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Entzündliche Prozesse stellen einen zentralen Aspekt der Karzinogenese dar und können sowohl zur Induktion als auch zum Progress von Tumoren beitragen. Der NF-kB-Signalweg ist einer der wichtigsten Signaltransduktionswege der In- flammation und Tumorpromotion, was ihn zur plausiblen Zielstruktur für die pros- pektive klinische Tumortherapie machen könnte. In der vorliegenden Arbeit wur- den die Eigenschaften von vier unterschiedlich targetierenden NF-kB-pathway- Inhibitoren – Cortisol, MLN4924, QNZ und TPCA1 – auf die Inflammation, Zell- proliferation und proapoptotische Sensitivierung am in vitro Modell des HNSCC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifische Auswahl des Inhi- bitors bzw. seines targets entscheidend für den wirkungsvollen Einsatz dieser Wirkstoffgruppe in der antiproliferativen Therapie des HNSCC zu sein scheint. Beispielsweise vermittelte MLN4924 die Freisetzung von IL-8. Cortisol bewirkte die Resistenz der FasL-induzierten Apoptose von HNSCC-Zellen. QNZ wirkte in einigen Zelllinien antiproliferativ und sensitivierend für den FasL-induzierten Zell- tod, beeinflusste jedoch in diesem Zusammenhang kontraproduktiv die IL-8-Sek- retion. Dies disqualifizierte diese Wirkstoffe für die Anwendung in der Therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Dahingegen qualifizierte sich TPCA-1 aufgrund folgen- der Eigenschaften als geeigneter Wirkstoff für den prospektiven klinischen Ein- satz:
1) TPCA-1 wirkte antiproliferativ,
2) hemmte die TNF-a-induzierte Inflammation,
3) regulierte die IL-8-Expression herab,
4) wirkte sensitivierend für den TNF-a-induzierten Zelltod,
5) interferierte kaum mit der FasL-vermittelten Apoptose und 6) induzierte Apoptose.
Die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Apoptose stellt einen zentralen Baustein in der Pathogenese von Tumorerkrankungen dar. cFLIP inhibiert rezeptornah die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose und spielt somit eine bedeutende Rolle als Regulator der Apoptose. Eine verstärkte Expression von cFLIP kann folglich hinweisend auf eine Fehlregulation der Apoptose bei der Entstehung und Progression von Tumoren sein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von cFLIP in kutanen epithelialen und melanozytären Tumoren mit formalinfixierten und paraffinierten Gewebeproben untersucht. Bei der zunächst durchgeführten Charakterisierung der käuflich erhältlichen monoklonalen cFLIP-Antikörper mittels cFLIP-überexprimierenden HaCaT-Keratinozyten wurde überraschenderweise die fehlende Spezifität eines Antikörpers (KlonEPR8438(2)) nachgewiesen, was zur Folge hatte, dass der Hersteller die Produktion nach Mitteilung der Befunde eingestellt hat. Daher wurden die weiteren Untersuchungen unter Verwendung des Antikörper-Klons G11, der sowohl im Western Blot als auch immunhistochemisch die beiden cFLIP-Splicevarianten cFLIPL und cFLIPS spezifisch nachweist, durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass cFLIP in epithelialen Hauttumoren in erheblichem Maß exprimiert wird. In jeweils 40% der untersuchten aktinischen Keratosen und Morbi Bowen konnte cFLIP nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu zeigte sich in den fortgeschrittenen Formen epithelialer Hauttumoren eine deutlich höhere Expressionsrate. Eine Expression wiesen zudem 100% der untersuchten Keratoakanthome und 95% der Plattenepithelkarzinome (mit überwiegend gutem Differenzierungsgrad) auf. Dementsprechend war es nicht verwunderlich, dass alle untersuchten Metastasen von Plattenepithelkarzinomen cFLIP überexprimierten. Die Analyse melanozytärer Läsionen ergab, dass cFLIP in melanozytären Nävi wie auch superfiziell spreitenden Melanomen, Lentigo-maligna-Melanomen und akral lentiginösen Melanomen nur in einer sehr geringen Anzahl der untersuchten Präparate überexprimiert wurde. Erstaunlicherweise konnte jedoch in 65% der nodulären Melanome sowie in 60% der Melanommetastasen cFLIP nachgewiesen werden. Bezüglich der Expression von cFLIP im Primärtumor sowie der Metastase desselben Patienten konnte kein eindeutiger Trend festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die frühe Hemmung des extrinsischen Apoptoseweges durch das antiapoptotische Protein cFLIP an der Entstehung, dem Wachstum und möglicherweise der Metastasierung epithelialer Hauttumore beteiligt sein dürfte. Die auffallend hohe Expressionsrate im nodulären Melanom sowie den untersuchten Melanommetastasen könnte einen zukünftigen therapeutischen Angriffspunkt darstellen.
Mit einer weltweiten Inzidenz von etwa 600.000 Neuerkrankten pro Jahr gehört das orale Plattenepithelkarzinom zu den sechs häufigsten malignen Tumorerkrankungen des Menschen. Zur Behandlung operabler Tumoren der Stadien III-IVb hat sich hingegen die multimodale Therapie mit primär operativem Vorgehen, gegebenenfalls mit nachfolgender adjuvanter Radiatio beziehungsweise Radiochemotherapie, etabliert. Beim Vorhandensein von Fernmetastasen hingegen ist das Therapiekonzept als palliativ einzustufen. Während sich für die adjuvante, kurativ intendierte Radiochemotherapie die Verwendung von Cisplatin oder cisplatinhaltiger Wirkstoffe etabliert hat, stellen seit einigen Jahren selektive Wirkstoffe wie Nivolumab und Cetuximab eine Alternative zur Cisplatin-Anwendung im palliativen Setting dar. Für die medikamentöse Therapie des fortgeschrittenen oralen Plattenepithelkarzinoms scheinen daher neue rationale Therapieansätze notwendig zu sein. Besonders ein hohes Maß an Toxizität sowie die individuelle Resistenzbildung vermögen den Therapieerfolg der herkömmlichen Chemotherapie zu kompromittieren. Spezifisch wirksame sogenannte "targeted agents" binden RTK und blockieren somit die nachgeschaltete Signalkaskade. In der vorliegenden Studie kam es zur Anwendung der TKI Afatinib, Volasertib und Nintedanib in alleiniger Anwendung sowie Kombinationstherapie mit Cisplatin und dem Smac-mimetic LCL-161. Die Analyse der Wirksamkeit oben genannter Stoffe erfolgte durch eine In-vitro-Evaluation an fünf Zelllinien des humanen Plattenepithelkarzinoms der Kopf- und Halsregion. Nach semiquantitativem Expressionsnachweis der Zielstrukturen erfolgte die Stimulation der Zellen mittels spezifischer Verdünnungsreihen in Mono- und Kombinationstherapie. Folgend wurden auf der Basis von Zellzahlanalysen, Kristallviolettassays und der Erstellung von Dosis-Wirkungskurven zelllinienspezifische IC50- beziehungsweise IC20-Werte ermittelt, statistisch ausgewertet und miteinander verglichen.
Die Anwendung von Afatinib in Monotherapie zeigte in der vorliegenden Studie keine signifikant erhöhte Zytoreduktion im Vergleich zur alleinigen Anwendung von Cisplatin. Auch ein Zusatz von Cisplatin zur Anwendung ergab keinen erwarteten synergistischen Effekt.
Die Anwendung von Nintedanib in Monotherapie zeigte in der Analyse keine signifikanten Vorteile gegenüber einer alleinigen Cisplatinanwendung. Auf der Basis der Ergebnisse der vorausgegangenen Expressionsanalysen scheint der FGFR-2 eine übergeordnete Rolle zu spielen, da hier partiell von einer verstärkten Wirksamkeit auszugehen ist. Weiterhin scheint gegenüber selektiven Angiogeneseinhibitoren kein Vorteil für Nintedanib zu bestehen. Betrachtet man die Kombinationsanwendung von Nintedanib mit Cisplatin so fallen sowohl synergistische wie auch partiell antagonistische Effekte im Vergleich zur Cisplatin-Monotherapie auf. Diese können durch die heterogene Expression der Zielstrukturen allein nicht erklärt werden, sodass hier weiterführende Untersuchungen sinnvoll wären.
Bei der Anwendung von Volasertib konnte für alle Zelllinien eine sehr deutliche Zytoreduktion erzielt werden, was durch generell erhöhte Expressionsraten erklärbar scheint. Sie manifestierte sich zudem in deutlich erniedrigten mittleren inhibitorischen Konzentrationen der Monotherapie gegenüber einer alleinigen Cisplatin-Anwendung. Betrachtet man die Kombinationsanwendung von Volasertib mit Cisplatin imponierten für alle Zelllinien erstaunlicherweise sogar schlechtere Ansprechraten verglichen mit der Volasertib-Monotherapie. Hier könnte man von einer inhibierenden Wechselwirkung der Wirkstoffe ausgehen. Diese Tatsache macht weiterführende Untersuchung zur Anwendung von Volasertib in Monotherapie attraktiver als die jeweilige Kombinationsanwendung.
Die Kombinationsanwendungen von LCL-161 mit Afatinib beziehungsweise Volasertib wiesen keine signifikant erhöhten zytoreduktiven Effekte auf. Hingegen waren die Untersuchungsergebnisse der Kombinationsanwendung des verwendeten Smac-Analogons und Nintedanib bemerkenswert. In vier von fünf Zelllinien sorgte ein LCL-161-Zusatz für eine signifikant erhöhte Zytoreduktion. Eine zusätzlich zur Angiogeneseinhibition durch Nintedanib induzierte Apoptoseinduktion in Kombination mit der Apoptosesensibilisierung durch LCL-161 könnte eine mögliche Erklärung dieser Beobachtung darstellen.
Aufgrund der sehr heterogenen Ergebnisse dieser Studie mit partiell synergistischen aber auch antagonistischen Effekten lässt sich schlussfolgern, dass alle drei verwendeten TKI aktuell keine vielversprechende Alternative zu der herkömmlichen Chemotherapie darstellen. Diese Heterogenität verdeutlicht auch, dass die Suche nach individuellen, zielgerichteten medikamentösen Therapieansätzen essenziell bleibt. Hierbei könnten Smac-Analoge ein vielversprechendes Feld weiterführender experimenteller und klinischer Studien eröffnen.
Elektromagnetische Felder (EMF) sind in der Umwelt des Menschen allgegenwärtig. Unter Verwendung unterschiedlicher Frequenzen bilden sie die Grundlage zahlreicher Technologien und begegnen uns im Alltag in einer Vielzahl von Anwendungen. Eine sehr wichtige Anwendung von EMF ist die mobile Kommunikation. Die hierfür verwendeten Frequenzen liegen im hochfrequenten Bereich und variieren mit dem Mobilfunkstandard. Weit verbreitet ist die GSM- und UMTS-Modulation der zweiten (2G) und dritten Generation (3G). Zum neuesten Mobilfunkstandard zählt LTE (4G).
