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- D-1221-2009 (1)
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Hyaluronsäure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellulärmatrix vieler Gewebe und tritt in erhöhten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberflächenrezeptoren abhängt, sondern hauptsächlich von der Porosität der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antikörper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Flüssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazelluläres Auftreten von HS vorwiegend perinukleär mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Moleküle im Medium bestimmt werden.
Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung neuartige Ansätze zur Identifizierung von biologisch aktiven Wirkstoffen, die in die Metamorphose von holometabolen Insekten eingreifen. Hexamerine und Neuropeptide besitzen sehr unterschiedliche Funktionen. Während Neuropeptide zusammen mit anderen Gewebshormonen auf einer übergeordneten regulatorischen Ebene wirken, sind Hexamerine als Speicher- und Verteidigungsproteine ein Endglied dieser hormonellen Regulationskaskade. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1) Im ersten Projekt sollten allatotrope Substanzen im Gehirn der großen Wachsmotte Galleria mellonella durch Screening einer Expressionsbibliothek mit polyklonalen Antiseren identifiziert werden. Dabei wurde das Neuropeptid Corazonin identifiziert. Die vollständige Corazonin-mRNA wurde kloniert und sequenziert. Das Expressionsmuster der Corazonin-mRNA und des Peptids wurde mittels Northern-Analyse und in-situ-Hybridisierung charakterisiert. Corazonin wird in vier Zellpaaren, die zu den lateralen neurosekretorischen Zellen gehören, exprimiert. Die Axone dieser Zellen verlaufen ipsilateral zu den Nervi corpori cardiaci I+II, feine Fasern verzweigen sich in die am Ösophagus angrenzende Hirnregion hinein. Corazonin wird offensichtlich an den Axon- Endigungen in den Corpora cardiaca in die Hämolymphe freigesetzt. Einige feine Fasern enden in den Corpora allata bzw. am Vorderdarm. Der Nachweis, dass Corazonin tatsächlich eine allatotrope Wirkung hat, konnte nicht erbracht werden. 2) Die Protein/Protein-Interaktion zwischen Hexamerinen und dem Hexamerinrezeptor der Schmeißfliege Calliphora vicina wurde durch Two-Hybrid-Experimenten analysiert. Durch Interaktionstest mit trunkierten Proteinfragmenten wurden die Bindungsdomänen beider Proteine kartiert. Als rezeptorbindende Domäne des Arylphorins wurde ein 49 AS großes Peptid in der Domäne-3 des Arylphorin- Monomers identifiziert. Die Ligandenbindungsdomäne des Hexamerinrezeptors wurde in den ersten 24 AS des N-Terminus kartiert. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein HTS-Protokoll entwickelt, das zur Identifizierung von Substanzen verwendet werden kann, welche die Bindung dieser beiden Proteine beeinflussen. Eine Two-Hybrid-Bibliothek wurde ausgehend von 7dL-Fettkörper-RNA konstruiert und mit "Hexamerinrezeptor-Ködern" gescreent. Dabei wurden zwei neue Interaktionspartner des Hexamerinrezeptors gefunden und genauer charakterisiert. Der erste identifizierte Interaktionspartner - d-AP-3 - ist Teil eines Adaptin- Komplexes, der als Adapter zwischen membranständigen Rezeptoren und Clathrin oder ähnlichen Proteinen an der rezeptorvermittelten Endozytose beteiligt ist. Die Adaptin-Interaktionsdomäne liegt innerhalb des ABP64-Spaltprodukts des Hexamerinrezeptors. Die Funktion des zweiten Interaktionspartners - AFP - ist unbekannt. AFP wird im anterioren Teil des Fettkörpers und in Hämozyten exprimiert. Die Interaktion zwischen dem Hexamerinrezeptor und AFP ist demnach auf diesen Teil des Fettkörpers beschränkt. Die mit AFP interagierende Domäne des Hexamerinrezeptors liegt innerhalb des P30-Spaltprodukts.
Unique functions of DNA topoisomerase IIalpha and IIbeta have been suggested. A human cell line which carries a homozygeous mutation of the nuclear localization sequence of the topoisomerase IIalpha gene expresses the isoform outside the nucleus at the onset of mitosis. At mitosis topoisomerase IIbeta diffused away from the chromatin despite the nuclear lack of the IIalpha-form. Chromosome condensation and disjunction was performed with the aid of cytosolic topoisomerase IIalpha which bound to the mitotic chromatin with low affinity. Consequently an increased rate of nondisjunction is observed in these cells. It is concluded that high affinity chromatin binding of topoisomerase IIalpha is essential for chromosome condensation/disjunction and that topoisomerase IIbeta does not adopt these functions. A centrosomal protein was recognized by topoisomerase IIalpha. This topoisomerase IIalpha-like protein resembles a modified form of topoisomerase IIalpha with an apparent size of 205 kDa compared to 170 kDa. The expression of the protein is constant in all stages of the cell cycle and it appears in proliferating as well as in resting cells. If there is not sufficient topoisomerase IIalpha present at mitosis the centrosomal proteins might adopt the function and a mitotic catastrophe in the cells could therefore be prevented.
Listeria monocytogenes überwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszulösen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere könnte über die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskuläre Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die für die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskulären HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen können. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und über eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das grün-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund ablösen oder lysieren und somit gegenüber intrazellulären Listerien sehr widerstandsfähig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adhärieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausstülpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausstülpungen sind mit der Zelle nur noch über sehr dünne Membranschläuche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivität in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberflächenproteinen InlA, InlB und ActA unabhängigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches für den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate beträchtlich. Listerienstämme mit einer Deletion im für InlB kodierenden Gen sind unfähig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adhäsion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabhängig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. Während sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erhöhen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivität von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zellüberstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. Während eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt.
Monolayer or suspension cell cultures are of only limited value as experimental models for human cancer. Therefore, more sophisticated, three-dimensional culture systems like spheroid cultures or histocultures are used, which more closely mimic the tumor in individual patients compared to monolayer or suspension cultures. As tissue culture or tissue engineering requires more sophisticated culture, specialized in vitro techniques may also improve experimental tumor models. In the present work, a new miniaturized hollow-fiber bioreactor system for mammalian cell culture in small volumes (up to 3 ml) is characterized with regard to transport characteristics and growth of leukemic cell lines (chapter 2). Cell and medium compartment are separated by dialysis membranes and oxygenation is accomplished using oxygenation membranes. Due to a transparent housing, cells can be observed by microscopy during culture. The leukemic cell lines CCRF-CEM, HL-60 and REH were cultivated up to densities of 3.5 x 107/ml without medium change or manipulation of the cells. Growth and viability of the cells in the bioreactor were the same or better, and the viable cell count was always higher compared to culture in Transwellâ plates. As shown using CCRF-CEM cells, growth in the bioreactor was strongly influenced and could be controlled by the medium flow rate. As a consequence, consumption of glucose and generation of lactate varied with the flow rate. Influx of low molecular weight substances in the cell compartment could be regulated by variation of the concentration in the medium compartment. Thus, time dependent concentration profiles (e.g. pharmacokinetic profiles of drugs) can be realized as illustrated using glucose as a model compound. Depending on the molecular size cut-off of the membranes used, added growth factors like GM-CSF and IL-3 as well as factors secreted from the cells are retained in the cell compartment for up to one week. Second, a method for monitoring cell proliferation the hollow-fiber bioreactor by use of the Alamar BlueTM dye was developed (chapter 3). Alamar BlueTM is a non-fluorescent compound which yields a fluorescent product after reduction e.g. by living cells. In contrast to the MTT-assay, the Alamar BlueTM-assay does not lead to cell death. However, when not removed from the cells, the Alamar BlueTM dye shows a reversible, time- and concentration-dependent growth inhibition as observed for leukemic cell lines. When applied in the medium compartment of a hollow-fiber bioreactor system, the dye is delivered to the cells across the hollow-fiber membrane, reduced by the cells and released from the cell into the medium compartment back again. Thus, fluorescence intensity can be measured in medium samples reflecting growth of the cells in the cell compartment. This procedure offers several advantages. First, exposure of the cells to the dye can be reduced compared to conventional culture in plates. Second, handling steps are minimized since no sample of the cells needs to be taken for readout. Moreover, for the exchange of medium, a centrifugation step can be avoided and the cells can be cultivated further. Third, the method allows to discriminate between cell densities of 105, 106 and 107 of proliferating HL-60 cells cultivated in the cell compartment of the bioreactor. Measurement of fluorescence in the medium compartment is more sensitive compared to glucose or lactate measurement for cell counts below 106 cells/ml, in particular. In conclusion, the Alamar BlueTM-assay combined with the hollow-fiber bioreactor offers distinct advantages for the non-invasive monitoring of cell viability and proliferation in a closed system. In chapter 4 the use of the hollow-fiber bioreactor as a tool for toxicity testing was investigated, as current models for toxicity as well as efficacy testing of drugs in vitro allow only limited conclusions with regard to the in vivo situation. Examples of the drawbacks of current test systems are the lack of realistic in vitro tumor models and difficulties to model drug pharmacokinetics. The bioreactor proved to be pyrogen free and is steam-sterilizable. Leukemic cell lines like HL-60 and primary cells such as PHA-stimulated lymphocytes can be grown up to high densities of 1-3 x 107 and analyzed during growth in the bioreactor by light-microscopy. The cytostatic drug Ara-C shows a dose-dependent growth inhibition of HL-60 cells and a dose-response curve similar to controls in culture plates. The bioreactor system is highly flexible since several systems can be run in parallel, soluble drugs can be delivered continuously via a perfusion membrane and gaseous compounds via an oxygenation membrane which also allows to control pO2 and pH (via pCO2) during culture in the cell compartment. The modular concept of the bioreactor system allows realization of a variety of different design properties, which may lead to an improved in vitro system for toxicity testing by more closely resembling the in vivo situation. Whereas several distinct advantages of the new system have been demonstrated, more work has to be done to promote in vitro systems in toxicity testing and drug development further and to reduce the need for animal tests.
Ziel der Arbeit war es, die wissenschaftlichen und technischen Voraussetzungen zu schaffen, um eine effiziente Elektroporation von großen aber auch kleinen Zellzahlen zu erreichen. Ein großer Teil der Arbeit diente der Entwicklung eines neuen Elektroporationsgerätes, des Multiporators. Die synergetischen Effekte dieser Technik tragen dazu bei, dass sehr hohe Ausbeuten bei der Elektrotransfektion von Zellen erzielt werden. Damit konnte zum ersten Mal der Gentransfer durch künstliche Säugerzell-Chromosomen (MACs) nachgewiesen werden. Eine weitere Anwendung der Elektroporation liegt in der Transfektion von primären Zellen. Dabei ist der entscheidende Punkt für eine hohe Transfektionseffizienz der Zellzyklus. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Konzept entwickelt, das als Basis für ein neues Elektroporationssystem benutzt werden kann.
This study investigates mechanisms and consequences of sexual selection in a polygynous population of dusky warblers Phylloscopus fuscatus, breeding near Magadan in the Russian Far East. In particular, the study focuses on individual variation in the reproductive behaviours of both females and males. The mating system of this population is characterised by facultative polygyny (17 per cent of the males mated with more than one female), and by an outstandingly high rate of extra-pair paternity (45 per cent of the offspring was not sired by the social partner of the female). The occurrence of polygyny is best explained by the ‘polygyny-threshold model’ (PTM). A novel finding of this study is that female mating decisions follow a conditional strategy. First-year females that have no prior breeding experience prefer monogamy over territory quality, while older females more often mate polygynously. I argue that the costs of receiving no male help may be higher for inexperienced females, while the benefits of having a free choice between territories may be higher for individuals that know which territories had the highest breeding success in previous years. Furthermore, I find support for the existence of two female mating strategies. The ‘emancipated’ female which is not dependent on male help, is free to choose the best territory and the best copulation partners. The ‘help-dependent’ female, in contrast, is bound to find a partner who is willing to assist her with brood care, thus she will have to accept territories and genetic fathers of lesser quality. The most unexpected finding on female mating behaviours is that this dichotomy between emancipated and help-dependent females is accompanied by morphological specialisation, which indicates that there is genetic variation underlying these female mating strategies. Male mating behaviours are characterised by competition for ownership of the best territories and by advertisement of male quality to females, as these are the factors which largely determine male reproductive success. Male success in obtaining copulations depended on the quality of their song, a fact that explains why males spend most of the daytime singing during the period when females are fertile. Individuals that were able to maintain a relatively high sound amplitude during rapid frequency modulations were consistently preferred by females as copulation partners. Studies of physiological limitations on sound production suggest that such subtle differences in male singing performance can provide an honest reflection of male quality. The present study is the first to indicate that females may judge the quality of a male’s song by his performance in sound production. Quality of song was also related to winter survival, which suggests that females can enhance the viability of their offspring by seeking extra-pair fertilisations from good singers (good-genes hypothesis). In general, the present study demonstrates that a complete understanding of avian mating systems is not possible without a detailed analysis of alternative behavioural strategies and of how individuals adjust their reproductive tactics according to their individual needs and abilities.
T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains.
Marine Schwämme der Gattung Aplysina besitzen Bromotyrosinealkaloide als typische Sekundärmetabolite. Diese Alkaloide werden in einer enzymatischen Abwehrreaktion zu biologisch aktiven Produkten abgebaut. In der vorliegenden Arbeit ist die Isolierung von 14 Schwamminhaltstsoffen aus dem Schwamm Aplysina insularis beschrieben. 14-oxo-Aerophobin-2 konnte als neues Bromoisoxazolinalkaloid beschrieben werden. Anhand des Schwammes Aplysina cauliformis wurde die Charakterisierung der enzymatischen Abwehrreaktion in Schwämmen der Gattung Aplysina vorgenommnen, die von zwei aufeinanderfolgenden Enzymen durchgeführt wird. Hierbei konnte erstmals eine Nitrilhydratase aus dem marinen Habitat beschrieben werden, die in der beschriebenen Abwehrreaktion als zweites Enzym beteiligt ist.
In operanten Konditionierungsexperimenten im Flugsimulator werden vier Parameter gefunden die Drosophila melanogaster aus visuellen Mustern extrahieren kann: Musterfläche, vertikale Position des Musterschwerpunkts, Verteiltheit und Musterausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung. Es ist nicht auszuschliessen, dass die Fliege weitere Musterparameter extrahieren kann. Spontane Musterpräferenzen und konditionierte Präferenzen zeigen unterschiedliche Zusammenhänge mit den Musterparametern. Aus räumlich getrennten Musterelementen zusammengesetzte Muster werden von der Fliege wie ein Gesamtmuster behandelt. Retinaler Transfer wird auch bei der Präsentation von Mustern an zwei verschiedenen vertikalen Trainingspositionen nicht beobachtet. Muster werden generalisiert, wenn die Schwerpunkte korrespondierender Muster zwischen Training und Test ungefähr an der gleichen Position liegen aber keine retinale Überlappung von Trainings- und Testmustern besteht. Retinotopie des Mustergedächtnisses liegt in diesem Fall nicht auf der Ebene der Bildpunkte, jedoch möglicherweise auf der Ebene des Parameters 'Musterschwerpunkt' vor. Fliegen können nicht trainiert werden bestimmte Musterpaare zu diskriminieren die sich nur durch die vertikale Position ihres Musterschwerpunktes unterscheiden. Dennoch bevorzugen sie beim Lerntest mit anderen Mustern mit korrespondierenden Schwerpunktspositionen die zuvor nicht bestrafte Schwerpunktsposition. Für die Modellierung der Extraktion von Musterschwerpunkt und Musterfläche wird ein einfaches künstliches neuronales Filter präsentiert, dessen Architektur auf einem Berechnungsalgorithmus für den gemeinsamen Schwerpunkt mehrerer Teilelemente beruht.
Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren
(2001)
In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann.
The present thesis reports on four years of field research on stingless bee ecology in Sabah, Malaysia. Hereby, it was the main focus to evaluate the effect of selective logging for timber extraction on communities of bees, and to elucidate causative relationships involved in regulating bee populations. Included were background studies on resource use (3.1, 3.2, 3.3) and nesting biology (3.4) as well as comparative studies on stingless bee diversity and abundance in logged and unlogged lowland rainforest sites (4.1, 4.2). Stingless bees proved to be generalist foragers that used a large range of plant species as pollen sources. Nevertheless, different species of bees had rather distinct pollen diets, a findind that was independent of fluctuations in flowering activity in the habitat. At one particular point in time colonies of one species (Trigona collina)collected mold spores (Rhizopus sp.) as a pollen surrogate. In order to obtain low-effort estimates of meliponine pollen sources a new method was developed: Trapping of bee garbage (with funnel traps) and the quantitative analysis of pollen in garbage samples. Pollen in bee garbage reflected pollen import with a certain time lag and could therefore be used for an assessment of long-term pollen foraging (see below). The majority of stingless bee nests (275 nests of 12 species) were found in cavities in trunks or under the bases of large, living canopy trees. Nest trees mostly belonged to commercial species and were of the correct size and (partly) timber quality to warrant harvesting. It was estimated that roughly one third of stingless bee nests in an given forest area would be killed during a selective logging operation. Besides causing direct mortality, logging may also indirectly affect bee populations by reducing the availability of potential nest sites (trees). However, in a comparison of primary and differentially logged forest sites (10 to 30 years after logging) no effect of the degree of disturbance on meliponine nest density was found. Instead, the variation in nest density (0 to 16.2 nest/ha) was best explained by differences in the available floral resources (assessed by analysis of pollen in bee garbage). Bee populations in forest edge situations were favored: there was a positive correlation between nest density and the proportion of external non-forest pollen (e.g. from crop plants, road edge vegetation, mangroves) in the bees’ diet. The highest nest density was found in a site bordering the mangroves in Sandakan Bay. Here, the mangrove tree Rhizophora apiculata represented a extraordinary large fraction of the pollen volume. Presumably, external pollen sources effectively supplement bee diets at times when little flowering occurs inside the forest, thus increasing overall bee carrying-capacity. The idea of differential pollen limitation was strengthened by direct measurements of pollen import and foraging activity over a period of five months. Both were elevated in colonies in a site with high bee density. It is concluded that the abundance of stingless bees in forests in Sabah is chiefly dependent on the local availability of food resources. Hereby, bee populations strongly benefit from edge effects and increased habitat diversity. Although direct negative effects of selective logging are strongly indicated by a close association of bee nests with commercial trees, no clear effects were detected in regenerating forests ten to 30 years after logging.
Das Secosterid Vitamin D3 wird durch die Nahrung aufgenommen oder im Organismus synthetisiert, wobei eine Reaktion in der Haut durch einen photochemischen Prozess katalysiert wird.Durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere wird Vitamin D3 über 25(OH) Vitamin D3 zum aktiven 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon. 1,25(OH)2 Vitamin D3 hat eine wichtige Funktion im Knochenstoffwechsel, es reguliert die Ca2+-Resorption im Dünndarm. Die 1,25(OH)2 Vitamin D3-Synthese in der Niere wird durch Parathormon (PTH) kontrolliert. Ist die Serum Ca2+-Konzentration niedrig, wird PTH ausgeschüttet und die 1a-Hydroxylase, das 25(OH) Vitamin D3-aktivierende Enzym, stimuliert. Das Prinzip der (Seco)steroid-Aktivierung und -Inaktivierung in glandulären Organen, wie Leber und Niere mit anschließender Freisetzung der aktiven Hormone und Transport zu den jeweiligen Zielgeweben gilt heute nicht mehr uneingeschränkt. Auch Einzelzellen sind in der Lage Steroid-modifizierende Enzyme, die Hydroxylasen und Dehydrogenasen, zu exprimieren. Monozytäre Zellen exprimieren das 1,25(OH)2 Vitamin D3-aktivierende und das -inaktivierende Enzym, die 1a-Hydroxylase und die 24-Hydroxylase. Sie sind somit in der Lage, 1,25(OH)2 Vitamin D3 zu sezernieren, welches parakrin auf Nachbarzellen wirken kann. In diesem Zusammenhang wurde die Expression und Regulation der 1a-Hydroxylase in peripheren Blutmonozyten (PBM) und monozytären THP1-Zellen untersucht. Durch Supplementation der Zellen mit dem Substrat 25(OH) Vitamin D3 konnte die Produktion an aktivem 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon in PBM signifikant gesteigert werden. In PBM konnte im Gegensatz zum systemischen Ca2+-Stoffwechsel nur ein geringer Einfluss auf die 1a-Hydroxylase-Aktivität beobachtet werden. Durch RT-PCR-Amplifikation konnte eine Expression des PTH Rezeptors Typ 1 (PTHR1) in PBM und Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Ein weiterer Ligand des PTHR1 ist PTH related Protein (PTHrP), ein Faktor der die Tumorhyperkalzämie propagiert. Durch Markierungsexperimente mit fluoreszenz-markiertem PTHrP konnte gezeigt werden, dass PTHrP an die Zellmembran von PBM und Dendritischen Zellen bindet und in den Zellkern von Dendritischen Zellen transportiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsive Gene in Monozyten/Makrophagen untersucht. Die Expression der 24-Hydroxylase wird innerhalb der Differenzierung von myeloischen THP1-Zellen zu Makrophagen- bzw. Osteoklasten-ähnlichen Zellen transient induziert. Als weiteres 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsives Gen wurde die Expression von Osteopontin (OPN) untersucht. OPN ist ein vor allem in Knochen vorkommendes Matrixprotein, das wesentlich an der Zelladhäsion beteiligt ist. OPN wird in THP1-Zellen im Zuge der Differenzierung zunehmend exprimiert. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte OPN in Granulomen von Morbus Crohn- und Leberschnitten detektiert werden. Es spielt hier eine wesentliche Rolle bei der Granulomentstehung. Die Thioredoxin Reduktase 1 (TR1) ist ein Selenoenzym, welches maßgeblich an der Reduktion von Disulfidbindungen in Proteinen beteiligt ist. Es moduliert Protein/Protein- und Protein/DNA-Interaktionen wie die Bindung der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB an DNA-responsive Elemente. Die Expression der TR1 wird in THP1-Zellen im Rahmen der Differenzierung induziert und ist in differenzierten Zellen maximal. Aktivitätsmessungen deckten sich mit dieser Beobachtung. In peripheren Blutmonozyten steigt die TR-Aktivität alleine durch Adhäsion der Zellen an das Kulturgefäß und nach Behandlung mit 1,25(OH)2 Vitamin D3. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigten eine Abhängigkeit der TR-Aktivität vom Differenzierungsgrad der Zellen und der Supplementation des Mediums mit dem Spurenelement Selen. Die Expression weiterer Selenoproteine in monozytären Zellen wurde nachgewiesen. So konnten durch 75Selenit-Markierungsexperimente neun Selenoproteine in THP1-Zellen detektiert werden, von denen fünf sezerniert werden. Ein weiteres, in monozytären Zellen charakterisiertes Selenoprotein ist die zelluläre Glutathionperoxidase. Ihre Aktivität konnte in Selenit-supplementierten Zellen um das 70fache gesteigert werden. Die Kultivierung monozytärer Zellen unter Selenit-Supplementation beeinflusst die Funktion dieser Zellen wesentlich. So konnte beobachtet werden, dass die Anzahl an phagozytierenden, zu Makrophagen differenzierten THP1-Zellen nach Selenit-Supplementation abnahm, während die Phagozytoserate der einzelnen Zellen anstieg. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass monozytäre Zellen mit Komponenten des 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon produzieren, sezernieren und inaktivieren können. Die lokale Kontrolle der 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsiver Gene, wie die Expression des Selenoproteins TR1, das einen direkten Einfluss auf den Redoxstatus und den Abbau reaktiver Sauerstoffverbindungen in diesen und Nachbarzellen ausübt.
The MEK5/ ERK5 kinase module is a relatively new discovered mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway with a poorly defined physiological function. Since ERK5 and its upstream activator MEK5 are abundant in skeletal muscle a function of the cascade during muscle differentiation was examined. ERK5 becomes activated upon induction of differentiation in mouse myoblasts. The selective activation of the pathway results in promoter activation of differentiation-specific genes, such as the cdk-inhibitor p21 gene, the myosin light chain (MLC1A) gene, or an E-box containing promoter element, where myogenic basic-helix-loop-helix proteins such as MyoD or myogenin bind. Moreover, myogenic differentiation is completely blocked, when ERK5 expression is inhibited by antisense RNA. The effect can be detected also on the expression level of myogenic determination and differentiation markers such as p21, MyoD and myogenin. Another new finding is that stable expression of ERK5 in C2C12 leads to differentiation like phenotype and to increased p21 expression levels under growth conditions. These results provide first evidence that the MEK5/ERK5 MAP kinase cascade is critical for early steps of muscle cell differentiation.
Food borne pathogens that cause systemic disease must cross the intestinal barrier. Many of these pathogens, eg Salmonella typhimurium and Shigella flexneri, use M cells, found only within the follicle associated epithelium (FAE) that overlies Peyer’s patches and other lymphoid follicles, to enter the host. This study is primarily an investigation into the interaction of S. typhimurium and Listeria monocytogenes with the intestinal epithelium, representing the early stage of an infection.
The mode of action of phloretin and its analogs on the permeability of natural membranes for neutral and charged molecules, such as urea, glucose and chloride has been characterized 25 years ago. In contrast to signal molecules with primary effects on transport systems of natural membranes, phloretin also affects model membranes, i.e., artificial membranes, which do not contain proteins. Since the dipole potential reducing effect of phloretin on mono- and bilayers has been found, it became clear that its primary effect must be a biophysical one: phloretin adsorbs to lipid layers and changes biophysical parameters of these layers. The aim of this work was the characterization of the interaction between the surface-active molecule phloretin and artificial lipid layers. We were able to describe structural and functional parameters of the model systems mono- and bilayer as functions of one or few variables. One of these parameters, the dipole potential, measured as a function of the aqueous phloretin concentration, allowed a critical examination of the Langmuir adsorption model that has been postulated for the interaction between phloretin and lipid layers. Surface pressure versus area per lipid molecule isotherms and surface (dipole) potential change versus area per lipid molecule isotherms, measured at lipid monolayers, allowed a structural description of the phloretin-lipid interaction: phloretin integrates into monolayers dependent on the surface pressure and the phase state of the lipid. Calorimetric measurements confirmed the integration of phloretin into membranes because of the strong decrease of the phase transition temperature, but they also showed that the cooperativity of phase transition is hardly affected, even at very high amounts of phloretin in the membrane. Obviously the interaction between phloretin and lipids is restricted to the head groups, an integration into the hydrocarbon layer is unlikely. 2H NMR measurements with spherical unilamellar vesicles of headgroup-deuterated lipid showed changed quadrupolar splittings indicating the interaction between phloretin and headgroups of the lipids.
Large parts of the tropical lowland rain forests of Sabah (Malaysia) were transformed into secondary forests due to heavy logging. Additionally the remaining forest remnants are isolated from each other by large scale oil palm plantations. Biodiversity patterns and responses of the community of leaf litter ants were studied in anthropogenically disturbed habitats and primary forests of different size. In logged over forests, only 70 per cent of the species of a primary forest were present even 25 years after timber extraction. The ant communities were thinned and could be described by a lower species density producing lower species numbers and a different community composition. The similarity in species number and community composition between logged over forests of different degrees of disturbance was explained by source-sink dynamics within a heterogeneous forest matrix. Rain forest fragments displayed even higher reductions in species density, numbers and diversity due to a more pronounced thinning effect. Even forest isolates exceeding 4 000 ha in size did not support more than 50 per cent of the species of the leaf litter ant community of a contiguous primary rain forest. Additionally, an increase in tramp species was recorded with decreasing size of the forest fragments, leading to a very different community composition. Regarding the leaf litter ant community, the remaining rain forest fragments of Sabah are effectively isolated by a barrier of oil palm plantation, now stretching all over the lowlands of the east coast. Only 13 species, which belonged to the forest ant community in highly disturbed areas were collected in these plantations. Some of the 10 other species of the highly reduced ground-dwelling ant community in the plantations are known as invasive tramp species, forming large exclusive territories. Correlative evidence and a field experiment implied, that leaf litter humidity, volume and temperature affect the distribution and community composition of forest leaf litter ant species. The smaller primary forests and the most disturbed logged over forests in this study revealed higher temperatures and lower humidity levels and a reduction in leaf litter volume compared to a large primary forest or forests affected by a lower impact of timber harvesting. If the pattern for leaf litter ants is confirmed for other taxa, the implications for any efficient management design aiming to preserve the majority of the biodiversity of the country are tremendous and current concepts need rethinking.
Most natural learning situations are of a complex nature and consist of a tight conjunction of the animal's behavior (B) with the perceived stimuli. According to the behavior of the animal in response to these stimuli, they are classified as being either biologically neutral (conditioned stimuli, CS) or important (unconditioned stimuli, US or reinforcer). A typical learning situation is thus identified by a three term contingency of B, CS and US. A functional characterization of the single associations during conditioning in such a three term contingency has so far hardly been possible. Therefore, the operational distinction between classical conditioning as a behavior-independent learning process (CS-US associations) and operant conditioning as essentially behavior-dependent learning (B-US associations) has proven very valuable. However, most learning experiments described so far have not been successful in fully separating operant from classical conditioning into single-association tasks. The Drosophila flight simulator in which the relevant behavior is a single motor variable (yaw torque), allows for the first time to completely separate the operant (B-US, B-CS) and the classical (CS-US) components of a complex learning situation and to examine their interactions. In this thesis the contributions of the single associations (CS-US, B-US and B-CS) to memory formation are studied. Moreover, for the first time a particularly prominent single association (CS-US) is characterized extensively in a three term contingency. A yoked control shows that classical (CS-US) pattern learning requires more training than operant pattern learning. Additionally, it can be demonstrated that an operantly trained stimulus can be successfully transferred from the behavior used during training to a new behavior in a subsequent test phase. This result shows unambiguously that during operant conditioning classical (CS-US) associations can be formed. In an extension to this insight, it emerges that such a classical association blocks the formation of an operant association, which would have been formed without the operant control of the learned stimuli. Instead the operant component seems to develop less markedly and is probably merged into a complex three-way association. This three-way association could either be implemented as a sequential B-CS-US or as a hierarchical (B-CS)-US association. The comparison of a simple classical (CS-US) with a composite operant (B, CS and US) learning situation and of a simple operant (B-US) with another composite operant (B, CS and US) learning situation, suggests a hierarchy of predictors of reinforcement. Operant behavior occurring during composite operant conditioning is hardly conditioned at all. The associability of classical stimuli that bear no relation to the behavior of the animal is of an intermediate value, as is operant behavior alone. Stimuli that are controlled by operant behavior accrue associative strength most easily. If several stimuli are available as potential predictors, again the question arises which CS-US associations are formed? A number of different studies in vertebrates yielded amazingly congruent results. These results inspired to examine and compare the properties of the CS-US association in a complex learning situation at the flight simulator with these vertebrate results. It is shown for the first time that Drosophila can learn compound stimuli and recall the individual components independently and in similar proportions. The attempt to obtain second-order conditioning with these stimuli, yielded a relatively small effect. In comparison with vertebrate data, blocking and sensory preconditioning experiments produced conforming as well as dissenting results. While no blocking could be found, a sound sensory preconditioning effect was obtained. Possible reasons for the failure to find blocking are discussed and further experiments are suggested. The sensory preconditioning effect found in this study is revealed using simultaneous stimulus presentation and depends on the amount of preconditioning. It is argued that this effect is a case of 'incidental learning', where two stimuli are associated without the need of reinforcement. Finally, the implications of the results obtained in this study for the general understanding of memory formation in complex learning situations are discussed.
The proventriculus regulates the food passage from crop to midgut. As the haemolymph provides a constantly updated indication of an insect’s nutritional state, it is assumed that the factor controlling the proventri-culus activity is to be found in the haemolymph. The purpose of this doctoral thesis was to investigate how output (metabolic rate), input (food quality and food quantity) and internal state variables (haemolymph osmolarity and haemolymph sugar titer) affect each other and which of these factors controls the activity of the proventriculus in the honeybee. Therefore free-flying foragers were trained to collect con-trolled amounts of different sugar solutions. Immediately after feeding, metabolic rates were measured over different periods of time, then crop-emptying rates and haemolymph sugar titers were measured for the same individual bees. Under all investigated conditions, both the sugar transport rates through the proventriculus and the haemolyph sugar titers depended mainly on the metabolism. For bees collecting controlled amounts of 15 per cent, 30 per cent or 50 per cent sucrose solution haemolymph trehalose, glucose and fructose titers were constant for metabolic rates from 0 to 4.5 mlCO2/h. At higher metabolic rates, trehalose concentration decreased while that of glucose and fructose increased with the exception of bees fed 15 per cent sucrose solution. As the supply of sugar from the crop via the proventriculus was sufficient to support even the highest metabolic rates, the observed pattern must result from an upper limit in the capacity of the fat body to synthesise trehalose. The maximal rate of conversion of glucose to trehalose in the fat body was therefore calculated to average 92.4 µg glucose/min. However, for bees fed 15 per cent sucrose solution both the rate of conversion of glucose to trehalose and the rate of sugar transport from the crop to the midgut were limited, causing an overall decrease in total haemolymph sugar titers for metabolic rates higher than 5 mlCO2/h. Haemolymph sucrose titers were generally low but increased with increasing metabolic rates, even though sucrose was not always detected in bees with high metabolic rates. Though foragers were able to adjust their sugar transport rates precisely to their metabolic rates, a fixed surplus of sugars was transported through the proventriculus under specific feed-ing conditions. This fixed amount of sugars increased with increasing concentration and in-creasing quantity of fed sugar solution, but decreased with progressing time after feeding. This fixed amount of sugars was independent of the metabolic rates of the bees and of the molarity and viscosity of the fed sugar solution. As long as the bees did not exhaust their crop content, the haemolymph sugar titers were unaffected by the sugar surplus, by the time after feeding, by the concentration and by the viscosity of fed sugar solution. When bees were fed pure glucose (or fructose) solutions, un-usually little fructose (or glucose) was found in the haemolymph, leading to lower total haemolymph sugar titers, while the trehalose titer remained unaffected. In order to investigate the mechanisms underlying the regulation of the honeybee proven-triculus, foraging bees were injected either with metabolisable (glucose, fructose, trehalose), or non-metabolisable sugars (sorbose). Bees reacted to injections of metabolisable sugars with reduced crop-emptying rates, but injection of non-metabolisable sugars had no influence on crop emptying. Therefore it is concluded that the proventriculus regulation is controlled by the concentration of metabolisable compounds in the haemolymph, and not by the haemo-lymph osmolarity. A period of 10min was enough to observe reduced crop emptying rates after injections. It is suggested that glucose and fructose have an effect on the proventriculus activity only via their transformation to trehalose. However, when the bees were already in-jected 5min after feeding, no response was detectable. In addition it was investigated whether the overregulation is the result of feed-forward regulation for the imminent take-off and flight. In a first experiment, we investigated whether the bees release an extra amount of sugar solution very shortly before leaving for the hive. In a second experiment, it was tested whether the distance covered by the bees might have an influence on the surplus amount released prior to the take-off. In a third experiment, it was investigated if walking bees fail to release this extra amount of sugars, as they do not have to fly. Though we were not able to demonstrate that the overregulation is the result of feed-forward regulation for the imminent take-off and flight, it is conceivable that this phenome-non is a fixed reaction in foragers that can not be modulated. To investigate whether regulated haemolymph sugar titers are also observed in honeybee foragers returning from natural food sources, their crop contents and haemolymph sugar titers were investigated. While the quantity of the collected nectar was without influence on the haemolymph sugar titers, foragers showed increasing haemolymph sugar titers of glucose, fructose and sucrose with increasing sugar concentration of the carried nectar. In contrast no relationship between crop nectar concentrations and haemolymph trehalose titers was observed. We are sure that the regulation of food passage from crop to midgut is controlled by the trehalose titer. However, under some conditions the balance between consumption and income is not numerically exact. This imprecision depends on the factors which have an impact on the foraging energetics of the bees but are independent of those without influence on the foraging energetics. Therefore we would assume that the proventriculus activity is modulated by the motivational state of the bees.
Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse.
Im Katabolismus methylverzweigter Fettsäuren spielt die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase eine wichtige Rolle, indem sie die (R)- und (S)-Isomere von alpha-methylverzweigten Fettsäuren als Coenzym A Thioester racemisiert. Methylverzweigte Fettsäuren entstehen beim Abbau von Isoprenoiden und werden darüber hinaus auch von vielen Organismen, wie z.B. Mycobakterien, synthetisiert. Die Hauptaufgabe der Racemase ist aber vermutlich in der Biosynthese von Gallensäuren zu sehen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase aus humanem Gewebe zu reinigen und zu charakterisieren sowie ihre physiologische Rolle im Katabolismus verzweigtkettiger Fettsäuren und der Gallensäurebiosynthese zu untersuchen. Die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase wurde aus humanem Gewebe zur Homogenität gereinigt, umfassend biochemisch charakterisiert und zur genauen molekularbiologischen Analyse in E.coli kloniert. Die Aktivität der Racemase wurde anhand der [³H]H2O-Freisetzung aus [alpha-³H]-a-Methylacyl-CoAs bestimmt. Die humane Racemase ist in der aktiven Form ein monomeres Protein und besteht aus 382 Aminosäuren. Als Substrate akzeptiert das Enzym ein breites Spektrum von alpha-Methylacyl-CoAs. Neben den Coenzym A-Thioestern alpha-methylverzweigter Fettsäuren, wie Pristansäure, werden auch CoA-Ester von Steroidderivaten, z.B. des Gallensäureintermediats Trihydroxycoprostansäure, und aromatischen Phenylpropionsäuren, wie dem Analgetikum Ibuprofen, umgesetzt. Freie Fettsäuren, geradkettige oder beta-methylverzweigte Acyl-CoAs werden nicht racemisiert. Die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase ist im Menschen zu ca. 80 Prozent auf die Peroxisomen und ca. 20 Prozent auf die Mitochondrien verteilt, wobei entsprechende peroxisomale (PTS 1) und mitochondriale (MTS) Transportsignale die Lokalisation bestimmen. Die vollständige cDNA-Sequenz der humanen a-Methylacyl-CoA-Racemase hat eine Gesamtlänge von 2039 Basenpaaren mit einem offenen Leseraster von 89 - 1237 bp. Das Startcodon ATG ist in eine klassische Kozak-Sequenz zum Translationsstart eingebettet. Die Protein endet am C-Terminus mit dem Sequenzmotiv –KASL, das dem peroxisomalen Transportsignal (PTS I) einiger Säugetierkatalasen entspricht. Aufgrund alternativer Polyadenylierung sind in allen untersuchten menschlichen Geweben Transkripte von 1,6 kb bzw. 2,0 kb zu finden. Es liegt keine gewebsabhängige Polyadenylierung vor, die Racemase wird aber gewebsspezifisch exprimiert (besonders stark in Leber und Niere). Das humane Racemasegen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 5 nahe am Centromer (5p1.3), im Intervall von D5S651 (46,6 cM) und D5S634 (59.9 cM).
Different transgenes that can be expressed in neurons to kill or block them were compared. Tetanus neurotoxin blocked chemical synapses very efficiently. Synapses consisting of a chemical and an electrical component were blocked more reliably by expressing a human inwardly rectifying potassium channel. To gain temporal control over neuronal function, three genetic tools have been investigated. None of the systems is without drawbacks, however, the recombination induced tetanus neurotoxin expression is a promising approach. The knowledge gained from the comparative methodological study was used to investigate the role of neurons in sensory systems in processing different sensory informations. Receptor neurons sensitive for chemical or mechanical stimuli were correlated to specific olfactory behaviors or locomotor tasks. The main topic of this thesis is the much discussed question of which neurons are involved in motion processing in the visual system of flies. Neither L2 nor L4 neurons in the first visual neuropil are essential for motion-detection. The results indicate that maybe motion is detected by the network of amacrine cells (a). The vertical motion-sensitive VS cells in the lobula plate are not necessary for behavioral responses to vertical motion. This finding implies that the lack of VS cells in the structural mutant optomotor blind is not causally related to the altered responses to motion stimuli. Other abnormalities in optomotor blind are responsible for this behavioral phenotype. This work shows the potential of the described methods in studying information processing in the Drosophila brain. Groups of neurons were correlated to complex behavioral responses and theories about information processing were tested by behavioral experiments with transgenic flies. The refinement of the genetic tools to interfere with neuronal function will make the Drosophila brain an even better model to study information processing in nervous systems.
Auf der Suche nach neuen biologisch aktiven Naturstoffe aus der Gattung Aglaia(Meliaceae) wurde die insektizide Wirkung von Methanol-Extrakten verschiedener Aglaia-Arten gegenüber frisch geschlüpften Raupen des Schadinsektes Spodoptera littoralis (Noctuidae) untersucht. Die getesteten Proben stammen aus Vietnam und Südchina. Aus den in diesem Bioscreening aufgefallenen Extrakten wurden mit Hilfe von durch Biotests begleiteter Fraktionierung sowie parallel durchgeführten chemisch-physikalischen Analysen insgesamt 29 Naturstoffe isoliert und charakterisiert. Darunter befinden sich sechs bisher nicht beschriebene Benzofurane (Rocaglamide), zwei Benzopyrane (je ein Aglain und ein Aglaforbesin), zwei Benzoxepine (Forbagline) sowie ein Zimtsäure-Putrescin-Bisamid. Die Strukturaufklärung erfolgte vor allem durch NMR-Spektroskopie (darunter 2D-Experimente wie H-H-COSY, HMQC, HMBC und ROESY) sowie durch Massenspektrometrie. Die Untersuchungen zur Struktur-Wirkungs-Beziehung ergaben für die Rocaglamide V, Z und AA eine starke insektizide Aktivität gegenüber Raupen von S. littoralis mit LC50- und EC50-Werten von 2.0 bis 6.6 ppm bzw. 0.1 bis 1.0 ppm, während die Rocaglamide X und Y überraschenderweise keine Aktivität zeigten. Letztere stellen bisher die ersten Beispiele für biologisch inaktive Rocaglamid-Derivate überhaupt dar. Dieser Befund weist darauf hin, daß für die insektizide Aktivität dieser Verbindungs-Klasse der Hydroxyl-Substituent am C-8b neben dem Benzofuran-Grundkörper eine entscheidende Rolle spielt, da eine Alkoxylierung an C-8b zum vollständigen Verlust der Aktivität führt. In einem Screening mit drei verschiedenen basalen Medien, die mit unterschiedlichen Phytohormonen und organischen Zusätzen versetzt worden waren, erwies sich das RW-(Risser und White) Medium mit 1 mg/l 2.4-D, 0.2 mg/l BAP, 0.1 g/l Ascorbinsäure und 0.5 g/l Caseinhydrolysat als geeignetstes Kulturmedium zur Kalusbildung bei Aglaia-Arten. Die Vorversuche zeigten darüber hinaus deutlich, daß Kalluskulturen von Aglaia elliptica in der Lage sind, relevante Inhaltsstoffe wie das Zimtsäure-Pyrrolidin-Bisamid- Derivat zu bilden.
TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.
Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repräsentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der öffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleinsäuresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, über eine Kombination aus computergestützter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten für VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fettsäuredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), während ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentität zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine präzise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollständige genetische Charakterisierung der genannten Fettsäuredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabhängig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufklärung der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen.
Recent advances in the development of immunoassays and nucleic acid assays have improved the performance and increased the sensitivity of sensors that are based on biochemical recognition. The new approaches taken by researchers include detecting pathogens by detecting their nucleic acids, using new nontoxic reporter entities for generating signals, and downscaling and miniaturizing sensors to micromigration and microfluidic formats. This dissertation connects some of these successful approaches, thereby leading to the development of novel nucleic acid sensors for rapid and easy detection of pathogens. The author's goal was to develop diagnostic tools that enable investigators to detect pathogens rapidly and on site. While the sensors can be used to detect any pathogen, the author first customized them for detecting particularly Cryptosporidium parvum, a pathogen whose detection is important, yet presents many challenges. Chapter 2 of this thesis presents a novel test-strip for the detection of C. parvum. The test-strip is designed to detect nucleic acids rather than proteins or other epitopes. While test strips are commonly used for sensors based on immunological recognition, this format is very new in applications in which nucleic acids are detected. Further, to indicate the presence or absence of a specific target on the test strip, dye-entrapped, oligonucleotide-tagged liposomes are employed. Using liposomes as reporter particles has advantages over using other reporter labels, because the cavity that the phospholipidic membranes of the liposomes form can be filled with up to 106 dye molecules. By using heterobifunctional linkers liposomes can be tagged with oligonucleotides, thereby enabling their use in nucleic acid hybridization assays. The developed test-strip provides an internal control. The limit of detection is 2.7 fmol/mL with a sample volume of 30 mL. In chapter 3 the detection of nucleic acids by means of oligonucleotide-tagged liposomes is scaled down to a microfluidic assay format. Because the application of biosensors to microfluidic formats is very new in the field of analytical chemistry, the first part of this chapter is devoted to developing the design and the method to fabricate the microchip devices. The performance of the microchips is then optimized by investigating the interactions of nucleic acids and liposomes with the material the chips consist of and by passivating the surface of the chips with blocking reagents. The developed microfluidic chip enabled us to reduce the sample volume needed for one assay to 12.5 mL. The limit of detection of this assay was determined to be 0.4 fmol/mL. Chapters 4 and 5 expand on the development of the microfluidic assay. A prototype microfluidic array that is able to detect multiple analytes in a single sample simultaneously is developed. Using such an array will enable investigators to detect pathogens that occur in the same environment, for example, C. parvum and Giardia duodenalis by conducting a single test. The array's ability to perform multiple sample analysis is shown by detecting different concentrations of target nucleic acids. Further, the author developed a microfluidic chip in which interdigitated microelectrode arrays (IDAs) that consist of closely spaced microelectrodes are integrated. The IDAs facilitate electrochemical detection of cryptosporidial RNA. Electrochemical detection schemes offer benefits of technical simplicity, speed, and sensitivity. In this project liposomes are filled with electrochemically active molecules and are then utilized to generate electrochemical signals. Chapter 6 explores the feasibility of liposomes for enhancing signals derived from nucleic acid hybridization in surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. SPR spectroscopy offers advantages because nucleic acid hybridization can be monitored in real time and under homogeneous conditions because no washing steps are required. SPR spectroscopy is very sensitive and it can be expected that, in the future, SPR will be integrated into microfluidic nucleic acid sensors.
