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Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung, die durch Autoantikörper gegen Dsg1 und Dsg3 gekennzeichnet ist. Der genaue Pathomechanismus, der zu einem PV-IgG vermittelten Verlust der interzellulären Adhäsion führt, ist noch unklar. Die Dsg3-Depletion und die Modulation von Signalkaskaden stellen hierbei kennzeichnende Merkmale der Erkrankung dar. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist eine bessere Einordnung der Dsg3-Depletion in den pathogenetischen Kontext von Pemphigus vulgaris möglich. Die Experimente zeigen, dass die Dsg3-Depletion von Differenzierungsprozessen abhängig ist und mit einem Adhäsionsverlust einhergehen kann. Die Hemmung der PKC verhindert hierbei sowohl die PV-IgG vermittelten Effekte in der Zellkultur als auch die Blasenbildung im Mausmodell in vivo und in humaner Haut ex vivo. Des Weiteren liefert die Arbeit neue Erkenntnisse, welche für die suprabasale Lokalisation der Blasenbildung bedeutsam sein könnten.
Desmosomen sind Zell-Zell-Kontakte, die eine starke interzelluläre Haftung vermitteln. Sie sind daher besonders wichtig für die Integrität von Geweben wie der Haut, die laufend einer starken mechanischen Beanspruchung ausgesetzt sind. Pemphigus vulgaris ist eine Autoimmundermatose, die zur Ausbildung schlaffer Blasen durch Spaltbildung in der Epidermis führt. Als ursächlich dafür wurden Autoantikörper gegen die desmosomalen Cadherine Dsg1 und 3 herausgestellt, die in Desmosomen vorkommen. cAMP ist ein wichtiger Botenstoff des Zellstoffwechsels und an der Regulierung und Modulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt, darunter auch die Stabilisierung der Endothelbarriere über Stärkung der Haftung eines klassischen Cadherins, nämlich VE-Cadherin.
In Anknüpfung an die vorliegenden Daten aus Pemphigus- und Endothelforschung beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle von cAMP bei Pemphigus vulgaris. Es wurde in Keratinozytenkultur sowie im neonatalen Pemphigus-Mausmodell untersucht, ob die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Spiegel einen Einfluss auf PV-IgG-induzierte morphologische und funktionelle Veränderungen hat.
Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels konnte sowohl in vitro als auch in vivo als protektiv herausgestellt werden. In Keratinozytenkultur konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels durch Forskolin/Rolipram oder Isoproterenol in der Lage war, die PV-IgG-induzierten morphologischen Veränderungen, die Dsg3-Depletion, sowie den Adhäsionsverlust zu blockieren. Weiterhin konnte die Blasenbildung in vivo durch cAMP-Erhöhung vollständig verhindert werden.
Im Anschluss wurde untersucht, ob die Inkubation mit PV-IgGs einen Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Spiegel in vitro hat. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zellen mit einer Erhöhung der cAMP-Spiegel reagieren, wenn auch in einem geringeren Ausmaß als durch die eingesetzten Mediatoren. Somit kann cAMP als Rettungsmechanismus der Zellen angesehen werden und es wurde daraufhin der Einfluss von cAMP auf die Regeneration von Keratinozyten nach PV-IgG-Inkubation untersucht. Dieser Prozess konnte durch eine cAMP-Erhöhung verbessert werden und erwies sich als partiell abhängig von PKA. Schlussendlich konnte nachgewiesen werden, dass cAMP in vitro wie in vivo über die Blockade der p38MAPK-Aktivierung protektiv wirkt.
Zusammenfassend konnte so ein neuer Einblick in die zelluläre Antwort von Keratinozyten auf Pemphigus-Autoantikörperbindung gewonnen werden. Dieser könnte auch im Hinblick auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien bei Pemphigus vulgaris wichtig sein.
