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Asthma bronchiale gehört weltweit zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des Menschen. In verschiedenen Leitlinien zur Asthmatherapie sind Sport bzw. regelmäßige körperliche Aktivität als nicht-medikamentöse Maßnahmen mittlerweile ein integrativer Bestandteil. Etliche Studien haben gezeigt, dass regelmäßige körperliche Aktivität sowohl die Lebensqualität als auch den Krankheitsverlauf bei Asthmatikern positiv beeinflussen kann. Welche Mechanismen genau die positiven Effekte von Sport bei dieser Erkrankung vermitteln, ist jedoch noch nicht abschließend geklärt. Die Erklärungsansätze reichen dabei von einer Zunahme der kardiopulmonalen Fitness sowie Verbesserung der Lungenfunktion über eine immunologisch vermittelte Reduzierung der Atemwegsinflammation bis hin zu einer Verbesserung körpereigener Reparaturmechanismen. Letztere ist in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus wissenschaftlicher Arbeiten gerückt, wobei man vermutet, dass dabei insbesondere CD34+ Progenitorzellen und MSCs eine bedeutende Rolle spielen könnten.
In der hier vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit sich körperliche Belastung auf die Anzahl zirkulierender CD34+ Progenitorzellen und MSCs bei Patienten mit einem allergischen Asthma bronchiale gegen Hausstaubmilben der Art Dermatophagoides pteronyssinus verglichen mit gesunden Kontroll-Probanden auswirkt. Hierfür unterzogen sich sieben Patienten und zwölf Gesunde einem spiroergometrischen Ausdauerleistungstest bis zur subjektiven körperlichen Ausbelastung. Vor und nach der Spiroergometrie erfolgten Blutentnahmen. Neben einer Bestimmung von Entzündungsparametern wurde jeweils ein Blutbild inklusive Differenzierung angefertigt und die Anzahl zirkulierender CD34+ Progenitorzellen und MSCs mittels FACS-Analyse bestimmt. Weiterhin wurde überprüft, ob sich mithilfe einer gängigen Methode zur Kultivierung von MSCs aus Knochenmark diese auch aus peripherem Blut isolieren und kultivieren lassen.
Bezüglich der CD34+ Progenitorzellen und der MSCs kam es dabei nach Belastung bei getrennter Berechnung für die beiden Studiengruppen zu keiner signifikanten Veränderung. Die Gesamtheit der Studienteilnehmer wurde daher nochmals in einer Gesamtgruppe zusammengefasst, für die ebenfalls durch Belastung hervorgerufene Veränderungen berechnet wurden. Hier ließ sich ein signifikanter Anstieg von CD34+ Progenitorzellen feststellen, wohingegen bei den MSCs weiterhin keine Veränderung zu beobachten war. In den Versuchen zur Kultivierung von MSCs aus peripherem Blut ließen sich keine nennenswerten Mengen dieser Zellen kultivieren, wenngleich die Kulturen doch möglicherweise zu Beginn einige dieser Zellen enthielten. Im Gegensatz dazu war die Kultivierung von MSCs aus Knochenmark erfolgreich.
