tissue contractility, although robust statistical results could not be obtained due to the small sample size. Further, it is unclear, which of the NLB cell types including neural progenitors have direct restoring effects or, alternatively may act via 'bystander' mechanisms in vivo. Our findings provide further evidence that NLB transplantation can be considered as feasible tool to improve ENS function in a variety of gastrointestinal disorders.