In der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie besteht ein großer Bedarf an Transplantaten zur intra- und extraoralen Defektdeckung in der chirurgischen Therapie, insbesondere für die Rekonstruktion nach Traumen oder Tumorresektionen für den Erhalt von Funktion und Ästhetik. Konventionelle Methoden wie die Verwendung von autologen, freien Spalt- und Vollhaut-Transplantaten zeigen Nachteile wie z. B. die Entnahmemorbidität der Spenderregion oder die Notwendigkeit eines zweiten chirurgischen Eingriffs zur Deckung des Entnahmedefektes. Zudem sind diese Transplantate nur in kleinen Mengen verfügbar oder haben eine unterschiedliche Gewebestruktur sowie andere Keratinisierungsmuster. Diese Nachteile sollen mit Hilfe eines im Tissue Engineering hergestellten Oralmukosa-Äquivalentes umgangen werden. Dazu wurden zunächst Methoden zur Isolierung und Kultivierung primärer, oraler Fibroblasten bzw. Keratinozyten entwickelt, die das Ausgangsmaterial für die Herstellung von Dermal-Äquivalenten bzw. von organotypischen Kokulturen in vitro bilden. Die Zellen wurden sowohl histologisch als auch immunhistochemisch charakterisiert und nach Optimierung der Kulturbedingungen zur Entwicklung von Oralmukosa-Äquivalenten (OMÄs) eingesetzt. Dabei ist auch die Wahl eines geeigneten Trägermaterials ein entscheidender Faktor. Deshalb wurden in dieser Arbeit verschiedene Unterlagen auf Eignung als Scaffold für das Tissue Engineering von Oralmukosa getestet. Unter anderem wurden die Materialien Vicryl (resorbierbares Polyglactin-910-Netz), DRT (dermale Regenerationsmatrix aus bovinem Kollagen-I vernetzt mit einem Glycosaminoglycan) und TFE (equine Kollagen-I-Membran) in Zellkulturversuchen auf Biokompatibilität und Stabilität geprüft. Dazu wurden zunächst Fibroblasten auf die Scaffolds ausgesät um Dermal-Äquivalente (DÄs) zu erhalten. Das Wachstum der Zellen wurde mittels Elektronenmikroskopie sowie immunhistochemischen Methoden untersucht. Die Analyse zeigte gutes Zellwachstum und somit gute Biokompatibilität auf allen verwendeten Materialien. In folgenden Experimenten wurden zusätzlich Keratinozyten auf DÄs ausgesät und somit organotypische OMÄs entwickelt. Die generierten Konstrukte wurden mit Hilfe von IIF-Färbungen von Kryoschnitten sowie RT-qPCR bezüglich ihrer Zellarchitektur, ihrer Fähigkeit zur Bildung einer Basalmembran und ihrer Fähigkeit zur Differenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, dass auf allen drei Trägern Fibroblasten-Keratinozyten Kulturen hergestellt werden konnten. Dabei zeigte Vicryl eine gute Biostabilität, jedoch ohne Ausbildung der natürlichen Stratifizierung der Keratinozytenschichten. Auf TFE dagegen zeigte sich die beste Architektur und Proliferation der Zellen mit Stratifizierung der Keratinozyten, allerdings eine schlechte Biostabilität. DRT stellte sich als die Matrix heraus, die die gewünschten Eigenschaften am besten vereint. Das Ergebnis war jedoch im Bezug auf die Dicke der Epithelschicht sowie deren Differenzierung und Ausbildung einer Basalmembran noch zu verbessern. Dies konnte mit Hilfe der Kulturmethode an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erreicht werden. Jedoch gelang bezüglich der Zellarchitektur noch immer kein optimales Ergebnis. Erst der Einsatz einer weiteren Membran, SIS (azellularisierter Schweinedarm), die durch ihren natürlichen Ursprung ähnlich strukturiert ist wie humane Submukosa, zeigte, dass die angewandte Methodik zur Herstellung von OMÄs funktionierte. Auf diesem Träger gelang die Herstellung eines Transplantates, das eine mit normaler Oralmukosa vergleichbare, reguläre Zellarchitektur mit dermaler und epidermaler Komponente aufwies, die qualitativ noch besser war als auf TFE. Auch die Biostabilität während des Versuchszeitraumes war wie bei Vicryl und DRT gegeben. Die Neusynthese einer Basalmembran konnte mittels IIF-Färbung nachgewiesen werden. Die Proliferation der Keratinozyten war in der Basalschicht lokalisiert und nahm Richtung apikal ab. Lediglich eine Differenzierung des Transplantates war mittels immunhistochemischer Methoden nicht nachweisbar. Auf diese Weise konnte in der vorliegenden Arbeit ein OMÄ entwickelt werden, dessen Aufbau mit dem von natürlicher Oralmukosa vergleichbar war. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse dienen somit als Grundlage zur Optimierung und Verwirklichung des klinischen Einsatzes von mittels Tissue Engineering hergestellten, autologen OMÄs.