Dass es nach körperlicher Aktivität bzw. Sport zu einem Anstieg CD34+ Progenitorzellen im peripheren Blut kommt, ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben. Es wird vermutet, dass diese Zellen an körpereigenen Reparaturvorgängen beteiligt sind. Dieser Mechanismus könnte eine mögliche Erklärung für die positiven Effekte von Sport bei Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen darstellen. Auch bei Lungenerkrankungen wird CD34+ Progenitorzellen eine Rolle bei Reparaturvorgängen zugeschrieben. Obwohl es zunehmend Hinweise dafür gibt, dass auch MSCs für diese Vorgänge von Bedeutung sind, ist die Frage, welche spezifische Rolle diesen Zellen im zirkulierenden peripheren Blut zukommt, weiterhin nicht hinreichend geklärt. Bei Untersuchungen zu diesem Thema kommt erschwerend hinzu, dass MSCs im peripheren Blut nur in sehr geringer Frequenz nachweisbar sind und die Gruppe dieser Zellen eine sehr große Heterogenität aufweist. Auch eine Kultivierung von MSCs aus peripherem Blut scheint nicht so ohne weiteres möglich zu sein. All dies bereitet Schwierigkeiten bei der genauen Quantifizie-rung und Charakterisierung dieser Zellen. Auch wenn es in dieser Studie nicht gelang einen Effekt körperlicher Belastung auf die Anzahl zirkulierender MSCs nachzuweisen, sollten dennoch weitere Untersuchungen zu den durch Sport vermittelten Effekten auf diese Zellen folgen. Der Fokus sollte dabei insbesondere auf die Untersuchung von Einflüssen körperlicher Aktivität auf die für das Homing dieser Zellen verantwortlichen Mechanismen gelegt werden. Auch weitere Untersuchungen zur Isolation und Expansion von MSCs aus peripherem Blut scheinen notwendig zu sein, um diesbezüglich langfristig eine sichere, erfolgsversprechende Kulturmethodik entwickeln zu können. Besonders vielversprechend scheint hier der Einsatz vorselektierter Zellen aus mobilisiertem Blut zu sein. Zusammenfassend könnte all dies einen wichtigen Beitrag dazu leisten, die Mechanismen körpereigener Reparaturvorgänge besser zu verstehen. Diese Erkenntnisse wiederum könnten dann zur Entwicklung neuer Strategien zur Therapie diverser Lungenerkrankungen wie auch Asthma beitragen.
Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.
Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).
Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.
In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.
Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing
(2015)
The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program “Predict-IV”; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of “omics” technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling.
This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day.
Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors.
Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling.
Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions.
Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo.
Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound’s distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies.
Primary infection of HEp-2 cells with rubella virus resulted in non-cytophatic longterm persistent infection. During four years of persistence the virus was produced in sufficient quantities (up to 6 logs PFU/ml) and did not differ from the parental variant in its pathogenicity for BHK-21 or RK-13 cells, or hemagglutinating activity, but formed smaller plaques. Persistent virus preserved the original antigenicity as judged from reciprocal hemagglutination-inhibition or plaque reduction-neutralization tests with polyclonal antisera. Both original and persistent rubella viruses were thermoresistant (T 56° C) and sligthly temperature-sensitive. Clonal analysis revealed presence of ts-mutants among both original and persistent virus clones with different degrees of plating efficiency at 40°/34° C. RNA fingerprinting showed only minor changes in persistent rubella virus.
Um realistische Risikoabschätzungen von karzinogenen und genotoxischen Expositionen besser bewerten zu können, bedarf es Untersuchungen von Kombinationen welche sich von der Einzellstoffbetrachtung loslöst. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die Gentoxizität einer Kombination in ihrer Stärke vom erwarteten Effekt der normalen Additivität abweicht, wenn die Kurven der Dosis – Wirkungsbeziehung der Einzelkomponenten nicht lineare Verläufe zeigen. Dabei muss zwischen Dosisaddition und Wirkaddition der Kombinationen unterschieden werden, das heißt ob die Einzelkomponenten einen untereinander ähnlichen oder unabhängigen Wirkmechanismus verfolgen. Für nicht lineare Dosis – Wirkungsbeziehungen differieren also die Kurvenverläufe zwischen Dosisaddition und Wirkaddition und bilden einen möglichen Bereich der Additivität zwischen ihnen (auch: „Hülle der Additivität“). Nur Reaktionen welche außerhalb dieses Bereiches ablaufen, dürfen als synergistische oder antagonistische Effekte bezeichnet werden. Diese Überlegungen wurden überprüft mit der Analysierung von Mikrokernen, induziert in L5178Y Maus – Lymphom – Zellen durch die methylierenden Substanzen Methylmethansulfonat (MMS) und Methyl-Nitroso-Urea (MNU), sowie dem Topoisomerase II Inhibitor Genistein (GEN). Alle drei Chemikalien erzeugen reproduzierbare sublineare Dosis – Wirkungsbeziehungen. Für die Analyse der Kombinationseffekte wurden diese Substanzen in drei binären Mixturen miteinander gemischt. Für MMS + MNU war der Effekt vereinbar mit Dosisaddition und lag signifikant höher als der vorkalkulierte Effekt der Netto – Wirkung. Für MMS + GEN lag der gemessene Effekt über der Wirkaddition, jedoch unter