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Significant advances in fluorescence imaging techniques enable life scientists today to gain insights into biological systems at an unprecedented scale. The interpretation of image features in such bioimage datasets and their subsequent quantitative analysis is referred to as bioimage analysis. A substantial proportion of bioimage analyses is still performed manually by a human expert - a tedious process that is long known to be subjective. Particularly in tasks that require the annotation of image features with a low signal-to-noise ratio, like in fluorescence images of tissue samples, the inter-rater agreement drops. However, like any other scientific analysis, also bioimage analysis has to meet the general quality criteria of quantitative research, which are objectivity, reliability, and validity. Thus, the automation of bioimage analysis with computer-aided approaches is highly desirable. Albeit conventional hard-coded algorithms are fully unbiased, a human user has to set its respective feature extraction parameters. Thus, also these approaches can be considered subjective.
Recently, deep learning (DL) has enabled impressive advances in computer vision research. The predominant difference between DL and conventional algorithms is the capability of DL models to learn the respective task on base of an annotated training dataset, instead of following user-defined rules for feature extraction. This thesis hypothesized that DL can be used to increase the objectivity, reliability, and validity of bioimage analyses, thus going beyond mere automation. However, in absence of ground truth annotations, DL models have to be trained on manual and thus subjective annotations, which could cause the model to incorporate such a bias. Moreover, model training is stochastic and even training on the same data could result in models with divergent outputs. Consequently, both the training on subjective annotations and the model-to-model variability could impair the quality of DL-based bioimage analyses. This thesis systematically assessed the impacts of these two limitations experimentally by analyzing fluorescence signals of a protein called cFOS in mouse brain sections. Since the abundance of cFOS correlates with mouse behavior, behavioral analyses could be used for cross-validation of the bioimage analysis results. Furthermore, this thesis showed that pooling the input of multiple human experts during model training and integration of multiple trained models in a model ensemble can mitigate the impact of these limitations. In summary, the present study establishes guidelines for how DL can be used to increase the general quality of bioimage analyses.
Thema dieser Thesis ist die Analyse sekretorischer Vesikelpools auf Ultrastrukturebene in unterschiedlichen biologischen Systemen. Der erste und zweite Teil dieser Arbeit fokussiert sich auf die Analyse synaptischer Vesikelpools in neuromuskulären Endplatten (NME) im Modellorganismus Caenorhabditis elegans. Dazu wurde Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution angewandt, um eine unverzügliche Immobilisation der Nematoden und somit eine Fixierung im nahezu nativen Zustand zu gewährleisten. Anschließend wurden dreidimensionale Aufnahmen der NME mittels Elektronentomographie erstellt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden junge adulte, wildtypische C. elegans Hermaphroditen mit Septin-Mutanten verglichen. Um eine umfassende Analyse mit hoher Stichprobenzahl zu ermöglichen und eine automatisierte Lösung für ähnliche Untersuchungen von Vesikelpools bereit zu stellen wurde eine Software namens 3D ART VeSElecT zur automatisierten Vesikelpoolanalyse entwickelt. Die Software besteht aus zwei Makros für ImageJ, eines für die Registrierung der Vesikel und eines zur Charakterisierung. Diese Trennung in zwei separate Schritte ermöglicht einen manuellen Verbesserungsschritt zum Entfernen falsch positiver Vesikel. Durch einen Vergleich mit manuell ausgewerteten Daten neuromuskulärer Endplatten von larvalen Stadien des Modellorganismus Zebrafisch (Danio rerio) konnte erfolgreich die Funktionalität der Software bewiesen werden. Die Analyse der neuromuskulären Endplatten in C. elegans ergab kleinere synaptische Vesikel und dichtere Vesikelpools in den Septin-Mutanten verglichen mit Wildtypen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden neuromuskulärer Endplatten junger adulter C. elegans Hermaphroditen mit Dauerlarven verglichen. Das Dauerlarvenstadium ist ein spezielles Stadium, welches durch widrige Umweltbedingungen induziert wird und in dem C. elegans über mehrere Monate ohne Nahrungsaufnahme überleben kann. Da hier der Vergleich der Abundanz zweier Vesikelarten, der „clear-core“-Vesikel (CCV) und der „dense-core“-Vesikel (DCV), im Fokus stand wurde eine Erweiterung von 3D ART VeSElecT entwickelt, die einen „Machine-Learning“-Algorithmus zur automatisierten Klassifikation der Vesikel integriert. Durch die Analyse konnten kleinere Vesikel, eine erhöhte Anzahl von „dense-core“-Vesikeln, sowie eine veränderte Lokalisation der DCV in Dauerlarven festgestellt werden.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde untersucht ob die für synaptische Vesikelpools konzipierte Software auch zur Analyse sekretorischer Vesikel in Thrombozyten geeignet ist. Dazu wurden zweidimensionale und dreidimensionale Aufnahmen am Transmissionselektronenmikroskop erstellt und verglichen. Die Untersuchung ergab, dass hierfür eine neue Methodik entwickelt werden muss, die zwar auf den vorherigen Arbeiten prinzipiell aufbauen kann, aber den besonderen Herausforderungen der Bilderkennung sekretorischer Vesikel aus Thrombozyten gerecht werden muss.