Die Stabiltät und Integrität der Epidermis beruht zu einem großen Teil auf der intakten Funktion der Desmosomen. Diese fleckförmigen Zellkontakte vermitteln extrazellulär die Haftung zwischen den Keratinozyten durch Desmocadherine und sind intrazellulär über Adaptorproteine im Intermediärfilamentsystem des Zellskeletts verankert. Diese Funktion ist bei der Autoimmunerkrankung Pemphigus gestört, die zu intraepidermaler Blasenbildung durch Akantholyse der Keratinozyten führt. Pemphigus vulgaris (PV) und Pemphigus foliaceus (PF) stellen die beiden Hauptvarianten dar, wobei PV durch Autoantikörper gegen die Desmocadherine Desmoglein (Dsg) 3 und oftmals zusätzlich gegen Dsg 1, PF durch Autoantikörper nur gegen Dsg 1 gekennzeichnet ist. Rho-GTPasen sind zelluläre Regulatorproteine, die das Aktinzytoskelett und verschiedene Zellkontakte beeinflussen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss von Rho-GTPasen bei der Regulation von desmosomal vermittelter Adhäsion. In einem zweiten Teil wurde die Beteiligung von Rho-GTPasen bei den Pemphigusvarianten PV und PF näher charakterisiert. Für den ersten Abschnitt wurden bakterielle Toxine verwendet, die spezifisch Rho GTPasen aktivieren bzw. inhibieren, während für den zweiten Teil IgG-Fraktionen von PV- und PF-Patienten in Kombination mit aktivierenden Toxinen zur Anwendung kamen. Eine Inhibition der drei Hauptvertreter der Rho-GTPasen in kultivierten Keratinozyten und humaner Epidermis führte zu einer Rarefizierung des Aktinfilamentsystems, zu Verlust von membranständig lokalisiertem Dsg 1 und 3 und zu Zelldissoziation sowie zu verminderter Dsg 1 und 3-vermittelter Haftung von Mikroperlen auf der Oberfläche von Keratinozyten. Die Aktivierung der GTPasen resultierte in vermehrter linearisierter Darstellbarkeit von Aktin und Dsg 3 an den Zellgrenzen und einer verstärkten Dsg-vermittelten Haftung. Pemphigus-IgG führten ebenfalls zu Zelldissoziation und Verlust von Dsg-Immunreaktivität in Keratinozytenkulturen, zu Spaltbildung in humaner Epidermis und zum Verlust der durch Dsg 1 und Dsg 3 vermittelten Adhäsion. Dies ging einher mit einer vermehrten Menge an nicht am Zytoskelett verankerten Dsg 3 und wurde durch eine p38MAPK-abhängige Verminderung der Aktivität von Rho A moduliert. Die Aktivierung von Rho A verhinderte die Ausbildung der Pemphigus-induzierten Effekte nahezu vollständig. Zusammenfassend regulieren Rho-GTPasen die desmosomale Haftung in Keratinozyten. Die Daten zeigen weiterhin, dass Pemphigus-IgG durch eine Inhibition von Rho A diese Regulation beeinträchtigt, was zu Schwächung der Zytoskelettverankerung von Desmogleinen und zu Haftungsverlust und Spaltbildung führt. Somit ist Rho A ein wichtiger Faktor der Pemphigus-Pathogenese und stellt einen Erfolg versprechenden Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Therapieoptionen dar.
Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen.
In Keratinozyten wird sowohl durch UVB als auch durch PUVA-Bestrahlung Apoptose induziert. Wir untersuchten die in Keratinozyten durch UVB, PUVA, UVA und Todesliganden wie TRAIL ausgelösten Apoptosewege näher. UVB und PUVA, nicht aber UVA-Bestrahlung lösen in vitro Keratinozytenapoptose aus. 2-4 h nach UVB beobachteten wir die Aktivierung von Caspasen. Nach PUVA setzt die Aktivierung von Caspasen wesentlich später ein, nämlich erst 12 h nach Bestrahlung. Passend dazu, ist ein Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials 6-8 h nach UVB und 12-14 h nach PUVA detektierbar. Die Überexpression des Proteins Bcl-2 verhindert den Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach UVB, und vermittelt auch einen klonogen Schutz, unabhängig von der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale. Im Gegensatz dazu verzögert es den Verlust des Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach PUVA nur und verhindert sie nicht. PUVA-bestrahlte Zellen können sich nicht weiter teilen, sind also durch Bcl-2 nicht klonogen geschützt.
Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält.