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- Comprehensive Hearing Center, Department of ORL, Plastic, Aesthetic and Reconstructive Head and Neck Surgery, Würzburg, Germany (1)
- DNA Analytics Core Facility, Biocenter, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Department of Animal Ecology and Tropical Biology, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Maastricht University, Maastricht, the Netherlands (1)
Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repräsentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der öffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleinsäuresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, über eine Kombination aus computergestützter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten für VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fettsäuredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), während ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentität zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine präzise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollständige genetische Charakterisierung der genannten Fettsäuredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabhängig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufklärung der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen.
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat in viele Gebiete der modernen Medizin und Biologie Einzug gehalten. Ein wichtiges Anwendungsfeld hat sie in der pränatalen Diagnostik gefunden. An kultivierten Interphasekernen sowie Metaphasechromosomen eingesetzt kann sie zusätzliche Informationen zur zytogenetischen Analyse liefern. Chromosomenspezifische Sonden können auch auf native Fruchtwasserzellen, Chrorionzottenzellen und fetale Blutzellen hybridisiert werden. Seit einigen Jahren wird FISH an unkultivierten Amniozyten bei bestimmten Indikationen ergänzend zur herkömmlichen Chromosomenanalyse durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Prozentsätze der Kerne mit disomem (2 Signale) und aberrantem (z.B. 3 Signale bei Trisomie) Signalmuster analysiert. Für eine zuverlässige Information müssen mindestens 50 Kerne pro Sonde ausgewertet werden. Bei weniger als 10 Prozent aneuploiden Kernen wird das Ergebnis als unauffällig gewertet, bei mehr als 60 Prozent aberranten Kernen als auffällig und dazwischen als uneindeutig bzw. kontrollbedürftig. Die konventionelle Chromosomenanalyse erfordert in der Regel ein 2-3wöchige Zellkultur. Das Ergebnis der FISH-Analyse ist dagegen nach 1-3 Tagen erhältlich, verkürzt so die für die werdende Mutter oft quälende Wartezeit beträchtlich und ist damit besonders für Hochrisikogruppen geeignet. Mit FISH für die Chromosomen 13, 18, 21 und XY können können bis zu 90 Prozent der im 2. Trimenon erwarteten Chromosomenanomalien diagnostiziert werden. 10-15 Prozent der Anomalien, z.B. strukturelle Aberrationen können mit dieser Methode grundsätzlich nicht erfasst werden. Technische Probleme, wie z.B. Versagen der Hybridisierung, eine zu geringe Anzahl auswertbarer Kerne oder eine Kontamination der nativen Fruchtwasserprobe mit Zellen mütterlichen Ursprungs können die Aussagekraft des Tests beträchtlich herabsetzen. In der vorliegenden Arbeit werden die ersten 129 FISH-Untersuchungen an unkultivierten Fruchtwasserproben, die am Institut für Humangenetik in Würzburg in der klinischen Diagnostik durchgeführt wurden, retrospektiv aufbereitet. Die einzelnen Fälle werden nach den oberngenannten Kriterien in Gruppen mit unauffälligen, auffälligen und problematischen FISH-Befunden aufgeteilt. Der Anteil der letztgenannten Gruppe ist recht groß: In lediglich 20 Prozent (n=26) der Fälle konnten 50 Zellkerne pro Sonde ausgewertet werden, in 22 Prozent (n=28) der Fälle war das Ergebnis mit 10-60 Prozent aberranten Kernen uneindeutig und in 26 Prozent (n=33) der Fälle schlug die Hybridisierung für mindestens eine Sonde fehl. Dennoch konnten 79 Prozent (15/19) der erkennbaren Anomalien korrekt identifiziert werden: 5 Trisomie 21-Fälle, darunter eine Robertson-Translokation, 3 Trisomie 18-Fälle, 4 Fälle mit Triploidie, 2 Fälle mit Monosomie X und eine Fall mit dem Chromosomensatz 48, XXY, +21. Nicht diagnostiziert wurden aufgrund von fehlgeschlagener Hybridisierung 2 Fälle mit Trisomie 21 und ein Fall mit Trisomie 13. ein Fall von Trisomie 18 zeigte ein unauffälliges Signalmuster. Es traten keine falsch positiven Befunde auf. Fünf Fälle mit strukturellen Aberrationen entgingen der FISH-Analyse. In der folgenden Arbeit werden die Anzahl auswertbarer Kerne, die Signalverteilung in den verschiedenen Gruppen, Probleme bei Hybridisierung oder Auswertung und beeinflussende Faktoren wie Indikation, Gestationsalter, Farbe und Menge des Fruchtwassers beschrieben. In der Diskussion wird auf grundsätzliche technische Besonderheiten der FISH-Analyse eingegangen, wie z.B. Sondenqualität, Gestationsalter und Zellzahl. Das Problem der Kontamination der Fruchtwasserproben mit mütterlichen Zellen wird erläutert. Anschließend wird nochmals auf die pathologischen, problematischen und diskrepanten FISH-Befunde eingegangen. Daten und Erfahrungen verschiedener Arbeitsgruppen aus der Literatur werden jeweils berücksichtigt und mit den eigenen Daten in Beziehung gesetzt. Sensitivität und Spezifität der Methode werden diskutiert. FISH kann eine wertvolle Ergänzung zum Goldstandard der pränatalen Diagnostik und insbesondere der psychischen Entlastung der Patientin dienen. Einen vollständigen Ersatz der konventionellen Technik kann sie wegen der oben erwähnten Limitationen nicht bieten. Die Entscheidung über die Anwendung der FISH-Diagnostik, wie auch der Pränataldiagnostik überhaupt, sollte der betroffenen Frau überlassen werden und erst nach ausführlicher Information über Vor- und Nachteile sowie mögliche Konsequenzen, im Idealfall im Rahmen einer Genetischen Beratung, erfolgen.