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Dendritische Zellen (DC) sind spezialisierte antigenpräsentierende Zellen. Die von Monozyten abgeleiteten DC sezernieren überwiegend Zytokine vom Th1-Typ. Da während der normalen Schwangerschaft die Produktion von Th2-Zytokinen durch immunkompetente Zellen überwiegt, ist zu vermuten, dass die auf der Oberfläche des Trophoblasten exprimierten Moleküle HLA-G und HLA-E die Zytokinproduktion der DC modulieren. Material und Methoden. DC wurden aus isolierten Monozyten des peripheren Blutes kultiviert. Nach Inkubation mit Leukämiezellen der Linie K-562, an deren Oberfläche die HLA Moleküle der Klassen I und II fehlen und die mit HLA-G oder HLA-E transfiziert wurden, sowie mit nicht transfizierten K-562 Zellen (Kontrollen) wurden die Konzentrationen der Zytokine IL-10, IL-12p70, IL-18 und TNF-alpha sowie des Chemokins IL-8 im Überstand mit ELISA bestimmt. Ergebnisse. Die Kultur mit nicht transfizierten K-562 Zellen resultierte in einem signifikanten Anstieg der Produktion von IL-8 und TNF-alpha durch unreife und reife DC sowie von IL-10 durch unreife DC (p < 0,01). In der Kokultur mit HLA-G und HLA-E transfizierten Zellen nahm im Vergleich dazu die Produktion von IL-8 durch unreife und reife DC und die von IL-10 und TNF-alpha durch unreife DC signifikant (p < 0,01) ab. Der Kontakt mit HLA-G und HLA-E transfizierten Zellen hatte keinen Effekt auf die Sekretion von IL-12p70 und IL-18 durch DC. Schlussfolgerungen. Diese Resultate zeigen, dass DC nach Kontakt mit nicht HLA-präsentierenden Zellen mit einer Ausschüttung von Zytokinen reagieren. Der eindeutige suppressive Effekt von HLA-G und HLA-E auf die Produktion des Th 1-Zytokins TNF-alpha, des Th 2-Zytokins IL-10 und des Chemokins IL-8 durch unreife DC liefert einen weiteren Beleg für die zentrale Rolle von HLA-G und HLA-E bei der Immuntoleranz der normal verlaufenden Frühschwangerschaft.
Während der Schwangerschaft kommt es gegen das mit Fremdantigen beladene Kind nicht zu einer cytotoxischen Immunreaktion. Da sich auch der Hormonhaushalt der Mutter ändert, stellt sich die Frage nach dem Zusammenhang zwischen dem Immunsystem und der Hormonlage. Dendritische Zellen sind bedeutende Zellen im menschlichen Immunsystem . Diese wurden aus Buffy coats angezüchtet und mit schwangerschaftsassoziierten Hormonen versetzt. Nachdem man die von den DC produzierten Cytokine mittels ELISA gemessen hatte, liess sich eine Aussage darüber treffen wie die Hormone die dendritischen Zellen in ihrer Stoffproduktion beeinflussen und ob sie protektiv, bzw. cytotoxisch auf das Schwangerschaftsgeschehen wirken.
Das Implantationsversagen stellt die häufigste Ursache für den Misserfolg der menschlichen Reproduktion dar und spielt wahrscheinlich eine bedeutende Rolle bei wiederholt erfolgloser assistierter Reproduktion (IVF/ICSI und ET). Die hormonell eingeleitete Regulation der Implantation beinhaltet eine komplexe Folge von Signalen zwischen Embryo und Endometrium, deren regelrechter Ablauf für die erfolgreiche Einrichtung einer Schwangerschaft entscheidend ist. Eine Fülle von Faktoren wie Zytokine und Wachstumsfaktoren spielen hier eine bedeutende Rolle. Unter diesen Mediatoren ist auch Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) am Implantationsvorgang beteiligt. Bei weiblichen Mäusen mit einer homozygoten Inaktivierung des LIF-Gens bleibt nach erfolgreicher Befruchtung ihrer Oozyten die Implantation aus, obwohl ihre Blastozysten lebensfähig sind. Die mütterliche LIF-Produktion ist also essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft bei Mäusen. Für die Beteiligung LIFs an der Kontrolle des Implantationsvorgangs auch beim Menschen gibt es eine Reihe von Hinweisen. Das LIF-Protein wird im menschlichen Endometrium zyklusabhängig mit einem Maximum zum Zeitpunkt der Implantation produziert. Menschliche Blastozysten exprimieren zum Zeitpunkt der Implantation mRNA für LIF-Rezeptoren, so dass sie als Ziel der Zytokinwirkung gelten. Ein Mangel an LIF könnte im Zusammenhang mit einigen Formen von Infertilität stehen. In uteriner Spülflüssigkeit idiopathisch infertiler Frauen wurden reduzierte LIF-Konzentrationen nachgewiesen, endometriale Zellen infertiler Frauen, sezernierten signifikant weniger LIF als die fertiler Frauen. Als Grundlage dieser Veränderungen werden Mutationen im LIF-Gen vermutet, die zu reduzierter endometrialer Produktion oder verminderter biologischer Aktivität des Zytokins führen und eine gestörte Implantation der Blastozyste im menschlichen Endometrium zur Folge haben. Im Vorfeld konnte bereits eine signifikant erhöhte Prävalenz von heterozygoten Mutationen im menschlichen LIF-Gen in einer Population von Frauen mit unterschiedlichen Infertilitätsursachen nachgewiesen werden. Bislang liegen nur unzureichende Daten zur Prävalenz von Mutationen im LIF-Gen als mögliche Ursache für ein Implantationsversagen vor. Der Nachweis von Mutationen im LIF-Gen könnte einerseits diagnostisch zur Beurteilung der endometrialen Rezeptivität und der Prognose eines IVF/ICSI-Behandlungsversuches genutzt werden. Andererseits hätte der Nachweis eines LIF-Mangels auf dem Boden einer LIF-Gen-Mutation auch therapeutische Konsequenzen, wenn in Zukunft die Substitution LIFs möglich wäre. Ziel dieser Arbeit war es, die Häufigkeit und Art der Mutationen im LIF-Gen bei Frauen mit wiederholt erfolgloser IVF/ICSI-Behandlung zu untersuchen, um ihre Bedeutung für das Implantationsversagen bei der assistierten Reproduktion beurteilen zu können, und zu prüfen, ob der Einsatz eines geeigneten Screeningverfahrens auf LIF-Gen-Mutationen bei diesen Patientinnen sinnvoll erscheint. Zu diesem Zweck wurden 50 Patientinnen mit wiederholtem IVF/ICSI-Versagen und 105 fertile Frauen als Kontrollgruppe auf das Vorliegen von Mutationen im LIF-Gen untersucht. Zum diesem Screening dienten die standardisierte DNA-Extraktion, deren Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Single-Strand Conformation Polymorphism-Analyse (SSCP). Zeigte sich bei der SSCP-Analyse ein abnormes Laufverhalten in den Elektrophoresebanden, erfolgte anschließend die Sequenzierung des DNA-Abschnittes zur Bestätigung und Identifizierung der genetischen Alteration als Mutation oder Polymorphismus. Eine Patientin wies im Exon 3 des LIF-Gens eine heterozygote Transversion (G3453T) auf, welche die Struktur und Funktion des LIF-Proteins jedoch nicht beeinflusst, so dass es sich nicht um eine Mutation, sondern um einen funktionell unbedeutenden Polymorphismus handelt. In einem Fall der Kontrollgruppe fand sich ebenfalls ein Polymorphismus, eine Transition (C3235T) im Intron zwischen Exon 2 und 3. Mutationen mit Auswirkungen auf das Expressionsniveau oder die Bioaktivität LIFs konnten nicht aufgedeckt werden. Die Mutationsrate bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen nach IVF/ICSI-Therapie ist demnach sehr niedrig und gegenüber fertilen Frauen nicht signifikant erhöht. Damit stehen die Resultate dieser Arbeit im Einklang mit Ergebnissen früherer Studien, wonach LIF beim Menschen zwar eine wichtige Teilfunktion bei der Steuerung des komplexen Implantationsvorganges einnimmt, aber nicht essentiell für seinen Erfolg ist. Aufgrund der niedrigen Prävalenz funktioneller Mutationen im LIF-Gen bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen nach einer IFV/ICSI-Behandlung erscheint ein Screening der betroffenen Patientinnen als Routinemaßnahme zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken nicht gerechtfertigt.
