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G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest class of membrane proteins, and are the master components that translate extracellular stimulus into intracellular signaling, which in turn modulates key physiological and pathophysiological processes. Research within the last three decades suggests that many GPCRs can form complexes with each other via mechanisms that are yet unexplored. Despite a number of functional evidence in favor of GPCR dimers and oligomers, the existence of such complexes remains controversial, as different methods suggest diverse quaternary organizations for individual receptors. Among various methods, high resolution fluorescence microscopy and imagebased fluorescence spectroscopy are state-of-the-art tools to quantify membrane protein oligomerization with high precision. This thesis work describes the use of single molecule fluorescence microscopy and implementation of two confocal microscopy based fluorescence fluctuation spectroscopy based methods for characterizing the quaternary organization of two class A GPCRs that are important clinical targets: the C-X-C type chemokine receptor 4 (CXCR4) and 7 (CXCR7), or recently named as the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3). The first part of the results describe that CXCR4 protomers are mainly organized as monomeric entities that can form transient dimers at very low expression levels allowing single molecule resolution. The second part describes the establishment and use of spatial and temporal brightness methods that are based on fluorescence fluctuation spectroscopy. Results from this part suggests that ACKR3 forms clusters and surface localized monomers, while CXCR4 forms increasing amount of dimers as a function of receptor density in cells. Moreover, CXCR4 dimerization can be modulated by its ligands as well as receptor conformations in distinct manners. Further results suggest that antagonists of CXCR4 display distinct binding modes, and the binding mode influences the oligomerization and the basal activity of the receptor: While the ligands that bind to a “minor” subpocket suppress both dimerization and constitutive activity, ligands that bind to a distinct, “major” subpocket only act as neutral antagonists on the receptor, and do not modulate neither the quaternary organization nor the basal signaling of CXCR4. Together, these results link CXCR4 dimerization to its density and to its activity, which may represent a new strategy to target CXCR4.
Für das klinische Management des Prostatakarzinoms werden nuklearmedizinische Verfahren zunehmend relevant. Bildgebung und Therapie, welche gegen das Prostataspezifische Membranantigen (PSMA) gerichtet sind, werden bereits im klinischen Alltag angewendet. Weitere potenzielle Biomarker des Prostatakarzinoms, wie beispielsweise der CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) und der Somatostatinrezeptor Typ 2 (SSTR2), werden zudem als nuklearmedizinische Zielstrukturen diskutiert. Vorangegangene Arbeiten legten einen Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der PSMA-Expression und der Sensitivität gegenüber Docetaxel in Prostatakarzinomzellen nahe. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, diesen Mechanismus genauer zu untersuchen. Dabei wurden die Aktivität onkogener Signalwege, die Proliferation und die CXCR4- sowie die Androgenrezeptor (AR)- Expression in Prostatakarzinomzelllinien mit unterschiedlicher PSMA-Expression durchflusszytometrisch quantifiziert. Im zweiten Projektteil sollte der Einfluss von Metformin und verschiedener, bereits in der Prostatakarzinomtherapie angewandter Medikamente (Docetaxel, Dexamethason, Abirateron und Enzalutamid), auf die Expression von PSMA, CXCR4 und SSTR2 untersucht werden. Die Quantifizierung der Expression erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Ein kausaler Mechanismus für den Zusammenhang zwischen PSMA-Expression und Docetaxel-Sensitivität konnte in dieser Arbeit schließlich nicht hergestellt werden. Es zeigten sich jedoch vor allem Expressionsmodulationen von PSMA und CXCR4. Mittels Docetaxel konnte z.B. bei C4-2 Zellen eine Verdopplung der PSMA-Expression und eine Verdreifachung der CXCR4-Expression erreicht werden. Darüber hinaus zeigte die Behandlung mit Abirateron eine deutliche Heraufregulation der PSMA- Expression bei LNCaP und C4-2 Zellen, sowie eine Zunahme der CXCR4- Expression bei allen untersuchten Zelllinien. Sollte sich der Einfluss der medikamentösen Behandlung auf die Expression von PSMA und CXCR4 bestätigen, kann dies zukünftig zur verbesserten und individualisierten Diagnostik und Therapie von Prostatakarzinompatienten beitragen.
Loss of Somatostatin Receptor 2 (SSTR2) expression and rising CXC Chemokine Receptor Type 4 (CXCR4) expression are associated with dedifferentiation in neuroendocrine tumors (NET). In NET, CXCR4 expression is associated with enhanced metastatic and invasive potential and worse prognosis but might be a theragnostic target. Likewise, activation of Wnt/β-catenin signaling may promote a more aggressive phenotype in NET. We hypothesized an interaction of the Wnt/β-catenin pathway with CXCR4 expression and function in NET. The NET cell lines BON-1, QGP-1, and MS-18 were exposed to Wnt inhibitors (5-aza-CdR, quercetin, and niclosamide) or the Wnt activator LiCl. The expressions of Wnt pathway genes and of CXCR4 were studied by qRT-PCR, Western blot, and immunohistochemistry. The effects of Wnt modulators on uptake of the CXCR4 ligand [\(^{68}\)Ga] Pentixafor were measured. The Wnt activator LiCl induced upregulation of CXCR4 and Wnt target gene expression. Treatment with the Wnt inhibitors had opposite effects. LiCl significantly increased [\(^{68}\)Ga] Pentixafor uptake, while treatment with Wnt inhibitors decreased radiopeptide uptake. Wnt pathway modulation influences CXCR4 expression and function in NET cell lines. Wnt modulation might be a tool to enhance the efficacy of CXCR4-directed therapies in NET or to inhibit CXCR4-dependent proliferative signaling. The underlying mechanisms for the interaction of the Wnt pathway with CXCR4 expression and function have yet to be clarified.
Obwohl es sich bei Vestibularisschwannomen (VS) um benigne Tumoren handelt, können sie die Lebensqualität der betroffenen Patienten deutlich beeinträchtigen. Gerade bei Patienten, die an einer NF 2 leiden und sich daher wiederholt operativen Eingriffen unterziehen müssen, ist es notwendig, eine medikamentöse Therapiealternative anbieten zu können, die ohne die Notwendigkeit einer operativen Intervention auskommt und gleichzeitig schwerwiegenden Folgen der Tumorerkrankung – wie dem drohenden Hörverlust – Einhalt gebietet. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, sich dieser medikamentösen Therapiealternative einen Schritt anzunähern, indem molekulare Pathomechanismen, die dem VS zugrunde liegen könnten, untersucht wurden. Im Mittelpunkt standen der Chemokinrezeptor CXCR4, das Tumorsuppressorprotein Merlin und die Metalloprotease ADAM9. Für CXCR4 ließen sich keine Effekte in Bezug auf die Aktivierung der ERK- und AKT-Signalwege erkennen. Auch beeinflusste eine Merlinüberexpression in VS-Zellen die CXCR4- und ADAM9-Proteinexpression nicht. Für ADAM9 zeigte sich eine potenzielle Relevanz für die Pathogenese des VS: Wurde die ADAM9-Konzentration durch einen knock-down reduziert, hatte dies eine verminderte VS-Zellzahl zur Folge. Des Weiteren scheint Integrin α6 ein Substrat von ADAM9 zu sein, das möglicherweise in die Zytoskelettmodifikation durch ADAM9 involviert ist. Somit stellt die ADAM9-Inhibition einen interessanten Angriffspunkt für eine mögliche medikamentöse Behandlung von VS dar. Ferner wurden Cytokine gefunden, die bisher nicht in einen Zusammenhang mit dem VS gebracht worden waren. Vor allem die Bedeutung der Cytokine TIMP-2 und CXCL7 sollte für das VS näher untersucht werden. Somit konnte diese Arbeit weitere Aspekte aufdecken, die für die Pathogenese des VS relevant sein könnten und an die zukünftige Forschung anknüpfen sollte.
The serine/threonine protein kinase AKT1 is a downstream target of the chemokine receptor 4 (CXCR4), and both proteins play a central role in the modulation of diverse cellular processes, including proliferation and cell survival. While in chronic myeloid leukemia (CML) the CXCR4 is downregulated, thereby promoting the mobilization of progenitor cells into blood, the receptor is highly expressed in breast cancer cells, favoring the migratory capacity of these cells. Recently, the LIM and SH3 domain protein 1 (LASP1) has been described as a novel CXCR4 binding partner and as a promoter of the PI3K/AKT pathway. In this study, we uncovered a direct binding of LASP1, phosphorylated at S146, to both CXCR4 and AKT1, as shown by immunoprecipitation assays, pull-down experiments, and immunohistochemistry data. In contrast, phosphorylation of LASP1 at Y171 abrogated these interactions, suggesting that both LASP1 phospho-forms interact. Finally, findings demonstrating different phosphorylation patterns of LASP1 in breast cancer and chronic myeloid leukemia may have implications for CXCR4 function and tyrosine kinase inhibitor treatment.
We aimed to elucidate the diagnostic potential of the C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4)-directed positron emission tomography (PET) tracer \(^{68}\)Ga-Pentixafor in patients with poorly differentiated neuroendocrine carcinomas (NEC), relative to the established reference standard \(^{18}\)F-FDG PET/computed tomography (CT). In our database, we retrospectively identified 11 treatment-naïve patients with histologically proven NEC, who underwent \(^{18}\)F-FDG and CXCR4-directed PET/CT for staging and therapy planning. The images were analyzed on a per-patient and per-lesion basis and compared to immunohistochemical staining (IHC) of CXCR4 from PET-guided biopsies. \(^{68}\)Ga-Pentixafor visualized tumor lesions in 10/11 subjects, while \(^{18}\)F-FDG revealed sites of disease in all 11 patients. Although weak to moderate CXCR4 expression could be corroborated by IHC in 10/11 cases, \(^{18}\)F-FDG PET/CT detected significantly more tumor lesions (102 vs. 42; total lesions, n = 107; p < 0.001). Semi-quantitative analysis revealed markedly higher 18F-FDG uptake as compared to \(^{68}\)Ga-Pentixafor (maximum and mean standardized uptake values (SUV) and tumor-to-background ratios (TBR) of cancerous lesions, SUVmax: 12.8 ± 9.8 vs. 5.2 ± 3.7; SUVmean: 7.4 ± 5.4 vs. 3.1 ± 3.2, p < 0.001; and, TBR 7.2 ± 7.9 vs. 3.4 ± 3.0, p < 0.001). Non-invasive imaging of CXCR4 expression in NEC is inferior to the reference standard \(^{18}\)F-FDG PET/CT.
Im Zuge der Bemühungen um neue, tumorspezifische Therapieansätze für die Myelomerkrankung hat sich der C-X-C-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) aufgrund seiner zentralen Rolle in der Tumorgenese als vielversprechender Angriffspunkt hervorgetan. Im Sinne eines theranostischen Konzepts wird der Rezeptor mithilfe eines radioaktiv markierten Liganden quantifiziert und anschließend von rezeptorspezifischen Radiotherapeutika als Zielstruktur genutzt. Die CXCR4-Expression ist allerdings ein höchst dynamischer Prozess mit großer inter- und intraindividueller Heterogenität, der u.a. durch eine begleitende Chemotherapie beeinflusst werden kann. Ob sich therapieinduzierte Veränderungen der Rezeptorexpression gezielt nutzen lassen, um die CXCR4-Expression zu optimieren und so die Effektivität der CXCR4-gerichteten Strategien zu steigern, wurde bislang nicht untersucht.
Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene, in der Myelomtherapie etablierte Substanzen sowohl einzeln als auch in Kombination hinsichtlich ihres Einflusses auf die CXCR4-Expression von MM-Zelllinien und primären MM-Zellen unter in vitro Bedingungen analysiert.
In den durchgeführten Experimenten zeigte sich eine hohe Variabilität der CXCR4-Expression der MM-Zellen nach Therapieinduktion, die sich als substanz-, dosis- und zeitabhängig herausstellte. Die Ergebnisse bestätigten das große Potenzial der therapieinduzierten Modulation der CXCR4-Expression. Im weiteren Verlauf sind translationale Forschungsansätze gerechtfertigt, die die Übertragbarkeit der in vitro gewonnenen Ergebnisse auf die komplexen Vorgänge im lebenden Organismus überprüfen. Langfristiges Ziel ist der Entwurf eines patientenzentrierten, multimodalen Therapiekonzepts, welches das CXCR4-gerichtete theranostische Konzept mit einer individuell angepassten, medikamentösen MM-Therapie kombiniert.
CXCR4 ist der spezifische Rezeptor für das Chemokin CXCL12 und ist überexprimiert in Vestibularisschwannomzellen.
Das Ziel dieser Arbeit war es den Effekt des spezifischen Inhibitors AMD3100 auf die CXCR4 vermittelte Proliferation und Migration der Vestibularisschwannomzellen in verschiedenen Zellkuturmodellen zu analysieren.
Die nachgewiesene Inhibition von CXCR4 deutet auf einen möglichen Einsatz von AMD3100 in der systemischen Therapie von NF-2 Patienten hin.
Chronic myeloid leukaemia (CML) is a clonal myeloproliferative stem cell disorder characterized by the constitutively active BCR‐ABL tyrosine kinase. The LIM and SH3 domain protein 1 (LASP1) has recently been identified as a novel BCR‐ABL substrate and is associated with proliferation, migration, tumorigenesis and chemoresistance in several cancers. Furthermore, LASP1 was shown to bind to the chemokine receptor 4 (CXCR4), thought to be involved in mechanisms of relapse. In order to identify potential LASP1‐mediated pathways and related factors that may help to further eradicate minimal residual disease (MRD), the effect of LASP1 on processes involved in progression and maintenance of CML was investigated. The present data indicate that not only overexpression of CXCR4, but also knockout of LASP1 contributes to proliferation, reduced apoptosis and migration as well as increased adhesive potential of K562 CML cells. Furthermore, LASP1 depletion in K562 CML cells leads to decreased cytokine release and reduced NK cell‐mediated cytotoxicity towards CML cells. Taken together, these results indicate that in CML, reduced levels of LASP1 alone and in combination with high CXCR4 expression may contribute to TKI resistance.
Impact of the Chemokine Receptors CXCR4 and CXCR7 on Clinical Outcome in Adrenocortical Carcinoma
(2020)
Chemokine receptors have a negative impact on tumor progression in several human cancers and have therefore been of interest for molecular imaging and targeted therapy. However, their clinical and prognostic significance in adrenocortical carcinoma (ACC) is unknown. The aim of this study was to evaluate the chemokine receptor profile in ACC and to analyse its association with clinicopathological characteristics and clinical outcome. A chemokine receptor profile was initially evaluated by quantitative PCR in 4 normal adrenals, 18 ACC samples and human ACC cell line NCI-H295. High expression of CXCR4 and CXCR7 in both healthy and malignant adrenal tissue and ACC cells was confirmed. In the next step, we analyzed the expression and cellular localization of CXCR4 and CXCR7 in ACC by immunohistochemistry in 187 and 84 samples, respectively. These results were correlated with clinicopathological parameters and survival outcome. We detected strong membrane expression of CXCR4 and CXCR7 in 50% of ACC samples. Strong cytoplasmic CXCR4 staining was more frequent among samples derived from metastases compared to primaries (p=0.01) and local recurrences (p=0.04). CXCR4 membrane staining positively correlated with proliferation index Ki67 (r=0.17, p=0.028). CXCR7 membrane staining negatively correlated with Ki67 (r=−0.254, p=0.03) but positively with tumor size (r=0.3, p=0.02). No differences in progression-free or overall survival were observed between patients with strong and weak staining intensities for CXCR4 or CXCR7. Taken together, high expression of CXCR4 and CXCR7 in both local tumors and metastases suggests that some ACC patients might benefit from CXCR4/CXCR7-targeted therapy.
Chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4) is a key factor for tumor growth and metastasis in several types of human cancer including multiple myeloma (MM). Proof-of-concept of CXCR4-directed radionuclide therapy in MM has recently been reported. This study assessed the diagnostic performance of the CXCR4-directed radiotracer [\(^{68}\)Ga]Pentixafor in MM and a potential role for stratifying patients to CXCR4-directed therapies.
Thirty-five patients with MM underwent [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET/CT for evaluation of eligibility for endoradiotherapy. In 19/35 cases, [\(^{18}\)F]FDG-PET/CT for correlation was available. Scans were compared on a patient and on a lesion basis. Tracer uptake was correlated with standard clinical parameters of disease activity.
[\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET detected CXCR4-positive disease in 23/35 subjects (66%). CXCR4-positivity at PET was independent from myeloma subtypes, cytogenetics or any serological parameters and turned out as a negative prognostic factor. In the 19 patients in whom a comparison to [\(^{18}\)F]FDG was available, [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET detected more lesions in 4/19 (21%) subjects, [\(^{18}\)F]FDG proved superior in 7/19 (37%). In the remaining 8/19 (42%) patients, both tracers detected an equal number of lesions. [\(^{18}\)F]FDG-PET positivity correlated with [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET positivity (p=0.018).
[\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET provides further evidence that CXCR4 expression frequently occurs in advanced multiple myeloma, representing a negative prognostic factor and a potential target for myeloma specific treatment. However, selecting patients for CXCR4 directed therapies and prognostic stratification seem to be more relevant clinical applications for this novel imaging modality, rather than diagnostic imaging of myeloma.
C-X-C-motif chemokine receptor 4 (CXCR4) is a key factor for tumor growth and metastasis in several types of human cancer. We have recently reported promising first-in-man experience with CXCR4-directed endoradiotherapy (ERT) in multiple myeloma (MM).
Eight heavily pretreated MM patients underwent a total of 10 ERT cycles (7 patients with 1 cycle and a single patient with 3 cycles). ERT was administered in combination with chemotherapy and autologous stem cell support. End points were occurrence and timing of adverse events, progression-free and overall survival.
ERT was overall well tolerated without any unexpected acute adverse events or changes in vital signs. With absorbed tumor doses >30-70 Gy in intra- or extramedullary lesions, significant anti-myeloma activity was observed with 1 patient achieving complete remission and 5/8 partial remission. Directly after ERT major infectious complications were seen in one patient who died from sepsis 22 days after ERT, another patient with high tumor burden experienced lethal tumor lysis syndrome. Median progression-free survival was 54 days (range, 13-175), median overall survival was 223 days (range, 13-313). During follow-up (6 patients available), one patient died from infectious complications, 2/8 from disease progression, the remaining 3/8 patients are still alive.
CXCR4-directed ERT was well-tolerated and exerted anti-myeloma activity even at very advanced stage MM with presence of extramedullary disease. Further assessment of this novel treatment option is highly warranted.
Zusammenfassung:
Unsere Arbeit bestätigt die aus kleineren Studien bekannte hohe Expression der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CXCR7 in der normalen Nebenniere und in der Mehrheit der Nebennierenkarzinome. Das auf mRNA Ebene bestätigte Vorkommen beider Chemokinrezeptoren im gesunden Nebennierengewebe deutet auf eine überwiegend für die normale Nebennierenphysiologie wichtige Rolle dieser Chemokinrezeptoren hin. Eine eventuell dennoch bestehende pathophysiologische Relevanz der Rezeptoren wurde ergänzend überprüft und ergab keinen signifikanten Einfluss auf die Prognose des Nebennierenkarzinoms.
Die therapeutischen Möglichkeiten des metastasierten Prostatakarzinoms (Pca) haben sich durch die neuen Substanzen Docetaxel und Abirateron deutlich verbessert.
Das prostataspezifische Membranantigen (PSMA) stellt für die Diagnose und Therapie des Pca´s einen vielversprechenden Angriffspunkt dar. PSMA wird in Prostatakarzinomzellen überexprimiert und dient als Zielstruktur für nicht-invasives bildgebendes Verfahren und Lutetium-177-PSMA-Radioligandentherapie als Therapieoption.
Der CXCR4-Rezeptor wird an unterschiedlichen Zelltypen und Organen exprimiert. Seine Überexpression wird mit einer Metastasierung und schlechter Prognose assoziiert.
Gallium-68-PSMA PET/CT liefert genaue Kenntnisse bezüglich Ausbreitung und Fortschreiten des Tumorgeschehens.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Zusammenhänge zwischen Expression von PSMA und CXCR4 in Verbindung mit etablierten Therapeutika und versucht Wege aufzuzeichnen, welche durch Erhöhung der PSMA-Expression zur verbesserten Sensitivität des PSMA PET/CT führen könnten, wodurch der personalisierte Therapieansatz weiter optimiert werden kann.
We have recently demonstrated CXCR4 overexpression in vestibular schwannomas (VS). This study investigated the feasibility of CXCR4-directed positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging of VS using the radiolabeled chemokine ligand [\(^{68}\)Ga]Pentixafor.
Methods: 4 patients with 6 primarily diagnosed or pre-treated/observed VS were enrolled. All subjects underwent [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET/CT prior to surgical resection. Images were analyzed visually and semi-quantitatively for CXCR4 expression including calculation of tumor-to-background ratios (TBR). Immunohistochemistry served as standard of reference in three patients.
Results: [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET/CT was visually positive in all cases. SUV\(_{mean}\) and SUV\(_{max}\) were 3.0 ± 0.3 and 3.8 ± 0.4 and TBR\(_{mean}\) and TBR\(_{max}\) were 4.0 ± 1.4 and 5.0 ± 1.7, respectively. Histological analysis confirmed CXCR4 expression in tumors.
Conclusion: Non-invasive imaging of CXCR4 expression using [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET/CT of VS is feasible and could prove useful for in vivo assessment of CXCR4 expression.
Despite histological evidence in various solid tumor entities, available experience with CXCR4-directed diagnostics and endoradiotherapy mainly focuses on hematologic diseases. With the goal of expanding the application of CXCR4 theranostics to solid tumors, we aimed to elucidate the feasibility of CXCR4-targeted imaging in a variety of such neoplasms.
Methods: Nineteen patients with newly diagnosed, treatment-naïve solid tumors including pancreatic adenocarcinoma or neuroendocrine tumor, cholangiocarcinoma, hepatocellular carcinoma, renal cell carcinoma, ovarian cancer, and prostate cancer underwent [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET/CT. CXCR4-mediated uptake was assessed both visually and semi-quantitatively by evaluation of maximum standardized uptake values (SUV\(_{max}\)) of both primary tumors and metastases. With physiologic liver uptake as reference, tumor-to-background ratios (TBR) were calculated. [\(^{68}\)Ga]Pentixafor findings were further compared to immunohistochemistry and [\(^{18}\)F]FDG PET/CT.
Results: On [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET/CT, 10/19 (52.6%) primary tumors were visually detectable with a median SUVmax of 5.4 (range, 1.7–16.0) and a median TBR of 2.6 (range, 0.8–7.4), respectively. The highest level of radiotracer uptake was identified in a patient with cholangiocarcinoma (SUVmax, 16.0; TBR, 7.4). The relatively low uptake on [\(^{68}\)Ga]Pentixafor was also noted in metastases, exhibiting a median SUVmax of 4.5 (range, 2.3–8.8; TBR, 1.7; range, 1.0–4.1). A good correlation between uptake on [\(^{68}\)Ga]Pentixafor and histological derived CXCR4 expression was noted (R = 0.62, P < 0.05). In the 3 patients in whom [\(^{18}\)F]FDG PET/CT was available, [\(^{68}\)Ga]Pentixafor exhibited lower uptake in all lesions.
Conclusions: In this cohort of newly diagnosed, treatment-naïve patients with solid malignancies, CXCR4 expression as detected by [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET/CT and immunohistochemistry was rather moderate. Thus, CXCR4-directed imaging may not play a major role in the management of solid tumors in the majority of patients.
Der primäre Hyperaldosteronismus stellt mit einer Prävalenz von 5 - 12% die häufigste endokrine Ursache einer sekundären Hypertonie da. Der Aldosteronexzess beruht in den meisten Fällen auf einer bilateralen Nebennierenhyperplasie, oder einem unilateralen Aldosteron-produzieren Adenom. Die Unterscheidung dieser beiden Entitäten ist zur weiteren Therapieplanung essentiell: Während ein unilaterales Aldosteron-produzierendes Adenom operativ entfernt wird, erhalten Patienten mit bilateraler Nebennierenhyperplasie eine lebenslange medikamentöse Therapie mit Mineralocorticoidantagonisten. Der selektive Nebennierenvenenkatheter stellt den aktuellen Referenzstandard zur Subtypendifferenzierung bei Patienten mit primärem Hyperaldosteronismus dar. Dieser ist allerdings mit zahlreichen Nachteilen, wie beispielsweise hoher Untersucherabhängigkeit und fehlender Standardisierung, behaftet. Die Strahlenbelastung des Nebennierenvenenkatheters wurde bis dato nicht systematisch analysiert.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde daher im Rahmen einer retrospektiven Studie die Strahlenbelastung des Nebennierenvenenkatheters (n=656) an vier deutschen Zentren zwischen 1999 und 2017 untersucht. Primäre Endpunkte waren das Dosisflächenprodukt, die Durchleuchtungszeit und die kalkulierte effektive Dosis. Das mediane Dosisflächenprodukt lag bei 32,5 Gy*cm², die Durchleuchtungszeit bei 18 min, die berechnete effektive Dosis bei 6,4 mSv. Die Strahlenbelastung zeigte allerdings deutliche interinstitutionelle Unterschiede. Hauptursachen hierfür lagen in zentrumsabhängigen Unterschieden in den Untersuchungsmodalitäten, insbesondere der Anzahl an Entnahmestellen und der Verwendung von digitalen Subtraktionsangiographien.
Der zweite Teil der Arbeit widmet sich der Evaluation des Chemokinrezeptors CXCR4 als neues Target in der Differentialdiagnostik des primären Hyperaldosteronismus. Mittels quantitativer real-time PCR und Immunohistochemie konnte eine hohe Expression von CXCR4 in den äußeren Schichten der Nebennierenrinde, der anhängenden Nebenniere benigner Nebennierentumore, sowie in Aldosteron-produzierenden Adenomen beobachtet werden. Ebenso zeigte sich eine Korrelation der CXCR4-Expression mit der Expression von CYP11B2 (Aldosteron-Synthase). Dem entgegengesetzt, war eine fehlende bzw. signifikant niedrige CXCR4-Expression in endokrin inaktiven Nebennierenadenomen nachweisbar. In autoradiographischen Bindungsstudien zeigte der CXCR4-spezifische PET-Tracer 68Ga-Pentixafor eine deutliche und spezifische Bindung an Kryogewebe von Aldosteron-produzierenden Adenomen. Im Anschluss wurden 9 Patienten mit primärem Hyperaldosteronismus mittels 68Ga-Pentixafor-PET/CT untersucht. Der Tracer-Uptake war signifikant höher in Aldosteron-produzierenden Adenomen im Vergleich zu Nebennieren von Patienten, die aufgrund anderer Grunderkrankungen eine 68Ga-Pentixafor-Bildgebung erhalten hatten. Somit stellt eine CXCR4-spezifische Bildgebung eine vielversprechende Möglichkeit zur nicht-invasiven Charakterisierung von Nebennierenraumforderungen bei primärem Hyperaldosteronismus dar.
C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4) is a key factor for tumor growth and metastasis in several types of human cancer. This study investigated the feasibility of CXCR4-directed imaging with positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) using [\(^{68}\)Ga]Pentixafor in malignant pleural mesothelioma.
Six patients with pleural mesothelioma underwent [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET/CT. 2′-[\(^{18}\)F]fluoro-2′-deoxy-D-glucose ([\(^{18}\)F]FDG)-PET/CT (4/6 patients) and immunohistochemistry obtained from biopsy or surgery (all) served as standards of reference. Additionally, 9 surgical mesothelioma samples were available for histological work-up.
Whereas [\(^{18}\)F]FDG-PET depicted active lesions in all patients, [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET/CT recorded physiologic tracer distribution and none of the 6 patients presented [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-positive lesions. This finding paralleled results of immunohistochemistry which also could not identify relevant CXCR4 surface expression in the samples analyzed.
In contrast to past reports, our data suggest widely absence of CXCR4 expression in pleural mesothelioma. Hence, robust cell surface expression should be confirmed prior to targeting this chemokine receptor for diagnosis and/or therapy.
Das Multiple Myelom ist eine hämatologische Erkrankung, die durch die Proliferation von Plasmazellen und die Produktion von Antikörpern oder deren Leichtketten gekennzeichnet ist. Eine frühe Diagnosestellung durch Detektion sowohl intra- als auch extramedullärer Manifestationen ist für die Einleitung einer effektiven Therapie von entscheidender Bedeutung. Ebenso bedeutsam ist ein wirksames Therapiemonitoring. Wichtige diagnostische Modalitäten sind bei beiden Fragestellungen tomografische, bildgebende Verfahren. Hierbei wurde die Effektivität der 18F-FDG-PET/CT im Rahmen der Diagnose, des Stagings und der Prognoseabschätzung bereits nachgewiesen. Dennoch ist ihr klinischer Nutzen durch die geringe Sensitivität bei Detektion von diffusem Knochenmarksbefall und Vorliegen sowohl falsch positiver als auch falsch negativer Befunde limitiert.
Die vorliegende Arbeit hat untersucht, ob der aminosäurebasierte Tracer 11C-MET über spezifische Eigenschaften verfügt, die eine höhere Sensitivität und Spezifität in der Detektion von Myelomzellen ermöglichen und ob der Radioligand dem etablierten Glukoseanalogon 18F-FDG überlegen ist. Hierfür wurden drei etablierte humane Myelomzelllinien, sowohl nativ als auch nach 48-stündiger Therapie mit dem Proteasominhibitor Carfilzomib, mit 18F-FDG und 11C-MET inkubiert und mithilfe eines Gammastrahlungszählers beurteilt. Zudem wurde untersucht, ob die Traceraufnahme mit spezifischen Charakteristika der Tumorbiologie korreliert. So wurde die Oberflächenexpression von CD138 und CXCR4, die intrazelluläre Expression der Leichtketten κ/λ und die Proliferation der Zelllinien mittels Durchflusszytometrie vor und nach Behandlung mit Carfilzomib eruiert.
Die unbehandelten Zellen zeigten, verglichen zu 18F-FDG, bereits nach kürzester Inkubationsdauer eine 3-3,5-fach höhere 11C-MET Retention. Weiterhin zeigte sich die 11C-MET-Aufnahme nach Behandlung aller Zellreihen insgesamt marginal höher als die 18F-FDG-Aufnahme, während die Reduktion der 11C-MET-Anreicherung im prä- zu posttherapeutischen Vergleich für alle drei Zelllinien signifikant war.
Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtungen liefert die Myelombiologie: eine erhöhte Aufnahme der radioaktiv markierten Aminosäure durch MM-Zellen könnte durch eine Zunahme der Zellproliferation und insbesondere durch eine Steigerung der Proteinsynthese im Rahmen der überschießenden Produktion von M-Protein bedingt sein. In Zusammenschau könnte 11C-MET mit höherer Sensitivität Myelommanifestationen detektieren, wodurch ggf. Läsionen mit geringem Metabolismus dargestellt und eine bessere Beurteilung des Krankheitspogresses erfolgen könnte. Zudem bietet für den klinischen Einsatz die – verglichen zu 18F-FDG – größere Differenz der 11C-MET-Retention zwischen prä- und posttherapeutischer Messung die Möglichkeit einer besseren Beurteilbarkeit des Therapieansprechens. 11C-MET birgt ggf. das Potential auch minimale aktive Restherde zu detektieren und damit Patienten einem individualisierten Therapiekonzept zuzuführen.
Ein Zusammenhang zwischen den untersuchten Biomarkern und der 11C-MET Retention bzw. deren Abnahme nach Behandlung konnte nicht gezeigt werden. Somit sollten für 11C-MET andere Biomarker herangezogen werden, um diese mit der Bildgebung zu korrelieren und zu bewerten.
CXCR4 is a G-protein-coupled receptor that mediates recruitment of blood cells toward its ligand SDF-1. In cancer, high CXCR4 expression is frequently associated with tumor dissemination andpoor prognosis. We evaluated the novel CXCR4 probe [\(^{68}\)Ga]Pentixafor for invivo mapping of CXCR4 expression density in mice xenografted with human CXCR4-positive MM cell lines and patients with advanced MM by means of positron emission tomography (PET). [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET provided images with excellent specificity and contrast. In 10 of 14 patients with advanced MM [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET/CT scans revealed MM manifestations, whereas only nine of 14 standard [\(^{18}\)F]fluorodeoxyglucose PET/CT scans were rated visually positive. Assessment of blood counts and standard CD34\(^{+}\) flow cytometry did not reveal significant blood count changes associated with tracer application. Based on these highly encouraging data on clinical PET imaging of CXCR4 expression in a cohort of MM patients, we conclude that [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET opens a broad field for clinical investigations on CXCR4 expression and for CXCR4-directed therapeutic approaches in MM and other diseases.
Disclosing the CXCR4 expression in lymphoproliferative diseases by targeted molecular imaging
(2015)
Chemokine ligand-receptor interactions play a pivotal role in cell attraction and cellular trafficking, both in normal tissue homeostasis and in disease. In cancer, chemokine receptor-4 (CXCR4) expression is an adverse prognostic factor. Early clinical studies suggest that targeting CXCR4 with suitable high-affinity antagonists might be a novel means for therapy. In addition to the preclinical evaluation of [\(^{68}\)Ga]Pentixafor in mice bearing human lymphoma xenografts as an exemplary CXCR4-expressing tumor entity, we report on the first clinical applications of [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-Positron Emission Tomography as a powerful method for CXCR4 imaging in cancer patients. [\(^{68}\)Ga]Pentixafor binds with high affinity and selectivity to human CXCR4 and exhibits a favorable dosimetry. [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-PET provides images with excellent specificity and contrast. This non-invasive imaging technology for quantitative assessment of CXCR4 expression allows to further elucidate the role of CXCR4/CXCL12 ligand interaction in the pathogenesis and treatment of cancer, cardiovascular diseases and autoimmune and inflammatory disorders.
C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4) and somatostatin receptors (SSTR) are overexpressed in gastro-entero-pancreatic neuroendocrine tumors (GEP-NET). In this study, we aimed to elucidate the feasibility of non-invasive CXCR4 positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging in GEP-NET patients using [\(^{68}\)Ga]Pentixafor in comparison to \(^{68}\)Ga-DOTA-D-Phe-Tyr3-octreotide ([\(^{68}\)Ga]DOTATOC) and \(^{18}\)F-fluorodeoxyglucose ([\(^{18}\)F]FDG). Twelve patients with histologically proven GEP-NET (3xG1, 4xG2, 5xG3) underwent [\(^{68}\)Ga]DOTATOC, [\(^{18}\)F]FDG, and [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET/CT for staging and planning of the therapeutic management. Scans were analyzed on a patient as well as on a lesion basis and compared to immunohistochemical staining patterns of CXCR4 and somatostatin receptors SSTR2a and SSTR5. [\(^{68}\)Ga]Pentixafor visualized tumor lesions in 6/12 subjects, whereas [\(^{18}\)F]FDG revealed sites of disease in 10/12 and [\(^{68}\)Ga]DOTATOC in 11/12 patients, respectively. Regarding sensitivity, SSTR-directed PET was the superior imaging modality in all G1 and G2 NET. CXCR4-directed PET was negative in all G1 NET. In contrast, 50% of G2 and 80% of G3 patients exhibited [\(^{68}\)Ga]Pentixafor-positive tumor lesions. Whereas CXCR4 seems to play only a limited role in detecting well-differentiated NET, increasing receptor expression could be non-invasively observed with increasing tumor grade. Thus, [\(^{68}\)Ga]Pentixafor PET/CT might serve as non-invasive read-out for evaluating the possibility of CXCR4-directed endoradiotherapy in advanced dedifferentiated SSTR-negative tumors.
Die Koronare Herzkrankheit (KHK) zählt zu den häufigsten Todesursachen in Deutschland und weltweit. Die Atherosklerose der Herzkranzgefäße gilt als pathophysiologisches Korrelat der KHK. Die manifeste KHK geht mit Myokardhypoxie einher, persistierende Myokardhypoxie resultiert im Myokardinfarkt. Atherosklerose ist ein multifaktorieller, sich selbst verstärkender Inflammationsprozess, an dem multiple Zellen und Moleküle beteiligt sind. Hierzu zählen zum Beispiel das monozytär-phagozytäre System (MPS) und Chemokine sowie Chemokinrezeptoren. Auch im Regenerationsprozess nach Myokardinfarkt spielt die MPS-Chemokinrezeptor-Interaktion eine bedeutsame Rolle. Die perkutane Koronarintervention mit Stentimplantation (PCI) hat sich als geeignete Behandlungsmöglichkeit der manifesten KHK etabliert. Häufigste Komplikationsfolge der Implantation von Bare-Metal-Stents stellt die In-Stent-Restenose aufgrund einer überschießenden Inflammationsreaktion dar. Konsekutiv entwickelte Drug-Eluting-Stents sondern Immunmodulatoren zu Eindämmung der Inflammationsreaktion ab. Dadurch kommt es auch zu Eindämmung der gewollten Reendothelialisierung des Stents mit Zunahme gefürchteter Stent-Thrombosen. Ideal wäre demnach eine selektivere Hemmung der Inflammationsreaktion, die die gewünschte Reendothelialisierung nicht beeinträchtigt. Hierzu müssen die molekularbiologischen Zusammenhänge am Gefäßbett nach Stenting beleuchtet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Expressionsverhalten der Chemokinrezeptoren CXCR4, CX3CR1 und CCR2 auf Monozyten vor und nach PCI im humanen Modell untersucht, alle untersuchten Probanden litten an Atherosklerose, circa die Hälfte hatte bereits vormalig einen Myokardinfarkt erlitten. 24 Stunden nach Stenting zeigte sich eine signifikant geringere CXCR4-Expression und Positivität auf Monozyten der Gesamtpopulation. Dies ist vermutlich Korrelat einer Achsenaktivierung mittels CXCR4-typischer Rezeptorinternalisierung und mittels Abwanderung CXCR4-positiver Monozyten ins Gefäßbett und spricht für eine grundlegende Rolle der CXCR4-MPS-Interaktion nach PCI. Patienten, die bereits einen Myokardinfarkt erlitten hatten, konnten eine signifikant niedrigere CXCR4-Expression auf Monozyten aufweisen als die Vergleichsgruppe. Weiterhin zeigten Patienten mit pectanginösen Beschwerden einen signifikant höheren Rezeptorverlust an der Oberfläche der Monozyten nach Stenting. Dies deutet auf eine grundlegende Rolle der CXCR4-MPS-Interaktion bei Myokardhypoxie hin und liefert einen Einblick in das komplexe Geschehen der Infarktheilung und Hypoxiekompensation.
Hypothetisch denkbar wäre eine protektive Rolle der CXCR4-Achse nach Ischämie, mit Hypoxie-vermittelter Präkonditionierung humaner Monozyten nach stattgehabtem Myokardinfarkt und konsekutiv basal gesteigerter CXCR4-Expression, die nach erneutem Hypoxie-Ereignis einen schnelleren Zugriff auf CXCR4-vermittelte, protektive Signalwege erlauben könnte. Patienten, die sich bereits vormals einem Stenting unterzogen hatten, konnten eine signifikant niedrigere CX3CR1-Expression auf Monozyten aufweisen. Dies steht in Kongruenz mit Ergebnissen von Tierstudien, die eine grundlegende Rolle von CX3CR1 im chronischen Monozytenrecruitment nach Gefäßverletzung beschrieben hatten. Für CCR2 ergaben sich keine relevanten Ergebnisse. Die Rolle der Interaktion der Chemokinrezeptoren CXCR4, CX3CR1 und CCR2 mit humanen Monozyten in Neointimagenese, Atherosklerose und Myokardheilung nach Infarkt ist nicht eindeutig beschrieben und wird zum Teil kontrovers diskutiert. Unsere Studie liefert interessante neue Erkenntnisse bezüglich der Beteiligung der untersuchten Rezeptoren und dem MPS bei den beschriebenen pathogenetischen Prozessen. Die erstmalig beschriebene CXCR4-MPS-Interaktion nach Stenting sowie die Hinweise auf eine Beteiligung von CX3CR1 im chronischen Monozytenrecruitment der humanen Neointimagenese liefern einen interessanten Anhaltspunkt für die Entwicklung neuer, selektiver Antagonisten im Kampf gegen die In-Stent-Restenose.
Bekanntermaßen führt die H.pylori Infektion des Magens über eine komplexe Modulation des Chemokinsystems zur Ausbildung der H.pylori Gastritis. Die Chemokinrezeptorexpression in der H.pylori Gastritis ist jedoch bisher noch fast nicht untersucht. Das Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der Chemokinrezeptorexpression im Magen und die Testung eines Einfluss von H.pylori auf die Expression von Chemokinrezeptoren. In vitro führt die Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit H. pylori zu einer schnellen Herunterregulation von CXCR1 und CXCR2 auf Proteinebene durch Rezeptorinternalisation und intrazellulären Abbau. Der Effekt ist unabhängig vom cag Status von H. pylori, sowie von TNF-α- oder IL-8. Als möglicher Signaltransduktionsmechanismus für diesen Effekt wäre die direkte Interaktion von H. pylori mit „toll-like receptors“ (TLRs) denkbar. Auf mRNA Ebene kommt es in vitro bei der Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit H. pylori zu einer Herunterregulation von CXCR1 und CXCR2 mRNA nach 3 Stunden. Dieser Effekt tritt bei Inkubation mit einem cag positiven H. pylori Stamm verstärkt auf und könnte bedingt sein durch autokrine Herunterregulation der Expression von CXCR1 und CXCR2 durch IL-8. In vivo exprimieren neutrophile Granulozyten in der H. pylori Gastritis in den Krypten ebenfalls vermindert CXCR1 und CXCR2. Sowohl die Expression der Chemokine als auch der korrespondierenden Chemokinrezeptoren wird somit durch H.pylori beeinflusst. Es lässt sich somit der folgende Pathomechanismus postulieren: Nach dem Eintritt der neutrophilen Granulozyten in die Schleimhaut, kommt es über den direkten Kontakt mit H.pylori zum Verlust der Chemokinrezeptoren. Die neutrophilen Granulozyten können somit nicht mehr auf Chemokinsignale reagieren und werden in der Magenschleimhaut immobilisiert. Dort setzen sie reaktive Sauerstoffradikale, proinflammatorische Zytokine und Chemokine frei, die zur Schleimhautschädigung führen. Magenkarzinome exprimieren die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR7. Die Expression wird mit der Neigung zur Metastasierung und einer schlechten klinischen Prognose assoziiert. In unseren Untersuchungen wird CXCR4 in vivo während des Prozess der Karzinogenese im Magen ab dem Stadium der intestinalen Metaplasie exprimiert. Bei Inkubation der Zelllinien mit cagA positiven und cagA negativen H. pylori – Stämmen, kommt es zu keiner Änderung der Expression von CXCR4. Die Infektion mit H. pylori ist zwar die Voraussetzung für die Genese der intestinalen Metaplasie, scheint jedoch nicht ursächlich an der Expression von CXCR4 beteiligt zu sein. CCR7 tritt in vivo auf den Magenepithelien der H. pylori Gastritis, der intestinalen Metaplasie, Dysplasie und Magenkarzinomen auf. In vitro führt die Koinkubation von CCR7 tragenden Magenzelllinien mit H. pylori zur Hochregulation von CCR7 kommt. Die Expression von CCR7 auf Karzinomzellen wird ebenfalls möglicherweise durch eine begleitende Infektion mit H. pylori begünstigt. Der Effekt der CCR7 Induktion durch H. pylori in vitro ist unabhängig vom cag Status des für die Infektion verwendeten H. pylori Stammes. Die Hochregulation von CCR7 ist möglicherweise bedingt durch die intrazelluläre Aktivierung von NFκB infolge der H. pylori Infektion. Denkbar wäre auch eine Induktion der Expression von CCR7 in den Magenepithelzellen in TLR abhängiger Weise, äquivalent zu Mechanismen, die in dendritischen Zellen beschrieben wurden. Es lässt sich abschließend feststellen, dass die H.pylori Infektion nicht nur die Freisetzung von Chemokinen, sondern auch die Expression von Chemokinrezeptoren wesentlich beeinflusst. Neutrophile Granulozyten verlieren in direktem Kontakt zu H.pylori die Chemokinrezeptoren CXCR1 und CXCR2. Auf Epithelzellen führt der direkte Kontakt zu H.pylori zur vermehrten Expression von CCR7. Die direkte Regulation von Chemokinrezeptoren durch H.pylori scheint also sowohl bei der H.pylori Gastritis, als auch bei der Entstehung und Progression von Magenkarzinomen eine Rolle zu spielen.