Aus statistischen Daten geht hervor, dass derzeit weltweit mehr als sieben Milliarden Mobilfunk-Endgeräte existieren. Die weitverbreitete und stetig ansteigende Verwendung dieser Technologien verdeutlicht, dass viele Menschen, darunter auch zunehmend Kinder und Jugendliche, regelmäßig einer Exposition gegenüber EMF ausgesetzt sind. Die wichtigste Expositionsquelle stellt dabei das Mobiltelefon dar, da sich in diesem Szenario die Quelle sehr nah am menschlichen Körper befindet. In der Vergangenheit wurden zahlreiche in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen sowie epidemiologische Studien durchgeführt, um potentielle, nicht-thermische Effekte von Mobilfunkstrahlung auf biologische Systeme beurteilen zu können. Ein vollständiger Konsens konnte auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht erzielt werden, sodass weiterhin Bedenken zum schädlichen Potential dieser nichtionisierenden Strahlung bestehen. Insbesondere wurden Fragestellungen zu Langzeiteffekten sowie zu Effekten, die speziell bei Kindern eine besondere Rolle spielen, bisher nicht ausreichend adressiert. Kinder können empfindlicher auf Umwelteinflüsse reagieren und sind im Vergleich zu Erwachsenen teilweise höher gegenüber EMF exponiert. Dies gilt vor allem für Kopfregionen, in denen sich das aktive, für die Hämatopoese verantwortliche Knochenmark befindet.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Einfluss von Mobilfunkstrahlung auf das humane blutbildende System zu untersuchen. Im Fokus standen dabei humane hämatopoetische Stammzellen, die mit Frequenzen der Mobilfunkstandards GSM (900 MHz), UMTS (1.950 MHz) und LTE (2.535 MHz) jeweils über einen kurzen (4 h) und einen langen (20 h) Zeitraum und mit unterschiedlichen Intensitäten (0 W/kg, 0,5 W/kg, 1 W/kg, 2 W/kg und 4 W/kg) exponiert wurden. Vergleichende Experimente erfolgten mit Zellen der Promyelozyten-Zelllinie HL-60. Mögliche Effekte wurden mit den Endpunkten Apoptose, oxidativer Stress, Zellzyklus, DNA-Schaden und –Reparatur sowie Differenzierung und Epigenetik in Form von Histonacetylierung bewertet. In keinem der genannten Endpunkte konnten klare Effekte durch Mobilfunkstrahlung ausgemacht werden, weder für die hämatopoetischen Stammzellen, noch für die Zelllinie HL-60. Die einzige Veränderung wurde bei der Quantifizierung von DNA-Schäden beobachtet. Hier zeigte sich nach der Kurzzeitexposition der Stammzellen mit der Modulation GSM eine kleine, aber statistisch signifikante Abnahme der DNA-Schäden verglichen mit der Scheinexposition. Diese Beobachtung ließ sich in weiteren Replikaten jedoch nicht reproduzieren und wurde daher als nicht biologisch relevant eingestuft.
Insgesamt konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Mobilfunkstrahlung mit Frequenzen der verbreiteten Modulationen GSM, UMTS und LTE sowie SAR-Werten, die unterhalb und oberhalb des empfohlenen Sicherheitsstandards liegen und typischerweise bei Handytelefonaten auftreten, keine Effekte in Zellen des blutbildenden Systems unter den gegebenen Versuchsbedingungen induziert wurden. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Weiterhin wurden zum ersten Mal humane hämatopoetische Stammzellen für derartige Untersuchungen eingesetzt. Dies hat insofern eine besondere Bedeutung, als hämatopoetische Stammzellen aufgrund ihrer multipotenten Eigenschaften eine breitere Analyse mit Hinblick auf die Kanzerogenese und auf das Immunsystem ermöglichen.
Um über die Mobilfunk-Untersuchungen hinaus die hämatopoetischen Stammzellen besser charakterisieren zu können, sowie die Sensitivität von Blutzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsstatus zu analysieren, wurden sie anderen Zellen des blutbildenden Systems (undifferenzierte und differenzierte HL-60-Zellen und TK6-Zellen) gegenübergestellt. Eine Behandlung der verschiedenen Zelltypen mit mutagenen Substanzen zeigte, dass sich die hämatopoetischen Stammzellen in den meisten der untersuchten Endpunkte von den Zelllinien unterschieden. Deutliche Abweichungen zeigten sich beim oxidativen Stress, der DNA-Reparatur und der Histonacetylierung; kein Unterschied konnte dagegen bei den DNA-Schäden beobachtet werden. Eine erste Interpretation der erhaltenen Ergebnisse ist auf der Grundlage der unterschiedlichen Eigenschaften von Zellen mit abweichendem Differenzierungsstatus möglich. Um jedoch eine eindeutige Aussage treffen zu können, müssten noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden.
Die vorliegende Arbeit behandelt TRAIL-induzierte Apoptose und Nekroptose in verschiedenen Zelllinien. Im Speziellen wurden die verschiedenen Funktionen des TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) untersucht. Hierzu wurde ein transienter Knockdown etabliert und dessen Wirkung auf die Suszeptibilität der Zellen gegenüber dem Zytokin TRAIL untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von TRAF2 nicht nur zur Sensitivierung für Apoptose führt, sondern auch in Nekroptose-kompetenten Zellen zu einer Verstärkung der durch Caspaseinhibition mittels zVAD-fmk nach TRAIL-Stimulation induzierten Nekroptose führt. Mittels des Zytokins Fc-TWEAK wurde Fn14-vermittelt TRAF2 aus dem Zytosol in ein Triton X100-unlösliches Kompartiment rekrutiert und dadurch physiologisch depletiert. Dies führte zwar kaum zu gesteigerter TRAIL-abhängiger Apoptose, sensitivierte jedoch analog zum TRAF2-Knockdown RIP3-exprimierende Zellen für Nekroptose. Durch Vergleich RIP3-negativer (HeLa-Leervektor) mit RIP3-exprimierenden Zellen (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) konnte die Essentialität von RIP3 für die Nekroptose herausgestellt werden und Einsatz des RIP1-Kinase-Inhibitors Necrostatin-1 sowie des MLKL-Inhibitors Necrosulfonamide belegte die Beteiligung der Nekroptosomkomponenten RIP1 und MLKL. Antagonismus putativen autokrinen TNFs bewies, dass es sich bei dem durch Fc-TWEAK verstärkten Zelltod um einen direkten TRAIL-Effekt handelte und Inhibition kanonischen NFkBs durch IKK2-Inhibitor TPCA-1, dass die TRAF2-Knockdown-vermittelte Sensitivierung gegenüber TRAIL nicht auf verändertes NFkB-Signalling zurückzuführen ist. Einsatz des SMAC-Mimetikums BV6 rekapitulierte zudem stark das im TRAF2-Knockdown Gesehene und unterstrich die Bedeutung der cIAPs. Immunpräzipitation von Caspase 8 unter nekroptotischen Bedingungen zeigte bei TRAF2-Knockdown eine Depletion von TRAF2 und cIAP1/2 sowie RIP1 und RIP3 aus dem Komplex mit Caspase 8. Insgesamt wird deutlich, dass TRAF2 einerseits antiapoptotisch wirkt als K48-Ubiquitinligase, die die Halbwertszeit aktiver Caspase 8-Komplexe determiniert und andererseits eine antinekroptotische Funktion hat, da es durch Rekrutierung von cIAP1/2 an RIP1 die TRAIL-induzierte Nekroptose verhindert, wenn die Caspasen inhibiert sind.
Fas (Apo-1/CD95) ist ein Mitglied der TNF (Tumor Necrosis Factor)-Familie, dass über die rezeptoreigene Todesdomäne Caspase 8-vermittelt Apoptose induzieren kann. Dies geschieht entweder auf direktem Wege durch Aktivierung von Caspase 3 oder durch die zusätzliche, für den Untergang der Zellen essentiellen Stimulation des intrinsischen mitochondrialen Signalwegs. Abhängig von der jeweiligen Art der Apoptoseinduktion werden Zellen somit in Typ I oder Typ II unterteilt. Durch das Vorhandensein von antiapoptotischen Proteinen wie unter anderem Bcl-xL kann in Letzterem negativ regulierend auf den Signalweg eingegriffen werden (siehe Abb. 3). Während der Aktivierung des Fas-Signalweges kommt es zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen JNK, p38-MAPK und ERK; dies alleine ist jedoch nicht ausreichend für die Induktion des Zelltodes und findet ebenfalls in apoptoseresistenten Zellen statt. Weiterhin wurde bei der Regulation entzündlicher Prozesse eine Beteiligung von Fas beschrieben18. Bedingt durch die hohe Dichte an Fas und seinem Liganden FasL auf T-Zellen nimmt es durch Apoptoseinduktion auf T-Zellen selbst oder deren Zielzellen indirekt auf verschiedene Formen entzündlicher oder immunregulatorischer Prozesse wie beispielsweise die Transplantatabstoßung Einfluss.
Seit vielen Jahren ist zudem bekannt, dass durch die Aktivierung des Fas-Signalweges auch nichtapoptotische Signalwege induziert werden können. Beispielhaft hierfür steht der NF-B-Signalweg, welcher letztendlich zur Transkription antiapoptotischer Zielgene führt. Auch hierbei kommt es Caspase 8-vermittelt zur Phosphorylierung von JNK, p38-MAPK und ERK, weiterhin scheint eine Aktivierung dieses Signalweges in Zusammenhang mit einer erhöhten Produktion von Interleukin 8 zu stehen49.
Im Rahmen dieser Arbeit hat sich nun gezeigt, dass die Aktivierung von Fas sowohl durch die Aktivierung von Caspase 8 als auch durch unabhängige Mechanismen zur Aktivierung von JNK führt. Hierbei wurde durch Stimulation der apoptosesensiblen T-Zelllinie Jurkat mit dem vorvernetzten FasL die Phosphorylierung von JNK bei nativen
Zellen ebenso wie mit dem Caspaseinhibitor zVAD vorbehandelnden Zellen nachgewiesen.
Des Weiteren konnte in den wenig apoptosesensitiven KB-Zellen sowie in den transfizierten und somit apoptoseresistenten Colo 357 Bcl-xL Zellen ein caspaseabhängiger, jedoch apoptoseunabhängiger Signalweg zur Aktivierung von JNK nachgewiesen werden. Dieses Phänomen scheint vom Zelltyp abhängig zu sein. Die Stimulation der Colo 357 Bcl-xL Zellen führte nach Vorbehandlung mit CHX, das eine Todesrezeptor-vermittelte, verstärkte Caspase 8-Aktivierung bewirkt, zur Aktivierung von JNK, während im simultan durchgeführten Zytotoxizitätsessay das Überleben der Zellen bestätigt werden konnte. Bei Zugabe des Caspaseinhibitors zVAD konnte in den Colo 357 Bcl-xL Zellen kein phosphoryliertes JNK nachgewiesen werden, während in den KB-Zellen eine Aktivierung von JNK bei reduzierter Konzentration von zVAD mit jedoch bestehendem Apoptoseschutz, graduell stattfand.
Zuletzt wurde der Einfluss der JNK-Aktivierung auf die Interleukin 8 Produktion untersucht. Hierzu wurde die Interleukin 8 Produktion bei Colo 357 Bcl-xL Zellen unter Stimulation mit FasL gemessen und mit der Produktion nach Vorbehandlung mit zVAD verglichen. Hierbei zeigte sich eine unveränderte Produktion von Interleukin 8, was einen JNK-unabhängigen Weg postuliert, da JNK, wie im Vorversuch gezeigt, in dieser Zelllinie durch zVAD inhibiert wird. Unter Zugabe des JNK-spezifischen Inhibitors JNKII kommt es jedoch zu einer deutlichen, aber Konzentrations-abhängigen Suppression der Interleukin 8 Produktion, was in direktem Widerspruch zu dem vorab bestehenden Ergebnis steht. Möglicherweise führt eine erhöhte Konzentration von JNKII zu einer Hemmung zusätzlicher Signalwege wie beispielsweise der des NF-B-Signalweges, was indirekt zu einer Beeinflussung der Interleukin 8-Produktion führt. Weiterhin könnte eine obligat gemeinsame Aktivierung des JNK und des NF-B-Signalweges zur Interleukin 8 Produktion notwendig sein.
Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ besitzt sehr vielgestaltige Funktionen und ist an Wachstums-und Differenzierungsvorgängen verschiedener Gewebe beteiligt. So fördert es in T-Lymphozyten über Transaktivierung des Il4-Promotors und Repression der TH1-Zytokine IL-2 und IFN-γ die Bildung eines TH2-Phänotyps [Berberich-Siebelt et al. 2000]. Durch Herabregulation von c-Myc bewirkt es einen Zellzyklusarrest in G1 und vermehrte Differenzierung der Zellen auch über eine reziproke Steigerung von Differenzierungsfaktoren wie Mad4 [Berberich-Siebelt et al. 2006]. In einer den G1-Arrest nachweisenden Zellzyklusanalyse von mit C/EBPβ transduzierten EL-4 Zellen zeigte sich daneben ein kleiner Sub-G1-Peak, der auf eine apoptotische Zellpopulation hinweist [Berberich-Siebelt et al. 2006]. Aufgabe dieser Arbeit war es, den möglichen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von C/EBPβ und Auslösung von Apoptose in EL-4 Zellen hinsichtlich seiner Spezifität und dabei favorisierter Signalwege zu untersuchen.