In der vorliegenden Arbeit wurden zum einen die Chorionkarzinomzelllinien JEG-3 (exprimiert HLA-C und HLA-G) und JAR (MHC-Klasse I negativ, exprimiert HLA-E), zum anderen die Leukämiezellllinien K562 (untransfiziert), K562 (mit HLA-G transfiziert) und K562 (mit HLA-E transfiziert) als Modell für fetalen Trophoblasten verwendet. In Kokulturen dieser Zelllinien mit Large Granular Lymphocytes (LGL, CD 56++) sowie LGL freier Dezidua (WASH) wurde die Expression der Sekretion der Zytokine TNF-a, IFN-g, GM-CSF, IL-5, IL-10, IL-13 und IL-15 gemessen. Dabei zeigte die Chorionkarzinomzelllinie JEG-3 eine Unterdrückung der TNF-a-, IFN-g-, GM-CSF- und IL-13-Produktion, aber eine Erhöhung der IL-10- und IL-15-Produktion gegenüber JAR. Möglicherweise tragen aber auch díe Chorionkarzinomzelllinien selbst zur Zytokinproduktion bei oder bewirken durch andere, noch nicht bekannte Mechanismen, eine Veränderung der Resultate. Im Vergleich mit Kokulturen von LGL mit der untransfizierten Leukämiezellline K562 produzierten Kokulturen mit Leukämiezellen, die HLA-G exprimieren, signifikant weniger Zytokine (TNF-a, IFN-g, GM-CSF, IL-10, IL-13 und IL-15). Wurden dagegen LGL mit K562-Zellen kokultiviert, die mit HLA-E transfiziert waren, konnte keine signifikante Reduktion der Zytokinproduktion gemessen werden. In diesen Untersuchungen präsentierten also mit HLA-G transfizierte Zellen und in geringerem Maße auch mit HLA-E transfizierte Zellen eine Zytokinfreisetzung, die nicht mit der bisherigen Überzeugung übereinstimmt, nach der es für eine erfolgreiche Schwangerschaft notwendig ist, dass Th1-Zytokine herabreguliert und Th2-Zytokine heraufreguliert werden. In dieser Arbeit konnte eine generelle Herabregulation aller gemessenen Zytokine durch die Präsentation von HLA-G auf K562-Zellen erkannt werden.
Geburtseinleitung mit 2 mg Prostaglandin-E 2-Vaginalgel bei unreifem Zervixbefund (Bishop-Score 5)
(2004)
Das Ziel einer medikamentösen Geburtseinleitung ist, durch die Beendigung der Schwangerschaft ein besseres perinatales Ergebnis für Mutter und Kind zu erreichen als bei einer abwartenden Haltung. Da bei unreifem Zervixbefund die Applikation von 2 mg PGE2-Vaginalgel der Applikation von 1 mg PGE2-Vaginalgel und 0,5 mg PGE2-Intrazervikalgel überlegen erscheint wurde in dieser Studie überprüft, ob die Geburtseinleitung nach 12 Stunden mit 2 mg PGE2-Gel intravaginal bei unreifer Zervix (Bishop-Score ≤ 5) eine effektive und sichere Methode darstellt. Die Geburtseinleitung mit 2 mg PGE2-Vaginalgel führte bei Patientinnen mit vorzeitigem Blasensprung trotz unreifem Zervixbefund in einem hohen Prozentsatz (88%) innerhalb von 24 h zu einer vaginalen Entbindung. Dabei zeigte sich vor allem der Einfluss der Parität auf die Wirksamkeit der Geburtseinleitung bei unreifem Zervixbefund. Der Nachweis von phosphoryliertem IGFBP 1 im Zervikalsekret scheint einen paediktiven Wert für den Erfolg einer Geburtseinleitung zu besitzen. Es zeigte sich bei positivem actim Partus test eine signifikant höhere Spontangeburtsrate. Auch korreliert der actim Partus test mit dem Bishop-Score bei Einleitungsbeginn. Es ließen sich jedoch keine signifikant höheren vaginalen Entbindungsraten im 24 Stunden Intervall nachweisen. Dies ist möglicherweise mit der kleinen Fallzahl erklärbar. Somit scheint der actim Partus test mit der hohen Nachweisgrenze von 10 µg/l phosphoryliertem IGFBP 1 zur Abschätzung des Erfolges einer Geburtseinleitung bei unreifem Zervixbefund nur bedingt geeignet zu sein. Zukünftige Studien zur Geburtseinleitung mit Prostaglandin-E2-Vaginalgel bei unreifem Zervixbefund sollten mit einer Quantifizierung des phosphorylierten IGFBP 1 im Zervikalsekret durchgeführt werden um einen optimale Schwellenwert für die Entwicklung eines Schnelltests für die klinische Praxis zu ermitteln.
Dendritische Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation von Immunantworten. Neuere Forschungsergebnisse zeigen, wie vielfältig diese außergewöhnliche Zellpopulation die Richtung einer Immunantwort beeinflussen kann. So stellen DC nicht nur die wohl wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen dar und induzieren hocheffektive inflammatorische Immunantworten, sondern spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung immunologischer Toleranz. Die Entdeckung dendritischer Zellen in menschlicher Dezidua wirft die Frage nach der Beteiligung der DC an den immunologischen Vorgängen an der fetomaternalen Grenzzone auf. Trotz der großen Zahl an Untersuchungen konnte bis heute nicht abschließend geklärt werden, welche Mechanismen zur immunologischen Akzeptanz des Feten durch das mütterliche Immunsystem beitragen. Während der Schwangerschaft finden sich neben den veränderten Spiegeln für Progesteron, b-Estradiol, bHCG und weiteren Hormonen auch wesentliche Veränderungen im Zytokinmilieu des uterinen Gewebes. Für einige Zellpopulationen sind Interaktionen zwischen dem Immunsystem und dem endokrinen System bereits nachgewiesen - für DC lag bisher jedoch noch keine systematische Untersuchung vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Wirkung schwangerschaftsassoziierter Hormone auf humane DC gezeigt werden. Als Modellsystem wurden in vitro aus Monozyten des peripheren Blutes differenzierte DC gewählt. Ausgereifte DC (mDC) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Progesteron, 17b-Estradiol, bHCG und Dexamethason behandelt. Untersucht wurden Veränderungen der Zytokinspiegel in den Zellkulturüberständen mittels ELISA. Die Veränderung der Oberflächenmarkerexpression wurde durchflusszytometrisch im FACS gemessen und Veränderungen der T-Zellstimulationskapazität in Stimulationsversuchen (MLR) gemessen. Die Messungen zeigten deutliche Veränderungen der Zytokinspiegel nach Stimulation der Zellen mit schwangerschaftsassoziierten Hormonen. Dagegen bestätigte die Untersuchung der Oberflächenmarkerexpression im FACS zwar den ausdifferenzierten Phänotyp der DC, konnte ansonsten aber nur für mit Dexamethason behandelte DC signifikante Veränderungen der Reifungs- und Aktivierungsmarker zeigen. Die T-Zellstimulationsassays zeigten keine wesentliche Beeinflussung der DC durch schwangerschaftsassoziierte Hormone. Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass eine endokrine Beeinflussung der reifen dendritischen Zellen durchaus stattfindet, eine wesentliche Wirkung allerdings nur auf die Zytokinexpression dendritischer Zellen nachweisbar ist. Signifikant sind hier die verminderte Produktion inflammatorischer Th1-Zytokine und hochsignifikante Steigerung der IL-10-Sekretion nach Behandlung der Zellen mit Dexamethason und Progesteron, insbesondere in der Kombination von Progesteron mit bHCG. Die für den Erhalt der Schwangerschaft entscheidenden Veränderungen des Zytokinmilieus an der fetomaternalen Grenzzone mit erniedrigten Th1- und erhöhten Th2-Zytokinspiegeln könnten also durch die veränderte Zytokinproduktion der DC mitbestimmt werden.