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Die Messung der räumlich aufgelösten Aktivität von neuronalen Zellverbänden ist ein wichtiges Werkzeug, um die Funktionsweise von Gehirnen zu verstehen. Für diese Arbeit diente die Fruchtfliege Drosophila melanogaster mit ihrer gut beschriebenen Genetik und Neurobiologie als Untersuchungsobjekt. Bei der vorgelegten Arbeit lag eine zweigeteilte Aufgabenstellung vor: Zum einen wurde die Technik des in – vivo Calcium – Imagings mit Hilfe des genetisch codierten Sensors Yellow Cameleon 2.1 am Lehrstuhl komplett neu etabliert, zum anderen wurde mit der neuen Technik das Zusammenspiel der funktionellen Elemente neuronaler Systeme anhand der Fliegenolfaktorik untersucht. Sowohl die Experimente zur Depolarisation durch KCl, als auch die Experimente zur olfaktorischen Codierung, wurden mit dem Calciumsensor Yellow Cameleon 2.1 durchgeführt. Es wurde ausgehend von der Vorgängerversion Yellow Cameleon 2.0 durch gezielte Mutagenese von Sören Diegelmann erstellt. Eine Photomultiplier – basierte in – vitro Funktionsanalyse des rekombinanten Sensorproteins ergab eine Zunahme der Ratio EYFP / ECFP mit steigender Calciumkonzentration. Dabei konnte auch der ratiometrische FRET – Effekt des Cameleons verdeutlicht werden: Mit steigender Calciumkonzentration verschiebt sich das Verhältnis von EYFP – Fluoreszenz zu ECFP – Fluoreszenz zu höheren Ratiowerten. Durch Zugabe des Calciumchelators EGTA konnte außerdem die reversible Arbeitsweise des Sensors nachgewiesen werden. Das in die Fliege eingebrachte Yellow Cameleon 2.1 – Konstrukt wurde mittels der GAL4 – UAS – Technik in verschiedenen olfaktorischen Gehirnzentren exprimiert. Von besonderer Relevanz für die Experimente zur olfaktorischen Codierung war dabei die GAL4 – Treiberlinie GH146. Mit ihrer Hilfe konnte das Fusionsprotein in den olfaktorischen Projektionsneuronen des Fliegengehirns exprimiert, und so die Duftrepräsentation im postsynaptischen Neuropil der Antennalloben bzw. in den präsynaptischen Neuropilen der Calyces und des lateralen Protocerbrums untersucht werden: Die Stimulation von 3 individuellen Fliegen mit den Düften Benzaldehyd, Isoamylacetat und Octanol liefert duftspezifische neuronale Aktivitätsmuster im Antenallobus. Die auf die Duftstimuli mit Calciumsignalen reagierenden Areale haben eine Größe von 10 – 30 µm, liegen also in der Größenordnung von individuellen Glomeruli. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben zeigt außerdem einen kombinatorischen Aspekt: Jeder Duft evoziert ein charakteristisches Aktivitätsmuster bestehend aus einem oder mehreren Glomeruli. Die Aktivitätsmuster verschiedener Düfte können sich überlagern, d.h. individuelle Glomeruli können durch verschiedene Düfte aktiviert werden, das gesamte Aktivitätsmuster, d.h. die Summe der aktivierten Glomeruli eines bestimmten Duftes, ist jedoch charakteristisch. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben von Drososophila geschieht also in Form eines glomerulären Codes, ein Prinzip der Duftverarbeitung, das auch in anderen Insekten und Vertebraten nachgewiesen werden konnte. Für den Calyx des Pilzkörpers ergaben sich innerhalb eines Individuums, bei wiederholter Stimulation mit demselben Duft, ebenfalls duftspezifische Aktivitätsmuster. Dabei waren die auf den Duftstimulus hin antwortenden neuronalen Areale diskret über den Calyx hinweg verteilt. Insgesamt zeigt das hohe Maß an Reproduzierbarkeit der Aktivitätsmuster für einen gegebenen Duft, dass im Calyx, wie in den Antennalloben, eine duftspezifische räumliche Repräsentation vorliegt. Der kombinatorische Aspekt der Codierung konnte auch hier beobachtet werden. Die einzelnen Spots der im Calyx gemessenen Aktivitätsmuster liegen in der Größenordnung von 5 +/- 2 µm und entsprechen somit in ihrer Größe den elektronenmikroskopisch beschriebenen Microglomeruli. Durch die Calcium – Imaging Experimente am lateralen Protocerebrum konnte nachgewiesen werden, dass die Erhöhung der Duftkonzentration eine räumliche Ausdehnung des aktivierten Neuropils zur Folge hat. Die EYFP –, ECFP – und Ratio – Intensitäten, die aus einer “Region of Interest“ im anterioren Bereich des lateralen Protocerebrums berechnet wurden, zeigen weiterhin, dass mit steigender Duftkonzentration auch die Stärke des Calciumsignals zunimmt. Dabei gibt es zwischen den 4 getesteten Düften statistisch signifikante Unterschiede: Methylcyclohexanol evoziert über den gesamten Verdünnungsbereich hinweg die schwächste neuronale Aktivität, Isoamylacetat evoziert in den Verdünnungsstufen 10-3 und 10-1 die stärkste neuronale Aktivität. D.h. neben der räumlichen Ausdehnung des Signals, führt die Konzentrationserhöhung auch zu einer gesteigerten Intensität des Calciumsignals, wobei sich die Signalintensitäten für verschiedene Düfte und Verdünnungsstufen unterscheiden können. Mit der verwendeten Versuchsanordnung und Datenauswertung, war es jedoch bislang nicht möglich eine räumliche Repräsentation der Düfte im lateralen Protocerebrum nachzuweisen.