Gegenstand der Untersuchungen waren mit dem C/EBPβ-ERTM-Konstrukt alleine und in Kombination mit dominant-negativen Mutanten der Caspase-3 und der Caspase-9 transduzierte EL-4 Kulturzellen. Durch Einbringen der Caspasemutanten sollte eine kompetitive Hemmung der entsprechenden endogenen Caspasen bewirkt werden. Methodisch erfolgten Apoptosenachweise mittels durchflusszytometrischer Analysen von mit Annexin V-PE und 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) gefärbten EL-4 Zellen sowie die Detektion von gespaltener PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase), einem Substrat der Caspase-3 im Western Blot. Des Weiteren erfolgten mittels Ribonuklease-Protektionsanalysen Untersuchungen der RNA-Expression von Zytokinen, Caspasen und von Mitgliedern der Myc- und der Bcl-2-Proteinfamilien, um das Verhalten der Zellen unter Hemmung von Apoptosewegen bzw. Caspasen bei Aktivierung von C/EBPβ näher betrachten zu können.
In Annexin V-PE- und 7-AAD-Färbungen sowie durch Nachweis der spezifischen Spaltung von PARP konnte gezeigt werden, dass C/EBPβ Zelluntergang und Apoptose fördert. Diese war durch den Pancaspaseinhibitor Z-VAD fmk hemmbar, was, wie auch die PARP-Spaltung, auf einen caspaseabhängigen Signalweg hinweist. Hemmung der Caspase-3 durch Transduktion der Zellen mit einer Caspase-3-Mutante besaß kaum Einfluss auf die durch C/EBPβ veränderte Zytokinexpression und die Repression von c-Myc, doch erschien eine vermehrte Hochregulation des Differenzierungsfaktors Mad4, der endogenen Caspase3- und der Caspase11-RNA. Die Steigerung von Caspase-3 unter Aktivierung von C/EBPβ fand sich auch auf Proteinebene. Allerdings konnte eine Hemmung der Caspase-3 bei den untersuchten EL-4 Zellen die durch C/EBPβ vermittelte Apoptose nicht verhindern, was auf andere Apoptosewege oder kompensatorischer Effekte verwies. Durch Beeinflussung des intrinsischen Signalweges mit Hemmung der Caspase-9 zeigten sich ebenfalls kaum Auswirkungen auf die Zytokinexpression der untersuchten Zellen. Hier fanden sich Hochregulationen sowohl der pro- als auch antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Funktionell konnte auch eine Hemmung von Caspase-9 die Zellen nicht vor der Apoptose durch Aktivierung von C/EBPβ bewahren.
So konnte hier gezeigt werden, dass Aktivierung von C/EBPβ in den untersuchten EL-4 Zellen Apoptose fördern kann, dies über eine Aktivierung der Caspasekaskade zu geschehen scheint und mit einer Steigerung endogener Caspase-3-Expression einhergeht. Aus den Untersuchungen dieser Arbeit konnte eine Favorisierung eines bestimmten Apoptosesignalweges nicht abgeleitet werden, da eine Hemmung des intrinsischen Weges die Zellen nicht vor dem Zelltod schützen konnte. Insgesamt lässt sich aber, obwohl nicht alle Details geklärt werden konnten, festhalten, dass C/EBPβLAP in T-Zellen neben Proliferationshemmung und Differenzierungsinduktion auch für Caspase vermittelten Zelltod verantwortlich ist.
Die endotheliale Dysfunktion stellt eine der Hauptursachen für die Entstehung von Atherosklerose an humanen Gefäßwänden dar und ist somit auch wesentlich an der Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt. Das proinflammatorische Zytokin Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) gilt als einer der Hauptinduktoren der endothelialen Dysfunktion. Da bei der Endothelzellapoptose unter TNF-α diverse rezeptorvermittelte oxidative Prozesse innerhalb der Zelle ablaufen, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, inwiefern das Multidrug Resistance Associated Protein-1 (MRP-1) bei diesen oxidativen Prozessen und bei der Modulation der TNF-α-Signalkaskade involviert ist.
Die Stimulation des CD95-Todesrezeptors durch seinen natürlichen membranständigen Li-ganden CD95L führt zur kontextabhängigen Aktivierung von sowohl apoptotischen als auch nicht-apoptotischen Signalwegen. Durch Proteolyse wird aus dem membranständigen CD95L löslicher trimerer CD95L freigesetzt. Die Bindung von löslichem trimerem CD95L an CD95 ist nicht ausreichend, um die CD95-Signaltransduktion effizient zu stimulieren. Die Fähigkeit von löslichen CD95L-Trimeren CD95-vermittelte Signalwege robust zu aktivieren kann jedoch durch Oligomerisierung und artifizielle Immobilisierung an eine Oberfläche drastisch gesteigert werden. In dieser Arbeit wurde zunächst bestätigt, dass nur oligomere CD95L-Varianten, die z.B. durch Antikörpervernetzung von N-terminal getaggten rekombinanten CD95L-Varianten oder durch eine gentechnisch erzwungene Hexamerisierung von CD95L-Molekülen erhalten wur-den, in der Lage sind, effizient apoptotische und nicht-apoptotische Signalwege zu aktivieren. Ferner zeigte sich dann, dass die Bindung von löslichen CD95L-Trimeren nicht ausreichend ist, um die Translokation von CD95-Molekülen in detergenzunlösliche „Lipid Raft“- Membrandomänen zu stimulieren. Die „Lipid Raft“-Translokation ist ein zentrales Ereignis bei der CD95-Aktivierung und vor allem für die Induktion der Apoptose bedeutsam. Dabei ist ein selbstverstärkender Prozess aus Caspase-8-Aktivierung und „Lipid Raft“-Assoziation des CD95 von Bedeutung. Um die Interaktion von CD95 und CD95L mit Hilfe von hoch sensitiven zellulären Bindungs-studien analysieren zu können, wurden in dieser Arbeit desweiteren CD95L-Fusionsproteine entwickelt und hergestellt, an welche N-terminal eine Gaussia princeps Luziferase (GpL)- Reporterdomäne gekoppelt ist. So konnte mit den GpL-CD95L-Fusionsproteinen gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von CD95L-Trimeren keinen Effekt auf die Ligandenbele-gung des CD95 hat. Dies spricht dafür, dass die höhere spezifische Aktivität von oligomeri-sierten CD95L-Trimeren nicht auf einer Aviditäts-vermittelten Zunahme der apparenten Affi-nität beruht, sondern dies deutet darauf hin, dass die sekundäre Aggregation von sich initial bildenden trimeren CD95L-CD95-Komplexen eine entscheidende Rolle in der CD95-Aktivierung spielt. Durch Scatchard-Analysen zeigte sich ferner, dass trimerer CD95L mit mindestens zwei zellulären Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität interagiert. Bindungs-studien mit löslichen monomeren und trimeren GpL-CD95-Rezeptoren an membranständigen CD95L, als auch Inhibitionsstudien ergaben, dass trimerer CD95 weitaus besser an CD95L bindet. Dies legt nahe, dass es sich bei den zuvor beobachteten hoch- und niederaffinen Bindungsstellen für CD95L um monomere bzw. prä-assemblierte CD95-Moleküle handelt. Die GpL-CD95L-Fusionsproteine wurden auch genutzt, um die CD95-Translokation in „Lipid Rafts“ zu analysieren. So wurde trimerer GpL-CD95L als „Tracer“ zur Markierung von inaktiven CD95-Molekülen eingesetzt. Nach Aktivierung der übrigen freien CD95-Moleküle mit hoch aktivem hexameren Fc-CD95L konnte eine Zunahme der inaktiven GpL-CD95L-markierten Rezeptoren in „Lipid Rafts“ beobachtet werden. Offensichtlich stimulieren also aktivierte CD95-Moleküle in „trans“ die Ko-Translokation inaktiver CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Dies bestätigte sich auch in Experimenten mit Transfektanten, die einen chimären CD40-CD95-Rezeptor exprimieren. Letzterer ist nach Stimulation mit CD40L in der Lage, intrazellu-läre CD95-vermittelte Signalwege zu aktivieren. Die Aktivierung von CD95-assoziierten Sig-nalwegen durch Stimulation von endogenem CD95 in CD40-CD95-Transfektanten resultierte nun in der Ko-Translokation von unstimulierten CD40-CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Vice versa zeigte sich die Ko-Translokation von endogenem CD95 nach spezifischer Aktivierung des chimären CD40-CD95-Rezeptors. Schlussendlich erwiesen sich eine funktionsfähige Todesdomäne und die Aktivierung der Caspase-8 als essentiell für die „Lipid Raft“-Assoziation von aktivierten CD95-Molekülen und auch für die durch diese Rezeptorspezies induzierte Ko-Translokation von inaktiven Rezeptoren in „Lipid Rafts“.
Die Apoptose der Leberzellen ist abhängig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellulären Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener äußerer Einflüsse und natürlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzustände anzunehmen. Die verschiedenartigen Einflüsse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzustände. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzustände, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst verändert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellulären Netzwerkes und seiner verschiedenen Zustände dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabhängig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer Übereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-Möglichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso berücksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsmöglichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazelluläre Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten.
TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/Apo-2 Ligand ist ein Mitglied der TNF (tumor necrosis factor)-Superfamilie, das in den vergangenen Jahren als potentielles Tumortherapeutikum breite Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. Denn über seine korrespondierenden Todesrezeptoren induziert TRAIL vornehmlich in Tumorzellen den apoptotischen Zelltod, während normale Zellen unbeschadet bleiben (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Neuere Studien belegen allerdings, dass die TRAIL-Todesrezeptoren neben ihrer herausragenden Funktion als Auslöser der Apoptose zusätzlich die Fähigkeit zur Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden vornehmlich die nicht-apoptotischen Signalwege wie die MAPK-Kaskaden sowie die NFkappaB-Signalwege in Verbindung mit der Aktivierung von Apoptose sowie der Induktion des Chemokins IL-8 analysiert. Hierfür wurde die humane Pankreasadenokarzinomzellinie Colo 357 verwendet. In den Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAP Kinasen JNK, ERK und p38 in Colo 357 Zellen induziert. Die Induktion erfolgte hierbei unabhängig vom apoptotischen Zelltod aber abhängig von der Aktivierung der Caspasen. Desweiteren konnte eine TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB in Colo 357 Zellen demonstriert werden. Anhand von ELISA-Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl die Aktivierung der MAP Kinasen als auch die Aktivierung von NFkappaB eine essentielle Rolle bei der TRAIL-vermittelten Induktion von IL-8 spielen. Durch die Induktion von IL-8 wiederum kann TRAIL inflammatorische Effekte induzieren. Im Hinblick auf eine potentielle Tumortherapie mit TRAIL legen die Daten dieser Studie die Notwendigkeit von Kombinationstherapien mit TRAIL nahe. So kann durch die Kombination von TRAIL mit anti-inflammatorisch wirkenden Medikamenten eine Reduktion entzündlicher Nebenwirkungen erzielt werden. Andererseits kann durch Verwendung von TRAIL zusammen mit Proteasom-Inhibitoren die Resistenz gegenüber TRAIL-vermittelter Apoptose vermindert werden und gleichzeitig eine anti-inflammatorische und NFkappaB-hemmende Wirkung erzielt werden.
In dieser Arbeit sollte die Funktion von FGF-Signalen im Herzfeld und in der Entwicklung des Proepikards im Hühnerembryo untersucht werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) sind eine große Gruppe von Signalmolekülen und in eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen involviert. Das Proepikard (PE), welches sich asymmetrisch auf dem rechten Sinushorn des Sinus venosus entwickelt, bildet die Grundlage des Koronargefäßsystems des Herzens. FGF-Liganden (FGF2, FGF10, FGF12) werden insbesondere in den epithelialen Zellen des Proepikards exprimiert, sowie an der sinomyokardialen Basis dieser embryonalen Progenitorpopulation. Die FGF-Rezeptoren (FGFR1, FGFR2, FGFR4) weisen ein ähnliches Expressionsmuster auf und deren Inhibition, durch spezifische Antagonisten, war der Ausgangspunkt für die funktionelle Analyse der proepikardialen FGF-Signalaktivität. Die Inhibition von FGF-Signalen in vitro führt zu einem verringerten Wachstum sowie einer erhöhten Apoptoserate in proepikardialen Explantaten, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der Ras/MAPK- als auch der PI3-Kinase-Signalweg, beides Bestandteile der FGF-Signaltransduktion, für das Wachstum und Überleben proepikardialer Zellen verantwortlich sind. Dagegen sind FGF-Signale nicht in die Etablierung proepikardialer Identität involviert, wie die Analyse der Expression etablierter proepikardialer Markergene wie TBX18, WT1 und TBX5 nach FGF-Inhibition zeigte. Dies konnte gleichfalls durch in vivo-Experimente gezeigt werden, in denen die rechtsseitige Inhibition von FGF zu einem retardierten Proepikardwachstum führte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die asymmetrische Apoptose in der sich transient entwickelnden linksseitigen Proepikardanlage auf eine frühe differentielle Expression von Apoptosegenen wie Caspase 2 zurückgeht. Diese asymmetrische Expression wird von FGF8 reguliert, wahrscheinlich als Teil eines frühen rechtsseitigen Signalweges, der Apoptose im rechten Sinushorn des kardialen Einflusstraktes verhindert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression der Hyaluronansynthase 2 (HAS2) in Abhängigkeit von FGF in der Herzfeldregion analysiert. Hyaluronansynthasen produzieren Hyaluronsäure, welches eine essentielle Komponente der extrazellulären Matrix ist. Es wurde in vivo gezeigt, dass die Expression von HAS2 im primären Herzfeld in gleicher Weise von FGF reguliert wird wie die des kardialen Transkriptionsfaktors NKX2.5. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass FGF während der frühen Entwicklung des Herzens und der Entstehung des Proepikards diverse Funktionen besitzt.
Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erfüllt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilität und anti-apoptotische Funktion von A1 wird über den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch für den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminosäuren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilität und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gewählt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, während eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht möglich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in Stärke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es müssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein für den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterstützen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilität als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anhängt und das Protein damit für den proteasomalen Abbau markiert.
1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.
Primäre Nestin-positive adulte Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Phänotypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Primärzellen in Kultur begründet, das in der vorliegenden Arbeit ausführlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und führt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorläuferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen könnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile Überex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 fördernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-überexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zurückzuführen. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und Überlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zellähnlichen Phänotypen differenzierbarer Vorläuferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur Lösung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie für den Diabetes mellitus leisten.
TNF-Liganden liegen primär in membranständiger Form mit trimerer Struktur vor und die meisten von ihnen können sekundär durch Metalloproteasen in lösliche trimere Liganden prozessiert werden. Während membranständige Formen der TNF-Liganden ihre korrespondierenden Rezeptoren aktivieren können, sind die löslichen Varianten einzelner TNF-Liganden unterschiedlich aktiv beziehungsweise inaktiv an den korrespondierenden Rezeptoren, obwohl sie ebenfalls zur Bindung in der Lage sind. Dies konnte bereits in Studien für TNF und TRAIL gezeigt werden. Die Unterschiede zwischen löslichen Varianten und der membranständigen Form des Liganden betreffen sowohl die Rezeptorselektivität als auch den Aktivierungsgrad am Rezeptor bis hin zu völliger Inaktivität der löslichen Form. Unterschiede finden sich jedoch nicht nur hinsichtlich der Aktivität, sondern auch in der Interaktion des Liganden mit dem Rezeptor. Für die membranständige und die lösliche Form von FasL konnten Unterschiede in der Notwendigkeit intrazellulärer Signalmoleküle bei der Ausbildung Ligand-induzierter Rezeptorsignalcluster gezeigt werden. Für die lösliche und membranständige Form des CD40L werden eine unterschiedliche Rezeptorinternalisierung und eine unterschiedliche Rekrutierung von TRAF-Molekülen angenommen. Bisherige Arbeiten zur Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion stützen sich meist auf lösliche Varianten von TNF-Liganden, die durch artifizielle Multimerisierung oder Antikörper-induzierte Quervernetzung sekundär aktiviert werden müssen. Um für die Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion in Zukunft realitätsnähere Bedingungen zu schaffen, sollten im Rahmen dieser Arbeit multifunktionelle Fusionsproteine des membranständigen FasL und CD40L hergestellt und charakterisiert werden. Die Fusionsproteine wurden im Rahmen der Klonierung so konstruiert, dass von der aminoterminalen Seite beginnend eine GST-Domäne, ein Flag-Tag, ein YFP-Tag und abschließend die vollständige membranständige Form des Liganden (FasL oder CD40L) aneinander gefügt wurden. In FACS-Analysen konnte sowohl die Funktion des YFP-Tag als auch die korrekte Expression des Liganden an der Zelloberfläche durch spezifische Antikörperfärbung nachgewiesen werden. Die funktionelle Aktivität der Liganden wurde durch IL-8-Induktion gezeigt, die eine Aktivierung des NFB-Signalweges durch die GST-Fusionsproteine des membranständigen FasL und des membranständigen CD40L beweist. Im Rahmen von Immunopräzipitationen wurde die Möglichkeit der Detektion der Fusionsproteine über ihr Flag-Tag getestet. Für das in GST-pull-down-Assays genauer untersuchte membranständige GST-Flag-YFP-CD40L-Fusionsprotein gelang eine Koimmunopräzipitation mit dem im Rezeptorkomplex gebundenen TRAF2. Für dieses in der Signaltransduktion des CD40 entscheidende Molekül konnte seine transiente Interaktion mit dem Rezeptorsignalkomplex sowie eine Veränderung in der Assoziation an den Rezeptor durch TNF-abhängige TRAF1-Induktion gezeigt werden. Im Zusammenhang der mit der Rezeptoraktivierung oftmals gleichgesetzten Bildung von Rezeptorsignalclustern durch den entsprechenden TNF-Liganden war die Beobachtung interessant, dass das Konstrukt GST-Flag-YFP-CD40L im Gegensatz zum analog konstruierten GST-Flag-YFP-FasL nicht in der Lage war, Signalcluster des korrespondierenden Rezeptors zu erzeugen, aber dennoch fähig war, eine Rezeptoraktivierung zu bewirken. Hinsichtlich der Untersuchung von Unterschieden in der Rezeptor-Ligand-Interaktion von löslichen und membranständigen Formen sind für FasL und CD40L noch viele Fragen offen, die beispielsweise auch die Stabilität von Rezeptorsignalclustern betreffen. Die in dieser Arbeit erzeugten und charakterisierten multifunktionellen Fusionsproteine sollten helfen, neue Erkenntnisse bezüglich der molekularen Grundlagen der Rezeptor-Ligand-Interaktion zu erzielen.
Der intrazelluläre Hormonrezeptor PPARgamma spielt eine Rolle in vielen Differenzierungsprozessen. Zudem konnte in multiplen malignen Tumoren verschiedenen Ursprungsgewebe gezeigt werden, dass sowohl Proliferation als auch Apoptose beeinflusst werden können und so eine neuartige antiproliferative Therapieoption bestehen könnte. Im Barrettadenokarzinom des distalen Ösophagus, einer malignen Neoplasie auf dem Boden von Magensäure- und Dünndarmsekretreflux, sind diese Zusammenhänge bisher nicht ausreichend untersucht. Ziel dieser Studie sollte eine Untersuchung von Proliferation und Apoptose des Barrettadenokarzinoms unter dem Einfluss von einer PPARgamma-Aktivierung durch den synthetischen Agonisten Pioglitazon sein. Dazu wurden in vitro Zelllinien von Barrettadenokarzinomen und von Plattenepithelkarzinomen sowie humane Barrettgewebeproben auf Expression von PPARgamma untersucht. Zudem wurde nach Stimulation mit Pioglitazon die Wirkung auf Proliferation und Apoptose gemessen. Nach Generierung von soliden Tumoren in immundepletierten balb/c nu/nu Mäusen wurden diese mit Pioglitazon-haltigem Actos® stimuliert und das Tumorwachstum mit einer Kontrollgruppe verglichen. Zudem wurden nach Explantation der Tumore histologisch Apoptose- und Proliferationsverhalten bestimmt. Wir konnten zeigen, dass PPARgamma in humaner Barrettmukosa und in der humanen Barrettadenokarzinomzelllinie OE33 überexprimiert ist. PPARgamma-Aktivierung inhibiert das Wachstum von OE33-Barrett-Adenokarzinomzellen in vitro durch eine Induktion von Apoptose, während das Wachstum von transplantierten Tumoren, die von OE33-Zellen abgeleitet wurden, in vivo durch systemische PPARgamma-Aktivierung auf dem Boden einer gesteigerten Proliferation und einer Hemmung der Apoptose verstärkt wurde. Diese Ergebnisse charakterisieren PPARgamma als einen potentiellen molekularen Mediator, der in die Entwicklung eines Barrettepithels mit Metaplasie aus normalem Plattenepithel in dem gastro-ösophagealen Übergang involviert ist.
Die Tumorsuppressorproteine p33ING1b und p29ING4 (Inhibitor of Growth, ING) verhindern normalerweise die Entwicklung bestimmter Tumorarten, indem sie einen Transkriptionskomplex mit dem Tumorsuppressorgen p53 bilden. Die ING1b und ING4 Gene sind nach der Demonstration hoher Expressionswerte in verschiedenen Tumoren in den Mittelpunkt der Tumorforschung gerückt. Zudem hat die Immunogenität des p33ING1b Proteins in Patientinnen mit einem Mammakarzinom ihre potentielle Bedeutung für die Diagnose und eine auf dem Prinzip der Vakzinierung basierende Behandlung demonstriert. Häufig wird das Nierenzellkarzinom von einer großen Anzahl mononukleärer Zellen einschließlich T-Lymphozyten, NK-Zellen und Makrophagen infiltriert. Dabei wurde für frühe Tumorstadien in der vorliegenden Arbeit eine erhöhte Serumkonzentration an IL-2 und dessen Rezeptor (IL-2R) gezeigt, die auf eine erhöhte T-Zellproliferation und Aktivierung der Immunantwort im Tumorpatienten hindeutet. Eine verstärkte Expression von Zytokinen wie IFN-γ und TNF-α neben IL-2 im Serum weist, wie nachgewiesen, auf eine verstärkte Aktivierung von Th1 und zytotoxischen Tc1 Zellen im Tumorpatienten hin. Im Tumorgewebe selber akkumulieren T-Zellen in den Anfangsstadien des Nierenzellkarzinoms. Dies lässt eine lokale Tumorimmunantwort vermuten. Im peripheren Blut von Patienten später Stadien weisen die Ergebnisse dieser Arbeit jedoch auf eine stadienabhängige Abschwächung der gegen den Tumor gerichteten Th1-Antwort und eine Stärkung der Th2/Treg-Antwort mit supprimierender Auswirkung auf die Tumor-Immunabwehr hin. In fortgeschrittenen Tumorstadien bedeutet dies eine zunehmend inaktive Tumorimmunantwort. Intratumoral überwogen sowohl IL-10 positive CD4+ und CD8+ als auch IL-2 positive CD8+ T-Zellen, von denen immunsuppressive Effekte auf die Tumorimmunantwort vermutet werden. Möglicherweise entsteht durch eine Verschiebung im Zellverhältnis von zytotoxischen und T-Helferzellen gegenüber supprimierenden und regulatorischen Zellen ein Selektionsvorteil für das weitere Tumorwachstum. So wäre eine zytotoxische Immunantwort gegen den Tumor zunehmend ineffektiv. Immunologische Therapieansätze stellen wegen der Möglichkeit eines selektiven Angriffs auf Tumorzellen ein attraktives Konzept dar. Diese Arbeit zeigt, dass etwa 40% der untersuchten Patienten früher wie auch später Stadien eine signifikante Überexpression des ING1b Gens und über 30% eine signifikante Überexpression des ING4 Gens aufwiesen. Eine zytotoxische CD8+ sowie CD4+ T-Zell-Tumorimmunantwort gegen diese im Tumor selektiv überexprimierten Proteine könnte sich somit als ein attraktives Therapieziel erweisen. In der in begrenztem Umfang, da nicht thematischer Schwerpunkt der Arbeit, durchgeführten HLA-Analyse zeigte sich für die untersuchten HLA-A, -B und -C sowie HLA-DRA und -DRB Antigene im untersuchten Patientenkollektiv eine heterogene Genexpression. Der für verschiedenen Tumoren beschriebene Verlust von HLA Klasse I Molekülen auf der Tumorzelloberfläche stellt offensichtlich keine Allgemeingültigkeit dar. Beim Nierenzellkarzinom ist diese Beobachtung nach der eigenen Datenlage nicht unbedingt mit einem oft diskutierten Escape-Mechanismus gleichzusetzen. Dagegen zeigten sämtliche Patienten früher Stadien und 75% fortgeschrittener Tumoren eine signifikant herabregulierte HLA-G Expression auf. Die Bedeutung des HLA-G Moleküls für das Nierenzellkarzinom bleibt unklar, für andere Tumorentitäten wird es derzeit kontrovers diskutiert. Dessen Überexpression könnte sich als ein Selektionsvorteil für den Tumor herausstellen. Die Tatsache, dass sowohl im Tumor als auch im peripheren Blut p29ING4-positive T-Zellen nachweisbar sind, und dass diese Zellen in fortgeschrittenen Tumorstadien abnehmen, wurde in dieser Arbeit eindrücklich gezeigt. Dabei war der Anteil p29ING4-positiver CD4+ T-Zellen in frühen Tumoren größer als der spezifischer CD8+ T-Zellen. Dabei könnte es sich vermutlich um CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Zellen handeln. Die Sequenz p29ING4 aa 149-158 bewirkte eine IL-2-Antwort and war für eine verstärkte Expression des IFN-γ in PBLs von Patienten früher Stadien bedeutsam. Sie löste dazu nur eine geringe IL-10-Antwort aus. Dies deutet auf eine stimulierende Rolle dieses p29ING4 Epitops für die Induktion einer zytotoxischen Tc1- aber auch einer Th1-vermittelten T-Zellantwort in den PBLs der Tumorpatienten hin. Schlussfolgernd wäre die therapeutische Effizienz des identifizierten p29ING4 Epitops für eine Immuntherapie klinisch zu überprüfen. Möglicherweise stellt eine auf p29ING4-basierte Immuntherapie in Kombination mit CTLs, die durch eine begleitende Zytokintherapie (z.B. INF-α und IL-2) aktiviert werden, bei Patienten mit p29ING4-überexprimierenden Nierentumoren ein wirksames immunologisches Therapiekonzept für die Zukunft dar.
