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Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält.
Die klassische Signaltransduktionskaskade, auch MAP Kinase Kaskade genannt, ist wesentlich an der Regulation zellulärer Vorgänge wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt. Proteinkinasen der Raf-Familie wirken dort als signalübertragende Elemente, welche Membranrezeptoren nachgeschaltet sind. Diese Proteine fungieren als Proto-Onkogene, eine Veränderung dieser Proteine kann sie in Onkogene überführen und sind wesentlich an der Krebsentstehung beteiligt. Während die Rolle von c-Raf als MEK-Aktivator innnerhalb des klassischen Signaltransduktionsweges gut charakterisiert ist, so ist nur wenig über die beiden anderen Isoformen A-Raf und B-Raf bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei PC12 cDNA-Bibliotheken unter Verwendung des Two-Hybrid Systems mit A-Raf und mit c-Raf zur Isolierung neuer Raf-Interaktionspartner untersucht. Für c-Raf wurden die Wechselwirkungen mit den bekannten Interaktionspartnern bestätigt, es wurden jedoch keine neuen Bindungspartner identifiziert. Im A-Raf Two Hybrid Screen konnte zum einen Prolyl 4-Hydroxylase als Schlüsselenzym der Kollagensynthese isoliert werden. Es wurde keine Wechselwirkung zwischen Prolyl 4-Hydroxylase und c-Raf oder B-Raf beobachtet. Die Prolyl 4-Hydroxylase Bindungsstelle konnte innerhalb der N-terminalen variablen Region von A-Raf lokalisiert werden. Zum anderen wurde die Pyruvatkinase M2 als A-Raf spezifischer Bindungspartner identifiziert. Für diese Wechselwirkung war die c-terminale Region von A-Raf ausreichend. Durch Mutation zweier Aminosäuren im c-terminalen Teil von A-Raf konnte diese Wechselwirkung verhindert werden, wobei die Interaktion zu MEK und Ras dadurch nicht beeinträchtigt wurde. Ein kooperativer Effekt auf die Zelltransformation wurde durch Co-Transfektion von NIH Zellen mit onkogenem A-Raf und Pyruvatkinase M2 gezeigt. Diese führte zu doppelt so vielen Foci wie die Transfektion mit A-Raf alleine. Die Mutation der mutmaßlichen ATP-Bindungsstelle der Pyruvatkinase M2, welche die A-Raf Pyruvatkinase M2 Kooperation blockieren sollte, verhinderte diesen synergistischen Effekt. Diese Ergebnisse weisen auf eine Regulation der Pyruvatkinase M2 durch A-Raf hin und lassen den Schluss zu, dass die funktionelle Interaktion mit der Pyruvatkinase M2 durch onkogenes A-Raf für die Zelltransformation notwendig ist. Als zwei neue Raf-Interaktionspartner wurden Prolyl 4-Hydroxylase und Pyruvatkinase M2 identifiziert, welche Raf-Isoform spezifische Bindung zeigen. Auf diese Weise konnte eine direkte Verbindung zwischen der transformierenden MAP Kinase Kaskade und dem Energiestoffwechsel hergestellt werden.
MAPK Kaskaden spielen eine Schlüsselrolle bei der Übertragung und der Umwandlung von extrazellulären Reizen in intrazelluläre Signale und regulieren dadurch unterschiedliche Prozesse wie Differenzierung, Zellproliferation oder Stress Antworten. 'Mixed Lineage Kinasen' (MLKs) bilden eine Familie von Serin/Threonin Proteinkinasen mit mehreren Protein/Protein Interaktionsdomänen (SH3, Cdc42 Rac interactive binding sequence/CRIB, Leuzin Zipper), die am engsten mit der Familie der MAPKK Kinasen verwandt ist. In der voliegenden Arbeit zeigen wir, dass MLK3 Cdc42/Rac induzierte JNK/SAPK Aktivität vermittelt, welches zu einer anschließenden Phosphorylierung und verstärkter transkriptioneller Aktivität des zur AP-1 Familie gehörenden immediate early Gens c-Jun führt. Zusätzlich phosphoryliert MLK3 die dualspezifischen Kinasen MEK1/2 direkt in vitro und in vivo an den für die Aktivierung wichtigen Serinen 217/221. Wohingegen dies nur zu einer ERK Aktivierung in Überexpressionssystemen führte, demonstrieren die Analysen überzeugend, dass endogenes MEK1/2, welches von MLK3 phosphoryliert worden ist, nicht in der Lage ist, diese Aktivität auf das physiologische Substrat ERK1/2 in vitro wie auch in vivo zu übertragen. Wir postulieren daher, dass MLK3 vermittelte MEK1/2 Phosphorylierung die dualspezifischen Kinasen von ERK1/2 Aktivierung entkoppelt. Zusätzlich zeigen wir, dass Überexpression von Wild Typ MLK3 zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten und Wachstum in Soft Agar führt. In Übereinstimmung mit den anderen Analysen ist MEK1/2 stark phosphoryliert jedoch von ERK1/2 Aktivierung in MLK3 transformierten Zellen entkoppelt. Weiterhin kooperiert MLK3 mit aktivierter MEK1 in Foci Bildung, was zeigt, dass MLK3 andere Signalwege als ERK1/2 in der Zelltransformation benutzt. Vielmehr ist in MLK3 transformierten Fibroblasten Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Aktivierung und Expression des immediate early Gens junB partiell blockiert. Unsere Analysen zeigen zum ersten Mal für eine MAPKK Kinase, dass sie MAPK Signalwege unterschiedlich reguliert. Während MLK3 auf der einen Seite JNK/SAPK aktiviert, entkoppelt es MEK1/2 induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 Aktivierung und blockiert sogar Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Ativierung partiell.