der Dosisaddition. Für MNU + GEN lag der gemessene Effekt unterhalb der Wirkaddition und deutete damit auf einen echten Antagonismus hin. In Unkenntnis des sublinearen Dosis – Wirkungsverhaltens der Einzelsubstanzen wäre ein synergistischer Effekt von MMS mit beiden Substanzen MNU und GEN fälschlicherweise vorausgesagt worden. Der beobachtete Unterschied zwischen MMS und MNU und deren jeweiligen Kombination mit GEN wäre mit einer stark vereinfachten Interpretation der DNA - Methylierung nicht vorausgesagt worden. Ursachen könnten eine doch zu unterschiedliche Form der DNA – Methylierung und / oder epigentische Faktoren sein. Zusammenfassend kann man sagen, dass Kenntnisse der Nichtlinearität von Dosis – Wirkungskurven der einzelnen Substanzen ausschlaggebend für die Analyse von Synergismus oder Antagonismus in deren Kombinationen ist. Weiterhin ist ein Vorwissen über tiefere mechanistische Vorgänge hilfreich für eine Vorhersage von ähnlichen oder unabhängigen Wirkprozessen.
Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazelluläre Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antikörper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden dafür erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellulär an Vesikeln sowie an einem perinukleären Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukleären Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde überwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erhöht und gegenläufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit früher gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schlüssigen Konzept zusammenführt.
Neuromelanin (NM) is a complex polymer pigment found in catecholaminergic neurons of the human substantia nigra and locus ceruleus. The structure of this molecule is poorly characterised, and the physiological function of it in the brain is unknown. In vitro data, based upon synthetic dopamine melanins (DAM), suggest that these pigments may exhibit radical scavenging properties, but in the presence of iron, DAM acts as a proxidant. These data suggested that NM may be associated with the especial vulnerability of pigmented dopaminergic cells in Parkinson´s disease (PD), a disorder in which nigral iron levels are increased and the relatively specific loss of the pigmented neurons of the substantia nigra. Given the rarity of NM, and the difficulty of isolating this material from the human brain, all functional studies of NM published to date have utilised a synthetic dopamine melanin in place of the native pigment. In the current work we investigated the effects of NM from the healthy human brain and synthetic DAM on cell health and oxidative status in human-derived cell lines. Methods SK-N-SH, a human neuroblastoma cell line, and U 373, a human glioblastoma cell line was chosen to represent human neuronal and glial cell types. NM was isolated from the SN of adult human subjects from Australia and Germany with no history of neurological or neurodegenerative diseases. Synthetic DAM was prepared by autooxidation of dopamine. DAM and NM samples were added to the cultures with fresh media to final concentrations of 0.05 or 0.1 mg/ml. In some experiments cells were incubated with Fenton reagent (400µM FeSO4 plus 200µM H2O2) in the presence or absence of melanin or the iron chelator desferoxamine mesylate (100µM). The cells were incubated at 37 °C at 5% CO2 for varying periods of time as described. Lactate dehydrogenase (LDH) activity and Lipid peroxidation were measured. Hydroxyl radical production in the cultures was estimated used a modification of the salicylic acid spin-trapping method. All experiments were performed three times in triplicate and analysed using regression analysis and one- or two-way Analysis of Variance followed by Bonferroni’s t test corrected for multiple comparisons as appropriate. Results Following 24 hr incubation, both the native NM and the synthetic DAM pigment could be seen as electron dense granules both within the cell bodies of the SK-N-SH and U373 cells. The melanin was incorporated into the cell via an invagination of the cell membrane. DAM but not NM significantly increased the LDH activity and lipid peroxidation as well as the hydroxyl radical production. Co-incubation of Fenton reagent with either DAM or NM resulted in additive effects, compared to the levels elicited by Fenton reagent and the melanins alone. When added the iron chelator desferoximine together with Fenton reagent attentuated lipid peroxidation and hydroxyl radical production to control levels. In contrast, lipid peroxidation and hydroxyl radical production in U373 cells exposed to NM or DAM did not differ to that measured in untreated cells. Discussion Human neuron-derived cell line is a useful approach to address the effects of NM on dopaminergic neuron function. This is the first work to use internalised NM isolated from the healthy human brain as a model of intraneuronal pigment in vitro. Cell line functional studies showing cellular changes induced by DAM but not NM demonstrated that DAM is relatively toxic to cells but not NM. DAM represents a poor functional model of NM in that it displays a marked toxicity unrepresentative of the effects of the native melanin. Both NM and DAM were unable to attentuate the toxic effects of the added oxidative stimulus, this probably due to the exceeding the chelating capacity of NM. Future studies should point to the characterization and role of NM under in vivo conditions. The development of strategies to protect the neuromelanin in dopaminergic neurons may have important therapeutic implications not only for PD.
Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase.
Die in vitro-Langzeitkultivierung von Zellen in einer Drei-Dimensionalen Matrix (3D-Matrix) stellt nach wie vor eine Herausforderung im Tissue engineering dar. Die Kultivierung von Zellen auf/in komplexen 3D-Trägern erfordert hohe Zellzahlen und lange Kulturzeiten. Um die Probleme des schnellen Mediumverbrauches und der limitierten Zellzahl bzw. Zelldichte in konventionellen Kulturmethoden zu umgehen, wurde ein „Zweikreis-Perfusionssystem“ entwickelt. Hierzu wurde ein Cell-Pharm System (Cell-Pharm System 100®-Basisgerät) modifi-ziert. Das Grundprinzip des Systems besteht darin, dass ein kleinvolumiger (50-70 ml) „Zellkultur-Kreislauf“ über einen Bioreaktor (semipermeable Hohlfasermembran) durch einen großvolumigen (1000 ml) „Regenerations-Kreislauf“ kontinuierlich im Gegenstromprinzip regeneriert wird. Die Regulation des ph-Wertes und der Sauerstoffsättigung des Kulturmediums geschieht über einen integrierten, Druckluft-CO2-begasten Oxygenator. Während die Zirkulationsgeschwindigkeit (Durchflussrate) und Temperatur (37°C) im Regenerations-Kreislauf konstant gehalten werden, lassen sich diese Parameter im „Zellkultur-Kreislauf“ beliebig variieren. Es hat sich gezeigt, dass sich auf diese Weise kontinuierlich über einen langen Zeitraum ohne Mediumwechsel konstante und optimale Milieuverhältnisse in beiden Mediumkompartments einstellen lassen. Zur Untersuchung der Wachstumseigenschaften von Zellen in diesem Perfusions-system wurden humane osteoblastenähnliche Zellen oder Ratten-Knochenmarkszellen auf eine Matrix aus demineralisierter, GuHCl-extrahierter Rinderspongiosa unterschiedlicher Größe (Zylinder zwischen 5x3 mm und 5x10 mm) aufgetragen. Unter intermittierender Perfusion der Kulturkammern (z.B. Minucells cell container®) mit 50-70 ml/d kam es zu einem gleichmäßigen, intertrabekulären Wachstum der Zellen innerhalb des gesamten Trägers. Nach 6-8 Wochen konnte immer noch ein dichtes Netz interdigitierender ALP-positiver osteoblastenähnlicher Zellen innerhalb der gesamten Matrix beobachtet werden. Dabei scheint die physikalisch-mechanische Komponente der „Umspülung“ der Zellen mit dem kontinuierlich regenerierten Nährmedium einen positiven Einfluss auf das Anwachsverhalten und Proliferation der Zellen zu haben. Somit erlaubt das modifizierten „Zweikreisperfusionssystem“ eine gute Möglichkeit für die Langzeitperfusionskultur in einem geschlossenen System mit indi-viduell steuerbaren Strömungsverhältnissen im Zellkompartment bei einer kontinuierlichen Regeneration des Mediums.