Ziel dieser Arbeit war es, NF-AT1-Gen-defiziente Mauslinien zu erzeugen und die Folgen dieser genetischen Manipulation in vivo zu untersuchen. Die Untersuchung sollte die durch die Gendefizienz erwarteten Mängel während der Entwicklung (Embryogenese) und, im Besonderen, die Auswirkungen auf das Immunsytem und die Entwicklung und Differenzierung der T-Zellen aufzeigen. Zur Untersuchung der genomischen Organisation des Maus-NF-AT1-Gens wurde eine genomische l-Phagen-DNA-Bibliothek "gescreent" (durchgeführt von Dr. E. Jankevics, Universität von Riga, Lettland), die entsprechenden l-Phagen, die das NF-AT1-Gen enthielten, isoliert und die DNA präpariert. Nach Analyse der klonierten Phagen (Subklonierung und Sequenzierung) wurde eine Restriktionskarte der entsprechenden Bereiche erstellt und der "targeting-vector" erstellt. Der "targeting-vector" wurde durch Elektroporation in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) eingebracht und die Integration in das Genom ("Homologe Rekombination") durch Southern Blotting- bzw. PCR-Analyse untersucht. Manipulierte ES-Zellklone wurden in C57Bl/6-Blastozysten injiziert, diese in scheinschwangere Ammentiere transferiert und die Nachkommen nach Geburt anhand der Fellfarben klassifiziert. Nachkommen mit einem hohen Anteil hellen Fells wurden mit C57 Bl/6-Tieren verpaart und die Integration des manipulierten Zellklons in die Keimbahn wurde anhand der wildtypischen Fellfarbe und Genotypisierung nachgewiesen. Bezüglich des manipulierten NF-ATp-Gens heterozygote F1-Tiere wurden miteinander verpaart, um eine homozygote NF-ATp-defiziente Mäuse zu erhalten. Die Deletion des NF-ATp-Proteins wurde durch in Western-Blotting-Experimenten und EMSAs ("electrophoretic mobility shift assays") nachgewiesen. Die NF-ATp-/--Tiere zeigten keine augenscheinlichen Veränderungen während der Entwicklung und, bei jungen Tieren, keine offensichtlichen Veränderungen bei der Entwicklung des Immunsystems. In älteren Tieren (> 6 Wochen) war eine Hyperproliferation der Zellen des Immunsystems zu beobachten, was mit einer Splenomegalie, einer verstärkten Bildung von Keimzentren in lymphatischen Organen, vergrößerten Lymphknoten und einer verlangsamten Involution des Thymus einherging. Weitergehende Untersuchungen der Ursache dieser hyperproliferativen Erkrankung offenbarten eine verminderte klonale Deletion nach Aktivierung. Die Ursachen dieses überraschenden Effekts sind wahrscheinlich vielfältig, da NF-AT-Faktoren an der Regulation der Expression vieler Gene beteiligt sind, u.a. des Apoptose-assoziierten CD95-Liganden. Da sich bezüglich der IL-2-Expression keine Unterschiede zwischen NF-ATp-defizienten Tieren und Kontrollen zeigten, jedoch eine erhöhte IL-2-Konzentration im Medium kultivierter NF-ATp-defizienter T-Zellen beobachtet wurde, wurde die Bindung von NF-ATp an putative NF-AT-Bindungssequenzen des CD25-Promotors, die transkriptionelle Aktivierung des Promotors mittels Luciferase-Assays und die Expression der IL-2R-alpha-Kette (CD25) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß (1.) NF-ATp an zwei Regionen des CD25-Promotors bindet, (2.) der CD25-Promotor durch NF-ATp transkriptionell stark stimuliert wird und (3.) T-Zellen NF-ATp-defizienter Tiere nach Stimulation eine verminderte CD25-Expression zeigen. In NF-ATp-defizienten Tieren war die Expression von CD25 moderat reduziert, was eine Erklärung für den abgeschwächten Phänotyp dieser Tiere - im Vergleich zu IL-2- oder CD25-defizienten Tieren - sein kann. Die hyperproliferativen Erkrankungen dieser verschiedenen Mauslinien weisen auf eine Beteiligung der NF-AT-/IL-2-/IL-2R-Signalwege nicht nur während der T-Zell-Aktivierung hin, sondern auch auf eine Beteiligung an Signalwegen, die zur anschließenden Inaktivierung und Apoptose der T-Lymphozyten nötig sind.
Die Frage nach der Entstehung und Beibehaltung von sexueller Reproduktion nimmt in der Biologie eine zentrale Stellung ein. Dazu werden seit langem die Vor- und Nachteile asexueller Fortpflanzung diskutiert, da man sich von einer vergleichenden Betrachtungsweise wichtige Aufschlüsse erwartet. Dem kurzfristigen Vorteil der schnelleren Vermehrung stehen langfristige Nachteile entgegen: Aufgrund fehlender genetischer Rekombinationsprozesse können sich schädliche Mutationen im Laufe der Generationen anhäufen ("Muller’s ratchet"), und schnelle Anpassung an eine veränderte Umwelt oder neue Abwehrstrategien gegen Parasiten werden erschwert. Der Amazonenkärpfling, Poecilia formosa, stellt einen Organismus dar, dessen Fortpflanzung in Folge eines interspezifischen Hybridisierungsereignisses vom üblichen bisexuellen Muster abweicht: Es treten normalerweise nur Weibchen auf, die sich gynogenetisch vermehren. Hierbei werden die unreduzierten diploiden Eizellen durch Spermien sympatrisch vorkommender sexueller Wirtsmännchen nahe verwandter Arten (P. latipinna oder P. mexicana) stimuliert, um eine parthenogenetische Entwicklung der Embryonen zu initiieren. Es findet keine Karyogamie statt, so daß die Nachkommen in der Regel untereinander und mit ihren Müttern genetisch identisch (klonal) sind. Molekularbiologische Untersuchungen ergaben jedoch, daß P. formosa wesentlich älter ist, als dies auf der Basis von "Muller’s ratchet" zu erwarten war. Eine mögliche Erklärung dafür wäre, daß in seltenen Fällen väterliches Erbmaterial an die Nachkommen weitergegeben werden kann (paternale Introgression). Sowohl in natürlichen Lebensräumen als auch unter Laborbedingungen konnten nur zwei Formen paternaler Introgression identifiziert werden: Kommt es aufgrund von Karyogamie zu einer tatsächlichen Befruchtung der diploiden Oozyte durch das haploide Spermium entstehen triploide Individuen. In anderen Fällen verbleiben nach der Aktivierung durch das artfremde Spermium nur geringe DNA-Mengen in der Oozyte, die in den Kern aufgenommen werden und im Karyotyp als überzählige Chromosomen, sog. Mikrochromosomen, zu identifizieren sind. Die beiden Formen paternaler Introgression können jedoch auch kombiniert vorliegen. In diesen Fällen entwickelten sich die Individuen überraschenderweise zu phänotypischen Männchen. Die vorliegenden Ergebnisse über paternale Introgression können zur Aufklärung der Frage beitragen, warum P. formosa und andere asexuelle Organismen offenbar länger überlebten, als vorhergesagt. Im Gegensatz zu den bisherigen Annahmen könnte es sich bei spermienabhängiger Parthenogenese nicht etwa nur um eine unvollkommene Parthenogenese handeln, sondern um einen gut angepaßten Fortpflanzungsmodus, der die Vorteile von asexueller mit denen sexueller Fortpflanzung kombiniert.