TNF (Tumor Nekrose Faktor) vermittelt seine biologischen Funktionen durch Interaktionen mit TNFR1 (TNFRezeptor 1) und TNFR2 (TNFRezeptor 2). In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der TNFR2 sowohl durch die Induktion von membrangebundenem TNF als auch durch die proteasomale Degradation von TRAF2 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 2) die TNFR1-vermittelte Apoptose verstärken kann. Des Weiteren war bekannt, dass TRAF1 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 1), ein anderes Mitglied der TRAF-Familie, mit TRAF2 Heterotrimere bilden kann und zudem nach TNF-induzierter NFkappaB- (nuclear factor kappaB) Aktivierung verstärkt exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass TRAF1 in beide TNFR-Signalkomplexe rekrutiert wird und darin in einem TRAF2/TRAF1-Heterotrimer TRAF2 funktionell ersetzen kann. Darüber hinaus verhindert TRAF1 die Rekrutierung von TRAF2 in lipid rafts sowie dessen anschließende proteasomale Degradation. Auf diese Weise kann TRAF1 die TNFR2-abhängige Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose verhindern. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die TNF-vermittelte Aktivierung der JNK (c-Jun N-terminale Kinase), dessen Regulation durch ROS (reactive oxygen species), Caspasen (Cysteinyl-Aspartat-spezifische Proteasen) sowie NFkappaB-induzierte Faktoren untersucht. TNF induziert in den meisten Zellen zunächst nach zehn bis 30 Minuten eine transiente JNK-Aktivierung, woraufhin bei NFkB-inhibierten Zellen eine zweite andauernde JNK-Aktivierung folgt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Studien gehen dabei von einem ROS-abhängigen, Caspase-unabhängigen Mechanismus der persistierenden JNK-Aktivierung aus. Des Weiteren wurde in den vor allem bei embryonale Mausfibroblasten durchgeführten Untersuchungen davon ausgegangen, dass bestimmte NFkappaB-induzierte Radikalfänger die andauernde Aktivierung der JNK verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den humanen Zelllinien KB, Jurkat und HaCaT die andauernde Aktivierung der JNK, im Gegensatz zur transienten JNK-Aktivierung, Caspase-abhängig verläuft. Es ergab sich überdies, dass die inhibierende Wirkung des NFkB-Signalweges auf die persistierende JNK-Aktivierung in diesen Zelllinien in erster Linie auf die indirekte Verhinderung der Apoptose durch die Induktion von antiapoptotischen Proteinen wie Flip-L (FLICE-inhibitory protein long) und IAPs (inhibitor of apoptosis) zurückzuführen ist, als auf die direkte Expression von Radikalfängern. Zudem wurde in den untersuchten Zelllinien die Caspase-vermittelte Spaltung von MEKK-1 (MAP/ERK kinase kinase-1) und p21WAF/Cip 1 nachgewiesen, von denen bekannt ist, dass die Spaltprodukte eine JNK-stimulierende Wirkung haben. Dennoch müssen künftige Studien zeigen, ob die Spaltung von p21WAF/Cip 1 und MEKK-1 in Fragmente mit JNK–stimulierender Aktivität oder andere Caspasesubstrate für die Caspase-vermittelte andauernde Aktivierung der JNK verantwortlich sind.
Der erste Teil der vorliegenden Arbeit befasste sich mit der Wirkung von Antioxidantien auf die Apoptose. Dabei sollte vor allem die Abhängigkeit der Apoptosereaktion von der verwendeten Zellinie geprüft werden. Zwei verschiedene Zellmodelle kamen zum Einsatz, A3.01 T-Zelllymphoblasten und E6-1 Jurkat-Zellen. Als Antioxidantien wurden das natürlich vorkommende N-Acetylzystein und das synthetische Antioxidans BHA ausgewählt. Die Zellen wurden mit CD95L stimuliert, und mit den entsprechenden Antioxidantien behandelt. Nach der Inkubation wurden sie mit AnnexinV und 7AAD gefärbt. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, 7AAD an den Nukleus. Die Zellen wurden im Durchflusszytomter analysiert. Zellen, die nur Annexin V positiv waren, wurden als apoptotisch gezählt, während Zellen die für AnnexinV und 7AAD positiv waren (also einen Membranstörungen aufwiesen) als nekrotisch betrachtet wurden. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich schließen, dass die Apoptose in verschiedenen Zelllinien über unterschiedliche Signalwege vermittelt wird. A3.01 Zellen waren bereits für die Existenz eines nekrose-ähnlichen Zelltodes unter Caspaseinhibition bekannt. BHA konnte diesen nekrose-ähnlichen Zelltod verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass BHA nach Apoptoseinduktion ohne Caspaseinhibitoren eine stärkere Apoptose induziert als ein CD95-Ligand alleine. Dieselbe Reaktion konnte bei peripheren Blutmonozyten (PBMC) beobachtet werden. Bei E6-1 Jurkat-Zellen, die nach Inhibition der Caspase keinen nekrotischen Zelltod erleiden, kam es nach der Behandlung mit BHA und CD95 zu einer Abnahme der Apoptose. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die verwendeten Zellinien unterschiedlichen Zelltypen angehören: A3.01 Zellen und PBMC könnten den Typ 1 Zellen zugeordnet werden, die für die Durchführung der Apoptose auf Caspasen angewiesen sind, E6-1 Zellen könnten Typ 2 Zellen verkörpern, die zusätzlich noch auf mitochondriale Stimulation angewiesen sind, um apoptotisch zu werden. Diese mitochondriale Stimulation könnte durch BHA verhindert werden und so bei E6-1 Jurkat-Zellen Apoptose verhindern. NAC hingegen zeigte in der vorliegenden Arbeit einen anti-apoptotischen Effekt sowohl bei der A3.01 Zelllinie, als auch bei E6-1 Jurkat-Zellen. Hieraus könnte geschlussfolgert werden, dass NAC bereits zu einem früheren Zeitpunkt in den Ablauf der Apoptose eingreift. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Reaktivierung von HIV in der chronisch-infizierten T-Zelllinie ACH-2 durch bakterielle CpG-Sequenzen. Auch hier wurden die Zellen mithilfe der Durchflußzytometrie analysiert. Die HIV-Replikationsrate wurde quantitativ mit einem p24-Antikörper gemessen. Es wurde gezeigt, dass CpG-Motive in dieser Zellinie in vitro eine Reaktivierung der HIV-Replikation bewirken. Dieser Effekt wurde nicht durch die PTO-Modifikation der CpG-ODN hervorgerufen, sondern war spezifisch für die CpG-Sequenzen. Eine Behandlung mit ODNs ohne CpG-Sequenzen führte nicht zu einer Induktion der HIV-Replikation in ACH-2-Zellen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die verwendeten Cpg-Sequenzen die latent-infizierte T-Zellinie ACH-2 nicht aktivieren, sondern nur die Virusreplikation anstoßen. Versuche mit humanen nicht-infizierten PBMCs zeigten, dass CD3-positive Zellen, ähnlich wie ACH-2-Zellen, durch CpG-ODNs nicht aktiviert werden, CD3-negative PBMCs dagegen konnten durch die Behandlung mit CpG-ODNs aktiviert werden. Die Reaktivierung von HIV konnte durch die Inhibition verschiedener Transkriptionsfaktoren nicht wesentlich beeinflusst werden. Die NFkB-Inhibtoren CAPE und SN50 und der ERK-MAP-Kinase-Inhibtor UO126 verhinderten die durch CpG-ODNs induzierte HIV-Replikation in ACH-2 Zellen nicht. Unter dem Einfluss von CAPE wurde sogar ein geringfügiger Anstieg der Virusreplikation beobachtet. Dieser Effekt ist wahrscheinlich aber durch die intrinsische Aktivität von CAPE erklärbar. Die Frage nach den distalen Faktoren in den aktivierten Signalwegen muss also unbeantwortet bleiben. Könnten die in dieser Arbeit in vitro beobachteten spezifischen Effekte der CpG-ODNs in vivo bei HIV-positiven Patienten ausgelöst werden, so wäre das ein Schritt mehr in Richtung der vollständigen Eliminierung des Virus aus dem infizierten Organismus. Durch diese Methode könnten die Virusreservoirs in ruhenden T-Zellen, Makrophagen und dentritischen Zellen reaktiviert werden und wären so einer effizienten Therapie mit HAART zugänglich. Als nächster Schritt in diesem Bereich der Forschung sollten deswegen Versuche zu der Wirkung von CpG-Sequenzen auf chronisch-infizierte Zellen HIV-positiver Patienten unternommen werden, um die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ex vivo zu untersuchen.