Der Zellkern ist ein wichtiges Organell von eukaryotischen Zellen, der durch eine Doppelmembran vom Cytoplasma abgetrennt wird. Mit Hilfe des Zebrafischs als Modellorganismus und kultivierten Zellen verschiedener Vertebraten wurde in mehreren Teilprojekten Untersuchungen an integralen (Lamina assoziiertes Polypeptid 2, Lamin B Rezeptor) und peripheren Membranproteinen (Lamine) der in inneren Kernmembran durchgeführt. Eines der am besten untersuchten integralen Membranproteine der inneren Kernmembran ist das Lamina assoziierte Polypeptid 2 (LAP2). Durch alternatives Splicen entstehen aus einem einzigen Gen eine Reihe verschiedener Isoformen die entwicklungs- und gewebespezifisch exprimiert werden. In Säuger sind 6 verschiedene Isoformen (LAP2α, β, δ, ε, γ, ζ) bekannt, von denen alle mit Ausnahmen von LAP2α und ζ, in die innere Kernmembran integriert sind. Das LAP2α ist ausschließlich im Nukleoplasma lokalisiert und wurde bis jetzt nur bei Säugern beschrieben. Durch die Identifikation eines genomischen Klons ICRFc 7101293Q5 (RZPD) sowie vergleichende Datenbankanalysen konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LAP2-Gens ermittelt werden. Das Gen kodiert innerhalb von 19 kb (ohne regulatorische Sequenzen) 15 Exons aus denen durch alternatives Splicen 3 verschieden Isoformen hervorgehen (zLAP2 β, γ, ω). Mit Hilfe des “Radiation Hybrid mappings“ wurde das LAP2 Gen auf der “Linkage group“ 4 des Zebrafischs, zwischen den EST-Markern fc01g04 (213,97) und fb49f01 (215,69cR) lokalisiert. Aufgrund der zusätzlichen Identifikation der genomischen Sequenz des Hühner LAP2-Gens konnten die genomischen Sequenzen der LAP2 Gene von niederen Vertebraten (Zebrafisch), über die Vögel (Huhn), bis zum Säuger (Mensch) miteinander verglichen werden. Dabei zeigte sich einerseits, dass die ω Isoform des Zebrafischs nicht im Genom von Huhn und Säugern vorhanden ist: Andererseits ist die α Isoform der Säuger ebenfalls in keinem der anderen Spezies (Huhn, Zebrafisch) zu finden ist. Weiterhin konnte bei zusätzliche Proteinanalysen mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, gegen die konservierte aminoterminale Domäne der LAP2 Proteine, in 10 Tage alten Hühner Embryonen nur ein Protein mit einem vergleichbaren Molekulargewicht zum LAP2β anderer Spezies eindeutig detektiert werden. Aufgrund dieser Befunde und der Tatsache, dass die kodierenden Exonsequenzen zwischen Mensch und Huhn eine größere Ähnlichkeit zeigen als zwischen Mensch und Zebrafisch, liegt die Vermutung nahe, dass die α-Isoform eine Neuheit der Säugern darstellt. Ein weiteres integrales Membranprotein, dass erstmals beim Zebrafisch untersucht wurde, ist der Lamin B Rezeptor (zLBR). Mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden, konnte zwei Klone identifiziert werden die sowohl die gesamte cDNA-Sequenz (MPMGp567K10194Q3 (RZPD) als auch die gesamte genomische Sequenz (ICRFc71M10137Q5 (RZPD) beinhalten. Anhand von vergleichenden Datenbankanalysen, konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LBR-Gens ermittelt werden. Dieses kodiert innerhalb von 12 kb (ohne regulatorische Sequenzen) mit 13 Exons für ein 616 Aminosäure großes Protein. Vergleichbar mit dem LBR anderer Spezies besitzt der Zebrafisch LBR ebenfalls 8 Transmembrandomänen in seiner carboxyterminalen Domäne mit denen er in der inneren Kernmembran verankert ist. Der Aminosäurenvergleich mit anderen Spezies zeigte, dass die Aminosäurensequenz sowohl des aminoterminalen Bereichs als auch im Bereich der Transmembrandomänen hoch konserviert ist. Weiterhin wurden polyklonalen Antikörpern gegen die ersten 210 Aminosäuren des zLBRs hergestellt, die für zukünftige immunologische Analysen verwendet werden können. Ebenso wie die integralen Membranproteine spielen auch die Lamine eine wichtige Rolle bei nukleären Prozessen. Die B-Typ Lamine zeichnen sich alle durch ein konserviertes CxxMMotiv am Carboxyterminus aus. Das CxxM-Motiv wird nach posttranslational modifiziert, wodurch es lipophile Eigenschaften erlangt und somit für die anfängliche Verankerung der Lamine in der inneren Kernmembran verantwortlich ist. Bei A-Typ Laminen ist dieses Motiv nicht in der Primärsequenz enthalten oder es wird nach dem Einbau in die Kernlamina proteolytisch abgespalten. Eine Besonderheit stellt das meiotische Lamin C2 dar, welches ein Spliceprodukt des Lamin A Gens der Säuger ist. Das Lamin C2 besitzt zwar kein CxxMMotiv an seinem Aminoterminus, dafür aber ein Hexapeptid (GNAEGR) nach dem Startmethionin. Die posttranslationale Modifikation dieser Sequenz verleiht dem Protein lipoplile Eigenschaften. Anhand von funktionellen Analysen konnte durch die Überexpression GFP-Fusionsproteinen verschiedener wildtypischer Lamine und Lamin Mutanten gezeigt werden, dass die Interaktion der Lamine über das CxxM-Motiv oder das GNAEGR-Motiv mit der inneren Kernmembran, das Wachstum der Kernhülle induziert. In einem letzten Projekt konnte mit Hilfe spezifischer “antisense-“ Oligonukleotide, die als "Morpholinos" bezeichnet werden, die Expression von LAP2, LBR und den B-Typ Laminen B1 und B2 in Zebrafisch Embryonen reprimiert werden. Die Blockade der mRNA-Translation der entsprechenden Gene erfolgte in allen Fällen innerhalb der ersten 24 Stunden vollständig. Obwohl die Anzahl der beobachteten Embryonen relativ gering war, so zeigte sich bei allen Embryonen eine deutliche Entwicklungsverzögerung und unterschiedlich starke Entwicklungsstörungen. Die morphologischen Auswirkungen waren bei der Reduktion des LAP2 oder der Lamine geringer als bei der Reduktion des LBR, da in beiden Fällen maternale Proteine, wie das LA2ω oder das B-Typ Lamin LIII, nicht reduziert werden konnten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden visuelle Einflüsse auf die Beinplatzierung beim Laufen und auf das Kletterverhalten der Fliege Drosophila melanogaster analysiert. Während sich die Beinplatzierung als vorwiegend taktil gesteuert herausstellte, ist das Klettern sowohl bezüglich der Entscheidung zur Durchführung (Motivationssteuerung) als auch bezüglich der Ausführung selbst unter präziser visueller Kontrolle. Für die Untersuchungen wurde ein Lücken-Überwindungsparadigma entwickelt und die Kinematik des Kletterns über verschieden breite Lücken mit einer eigens entwickelten 3D-Hochgeschwindigkeits-Videoanlage erstmals quantitativ beschrieben. Drei wesentliche Verhaltensanpassungen sorgen dafür, dass die Fliegen die maximal mögliche Spannbreite ihrer Beine voll ausnützen und Lücken von bis zu 170% der eigenen Körperlänge überqueren können. Das Kletterverhalten wird abhängig von der Lückenbreite initiiert und sinnlose Versuche an unüberwindbar breiten Lücken vermieden. Die visuelle Lückenbreitenmessung wurde analysiert; sie beruht auf der Auswertung von Bewegungsparallaxe beim Anlauf. Einige Erkenntnisse aus der Laufforschung an Fliegen wurden auf einem im Rahmen dieser Arbeit modifizierten hexapoden Laufroboter umgesetzt und die Verbesserungen quantifiziert.
Kälteschockproteine werden in Bakterien, gleichermaßen wie die gut charakterisierten Hitzeschockproteine, bei hohen Temperaturschwankungen stark induziert und ermöglichen der Zelle durch unterschiedliche Funktionen ein Wachstum in der Kälte. In dieser Promotionsarbeit wurde begonnen, die Kälteschock-Antwort von Bakterien des Genus Bordetella zu charakterisieren. Sowohl B. bronchiseptica als auch B. pertussis codieren für fünf Kälteschockproteine, die als CspA, CspB, CspC, CspD und CspE bezeichnet werden. Die fünf Proteine weisen eine signifikante Homologie zum Haupt-Kälteschockprotein CspA aus E. coli auf. Während in den Modellorganismen E. coli und B. subtilis mindestens vier (E. coli) bzw. alle drei (B. subtilis) csp-Gene deletiert sein müssen, um einen Wachstumsdefizit zu erkennen, genügt im Falle von B. bronchiseptica eine einzige Insertionsmutation im Gen cspB, um einen temperaturunabhängigen Wachstumsdefekt zu beobachten. Nach einem Kälteschock werden in B. bronchiseptica drei der fünf csp-Gene, cspA, cspB und cspC, deutlich induziert. Betrachtet man das Expressionsmuster der fünf csp-Gene unter verschiedenen Stressbedingungen, wie Zugabe von translationshemmenden Antibiotika, Hitzeschock oder osmotischer Stress, so lässt sich ein komplexes Expressionsmuster aufzeichnen. Außerdem besitzen die drei kälteinduzierbaren Gene cspA, cspB und cspC mehrere Transkriptionsstartpunkte, deren Transkriptmengen unter den verschiedenen Schockbedingungen stark variieren. Es stellte sich heraus, dass eine Überexpression von CspB aus B. bronchiseptica für die E. coli – Zelle toxisch ist, daher wurde das CspB-Protein als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Glutathion-Sepharose aufgereinigt. Um eine potentielle Funktion von CspB in der Zelle zu untersuchen, wurden Filterbindeassays mit CspB::GST durchgeführt. Es wurde eine hochaffine, aber unspezifische Bindung an ssDNA festgestellt, was auf eine mögliche Funktion von CspB als Chaperon hindeutet. Nach Synthese eines CspB-spezifischen Antikörpers wurde die Kälteinduktion von CspB auch auf Proteinebene nachgewiesen. Durch 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrische Charakterisierung konnten 17 weitere kälteinduzierbare Proteine aus B. bronchiseptica identifiziert werden. Darunter waren u. a. ein Chaperon mit Ähnlichkeit zu GroES, ein Translationsinhibitor BB2940 und das CspB. Diese kälteinduzierbaren Proteine ähneln den CIPs aus E. coli. Weiterhin konnten noch das UspA und mehrere am Metabolismus beteiligte Proteine als CIPs aus B. bronchiseptica identifiziert werden, was signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kälteadaptation zwischen den beiden Organismen aufzeigt. Betrachtet man die Promotorbereiche aller identifizierten csp-Gene, so fällt eine für diese Gene typische sehr lange 5’UTR auf. Innerhalb dieser upstream Region findet man in vier der fünf csp-Gene einen 9 bp langen Consensus mit der Sequenz TCCTTGATT, der in nahezu gleichem Abstand vom postulierten Startcodon vorkommt. Diese identifizierte 9bp-box ist für eine effiziente Transkription in der Kälte jedoch nicht von Bedeutung. Auf posttranskriptioneller Ebene wird die lange 5’UTR für die Stabilisierung der cold-shock mRNA in der Kälte verantwortlich gemacht. Außerdem ist das Vorhandensein der kompletten 5’UTR essentiell für eine effiziente Translation bei niedriger Temperatur, wobei eine Mutation der 9bp-box einen geringen, aber signifikanten negativen Effekt auf die Translation ausübt. Sechs Gene, der neu identifizierten CIPs, beinhalten ebenfalls eine 9bp-box in ihrer upstream Region. Interessanterweise werden zwei der fünf csp-Gene, cspC und cspD, vom BvgAS Zweikomponentensystem, dem Haupttranskriptionsregulator der Virulenzgene im Genus Bordetella, reguliert. Die beiden Gene gehören zu den Bvg-negativ regulierten Genen, die in der Bvg-minus-Phase exprimiert werden. Weiterhin beeinflusst eine leichte Überexpression von CspB aus B. pertussis die Expression der Adenylatzyklase sowohl in B. pertussis, als auch in B. bronchiseptica negativ. Dieser für das CspB spezifische Effekt erinnert an das strukturell verwandte Tex-Protein (Fuchs et al, 1996; König et al, 2002). Beide Proteine beeinflussen die Expression der Virulenzfaktoren negativ, wobei für CspB gezeigt werden konnte, dass es einen direkten Einfluss auf die verminderte cyaA-Expression auf Transkriptionsebene besitzt. Dies zeigt eine Verbindung der Kälteschockantwort mit dem Virulenz-Regulon der Bordetellen, deren Rolle im Infektionszyklus bislang ungeklärt ist.
T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekundären lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekundären lymphatischen Organen angekommen, präsentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molekülen. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigeführt werden können, die ein T-Zell priming außerhalb der sekundären lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerstörung führte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines tertiären lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses tertiäre lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Präsenz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und naïven T-Zellen alle Voraussetzungen für ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifität der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Ausschüttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen für wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verstärkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabhängig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika führte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so führte dies zu einem stärkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl naïve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die Überexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, müssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming ermöglichen sollten. Dementsprechend riefen diese Veränderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekundärer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, naïven T-Zellen entscheiden zu sein. Die Möglichkeit des in vitro primings bekräftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekundären lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Veränderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben ermöglicht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden offene Fragen zur Objektwahl, zur Objektbeibehaltung und zur Aufgabe von Zielobjekten bei laufenden Taufliegen (Drosophila melanogaster) untersucht. Die Erkenntnisse zur Objektwahl wurden als kybernetisches Modell formuliert, auf einem eigens dafür konstruierten, autonom navigierenden Roboter mit Kameraauge implementiert und dessen Verhalten bei verschiedenen Landmarkenkonstellationen quantitativ mit dem Orientierungsverhalten laufender Fliegen verglichen. Es war bekannt, dass Drosophila in einer Wahlsituation zwischen unterschiedlich weit entfernten Objekten eine ausgeprägte Präferenz für nahe Objekte zeigt, wobei die Entfernung über das Ausmaß der retinalen Bildverschiebung auf dem Auge (Parallaxe) erfasst wird. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob die Parallaxe streng aus der Eigenbewegung der Fliege resultieren muss oder ob Eigenbewegung der Objekte Nähe vortäuschen und deren Attraktivität erhöhen kann. Es wurde gezeigt, dass die Präferenz für ein Objekt bei Drosophila umso größer wird, je mehr Bewegung dessen Abbild auf der Retina erzeugt; die relative Verschiebung des Objektabbildes muss dabei nicht mit der Eigenbewegung der Fliege gekoppelt sein. Überraschenderweise verschwand die Präferenz für nahe Objekte, wenn eine zusammenstehende Gruppe aus einer nahen und mehreren fernen Objekten präsentiert wurden, solange sie zusammen einen Sehwinkel von weniger als etwa 90° einnahmen. Diese Beobachtung ist konform mit einer Vorstellung, wonach Bewegung über größere Augenbereiche integriert und nicht einzelnen Objekten zugeordnet wird. Obwohl Drosophila bei gleichem Präsentationsort auf der Retina die größere parallaktische Bewegung bevorzugte, wurden bei gleicher Entfernung dennoch frontalere gegenüber lateraleren Objekten bevorzugt. Es wird postuliert, dass der frontale und der caudale Sehbereich eine Verstärkung erfahren, die die physikalisch bedingt geringere Parallaxe überkompensiert. Laufende Fliegen reagieren verzögert auf die Präsentation eines Objekts; dies wird im Sinne einer zeitlichen Bewegungsintegration interpretiert. Die darauf folgende Richtungsänderung hängt vom Präsentationswinkel des Objektes ab. Erscheint das Objekt frontolateral, findet eine Hinwendung statt, erscheint es caudolateral, kommt es bevorzugt zur Abwendung. Eine weitere wichtige kognitive Leistung der Fliege ist das Aufgeben eines zuvor ausgewählten Ziels, wenn sich dieses Ziel während des Anlaufs als unerreichbar herausstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Fliegen mit stark reduzierten Pilzkörpern erheblich mehr Zeit benötigen als wildtypische Fliegen, um vom gewählten Zielobjekt abzulassen. Dieser dem Perseveranzverhalten bei Parkinson-kranken Menschen ähnliche Phänotyp wurde unabhängig von der Methode der Ausschaltung der Pilzkörper gefunden. Die Dauer der Perseveranz nahm mit zunehmender Attraktivität des Zielobjekts, d. h. mit abnehmender Distanz, zu. Es wird vorgeschlagen, dass die Pilzkörper für die Evaluierung von eingehender sensorischer Information oder für Entscheidungsfindungen im Allgemeinen benötig werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Minimalmodell für die visuelle Orientierung nach Landmarken entwickelt. Das Modell beinhaltet eine zeitliche Integration des optischen Flusses in einem frontolateralen und einem caudolateralen Kompartiment pro Auge. Je nachdem, in welchem Kompartiment eine festgesetzte Schwelle zuerst erreicht wird, kommt es entweder zu einer Hin- (frontolateral) oder zu einer Abwendungsreaktion (caudolateral). Eine Gewichtungsfunktion kompensiert die geringe parallaktische Verschiebung in diesen Sehregionen. Das Modell wurde in einem mobilen Roboter mit Kameraauge implementiert und mit dem visuellen Orientierungsverhalten der Fliege quantitativ verglichen. Der Roboter war in der Lage, viele Aspekte der Landmarkenwahl von laufenden Fliegen erfolgreich zu reproduzieren und fliegenähnliches, autonomes Orientierungsverhalten unter verschiedenen Landmarkenkonfigurationen zu zeigen.