Städtische Agglomerationen zeichnen sich durch eine zunehmende Dynamik ökologischer, ökonomischer und sozialer Veränderungen aus. Um eine nachhaltige Entwicklung urbaner Räume zu gewährleisten, bedarf es verstärkt innovativer Methoden zur Erfassung der raumwirksamen Veränderungen. Diesbezüglich hat sich die satellitengestützte Erdbeobachtung als kostengünstiges Instrumentarium zur Erhebung planungsrelevanter Informationen erwiesen. Dabei wird in naher Zukunft eine neue Generation von Radarsatelliten zur Verfügung stehen, deren Leistungsvermögen erstmals die operationelle Analyse von Siedlungsflächen auf Grundlage von Radardaten ermöglicht. Vor diesem Hintergrund ist es das Ziel der Dissertation, auf der Basis einer nutzerorientierten Methodik das Potential hochauflösender SAR-Daten zur automatisierten Erfassung und Analyse von Siedlungsflächen zu untersuchen. Die Methodik setzt auf dem objektorientierten Bildanalysekonzept der Software eCognition auf. Dabei haben sich der SAR-Speckle sowie Schwächen hinsichtlich der Güte der Bildsegmentierung bzw. der Bestimmung geeigneter Segmentierungseinstellungen als Limitierungen erwiesen. Folglich liegt ein erster Schwerpunkt auf der Optimierung und Stabilisierung einer segmentbasierten Auswertung von Radardaten. Hier hat sich gezeigt, dass mit Blick auf Siedlungsareale weiterhin Optimierungsbedarf hinsichtlich einer strukturerhaltenden Bildglättung besteht. Daher wird zunächst ein neuer Filteransatz entwickelt, der gegenüber den etablierten Techniken eine konsequentere Reduzierung des Speckle in homogenen Bildarealen gewährleistet und dabei gleichsam die hochfrequente Information in stark strukturierten Aufnahmebereichen bewahrt. Die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Güte und Übertragbarkeit der Bildsegmentierung werden ebenso wie die Schwächen im Hinblick auf die zielgerichtete Definition der optimalen Segmentierungsparameter durch die Entwicklung eines klassenbasierten Ansatzes zur Segmentoptimierung in der Software-Umgebung von eCognition reduziert. Der zweite Schwerpunkt dieser Dissertation widmet sich der Entwicklung von Konzepten zur automatisierten Analyse der regionalen und lokalen Siedlungsstruktur. Im regionalen Kontext liegen die Identifizierung von Siedlungsflächen und die Erfassung einfacher Landnutzungsklassen im Fokus der Arbeiten. Dazu wird ein Regelwerk zur Auswertung einfach-polarisierter SAR-Aufnahmen erstellt, das sich maßgeblich auf räumlich und zeitlich robuste textur-, kontext- und hierarchiebezogene Merkmale stützt. Diese Wissensbasis wird anschließend so erweitert, dass sie die Analyse dual-polarisierter, bifrequenter oder kombinierter optischer und SAR-basierter Bilddaten ermöglicht. Wie die Ergebnisse zeigen, können Siedlungsflächen und Landnutzungsklassen bereits über einfach-polarisierte SAR-Aufnahmen mit Genauigkeiten von rund 90 Prozent erfasst werden. Durch die Einbindung einer weiteren Polarisation, Frequenz oder optischer Daten lässt sich diese Güte auf Werte von bis zu 95 Prozent steigern. Die lokalen Analysen zielen auf die thematisch und räumlich differenzierte Erfassung der Landnutzung innerhalb bebauter Areale ab. Die Untersuchung basiert auf der synergetischen Auswertung einer hochauflösenden Radaraufnahme und eines bedeutend geringer aufgelösten optischen Datensatzes. Die isolierte Analyse von SAR-Aufnahmen reichte hingegen selbst bei der Kombination verschiedener Frequenzen oder Polarisationen nicht zur Charakterisierung der kleinteiligen, heterogenen Stadtlandschaft aus. Im Kontext der synergetischen Auswertung dient die SAR-Aufnahme vornehmlich zur Extraktion der urbanen Topografie, während der optische Datensatz wichtige Merkmale zur Differenzierung der erfassten Struktureinheiten in die Kategorien Gebäude, versiegelte Freifläche, unversiegelte Freifläche und Baumbestand beisteuert. Das Resultat zeigt, dass sich trotz des synergetischen Ansatzes lediglich eine Genauigkeit von 65 Prozent erzielen lässt. Dennoch können Gebäude dabei mit einer Güte von 72 Prozent vergleichsweise akkurat erfasst werden. Im Hinblick auf die Demonstration des siedlungsbezogenen Anwendungspotentials höchstauflösender SAR-Daten lässt sich resümieren, dass eine automatische Ableitung siedlungsstruktureller Merkmale im komplexen städtischen Umfeld aufgrund der eingeschränkten spektralen Aussagekraft und der starken Geometrieabhängigkeit des Signals mit signifikanten Schwierigkeiten verbunden ist. Dennoch hat sich gezeigt, dass diese Limitierungen in gewissem Umfang über den Ansatz der multiskaligen, objektorientierten Klassifizierung kompensiert werden können. Dabei lassen sich die regionalen Siedlungs- und Landnutzungsmuster mit überzeugenden Genauigkeiten erfassen, während die Betrachtung der lokalen Siedlungsstruktur eindeutig die Grenzen der Radartechnik im Hinblick auf die Analyse komplex strukturierter Stadtlandschaften aufzeigt.
Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, erstmals unterschiedliche automatisierte Bildanalysesysteme in der Auswertung von Elispot-Proben miteinander zu vergleichen. Neben dem Vergleich der Anzahl der gemessenen Spots, sollten die Zeit für die Messungen, die Genauigkeit, Richtigkeit und Präzision untersucht werden. Weiterhin sollten die Zuverlässigkeit der Messungen sowie die Einflussgrößen der einzelnen Bildanalysesysteme geprüft werden. Es wurden Elispotproben von verschiedenen Spezies (Maus und Human) und von verschiedenen unabhängigen Arbeitsgruppen verwendet. Die verglichenen Bildanalysesysteme bestanden aus den aufeinander abgestimmten Komponenten Mikroskop, Farbkamera, Motortisch mit Steuerung, Analysesoftware und Rechner. Sie unterschieden sich in ihren Mikroskopen, in der Anzahl der pro Well aufgenommenen Bilder und in der damit erreichten Bildpunktauflösung. Beim KS Elispot wurden im Auflichtmikroskop pro Well 12 Bilder über eine Farbkamera aufgenommen, die Bildpunktauflösung für ein 760x580 Pixel Bild eines Wells betrug 2.6µm. Beim KS Elispot compact 0.65-Zoom-Einstellung wurde im Stereomikroskop pro Well 1 Bild über eine Farbkamera aufgenommen und eine Bildpunktauflösung von 12µm erreicht. Beim KS Elispot 1.25-Zoom-Einstellung wurden im Stereomikroskop 4 Bilder pro Well über eine Farbkamera erstellt, die Bildpunktauflösung betrug 6µm. Im Bezug auf den Faktor Zeit war das KS Elispot compact dem KS Elispot deutlich überlegen. Bei Verwendung eines Bildes pro Well bzw. 4 Bildern pro Well wertete das KS Elispot compact eine komplette 96-Well-Mikrotiterplatte bis zu 6 Mal schneller bzw. mindestens doppelt so schnell aus wie das KS Elispot. Die hohe Auflösung des KS Elispot resultiert in einer langen Auswertungszeit der einzelnen Platten. Werden große Mengen von Elispot-Proben ausgewertet, so bietet das KS Elispot compact aufgrund seiner kürzeren Messzeiten eine deutliche Ersparnis an Zeit und damit gegenüber dem KS Elispot unter diesem Gesichtspunkt einen entscheidenden Vorteil. Die Variabilität der Messungen lag bei allen Systemen niedrig, ohne nennenswerte Unterschiede zwischen den Systemen. Die höchste Zuverlässigkeit bei der Spoterkennung konnte für das System KS Elispot nachgewiesen werden. Es erkannte nahezu alle echten Spots und mehr echte Spots als das KS Elispot compact. Das KS Elispot wies im Gegensatz zum KS Elispot compact keine falsch-positiven Spots auf. Bei Verwendung von 4 Bildern pro Well arbeitete das KS Elispot compact zuverlässiger als bei Erstellung von nur einer Aufnahme pro Well: der Anteil an falsch-positiven Spots am Ergebnis sank und der Anteil der richtig erkannten Spots stieg. Die Werte lagen jedoch immer noch unterhalb der Ergebnisse, die das KS Elispot erzielt hatte. Das KS Elispot compact erkannte grundsätzlich in denselben Wells weniger Spots als das KS Elispot, das der tatsächlichen Anzahl der Spots am nächsten kam. Bei Verwendung von nur einer Aufnahme pro Well identifizierte das KS Elispot compact deutlich weniger Spots als bei Aufnahme von 4 Bildern pro Well. Die deutlichsten Unterschiede zwischen den beiden Systemen KS Elispot und KS Elispot compact wurden bei der Messung durch das KS Elispot compact mit einem Bild pro Well bei Spotzahlen über 100 bei Mausspots und über 400 bei Humanspots gesehen. Die zwischen dem KS Elispot und dem KS Elispot compact nachgewiesenen Unterschiede waren bei kleinen Spots (bis 100µm) deutlich größer als bei Spots größerer Durchmesser. Der Vergleich der Systeme erbrachte, dass das hochauflösende KS Elispot eine bessere Auswertungsqualität als das KS Elispot compact bietet, insbesondere bei der Auswertung von Elispot-Proben, die sehr viele und zudem sehr kleine Spots enthielten. Beim KS Elispot compact war die Messung mit 4 Bildern pro Well der Auswertung mit nur einem Bild pro Well bezüglich der Zuverlässigkeit klar überlegen. Bei Verwendung des KS Elispot compact sollte deshalb bei sehr kleinen Spots zumindest die mit 4 Bildern pro Well arbeitende Einstellung gewählt werden. Weiterhin ist zu bemerken, dass eine optimale Auswertung von Elispot-Proben durch automatisierte Reader-Systeme maßgeblich durch die Präparation der verwendeten Elispot-Proben und die daraus resultierende Qualität der Spots beeinflusst wird. Zahlreiche Artefakte, eine starke Untergrundfärbung oder nicht deutlich ausgebildete typische Spotmerkmale können die Messergebnisse eines Systems beeinträchtigen. Hierbei wurde das KS Elispot compact System stärker beeinflusst als das KS Elispot System. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Auswertung der Elispot-Proben und damit die gewonnenen Ergebnisse von dem verwendeten, automatisierten Lesesystem abhängen.Die Arbeit unterstreicht den hohen Stellenwert der Standardisierung, Validierung und Optimierung aller Komponenten der Elispot-Methode. Dies ist auch gerade in Bezug auf die Weiterentwicklung dieser Technik und die Eröffnung von weiteren Einsatzspektren unerlässlich.