Die Stimulation von Lymphozyten durch alleinige Quervernetzung ihrer Antigenrezeptoren führt in Abhängigkeit von der Signalstärke zur Induktion von Apoptose. Dieser Prozess spielt im Rahmen der negativen Selektion von B-Zellen eine wichtige Rolle und kann am Beispiel von WEHI 231 Zellen, einer murinen Lymphomzelllinie modellhaft nachempfunden werden. Die Quervernetzung des B-Zellrezeptors (BZR) in WEHI 231 Zellen führt in Abhängigkeit von der Prozessierung der mitochondrialen Caspase 9 zu Apoptose. Dies kann durch Überexpression des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 verhindert werden. Interessanterweise besitzt A1 im Gegensatz zu Fast allen anderen Bcl-2 Proteinen keinen C-terminalen Bereich, der das Protein in intrazelluläre Membranen wie Mitochondrien und Endoplasmatisches Retikulum verankert. Ob und gegebenenfalls welche Bedeutung das C-terminale Ende für das Protein und dessen Funktion hat wurde in dieser Arbeit untersucht. Eine C-terminale Deletionsmutante wies im Vergleich zum Wildtyp eine höhere Proteinstabilität auf. Die Fusion der letzten 35 Aminosäuren von A1 an eine enzymatisch inaktive Form von Caspase 3 führte zu einem sehr instabilen chimären Protein. Somit scheint der C-Terminus von A1 sowohl notwendig als auch hinreichend für die kurze Halbwertszeit des Proteins zu sein. Die meisten kurzlebigen Proteine werden über den proteasomalen Signalweg degradiert. Dies scheint auch für A1 zu gelten, da seine Halbwertszeit durch den Einsatz eines Proteasomeninhibitors verlängert wurde. In Koexpressionsstudien konnte zudem eine Ubiquitylierung von A1 beobachtet werden, welche bei der stabileren A1 Mutante stark reduziert war. A1 ist jedoch nicht immer instabil. In Anwesenheit des „BH3-only“ Proteins Bim, das A1 direkt binden kann, wird die Halbwertszeit von A1 enorm erhöht. Die antiapoptotische Funktion von A1 scheint sich jedoch nicht nur auf die Neutralisation durch bloße Bindung zu beschränken, da die Deletionsmutante trotz vergleichbarer Interaktion mit Bim einen sehr viel geringeren Schutz gegen Etoposid vermittelter Apoptose verlieh. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das antiapoptotische Bcl-2 Familienmitglied A1 eine sehr kurze Halbwertszeit besitzt und das der C-Terminus nicht nur die Stabilität sondern auch die antiapoptotische Schutzfunktion für das Protein vermittelt.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Thema "Die Rolle des Signalmoleküls Ca2+ in der Signaltransduktion der SC-1-induzierten Apoptose" anhand von immunhisto-chemischen, proteinbiochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Methoden erarbeitet. Die SC-1-induzierte Apoptose stellt einen neuen intrinsischen, „death domain“-unabhängigen Signalweg in der Vermittlung des programmierten Zelltodes dar, der über die Bindung dieses Antikörpers an CD55SC-1 ausgelöst wird. Dem Signalmolekül Ca2+ galt besonderes Interesse bei der Charakterisierung der durch SC-1 ausgelösten Signaltransduktion. Nach Aktivierung von CD55SC-1 durch SC-1 steigt das intrazelluläre Ca2+ um Faktor 2,7 an, stabilisiert sich danach auf dem 1,5fachen Ausgangsniveau. Dies hat keinerlei Einfluss auf die Ausführung des Apoptoseprogramms, ist aber maßgeblich in das Expressionsverhalten involviert. Der Ca2+ - Einstrom ist somit nicht direkt in die Ausführung der Apoptose beteiligt, durch die Hochregulation der Expression des Apoptoserezeptors verstärkt es jedoch die Wahrscheinlichkeit der Tumorzelle, den programmierten Zelltod zu vollziehen, da durch die verstärkte Expression dieses Apoptose-induzierenden Rezeptors auch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere SC-1-Antikörper binden können. Da die Quervernetzung mehrerer Rezeptoren mittels des SC-1-Antikörpers in der Apoptoseinduktion von Nöten ist, stellt diese durch Ca2+ getriggerte Überexpression von CD55SC-1 einen essentiellen Bestandteil in der Exekution dieses Selbstmordprogrammes dar. Dieses Ergebnis gibt einen interessanten Einblick in den Signalweg der durch SC-1 induzierten Apoptose. Weiterführende Experimente sind notwendig, um genauere Erkenntnisse dieser einzigartigen Form einer gewebespezifischen Apoptose zu erlangen.
Untersuchungen zur Apoptose durch das Kontakthapten NiCl 2 in humanen Nabelschnurendothelzellen
(2005)
Ziel unserer Untersuchungen war es, herauszufinden, ob das Kontakthapten und Umweltgift Nickelchlorid im Vergleich zum etablierten Apoptoseinduktor TNF programmierten Zelltod in Endothelzellen auslösen kann. In Gegenwart des Proteinsyntheseinhibitors Cycloheximid sowie des Transkritionsinhibitors Actinomycin D zeigte sich eine dosisabhängige Zunahme der Apotposerate, die offenbar eine Inhibition proteinsyntheseabhängiger und somit vor Apoptose schützender Mechanismen erfordert. Die Synthese dieser zytoprotektiven Proteine ist von einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB abhängig, wie es auch nach Exposition mit Nickel beobachtet wird. Zur Untersuchung der Mechanismen der NiCl-vermittelten Apoptose setzten wir weiterhin den Caspaseinhibitor Z-VADfmk ein; dieser blockierte die NiCl/CHX-vermittelte DNA-Fragmentation und Apoptose vollständig. Im Rahmen physiologischer wie auch pathophysiologischer Vorgänge werden Endothelzellen oxidativem Streß in Form reaktiver Sauerstoffradikale ausgesetzt, die zu einer Heraufregulation von Fas und seines Liganden FasL, welche einen bedeutende Rolle bei der Initiierung des programmierten Zelltods spielen, führen. Nickel bewirkt ähnlich wie freie Sauerstoffradikale eine Heraufregulation beider Parameter, erfordert hierfür aber die Gegenwart von CHX. Weiterhin wurde der Einfluß der Mitogen-aktivierbaren (MAP-)-Kinase p38 auf die NiCl-vermittelte DNA-Fragmentation studiert. P38 wird nach Exposition mit Nickel, ähnlich wie nach Stimulation mit TNF, aktiviert; eine Hemmung dieser Kinase mit dem pharmakologischen Inhibitor SB 202190 steigert die Nickelchlorid-induzierte Apoptoserate. Zusammenfassend belegt diese Studie, daß Nickel, welches als Kontaktallergen, als Umweltgift sowie als Bestandteil mancher Prothesematerialien im Kontext der Biokompatibilität medizinisch relevant sein kann, über weitgehend noch undefinierte Signalwege DNA-Fragmentation und Apoptose von primären humanen Endothelzellen vermittelt.
Der humane monoklonale IgM-Antikörper PAM-1 induziert in seiner monomeren Form sowohl in vivo als auch in vitro Apoptose an Magenkarzinomzellen. Er bindet hierbei an den post-transskriptionell modifizierten Rezeptor CFR-1, der auf nahezu allen epithelialen Karzinomzellen und deren Vorläuferläsionen exprimiert wird. In dieser Arbeit werden die intrazellulären Mechanismen nach PAM-1/CFR-1-Bin- dung anhand von Protein(de)phosphorylierungen und deren selektiver Hemmung näher charakterisiert. Die hierbei detektierten Protein(de)phosphorylierungen sind somit möglicherweise essentielle Bestandteile der durch PAM-1 ausgelösten Apoptose.
Drei verschiedene mit Hilfe der humanen Hybridomatechnologie aus einem Rektumkarzinompatienten isolierte humane monoklonale Antikörper wurden immunhistochemisch und mit Hilfe zellbiologischer Tests untersucht. Die Ergebnisse der Immunperoxidasefärbung geben erste Hinweise auf die Art und Verteilung der von den Antikörpern erkannten Antigene. HH 98/81-33-154 und HH 99/71-81-149 färben nur wenige kolorektale Karzinome sowie einige Tumoren verschiedenen histologischen Ursprungs an und zeigen keine Reaktion mit normalen adulten oder fetalen Geweben. HH 101/99-14 reagiert dagegen außer mit zahlreichen Dickdarmkarzinomen auch mit einigen fetalen Geweben, was auf die Expression des spezifischen Antigens während der Fetalperiode schließen läßt. Neben den Kreuzreaktionen mit verschiedenen zentralnervösen Strukturen adulter Normalgewebe, die im Hinblick auf paraneoplastische neurologische Krankheitsbilder von Interesse sind, zeigt der Antikörper weiterhin eine Affinität zu drüsig differenzierten Tumoren. Im MTT-Assay auf Zellen der Kolonkarzinomzellinie CACO-2 bewirkte unverdünnter Zellkulturüberstand der Antikörper HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 eine starke Proliferationshemmung. Dieser Effekt konnte sowohl nach 24- als auch nach 48stündiger Inkubation, nicht jedoch mit verdünntem Überstand nachgewiesen werden. Mit Überstand von HH 99/71-81-149 war hingegen nur eine schwache Hemmung mitochondrialer Dehydrogenasen zu verzeichnen. Zellen der Linien HT-29, COLO 206F sowie COLO 320 zeigten sich hingegen resistent gegen die antikörpervermittelte Wachstumshemmung. Mit Hilfe des Cell Death Detection ELISAPLUSÒ konnte weiterhin belegt werden, daß HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 nicht nur das Wachstum von Tumorzellen hemmen, sondern überdies auf der Zellinie CACO-2 Apoptose induzieren. In beiden funktionellen Tests überstieg die gemessene Aktivität des niedriger konzentrierten HH 98/81-33-154 die von HH 101/99-14. Die relativ geringe Anzahl von Kreuzreaktionen mit gesundem Gewebe sowie die apoptoseinduzierende Aktivität von HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 unterstreichen die Eignung der Antikörper als potentielle Immuntherapeutika für die adjuvante Behandlung des kolorektalen Karzinoms, einer weltweit zu den häufigsten Krebsarten zählenden Tumorerkrankung.
Ochratoxin A ist ein Schimmelpilzmetabolit, der in vielen Nahrungsmitteln des Menschen vorkommt und in <80% der Blutproben nachweisbar ist. OTA wirkt hauptsächlich auf die Niere, und hier unter anderem durch Apoptose. Im täglichen Leben sind wir jedoch vielen Nephrotoxinen gleichzeitig ausgesetzt. Somit untersuchten wir die apoptoseinduzierende Wirkung verschiedener Substanzen, wie Antibiotika, NO-Donoren, H2O2, CdCl2, Cisplatin, Cyclosporin A und unterschiedliche pH-Werte in Kombination mit OTA. Bedingt durch die hohe Zahl möglicher Kombinationen verwendeten wirt ein schnelles und effizienztes Apoptose-Screening. Wir bestimmten Caspase-3 Aktivität und Proteingehalt direkt an Zellen, die in 96-Well Platten angesät wurden. Apoptose wurde mittels DNA-Leiterbildung bestätigt, Nekrose durch die Aufnahme von Trypanblau in die Zelle bestimmt. Die untersuchten Zellinien umfassten: LLC-PK1 und IHKE-Zellen (proximaler Tubulus) und MDCK-C7-Zellen (Sammelrohr). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die apoptoseinduzierende Wirkung von OTA von homöostatischen und nephritogenen Agenzien beeinflusst wird, denen die Zellen simultan mit OAT ausgesetzt werden. So beobachteten wir, abhängig von der Kombination antagonistische, additive und potenzierende Effekte. Potenzierung der Wirkung von OTA wurde u.a. für H2O2, Cadmiuim und Cisplatin b eobachtet, während NO-Donoren, Amphotericin B und Angiotensin II eine hemmende Wirkung aof OTA hatten. Cyclosporin A, Cephalexin und Gentamicin zeigten überwiegend additive Wirkung. Das Ausmass der INteraktionen war zwischen den einzelnen Zellininen unterschiedlich und somit zelltyp-, konzentrations- und toxinabhänigig.
In Keratinozyten wird sowohl durch UVB als auch durch PUVA-Bestrahlung Apoptose induziert. Wir untersuchten die in Keratinozyten durch UVB, PUVA, UVA und Todesliganden wie TRAIL ausgelösten Apoptosewege näher. UVB und PUVA, nicht aber UVA-Bestrahlung lösen in vitro Keratinozytenapoptose aus. 2-4 h nach UVB beobachteten wir die Aktivierung von Caspasen. Nach PUVA setzt die Aktivierung von Caspasen wesentlich später ein, nämlich erst 12 h nach Bestrahlung. Passend dazu, ist ein Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials 6-8 h nach UVB und 12-14 h nach PUVA detektierbar. Die Überexpression des Proteins Bcl-2 verhindert den Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach UVB, und vermittelt auch einen klonogen Schutz, unabhängig von der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale. Im Gegensatz dazu verzögert es den Verlust des Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach PUVA nur und verhindert sie nicht. PUVA-bestrahlte Zellen können sich nicht weiter teilen, sind also durch Bcl-2 nicht klonogen geschützt.