Die in dieser Arbeit etablierte Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM ermöglicht es, das Genom von pathogenen Bakterien zu mutagenisieren und die so generierte Mutantenbank im high-throughput-Format auf Gene zu untersuchen, die unter bestimmten Bedingungen für das infektiöse Potential oder für das Überleben dieser Keime von Bedeutung sind. Die Grundlage von IDM bildet ein konditional replizierender Vektor, in den eine Genbank des Wirtsorganismus kloniert wird und der unter nicht-permissiven Replikationsbedingungen mittels homologer Rekombination ins Chromosom integriert und dadurch einen Gen-Knockout bedingt. Das IDM-Verfahren weist gegenüber der Transposon-Mutagenese den Vorteil auf, dass das Genom nach dem Zufallsprinzip saturierend mutagenisiert werden kann und dass keine hot spots für die Insertion auftreten. Darüber hinaus kann der mutierte Genlocus nach Screening der Mutanten schnell per PCR identifiziert werden, indem die Exzision des Vektors induziert und das klonierte, homologe Fragment sequenziert wird. Die Insertion des Vektors ins Chromosom und damit der Gen-Knockout ist selbst ohne Selektionsdruck sehr stabil, so dass die Mutanten im Zellkultur- oder Tier-System untersucht werden können. IDM wurde im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf Salmonella enterica Serovar typhimurium und Listeria monocytogenes angewandt. Die Applikation von IDM auf S. typhimurium hatte zum Ziel, Gene zu identifizieren, deren Produkte für das Überleben dieses Gram-negativen Keims in Vollmedium unter Laborbedingungen essentiell sind. Ausgehend von 14.000 S. typhimurium Fragmentbank-Klonen konnten durch Induktion der Integration des Vektors 262 Klone identifiziert werden, für welche die Mutation zu einem lethalen Phänotyp führte. 116 der 262 entsprechenden Proteine konnte durch IDM erstmalig eine essentielle Funktion für die Vitalität von S. typhimurium zugewiesen werden. Darunter befinden sich sowohl Proteine, die homolog sind zu Proteinen anderer klinisch-relevanter Keime, als auch Proteine, die Salmonella-spezifisch sind. Der größte Teil der identifizierten Proteine ist in die Speicherung und Weitergabe von Information (Transkription, Translation, DNA-Reparatur etc.) involviert, viele sind allerdings auch Proteine unbekannter Funktion. Die Essentialität der durch IDM identifizierten Gene konnte durch die Konstruktion von konditional lethalen Mutanten bestätigt werden. IDM ist demnach das erste Mutagenese-Verfahren, welches das essentielle Gen-Set von S. typhimurium für das Überleben in Vollmedium zu definieren vermochte. Basierend auf den IDM Daten konnte es auf 511 Gene, d.h. auf 11 % des Gesamt-Genoms beziffert werden. Bei der Applikation von IDM auf L. monocytogenes lag der Fokus auf der Identifizierung von Genen, die für das Überleben dieses Gram-positiven Bakteriums im Zytosol von eukaryontischen Zellen von Bedeutung sind. Im Screening von bis dato 720 der 1491 L. monocytogenes Insertionsmutanten auf ein attenuiertes Replikationsverhalten in Caco-2 Zellen konnten 69 Mutanten selektioniert werden. In diesen Mutanten sind Gene ausgeknockt, deren Produkte hauptsächlich wichtige Funktionen in der Nährstoffbereitstellung, in der Energiesynthese und im Metabolismus inne haben. Mit der Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM steht ein molekulares Werkzeug zur Verfügung, welches für die Identifzierung neuer targets für sowohl Breitband- als auch Spezies-spezifische Antiinfektiva eingesetzt werden kann und welches unbekannten Proteinen eine biologische Funktionen zuweisen kann.
Für BMPs wie auch die anderen Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie beginnt der Signalweg mit der Bindung des Liganden an zwei Typen transmembranärer Rezeptoren. Die Ligand-Rezeptor Interaktionen sind dabei durch unterschiedliche Affinität und Spezifität gekennzeichnet und bilden wahrscheinlich die Grundlage für das breite Spektrum biologischer Funktionen. In dieser Arbeit wurde mittels einer Struktur- und Funktionsanalyse von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen die molekulare Basis für die Affinität und Spezifität dieser Wechselwirkungen untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur des BMP-2 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplexes bei einer Auflösung von 1,9Å ermittelt. Mit der höheren Auflösung war die Charakterisierung der geometrischen Parameter eines Netzwerks von zehn Wasserstoff-Brückenbindungen in der Interaktionsfläche zwischen BMP-2 und BR-IAec möglich. Deren zentrale Bedeutung für dieWechselwirkung konnte auch durch funktionelle Analyse bestätigt werden. So stellen die im Zentrum der Bindungsfläche liegenden Wasserstoff-Brückenbindungen BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) und BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1), sowie die BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-Brücke die Hauptdeterminanten der Ligand-Rezeptor Bindung dar. Darüber hinaus ließ sich aus der strukturellen Analyse des "wrist"-Epitops von BMP-2 eine besondere Bedeutung der Prä-Helix Schleife L2, sowie der im Kontakt eingeschlossenen Wassermoleküle für die Anpassung der Bindungsfläche an unterschiedliche Interaktionspartner ableiten. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für ein neues Modell zur Beschreibung von Affinität und Spezifität der hochaffinen BMP-Typ I Rezeptor Interaktion. Dabei stellen die Wasserstoff-Brückenbindungen den Hauptanteil zur Bindungsenergie, während die hydrophobe Umgebung in der Interaktionsfläche die Bildung von Wasserstoff-Brückenbindungen energetisch begünstigen und hydrophobe Wechselwirkungen nur geringfügigen Einfluss auf die Affinität nehmen. Die vorliegenden Arbeit beschreibt zudem die Präparation und Kristallisation von binären Ligand-Typ I Rezeptor Komplexen für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie die der ternären Komplexe von BMP-2, BR-IAec und ActR-IIec bzw. BR-IIec. Die extrazellulären Domänen der hierfür verwendeten Rezeptoren wurden durch Expression in E.coli oder Sf-9 Insektenzellen erhalten. Ihre funktionelle Charakterisierung erfolgte durch BIAcore Interaktionsanalyse an immobilisierten Liganden, wobei in Abhängigkeit vom Ligand-Rezeptor Komplex unterschiedliche Affinitäten ermittelt werden konnten. In Übereinstimmung mit den hierbei erhaltenen Daten wurden die Ligand-BMP Typ IB Rezeptor Komplexe für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie der GDF-5 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplex präpariert. Des Weiteren konnte die Bildung des ternären BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec Ligand-Rezeptor Komplexes in Lösung nachgewiesen werden. Für all diese Komplexe konnten Kristallisationsbedingungen ermittelt werden. Trotz Optimierung dieser Bedingungen reichte die Qualität der erhaltenen Kristalle nicht für eine Aufklärung der Struktur aus. Für eine detailliertes Verständnis der Mechanismen der Rezeptoraktivierung muss die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen fortgeführt werden. Die präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass über die Kenntnis der einzelnen Affinitäten und die gezielte Modifikation der Interaktionspartner eine erfolgreiche Strukturanalyse dieser Ligand-Rezeptor Komplexe möglich ist.
HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären.
Zur Gattung Bordetella gehören mehrere zum Teil sehr eng miteinander verwandte Keime, die bislang, mit Ausnahme des Umweltisolats B. petrii, ausschließlich in Assoziation mit einem Wirtsorganismus nachgewiesen werden konnten. Hierzu gehören zum einen die „klassischen“ Arten, deren pathogenes Potential vom obligat humanpathogenen Erreger des Keuchhustens, B. pertussis, dem ebenfalls humanpathogenen Keim B. parapertussis bis hin zu B. bronchiseptica, dem Erreger von Atemwegserkrankungen in verschiedenen Säugetieren, reicht. Zum anderen wurde dieser Gattung mit B. avium, B. hinzii, B. trematum, B. holmesii und B. petrii in den letzten Jahren „neue“ Arten zugeordnet, die zum Teil humanpathogenes, zum Teil tierpathogenes Potential besitzen. Da die evolutionären Beziehungen der „neuen“ Bordetella-Arten innerhalb der Gattung Bordetella bislang noch wenig untersucht wurden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Verbreitung und Konservierung von bekannten Bordetella-Genen und IS-Elementen bei den „neuen“ Bordetella-Arten untersucht. Aufgrund der vermehrten Hinweise auf ein humanpathogenes Potential von B. holmesii und seiner Assoziation mit einem dem Keuchhusten ähnlichen Krankheitsbild wurde der Schwerpunkt dieser Untersuchungen auf die Analyse der phylogenetischen Beziehungen zwischen B. holmesii und dem B. bronchiseptica-Cluster gelegt. Während durch den Nachweis der bei dem B. bronchiseptica-Cluster vorkommenden IS-Elemente IS481 und IS1001 die durch die 16S rDNA-Sequenz ermittelte Position von B. holmesii innerhalb des B. bronchiseptica-Clusters bestätigt werden konnte, ergab eine vergleichende Sequenzanalyse der in der Gattung Bordetella hoch konservierten Proteine OmpA, BvgA und BvgS die interessante Beobachtung, dass dieser Organismus in dieser Hinsicht viel mehr Ähnlichkeiten zu den „neuen“ Bordetella-Arten besitzt und in diesem Zusammenhang phylogenetisch eher im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Bei der Charakterisierung von vier unterschiedlichen B. holmesii-Blutisolaten wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei variante B. holmesii-Stämme identifiziert, die sich hinsichtlich der fehlenden Expression des intakten Response-Regulators BvgABH von wildtypischen B. holmesii-Isolaten unterscheiden. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass bei diesen phasenvarianten Stämmen die fehlende Expression auf eine Punktmutation innerhalb der bvgABH-Nukleotidsequenz zurückzuführen ist. Diese wird in beiden Fällen an der selben Nukleotidposition durch die Insertion eines Adenosinrestes hervorgerufen. Obwohl dieser Sequenzabschnitt nicht durch eine repetitive Nukleotidfolge gekennzeichnet ist und somit keinerlei Ähnlichkeiten mit einer für Frameshift-Mutationen anfälligen Stelle besitzt, könnte es sich bei der identifizierten DNA-Region dennoch um einen „hot spot“ für eine Punktmutation handeln, da die zwei varianten B. holmesii-Stämmen unabhängig voneinander aus unterschiedlichen Blutkulturen isoliert wurden. Von besonderer Bedeutung war zudem die Beobachtung, dass sich unter diesen varianten Stämmen auch der bei den Stammsammlungen als Referenzstamm abgelegte B. holmesii-Stamm ATCC51541 befindet. Da im Rahmen dieser Arbeit keinerlei offensichtliche phänotypische Unterschiede zwischen den varianten und den wildtypischen B. holmesii-Stämmen festgestellt werden konnten, bleibt die Bedeutung der Phasenvariation bei B. holmesii bislang noch ungeklärt. Im weiteren wurde mit Hilfe eines „Genome Walks“ die an den bvgABH-Leserahmen angrenzenden DNA-Bereiche für B. holmesii ermittelt. Dabei konnte 5 bp nach dem bvgABH-Stoppcodon ein weiterer Leserahmen (bvgSBH) identifiziert werden, welcher Homologien zu der Histidinkinase BvgS aus B. pertussis besitzt. Interessanterweise stellte sich bei der Sequenzanalyse heraus, dass der Konservierungsgrad des bvgASBH-Locus aus B. holmesii und des bvgAS-Locus aus B. pertussis auf DNA-Ebene sehr gering ist. Diese Beobachtung erklärt wiederum, warum der bvgASBH-Genlocus aus B. holmesii früher nicht durch DNA/DNA- Hybridisierungs-Experimente mit einer B. pertussis spezifischen DNA-Sonde nachgewiesen werden konnte und sein Vorhandensein erst nach dem Einsatz von degenerierten Primern über PCR-Analysen detektiert werden konnte. Im weiteren konnte über den „Genome Walk“ gezeigt werden, dass die an dem bvgAS-Locus angrenzenden DNA-Bereiche innerhalb der Gattung Bordetella nicht konserviert sind. Zum einen ist der bvgASBH-Locus aus B. holmesii nicht wie bei dem B. bronchiseptica-Cluster in 5´-Richtung von dem fhaB-orthologen Genlocus benachbart, da sich an dieser Stelle ein weiterer, potentieller Response-Regulator befindet. Ebenso konnten stromaufwärts von bvgASBH keinerlei Hinweise auf das Vorhandensein eines, dem bvgR-Gen der „klassischen“ Arten orthologen Leserahmens erzielt werden. Über weitere Sequenzanalysen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass der Promotorbereich des bvgASBH-Genlocus überraschenderweise keinerlei offensichtliche Sequenzhomologien zu dem entsprechenden Promotorbereich der bvgAup-Region der „klassischen“ Arten zeigt. Dennoch konnten über in silico-Analysen mehrere Sequenzmotive innerhalb der bvgABHup-Region identifiziert werden, die als „inverted repeat“-Strukturen angeordnet sind und die zum Teil eine hohe Übereinstimmung zu der für die „klassischen“ Bordetella-Arten beschriebene BvgA-Konsensussequenz 5´-T/A T T C C/T T A-3 besitzen. Während sich diese Wiederholungssequenzen hinsichtlich ihrer Symmetrie und ihrer Anordnung von denen innerhalb der für das B. bronchiseptica-Cluster beschriebenen bvgAup-Region unterscheiden, konnten auffällige Parallelen zu der Promotorregion des vag- (virulence activated gene) Gens bvgR festgestellt werden. Obwohl sowohl der Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii als auch das BvgA-Protein aus B. pertussis in vitro an die „inverted repeat“ Strukturen der bvgABHup-Region binden kann, führte eine Analyse der GFP-Expression der Reportergenfusion bvgABHup-gfp zu der erstaunlichen Beobachtung, dass die Reportergenfusion in B. pertussis durch die Bindung des BvgA-Proteins reprimiert wird, während sie im Gegensatz dazu in B. holmesii durch die Bindung des BvgABH-Proteins aktiviert wird. Die molekulare Grundlage für diese unterschiedlichen Regulationsmechanismen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht ermittelt werden. Trotz einer umfangreichen Sequenzkonservierung zwischen dem Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii und BvgA aus B. pertussis ist das BvgABH-Protein nicht in Lage, die Funktion des BvgA-Proteins aus B. pertussis in vitro bzw. in vivo zu ersetzen. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe von Komplementationsexperimenten gezeigt werden, dass die Histidinkinase BvgSBH aus B. holmesii in der Lage ist, die Funktion des in dem B. pertussis Stamm 347 mutierten BvgS-Proteins zu übernehmen. Überraschenderweise unterschiedet sich jedoch das BvgSBH-Protein hinsichtlich der Wahrnehmung der Umweltstimuli von BvgS, da die Aktivität der Histidinkinase BvgSBH in dem hybriden B. pertussis Stamm BP 347 (pRK415-bvgASBH ATCC51541) nicht vollständig durch Sulfationen moduliert werden kann. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass im Gegensatz zu den cytoplasmatischen Regionen die BvgSBH- und BvgS- Sensorproteine vor allem in ihren sensorischen Bereichen einen sehr geringen Konservierungsgrad aufweisen.