Ziel dieser Arbeit war es, zum einen Unterschiede in der NF-kappaB-Zusammensetzung zwischen HD- und LCAL-Zelllinien und zum anderen anhand der NF-kappaB-Verteilung das in der Literatur beschriebene Verhalten der jeweiligen Zellen bezüglich Proliferation und Apoptose zu analysieren. In beiden untersuchten Zelllinien wurden die NF-kappaB-Faktoren p50 und p65 konstitutiv nukleär exprimiert. In den HD-Zelllinien fand sich zusätzlich konstitutives c-Rel, in den LCAL-Zelllinien dagegen konstitutives RelB. Diese vier Faktoren zeigten auch in den jeweiligen Zellen konstitutive Bindungsaktivität. Die NF-kappaB-Faktoren können als Marker für verschiedene Entwicklungsstufen hämatopoetischer Zellen dienen. Die konstitutiven nukleären NF-kappaB-Faktoren p50 und c-Rel in HD-Zellen wiesen auf B-Zell-typische Eigenschaften hin. Allerdings spricht das in der HD-Zelle HDLM-2 überwiegend im Zytoplasma lokalisierte c-Rel für T-Zell-typische Eigenschaften. In LCAL-Zellen dagegen lassen die konstitutiven nukleären NF-kappaB-Faktoren p50 und RelB einen T-Lymphozyten als Ursprungszelle erkennen. Die konstitutive NF-kappaB-Aktivität in HD-Zelllinien konnte im Vergleich mit den Ergebnissen anderer Forschergruppen bestätigt werden. Im Gegensatz zu den Arbeiten in der Literatur konnten bei den LCAL-Zellen konstitutiv aktive p65/p50-Heterodimere als auch RelB/p50-Heterodimere nachgewiesen werden. Obwohl p65 in den meisten menschlichen Zellen induziert wird, wurde p65 in beiden Zelllinien konstitutiv nukleär exprimiert. Dies könnte ein Indiz für ein dereguliertes NF-kappaB-System in beiden Zelllinien sein und damit möglicherweise die entkoppelte Funktion bezüglich Apoptose und Proliferation erklären. Nach Stimulation des Oberflächenrezeptors CD30 mit dem agonistischen monoklonalen Antikörper M44 konnte in der vorliegenden Arbeit keine NF-kappaB-Induktion festgestellt werden. Nach PMA-Ionomycin-Stimulation fiel in LCAL-Zellen die Aktivität des p65/p50-Komplexes nach vier Stunden ab, in HDLM-2-Zellen nahm sie nach vier Stunden und in KMH-2-Zellen nach einer Stunde zu. Die Komplexe mit den Faktoren RelB in LCAL-Zellen und c-Rel in HD-Zellen hatten eine unveränderte Bindungsaktivität. Die CD30-Stimulation führte in HD-Zellen zur Proliferation. Für KMH-2 sind die Aussagen in der Literatur allerdings widersprüchlich: teilweise zeigte sie keine Auswirkung, teilweise kam es zur Proliferation. Wird die konstitutive NF-kappaB-Aktivität in HD-Zellen gehemmt, reagieren die Zellen mit Apoptose. Der p65-Faktor ist bekannt für seine Apoptose-hemmende Eigenschaft. Die zunehmende p65/p50-Aktivität in HD-Zellen könnte die Zellen zur Proliferation anregen. Außerdem kam es ausschließlich in HD-Zellen zur Expression von c-Rel. Dieser Faktor ist in einigen Zellen ebenfalls für das Überleben notwendig. In LCAL-Zellen folgt der CD30- Aktivierung die Apoptose. In diesen Zellen nimmt die p65-Bindungsaktivität ab, was darauf hinweist, dass sie der Apoptose ausgesetzt sind. RelB wird nur in LCAL-Zellen exprimiert. RelB besitzt eine Doppelrolle: als Komplex mit p50 oder p52 ist er ein positiver Transaktivator, als Komplex mit p65 beeinflusst er die KappaB-abhängige Genexpression negativ. Die starke Konzentration von RelB im Zytoplasma und im Zellkern und die trotz steigender p65-Expression abnehmende p65-Aktivität könnte ein Hinweis auf das inaktivierte p65 und damit eine weitere Erklärung für die Apoptose der LCAL-Zellen sein.
Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk
(2003)
Überexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus führt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung führt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden können, scheinen somit über entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellulären Signaltransduktion verfügen zu müssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu gehören die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu können, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchimäre HER-mrk, deren extrazellulärer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellulärer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abhängigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen führt zu IL-3 unabhängigem Wachstum und zu Langzeitüberleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeitüberleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeitüberleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer höheren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verkürzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß für die Auslösung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, während für eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und für Langzeitüberleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf für die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine führt, während der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß für die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber möglicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verstärken. Für die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das für ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schwächere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, während der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 führen. Da diese Mutante kein Langzeitüberleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend für Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeitüberleben zu sichern. Expression der Rezeptorchimäre HER-mrk in murinen Melanozyten führt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivität von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, während STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivität aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein ähnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen führt (Wellbrock, unveröffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend für die Antiapoptose von Melanomen zu sein.
Der Pathomechanismus des T-Helferzellverlusts bei der HIV-Infektion ist bisher ungeklärt. Diese Arbeit zeigt, dass primäre, HIV-uninfizierte CD4+ Zellen in Kontakt mit HIV-infizierten Zellen zugrundegehen. Zur Aufklärung des Mechanismus dieses Zelltodes wurden einzelne Schritte der Zellfusion zwischen infizierten und uninfizierten Zellen mit Antikörpern und Peptiden blockiert, und die Auswirkung dieser Blockade auf den Zelltod bestimmt. Dabei zeigte sich dass die Blockade jedes Schritts der Fusion von nicht-infizierten und infizierten Zellen den Zelltod der uninfizierten Zellen verhindert. Weiter wurde gezeigt, dass im Verlauf des Zelluntergangs Apoptose auftritt, diese aber für den Zellverlust keine notwendige Voraussetzung ist.
Epidemiologische Studien weisen auf einen protektiven Einfluß einer ballaststoffreichen Ernährung gegenüber der Entstehung eines kolorektalen Karzinoms hin. Die kurzkettige Fettsäure Butyrat ist ein wichtiges Produkt bakterieller Fermentation von Ballaststoffen bzw. von unverdaubaren Kohlenhydraten im Kolon. Butyrat hat paradoxe Effekte auf Epithelzellen des Kolons: Haupternergieträger und Wachstumsstimulator normaler Mukosa einerseits, Proliferationshemmer und Apoptoseinduktor kolorektaler Karzinomzellen in vitro andererseits. Auch für NSAID wie Aspirin belegen epidemiologische Studien einen chemoprotektiven Effekt gegenüber dem Kolonkarzinom. Für das Zytokin TNFalpha werden einerseits apoptoseinduzierende Effekte für kolorektale Karzinomzellen in vitro beschrieben, jedoch gelten einige Kolonkarzinomzellinien als resistent gegen TNFalpha. Andererseits besitzt TNFalpha auch proinflammatorische und antiapoptotische Wirkung über Aktivierung des nukleären Faktors kappa B (NF-kappaB). In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse sowohl von Aspirin als auch von TNFalpha auf die durch Butyrat induzierte Apoptose an humanen kolorektalen Karzinomzellinien untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein durchflußzytometrischer Annexin V – Propidiumjodid – Assay etabliert. Mit Hilfe dieses Assays konnte gezeigt werden, daß der Apoptose induzierende Effekt sich sowohl durch eine Kombination mit Aspirin als auch durch eine Kombination mit TNFalpha im Sinne einer additiven Wirkung steigern läßt. Der Einfluß von Butyrat auf die antiapoptotische Wirkung von TNFalpha über Modulation von NF-kappaB wurde in einem Electophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) untersucht. Die Verstärkung der Butyrat-induzierten Apoptose durch eine Kombination mit TNFalpha ist mit einer Hemmung der TNFalpha induzierten Aktivierung von NF-kappaB assoziiert. In einem RNase Protection Assay war auf mRNA-Ebene keine Beeinflussung der NF-kappaB abhängigen antiapoptotischer Faktoren (TRAF-1 und -2, c-IAP1 und 2 und XIAP) durch Butyrat nachweisbar. Die Verstärkung der Apoptose durch TNFalpha zeigt, daß Butyrat in seiner protektiven Wirkung in der Lage ist, neben einer direkten Beeinflussung der Kolonozyten auch auf körpereigene Signalwege zu wirken. Die Untersuchungen dieser Arbeit leisten einen Beitrag zur weiteren Klärung der molekularen Grundlagen der Butyratwirkung auf Kolonepithelzellen. Evtl. besteht in Zukunft die Möglichkeit, Butyrat als adjuvantes Therapeutikum bei Prävention und Therapie kolorektaler Karzinome zu verwenden.
Epidemiologische Studien zeigen, daß eine regelmäßige Einnahme von Acetylsalicylsäure und eine ballaststoffreiche Ernährung die Inzidenz und Mortalität des kolorektalen Karzinoms senken. Ein Großteil der protektiven Ballaststoffeffekte wird der kurzkettigen Fettsäure Butyrat zugeschrieben, die durch bakterielle Fermentation von nicht-resorbierbaren Kohlenhydraten im Kolon entsteht. Butyrat und Acetylsalicylsäure modulieren eine Reihe von Faktoren, die den Zellzyklus und Apoptose regulieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß Acetylsalicylsäure und Butyrat in Kombination den Zellzyklusinhibitor p21 in Kolonkarzinomzellen synergistisch induzieren.
Die Aktivierung von Transkriptionsfaktors NF-kB ist ein Charakteristikum viraler Infektionen, einschließlich der Infektion durch Influenza-A-Viren (Hiscott J. et al., 2001). Da die Expression vieler proinflammatorischer und antiviraler Zytokine, wie IFNb oder TNF-a durch NF-kB kontrolliert wird, hat sich ein Konzept entwickelt, welches besagt, dass NF-kB und sein übergeordneter Aktivator IKK wichtige Bestandteile der angeborenen, antiviralen Immunität im Kontext einer Infektion mit RNA-Viren sind (Chu WM. Et al., 1999). Im Gegensatz zu dieser weithin akzeptierten Ansicht, wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB für eine effiziente Influenzareplikation von großer Wichtigkeit ist. Auf einer molekularen Ebene wurde dies durch die NF-kB-abhängige virale Aktivierung des proapoptotischen Faktors TRAIL gezeigt, welcher die Virusvermehrung sowohl auto- als auch parakrin erhöht. Somit kann man sagen, dass NF-kB im Kontext einer Influenza-A-Virusinfektion sowohl proapoptotisch als auch proviral wirkt. Die Induktion der Apoptose ist ein weiteres, charakteristisches Merkmal, das man im Zusammenhang mit Virusinfektionen beobachten kann. Da die Rolle der Apoptose während einer Influenza-A-Virusinfektion noch unklar war, wurde diese Frage adressiert. Dabei wurde versucht mit einem wichtigen, virus-induzierten Apoptose-Effektor, nämlich Kaspase-3 zu interferieren. Überraschenderweise wurde die Influenzavermehrung in Anwesenheit eines Kaspase-3-Inhibitors stark negativ beeinflusst. Im Einklang mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Virustiter in Zellen, in denen XIAP überexprimiert wurde, rückläufig waren. Gegengleich führte Überexpression von Prokaspase-3 zu einem Titeranstieg. Mechanistisch scheint der Blockade der Virusvermehrung eine Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern zu Grunde zu liegen, die die Bildung von reifen Viruspartikel verhindert. Die Erklärung dürfte in der Aktivität von Kaspase-3 zu finden sein, die an dem Abbau von Kernporenkomplexproteinen in apoptotischen Zellen beteiligt ist und was in Folge die freie Diffusion viraler RNPs ermöglichen dürfte. Abschließend entwickelte sich aufgrund der vorliegenden Arbeit eine neue Hypothese über die Rolle des IKK-NF-kB-Signalweges, seinen Einfluss auf die Apoptoseregulation in Influenza-infizierten Zellen und der Auswirkung auf das Virus.
Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.
Trotz der Entwicklung neuer und selektiver Immunsuppressiva, bleibt die Transplantation des Dünndarms auch weiterhin bei einer Fünfjahresüberlebensrate von 35% ein risikoreiches Verfahren, welches nur bei einem kleinen Patientenspektrum derzeit indiziert ist. Die Erkenntnis, daß eine cotransplantierte Leber die Überlebensrate nach Dünndarmtransplantation wesentlich verbessert, zeigt die immunologische Sonderstellung der Leber auf und verweist auf ihren protektiven Effekt, den sie auf sämtliche Organtransplantate des gleichen Spenders ausübt. Dies konnte sowohl tierexperimentell (Rasmussen, 1995; Meyer, 2000) als auch im Rahmen der humanen Leber/Dünndarmtransplantation nachvollzogen werden (Intestinal Transplant Registry). Dabei sind diese toleranzinduzierenden Mechanismen der Leber selbst, aber auch im gesamten Immunsystem des Empfängers, bisher nur unvollständig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es mit Hilfe der Durchflußzytometrie die Zellmigration immunologisch kompetenter Zellen nach Leber/Dünndarmtransplantation zu analysieren, welche möglicherweise Grundlage für die spenderspezifische Toleranz sind. Insbesondere führten wir Analysen in der transplantierten Leber selbst, aber auch in mesenterialen Lymphknoten und der Milz des Empfängers durch. Die Ergebnisse sollten mit gewonnenen Erkenntnisse aus der Immunhistologie korreliert werden. Dabei gelang es uns mit der kombinierten orthotopen Leber/Dünndarmtransplantation der Ratte in der Stammkombination BN®LEW ein geeignetes Tiermodell zu entwickeln. Erstmals war es damit möglich, vollständig physiologische Verhältnisse zu schaffen und die immunologischen Mechanismen nach Transplantation im Langzeitverlauf zu untersuchen. Nach Ablauf der initialen Gabe geringer Dosen des Immunsuppressivums FK506, konnten wir - nach passagerer Abstoßung - die induzierte spenderspezifische Toleranz nachweisen und dabei eine bloße Akzeptanz der Transplantate ausschließen, indem wir nachträglich Haut- und Herzorgane transplantierten. Mit Hilfe der Durchflußzytometrie untersuchten wir zusätzlich wesentliche Mechanismen der Toleranzinduktion: den Chimärismus und die Apoptose nicht-parenchymaler Zellen im Lebertransplantat. Den Chimärismus, konnten wir in seinen unterschiedlichen Manifestationsformen (Makro-, Mikro- und Transplantatchimärismus) zu jeder Zeit nach Transplantation nachweisen. Zum Nachweis apoptotischer Zellen mit der Durchflußzytometrie, gelang es uns eine Methode zu etablieren, die den dynamischen Apoptoseprozeß erfaßt und damit die Unterscheidung zwischen frühapoptotischen, apoptotischen und spätapoptotischen / nekrotischen Zellen ermöglicht. Die Apoptoseanalyse unterschiedlicher Leukozytenpopulationen im Lebertransplantat selbst gelang uns dabei ebenfalls. Unsere eigenen Ergebnisse, sowie die Erkenntnisse aus der Literatur lassen den Schluß zu, daß spenderspezifische Toleranz hauptsächlich in der Leber durch das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen induziert wird. Dabei scheinen der Chimärismus und die T-Zellapoptose eine zentrale Rolle zu spielen.
Nach Transplantation moduliert die Leber nicht nur die Immunantwort des Empfängers gegenüber ihr selbst, sondern übt auch auf mittransplantierte Organe einen protektiven Effekt aus. Dieses Phänomen wurde in der vorliegenden Arbeit an dem hoch immunogenen Dünndarm untersucht. Diese Studie war dabei nicht nur unter immunologischen Gesichtspunkten von Bedeutung. So stellt die simultane Leber- / Dünndarmtransplantation für Patienten, die an einer Leberzirrhose infolge eines Kurzdarmsyndrom leiden, eine erfolgversprechende Therapieoption dar. Zur experimentellen Analyse dieser speziellen Transplantationsform existierte aber in der Ratte bisher kein vergleichbares Modell. In der vorliegenden Arbeit wird daher erstmalig ein Modell etabliert, in dem – orientiert an den Verhältnissen beim Menschen – Leber (arterialisiert) und Dünndarm simultan und orthotop transplantiert werden. Mittels kurzfristiger Immunsuppression wurde bei allogener Transplantation hier nicht nur Akzeptanz sondern Toleranz erreicht und mittels Indikator-Herz- und Hauttransplantation überprüft. Die dazu benötigte immunsuppressive Dosis unterschritt dabei die für eine erfolgreiche isolierte Dünndarmtransplantation notwendige Immunsuppression erheblich. Dieser Toleranzentwicklung geht eine zeitlich begrenzte Abstoßungsreaktion voraus. Die daran beteiligten zellulären Mechanismen wurden durch sequentielle Immunhistologie dargestellt. Während dieser Abstoßung sammeln sich überdurchschnittlich viele apoptotische T-Lymphozyten, hauptsächlich CD8+ Zellen, im Lebertransplantat, nicht aber im transplantierten Dünndarm an. Dieses Phänomen konnte mittels einer neu etablierten Doppelfärbung dargestellt werden. Apoptoseinduktion in alloreaktiven T-Zellen könnte einer der Mechanismen sein, die den immunsuppressiven Effekt des Lebertransplantates erklären und den gleichzeitig transplantierten Dünndarm vor seiner Abstoßung bewahren.
Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger.
TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.
Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, führen in vielen Fällen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod führen, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage für den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei für die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen primären RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma über die Nachweisgrenze zu erhöhen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. Für die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR übergegangen. Während Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie während der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin gehören, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer originären retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung häufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivität extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.
Zahlreiche experimentelle und epidemiologische Studien schreiben der kurzkettigen Fettsäure Butyrat und dem Cyclooxygenasehemmer Acetylsalicylsäure eine Schutzwirkung auf die Entstehung des kolorektalen Karzinoms zu. Die genauen Mechanismen hinter der Wirkung beider Substanzen sind ungeklärt. Um die Effekte von Butyrat und Acetylsalicylsäure, sowie deren Kombination, auf das Wachstum, die Differenzierung und Apoptose von Kolonkarzinomzellen zu untersuchen, wurden Zellkulturexperimente und Western Blot Analysen durchgeführt. Unter Butyratinkubation kam es zu einer Steigerung der Differenzierung von HT-29-Kolonkarzinomzellen, jedoch nicht von Caco-2 Zellen. Acetylsalicylsäure allein hatte keinen relevanten Effekt auf die Zelldifferenzierung und in Kombination konnte Acetylsalicylsäure die differenzierende Wirkung des Butyrats nicht verstärken. Butyrat und Acetylsalicylsäure hemmten die Proliferation der untersuchten kolorektalen Karzinomzellen. Bei Inkubation mit einer Kombination von Butyrat und Acetylsalicylsäure wurde der antiproliferative Effekt der Einzelsubstanzen deutlich verstärkt. Im Western-Blot konnte diese Beobachtung durch Untersuchung des Proliferationsmarkers PCNA bestätigt werden. Gleichzeitig veränderte sich das Expressionsmuster zellzyklusregulierender Proteine in den untersuchten Zellen: Die Cyclin D3-Expression wurde in Caco-2 Zellen sowie in HT-29 Zellen durch Butyratinkubation erhöht. In Kombination mit Acetylsalicylsäure verstärkte sich die Wirkung von Butyrat auf die Expression von p21Waf1/Cip1 und cdk2: Acetylsalicylsäure und Butyrat in höheren Konzentrationen reduzierten die Expression von cdk2 in HT-29 Zellen, in niedrigen Konzentrationen führte nur die Acetylsalicylsäure-Butyrat-Kombination zu einem Abfall des cdk2-Proteingehalts. Butyrat induzierte die Expression des cdk-Inhibitors p21Waf1/Cip1 in beiden Kolonkarzinomzellinien. Die Wirkung auf p21Waf1/Cip1 war hierbei p53-unabhängig, da es gleichzeitig zu einem Abfall der Konzentration an p53-Protein in HT-29 Zellen kam und in Caco-2 Zellen kein p53 nachweisbar war. Acetylsalicylsäure hatte erst in höherer Konzentration einen Einfluss auf die p21Waf1/Cip1 Proteinexpression in HT-29 Zellen. Die Kombination von Butyrat und Acetylsalicylsäure übertraf in ihrer Wirkung die des Butyrats schon bei Konzentrationen, bei denen die alleinige Butyratinkubation ohne Effekt blieb. Weiterhin induzierte Butyrat, über einen Anstieg der Expression des pro-apoptotischen Faktors Bak, Apoptose in den untersuchten Kolonkarzinomzellen, bei gleichzeitigem Abfall des anti-apoptotischen Bcl-XL. Bei Inkubation mit der Acetylsalicylsäure-Butyrat-Kombination kam es zu einer deutlichen Verstärkung der Apoptoseinduktion, wobei Acetylsalicylsäure die Wirkung des Butyrats auf Bak und Bcl-XL jedoch nicht steigerte. Zudem konnte gezeigt werden, dass der Effekt des Butyrats mit einer Inhibition der Phosphorylierung und Degradation von IkBa, und damit einer Verhinderung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB einhergeht, was die Wirkung von apoptose-induzierenden Substanzen verstärken kann. Zusammenfassend zeigte sich bei Kombination der Einzelsubstanzen Butyrat und Acetylsalicylsäure eine Verstärkung ihrer Wirkung auf die Zellproliferation, sowie die Apoptoseinduktion bei Kolonkarzinomzellen. Dieser Effekt wird durch unterschiedliche molekulare Mechanismen vermittelt, wobei mit p21Waf1/Cip1 und cdk2 erstmals Faktoren ermittelt wurden, auf deren Expression Butyrat und Acetylsalicylsäure additive oder potentiell synergistische Effekte haben.
B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die größte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entzündung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein mögliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden ähnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um mögliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es möglich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberflächenmoleküls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von fünf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierfür eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminosäureaustauschen bei der Translation führen. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch ergänzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von löslichem Fas (sFas) oder Störungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der frühen MALT-Typ Lymphomgenese und möglicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zurückzuführen. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie völlige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verlängerte Überleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller Fälle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben.
Mechanismen der Toxoplasma-gondii-vermittelten Inhibierung der Apoptose in humanen Wirtszelllinien
(2000)
Als obligat intrazellulärer Parasit und Erreger von lebenslang persistierenden Infektionen in Mensch und Tier dürfte Toxoplasma gondii von der Integrität seiner Wirtszelle in besonderem Maße abhängig sein. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss des Parasiten auf die Wirtszellapoptose zu untersuchen. T. gondii inhibiert die in vitro induzierte Apoptose in humanen HL-60- und U937-Zellen. Dabei muss der Parasit aktiv in die Zelle eindringen, jedoch nicht in dieser replizieren können. Er interferiert dabei mit mindestens zwei Komponenten der Apoptose-Signalkaskade: Erstens vermindert T. gondii die Herunterregulation der Mcl-1-Expression nach Apoptoseinduktion. Das führt dazu, dass trotz Apoptoseinduktion die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma inhibiert wird und daraufhin die Caspasen 9 und 3 sowie deren Substrate weniger stark aktiviert werden. Zweitens wird die Expression der Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) durch T. gondii inhibiert. Beide Mechanismen könnten an der Inhibierung der Wirtszellapoptose durch T. gondii beteiligt sein und dem Parasiten damit sein intrazelluläres Überleben sichern.
Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts"
(2000)
Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unlöslich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der Hämodialyse eine Rolle, für die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrillärer Bündel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl für eine Akutphasenreaktion als auch für oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von Übergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, lässt sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizität unterschiedlicher Modell-AGEs ist abhängig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Präparationen in vitro. Die AGE-Toxizität ist hauptsächlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress lässt sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellulärer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors für AGEs (RAGE) mit spezifischen Antikörpern konnte die Zahl überlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgelöster Stress führt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu Störungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verhältnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Veränderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anfänglich erhöhter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktatausschüttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien können die Störungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschwächen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringfügig erhöhter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verläuft der durch AGEs ausgelöste Zelltod verläuft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch über rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Veränderungen im Metabolismus der Zelle. Dies führt u. a. dazu, dass für die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr genügend Energie zur Verfügung steht. AGE-Stress trägt damit in einer selbstverstärkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren könnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen.
Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern über komplexe z.T. miteinander verknüpfte Signaltransduktionskaskaden übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die Fähigkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen führt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese Fähigkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorauslösende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos führt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. Ähnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-Mäusen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade überein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellulären Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot überlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorläuferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copräzipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abhängigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird hauptsächlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopräzipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ansätze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren.
In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt.
Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung.