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Die Popeye domain containing (Popdc)-Gene bilden eine evolutionär stark konservierte Genfamilie mit präferenzieller Expression im Herzen und in der Skelettmuskulatur. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Popdc1 in kardialen Myozyten in Glanzstreifen, lateralen Membranen und im T-Tubuli-System exprimiert wird und mit Ionenkanälen und anderen myozytären Membranproteinen wie Cav1.2, Caveolin 3 und NCX1 kolokalisiert ist. Im ventrikulären Reizleitungssystem ist die Expression von Popdc1 gegenüber dem ventrikulären Arbeitsmyokard erhöht, während Atrium und Sinusknoten nahezu äquivalente Expressionsdomänen aufweisen. Mithilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte bei den Popdc1-Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusbradykardie festgestellt werden, die altersabhängig auftritt und auf Sinuspausen zurückzuführen ist. Histologische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme des Sinusknotenmarkers HCN4, zeigten einen Zellverlust im inferioren Teil des Sinusknotens. Popdc1 ist ein Transmembranprotein, das eine 150 Aminosäure umfassende, stark konservierte Popeye-Domäne aufweist. Für diese Domäne konnte auf struktureller Ebene eine Homologie zu zyklischen Nukleotid-Bindungsdomänen vorhergesagt und eine Bindung an cAMP und cGMP experimentell demonstriert werden. Es handelt sich bei den Popdc-Proteinen um einen neuen Zweig der Bindungsproteine für zyklische Nukleotidmonophosphate (cNMP). Die Bindungssequenz weist signifikante Unterschiede zu anderen bereits identifizierten cNMP-Bindungsproteinen auf. Weiterhin wurde die Interaktion von Popdc1 mit TREK1, einem Mitglied der Tandemporenkanäle untersucht. Es zeigte sich, dass Popdc1 nach Koexpression in Froschoozyten, den TREK1-Strom erhöht und dass die β-adrenerge Inhibition des TREK1 Kanals durch Popdc1 verstärkt wird. Im Arbeitsmyokard, im kardialen Reizleitungssystem und in kotransfizierten Cos7-Zellen werden beide Proteine überlappend exprimiert. Diese Daten zeigen, dass Popdc1 eine wichtige Funktion bei der Regulation der Schrittmacheraktivität, der Aufrechterhaltung der Sinusknotenmorphologie und der Modulation von Ionenkanälen aufweist. Interessanterweise wurden von unserer Arbeitsgruppe bereits die gleichen Phänotypen für die Popdc2 Maus beschrieben, sodass die Popdc Genfamilie überlappende und redundante Funktionen aufweist.
Abstract: 1. The response of dispersal towards evolution largely depends on its heritability for which upper limits are determined by the trait's repeatability. 2. In the Linyphiid spider E. atra, we were able to separate long- and short-distance dispersal behaviours (respectively ballooning and rappelling) under laboratory conditions. By performing repeated behavioural trials for females, we show that average dispersal trait values decrease with increasing testing days. By comparing mated and unmated individuals during two periods (before and after mating for the mated group, and the same two periods for the unmated group), we show that mating has no effect on the mean displayed dispersal behaviour or its within-individual variation. Repeatabilities were high and consistent for ballooning motivation, but not for rappelling. 3. Ballooning motivation can be regarded as highly individual-specific behaviour, while general pre-dispersal and rappelling behaviours showed more individual variation. Such difference in repeatability between long-and short-distance dispersal suggests that short-and long-distance dispersal events are triggered by different ecological and evolutionary mechanisms.
Abstract: Inbreeding depression, asymmetries in costs or benefits of dispersal, and the mating system have been identified as potential factors underlying the evolution of sex-biased dispersal. We use individual-based simulations to explore how the mating system and demographic stochasticity influence the evolution of sex-specific dispersal in a metapopulation with females competing over breeding sites, and males over mating opportunities. Comparison of simulation results for random mating with those for a harem system (locally, a single male sires all offspring) reveal that even extreme variance in local male reproductive success (extreme male competition) does not induce male-biased dispersal. The latter evolves if the between-parch variance in reproductive success is larger for males than females. This can emerge due to demographic stochasticity if the habitat patches are small. More generally, members of a group of individuals experiencing higher spatio-temporal variance in fitness expectations may evolve to disperse with greater probability than others.
River banks are naturally disturbed habitats, in which local flood events and the landscape structure are expected to govern riparian species assemblages. Not solely effects of flooding per se, but also related changes in vegetation structure will affect species’ distribution. By elucidating the relationships between species’ occurrence and multivariate habitat conditions on a restricted spatial scale, insight into conservation strategies to preserve riparian species is gained. Ordination and grouping methods revealed important environmental and functional trait constraints on species composition of predatory riparian arthropod assemblages. Mainly flooding disturbance appeared to affect spider and carabid beetle species composition. Habitat affinity and dispersal ability were retained as important traits explaining similarity between arthropod assemblages. River banks similar in species composition differed in absolute and functional group species richness. Furthermore, Poisson regressions demonstrated the importance of variation in discharge regime, sediment composition and vegetation structure for the preservation of rare riparian arthropods. Whereas hygrophilic species benefited from increased vegetation cover, xerothermophilic specialists were favoured by increased flooding disturbance. In contrast to flight-active riparian carabids occurring throughout the river system, especially cursorial spiders are expected to go extinct under increased anthropogenic alterations of discharge regimes. We show the importance of a dynamic and evidence-based approach of river management on a local scale to preserve vulnerable riparian arthropods. In general, river restoration should generate the required heterogeneity in environmental conditions (e.g. dynamic processes) at the river bank level, thereby increasing the sustainability of riverine landscapes. More-over, we argue that the understanding of functional responses towards environmental factors results in general and widely applicable guiding concepts for species conservation.
Vegetation structure can profoundly influence patterns of abundance, distribution, and reproduction of herbivorous insects and their susceptibility to natural enemies. The three main structural traits of herbaceous vegetation are density, height, and connectivity. This study determined the herbivore response to each of these three parameters by analysing oviposition patterns in the field and studying the underlying mechanisms in laboratory bioassays. The generalist leaf beetle, Galeruca tanaceti L. (Coleoptera: Chrysomelidae), preferentially deposits its egg clutches on non-host plants such as grasses. Earlier studies revealed that oviposition within structurally complex vegetation reduces the risk of egg parasitism. Consequently, leaf beetle females should prefer patches with dense, tall, or connected vegetation for oviposition in order to increase their reproductive success. In the present study, we tested the following three hypotheses on the effect of stem density, height, and connectivity on oviposition: (1) Within habitats, the number of egg clutches in areas with high stem densities is disproportionately higher than in low-density areas. The number of egg clutches on (2) tall stems or (3) in vegetation with high connectivity is higher than expected for a random distribution. In the field, stem density and height were positively correlated with egg clutch presence. Moreover, a disproportionately high presence of egg clutches was determined in patches with high stem densities. Stem height had a positive influence on oviposition, also in a laboratory two-choice bioassay, whereas stem density and connectivity did not affect oviposition preferences in the laboratory. Therefore, stem height and, potentially, density, but not connectivity, seem to trigger oviposition site selection of the herbivore. This study made evident that certain, but not all traits of the vegetation structure can impose a strong influence on oviposition patterns of herbivorous insects. The results were finally compared with data on the movement patterns of the specialised egg parasitoid of the herbivore in comparable types of vegetation structure.
Synaptonemal Komplexe (SC) sind evolutionär konservierte, meiosespezifische, proteinöse Strukturen, die maßgeblich an Synapsis, Rekombination und Segregation der homologen Chromosomen beteiligt sind. Sie zeigen eine dreigliedrige strickleiter-artige Organisation, die sich aus i) zwei Lateralelementen (LE), an die das Chromatin der Homologen angelagert ist, ii) zahlreichen Transversalfilamenten (TF), welche die LE in einer reißverschlussartigen Weise miteinander verknüpfen, und iii) einem zentralen Element (CE) zusammensetzt. Die Hauptproteinkomponenten der Säuger-SC sind das Transversalfilamentprotein SYCP1 und die Lateralelementproteine SYCP2 und SYCP3. Wie sich die SC-Struktur zusammenfügt war bisher nur wenig verstanden; es war nicht bekannt wie die TF innerhalb der LE-Strukturen verankert sind und dabei die homologen Chromosomen verknüpfen. Aufgrund dessen wurde die Interaktion zwischen den Proteinen SYCP1 und SYCP2 untersucht. Mit der Hilfe verschiedenster Interaktionssysteme konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von SYCP1 mit SYCP2 interagieren kann. Aufgrund der Bindungsfähigkeit zu beiden Proteinen, SYCP1 und SYCP3, kann angenommen werden, dass SYCP2 als Linker zwischen diesen Proteinen fungiert und somit möglicherweise das fehlende Bindungsglied zwischen den Lateralelementen und Transversalfilamenten darstellt. Obwohl die SC-Struktur in der Evolution hochkonserviert ist, schien dies nicht für seine Protein-Untereinheiten zuzutreffen. Um die Struktur und Funktion des SC besser verstehen zu können, wurde ein Vergleich zwischen den orthologen SYCP1 Proteinen der evolutionär entfernten Spezies Ratte und Medaka erstellt. Abgesehen von den erheblichen Sequenzunterschieden die sich in 450 Millionen Jahren der Evolution angehäuft haben, traten zwei bisher nicht identifizierte Sequenzmotive hervor, CM1 und CM2, die hochgradig konserviert sind. Anhand dieser Motive konnte in Datenbankanalysen erstmals ein Protein in Hydra vulgaris nachgewiesen werden, bei dem es sich um das orthologe Protein von SYCP1 handeln könnte. Im Vergleich mit dem SYCP1 der Ratte zeigten die Proteine aus Medaka und Hydra, neben den hoch konservierten CM1 und CM2, vergleichbare Domänenorganisationen und im heterologen System zudem sehr ähnliche Polymerisationseigenschaften. Diese Ergebnisse sprechen für eine evolutionäre Konservierung von SYCP1.
Leonia cymosa (Violaceae) is a small tree from the under story of the Amazonian rain forest. I investigated the seed dispersal ecology of L. cymosa in plots of old growth terra firme forest located within the Cuyabeno Faunistic Reserve in north-eastern Ecuador. This species offered good conditions to examine the variation of traits of individual trees and the way they are linked with fruit removal from each tree. With this study I aimed to address the question whether frugivores exert selection pressures on fruits and the fruiting regime of fleshy fruited plants. The mean height of a fruiting L. cymosa was 6.6 m (range: 2 - 12.6 m). The median tree density was 11.8 trees per hectare. Trees grew in clusters consisting of different numbers of trees of different heights. L. cymosa flowered two times a year, in late February to March and in October. The respective fruiting seasons occurred in August/September and between March and May. The fruit pulp of L. cymosa contained the sugars fructose, glucose, and sucrose, the total soluble sugar being the first important nutritional compound of the fruit pulp. The second important compound was proteins. No lipids were found in the fruit pulp. The variation of nutritional quality of the fruits was high within trees. Nonetheless, significant differences were found among trees in all nutrient constituents studied. The maximum of ripe fruits produced per season by a single tree was 427. Median productivity of the trees was 45 ripe fruits throughout the fruiting season in 1999 (n=57) and 36 ripe fruits in 2000 (n=92). The maximum standing crop of fruits in a tree was 324 fruits (counted in 2000). Black mantle tamarins, Saguinus nigricollis (Callitrichidae), and squirrel monkeys, Saimiri sciureus (Cebidae), and possibly an unknown nocturnal frugivore consumed the fruits of L. cymosa at my study site. Green-rumped acouchis (Myoprocta pratti, Dasyproctidae) consumed fallen fruits and seeds underneath the trees. Black mantle tamarins and squirrel monkeys differed widely in their effectiveness as seed dispersers. Black mantle tamarins swallowed the seeds together with the fruit pulp and defecated intact seeds far away from the mother tree. Squirrel monkeys opened the fruits to suck and gnaw on the fruit pulp, and then dropped seeds to the forest floor below the tree crowns. Each of my study plots fell into the core home range of one group each of S. nigricollis and S. sciureus. Thus, the frugivore assemblage is small and disperser availability is limited for the individual tree of L. cymosa. In a sample of 6 trees of comparable and high fruit crop size, the total of ripe fruits removed from a tree throughout the whole fruiting season by the reliable seed disperser S. nigricollis was neither significantly correlated with the content of any of the nutrients measured in the fruit pulp (fructose, glucose, sucrose, total protein; pulp does not contain lipids), nor with total metabolisable energy, seed to pulp weight ratio, or water content of the fruit pulp. Feeding preferences for single sugars determined by other laboratory studies were not confirmed by this field study. The reliable seed disperser S. nigricollis does not seem to exert selective pressure on the nutrient content of the fruits of L. cymosa. Seasonal fruit crop size was the main predictor of all aspects of fruit removal by the effective disperser of L. cymosa, Saguinus nigricollis, as well as by the non-disperser, Saimiri sciureus. Trees with larger seasonal fruit crop size had a higher probability to have fruits removed by the disperser than those with small seasonal fruit crop sizes. They also had a higher number of fruits removed by the seed disperser. However, the proportion of fruits removed by the disperser decreased with increasing seasonal fruit crop size. In contrast, probability of fruit removal, the number of fruits removed, and the proportion of fruits removed by the non-disperser increased with increasing seasonal fruit crop sizes. The observed differences between disperser and non-disperser are due to differences in feeding capacity, group size and foraging behavior. Tamarins were less likely to harvest Leonia trees that were not or less completely covered by surrounding vegetation. This probably reflects a behavior to avoid predation by forest raptors. At high con-specific fruit abundance in the neighborhood, the proportion of fruits removed by tamarins was reduced. This suggests competition of trees for the disperser. My study revealed selection of the disperser on seasonal fruit crop size of L. cymosa. My results are consistent with the “fruit crop size hypothesis”. FCSH appears to constitute a valid framework also in the monkey-dispersed L. cymosa. My findings also show that factors beyond the tree’s control influenced fruit removal from Leonia trees. Disperser-mediated selection may be constrained (yet not impeded) by neighborhood conditions.
Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, ähnlich den Symbionten von Blattläusen, hauptsächlich Gene der Aminosäurebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell bestätigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der dynamischen Interaktion der beiden Partner während des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem während der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein könnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus während der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgeklärt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in späteren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschränkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. Übereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am höchsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gefüllte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene für molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die möglicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminosäuren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem höheren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begründet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte bestätigt werden, dass die Faktoren mit der höchsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich mögliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell bestätigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angehören, ähnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf übergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus späten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erhöhte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminosäuren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge benötigt werden, während die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies äußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Veränderung der Symbiontenzahl übertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch während der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts über die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen Fähigkeiten der Bakterien stellen möglicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bedürfnissen des Wirtes verändert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose führen. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose für einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabhängige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolutionären Erfolg dieser Ameisengattung erklären könnte. 
Mechanisms and adaptive significance of interspecific associations between tropical ant species
(2009)
Aggression between ants from different colonies or species is ubiquitous. Exceptions to this rule exist in the form of supercolonies (within a species) and interspecific associations (between species). Probably the most intimate interspecific association is the parabiosis, where two ant species live together in a common nest. They keep their brood separate but jointly use trails and often share food resources. Parabioses are restricted to few species pairings and occur in South American and Southeast Asian rainforests. While the South American parabioses have been studied, albeit poorly, almost nothing is known about their Southeast Asian counterparts. My PhD project focuses on Southeast Asian parabioses between the myrmicine Crematogaster modiglianii Emery 1900 and the considerably larger formicine Camponotus rufifemur Emery 1900. The two species frequently nest together in hollow trees in the tropical lowland rainforest of Borneo. The basic question of my PhD project is why these two species live together. I investigated both proximate and ultimate aspects of this question. For comparative purposes, I included studies on a trail-sharing association in the same habitat. On the proximate level, I investigated which mechanisms facilitate tolerance towards hetero-spe¬ci¬fic nestmates. Ants generally discriminate nestmates from non-nestmates via cuticular hydro¬carbons that function as colony recognition cues. I studied the specificity of nestmate recognition within and between the two parabiotic species. Using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), I analyzed the cuticular substances in both ant species to find potential differences to non-parabiotic species, and to estimate the substance overlap among the two species. A high substance overlap would e.g. suggest that interspecific tolerance is caused by chemical mimicry. Finally, bioassays were conducted to evaluate the function of different cuticular compounds. Interspecific tolerance in the two parabiotic species was species-specific but not colony-specific. Ca. rufifemur tolerated all Cr. modiglianii individuals, even those from foreign colonies, but strongly attacked workers of other Crematogaster species. Cr. modiglianii, in turn, tolerated Ca. rufifemur workers of certain foreign colonies but attacked those of others. Chemical analyses revealed two sympatric, chemically distinct Ca. rufifemur varieties (‘red’ and ‘black’) with almost no hydrocarbon overlap. Cr. modiglianii only tolerated foreign Ca. rufifemur workers if they belonged to the same chemical variety as their own Ca. rufifemur partner. It also attacked other, non-parabiotic Camponotus species. Thus, reciprocal interspecific tolerance was restricted to the species Cr. modiglianii and Ca. rufifemur. Ca. rufifemur frequently tolerated conspecific non-nestmates of the same chemical variety. Minor workers were more often tolerated than majors, possibly because they possess two to three times lower hydrocarbon quantities per body surface than majors. In contrast, Cr. modiglianii nearly always attacked conspecific non-nestmates. Both species possessed hydrocarbons with considerably higher chain lengths than congeneric, non-parabiotic ant species. Long-chain hydrocarbons are less volatile than shorter ones and thus harder to perceive. They may thus considerably facilitate interspecific tolerance. Moreover, up to 98% of the cuticular hydrocarbons in Ca. rufifemur were methylbranched alkenes, which are highly unusual among insect cuticular hydrocarbons. Cr. modiglianii and Ca. rufifemur had almost no hydrocarbons in common, refuting chemical mimicry as a possible cause of interspecific tolerance. The only hydrocarbons common to both species were two methylbranched alkenes, which constituted 89% of the ‘red’ Ca. rufifemur hydrocarbon profile and also occurred in those Cr. modiglianii colonies that lived together with this Ca. rufifemur variety. Cr. modiglianii presumably acquired these two compounds from its red Ca. rufifemur partner. Cr. modiglianii was significantly less aggressive towards foreign Cr. modiglianii workers that were associated with the same Ca. rufifemur variety than to those associated with the respective other one. Hence, this species seemed to use recognition cues acquired from its parabiotic partner. Apart from hydrocarbons, both species possessed a set of hitherto unknown substances on their cuticle. The quantitative composition of the unknown compounds varied between parabiotic nests but was similar among the two species of a nest. They are probably produced in the Dufour glanf of Cr. modiglianii and transferred to their Ca. rufifemur partner. Possible transfer mechanisms include interspecific trophallaxis and ‘mounting behaviour’, where Cr. modiglianii climbed onto Ca. rufifemur workers without being displaced. Although the composition of the unknown compounds greatly varied between nests, they did not function as nestmate recognition cues since both species used hydrocarbons for nestmate recognition. However, the unknown compounds significantly reduced aggression in Ca. rufifemur. The ultimate, i.e. ecological and evolutionary aspects of my PhD research deal with potential costs and benefits that Cr. modiglianii and Ca. rufifemur may derive from the parabiotic association, their interactions with other species, and population genetic analyses. Additional studies on a trail-sharing association between three other ant species deal with two possible mechanisms that may cause or facilitate trail-sharing. Whether parabioses are parasitic, commensalistic, or mutualistic, is largely unknown and depends on the costs and benefits each party derives from the association. I therefore investigated food competition (as one of the most probable costs), differentiation of foraging niches (which can reduce competition), and several potential benefits of the parabiotic way of life. Besides, I studied interactions between the ant species and the hemiepiphyte Poikilospermum cordifolium. The foraging niches of the two species differed regarding foraging range, daily activity pattern, and food preferences. None of the two species aggressively displaced its partner species from baits. Thus, interference competition for food seemed to be low or absent. For both ant species, a number of benefits from the parabiotic lifestyle seem possible. They include interspecific trail-following, joint nest defence, provision of nest space by the partner species, food exchange via trophallaxis, and mutual brood care. If an ant species follows another species’ pheromone trails, it can reach food resources found by the other species. As shown by artificial extract trails, Ca. rufifemur workers indeed followed trails of Cr. modiglianii but not vice versa. Thus, Ca. rufifemur benefited from Cr. modiglianii’s knowledge on food sources (informational parasitism). In turn, Cr. modiglianii seemed to profit from nest defence by Ca. rufifemur. Ca. rufifemur majors are substantially larger than Cr. modiglianii workers. Although Cr. modiglianii often effectively defended the nest as well, it seemed likely that this species derived a benefit from its partner’s defensive abilities. In neotropical parabioses (ant-gardens), mutualistic epiphytes play an important role in providing nest space. The neotropical Camponotus benefits its Crematogaster partner by planting epiphyte seeds, for which Crematogaster is too small. Similarly, the Bornean parabioses often were inhabited by the hemiepiphyte Poikilospermum cordifolium (Barg.-Petr.) Merr (Cecropiaceae). P. cordifolium seedlings, saplings and sometimes larger indivi¬duals abundantly grew at the entrances of parabiotic nests. However, P. cordifolium provides no additional nest space and, apart from nutritive elaiosomes, perianths, and extrafloral nectar probably plays a less important role for the ants than the neotropical epiphytes. In conclusion, the parabiosis is probably beneficial to both species. The main benefits seem to be nest defence (for Cr. modiglianii) and interspecific trail-following (for Ca. rufifemur). However, Ca. rufifemur seems to be more dependent on its partner than vice versa. For both parabiotic species, I analyzed mitochondrial DNA of ants from different regions in Borneo. My data suggest that there are four genetically and chemically distinct, but closely related varieties of Camponotus rufifemur. In contrast, Crematogaster modiglianii showed high genetic differentiation between distant populations but was not differentiated into genetic or chemical varieties. This argues against variety-specific cocladogenesis between Cr. modiglianii and Ca. rufifemur, although a less specific coevolution of the two species is highly likely. In Bornean rainforests, trail-sharing associations of Polyrhachis (Polyrhachis) ypsilon Emery 1887 and Camponotus (Colobopsis) saundersi Emery 1889 are common and often include further species such as Dolichoderus cuspidatus Smith 1857. I investigated a trail-sharing association between these three species and studied two mechanisms that may cause or facilitate these associations: interspecific trail-following, i.e. workers following another species’ pheromone trail, and differential inter¬specific aggression. In trail-following assays, D. cuspidatus regularly followed extract trails of the other two species, thus probably parasitizing on their information on food sources. In contrast, only few P. ypsilon and Ca. saundersi workers followed hetero¬speci¬fic extract trails. Hence, the association between P. ypsilon and Ca. saundersi cannot be ex¬plained by foragers following heterospecific trails. In this case, trail-sharing may originate from few scout ants that do follow heterospecific pheromone trails and then lay their own trails. Interspecific aggression among P. ypsilon, Ca. saundersi and D. cuspidatus was strongly asymmetric, Ca. saundersi being submissive to the other two species. All three species discriminated between heterospecific workers from the same and a distant trail-sharing site. Thus, it seems likely that the species of a given trail-sharing site habituate to one another. Differential tolerance by dominant ant species may be mediated by selective habituation towards submissive species, and thereby influence the assembly of trail-sharing associations.
Morphologie und Organisation individueller oktopaminerger Neurone im Gehirn von Drosophila m.
(2009)
Das biogene Amin Oktopamin moduliert verschiedene Verhaltensweisen in Invertebraten. In verschiedenen Insektenspezies, wie Heuschrecken, Grillen oder Schaben, ist die Funktion und die Architektur des peripheren oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene bekannt. Um die zelluläre Grundlage für die verschiedenen Funktionen von Oktopamin im Zentralnervensystem zu verstehen, ist eine detaillierte Analyse der Architektur des zentralen oktopaminergen Systems notwendig. Innerhalb meiner Doktorarbeit fertigte eine anatomische Karte individueller oktopaminerger Neurone des adulten Hirns von Drosophila an. Ich nutzte die Flp-out Technik, um einzelne oktopaminerge Neurone anzufärben. Anhand ihrer Projektionsmuster konnte ich 28 verschiedene Zelltypen in vier Oktopamin-immunoreaktiven Zellclustern identifizieren. Ihre Morphologie sowie die Verteilung genetischer Marker zeigte, dass die meisten Zelltypen mehrere Neuropile innervieren und dabei eine klare Trennung von Prä- und Postsynaptischen Regionen aufweisen. Die Mehrheit der Zelltypen bildet dendritische Verzweigungen in einer bestimmten Region, der posterioren Slope. Jedoch innerviert jeder Zelltyp stereotyp eine bestimmte Kombination von Zielregionen im Gehirn. Das deutet stark darauf hin, dass oktopaminerge Neurone kombinatorisch organisiert sind: Jedes individuelle Neuron scheint Komponente eines spezifischen neuronalen Schaltkreises zu sein. Dabei könnte jeder Zelltyp eine Art “Modul” darstellen, das selektiv bestimmte Funktionen in den jeweiligen Zielregionen moduliert. Das oktopaminerge Mittelliniencluster des Subösophagealen Ganglions zeigt eine besondere zelluläre Organisation. Es besteht aus gepaarten und ungepaarten Neuronen, die des Zentralgehirn mit extensiven Verzweigungen versorgen. Um die Ordnung hinter dieser komplexen Organisation zu verstehen, wurden die segmentale Organistion der Mittellinienneurone auf Einzelzellebene analysiert und ihre embryonalen Anlagen verglichen. Letzteres ermöglichte die morphologische Analyse von einzelnen oktopaminergen Mittellinienklonen. OA-VPM und OA-VUM Neurone bilden zusammen drei Subcluster im Subösophagealen Ganglion, die wahrscheinlich die drei gnathalen Neuromere repräsentieren. Alle OA-VUM Neurone stammen von der embryonalen Mittellinie ab. In den mandibularen und maxillaren Neuromeren formen sie morphologisch identische Zelltypen, mit stereotypen Innervationsmustern. OA-VPM Neurone gehen nicht aus der embryonalen Mittellinie hervor und sind nicht segmental dupliziert. Diese Arbeit vermittelt nicht nur einen Eindruck über die Architektur individueller oktopaminerger Neurone, sondern auch über die Organisation des oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene.
In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen können im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, nämlich die Überlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im Überschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit überwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellulär gewachsene Bakterien über Bindung an paramagnetische Partikel („Beads“) und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gewählt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel  Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy – CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur für die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate für die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien während der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. Für einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen“ Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begründet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen Fällen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellulären Veränderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten übereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazelluläre posttranskriptionelle Mechanismen begründet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen.
The olfactory system of leafcutting ants: neuroanatomy and the correlation to social organization
(2009)
In leaf-cutting ants (genera Atta and Acromyrmex), the worker caste exhibits a pronounced size-polymorphism, and division of labor is largely dependent on worker size (alloethism). Behavioral studies have shown a rich diversity of olfactory-guided behaviors, and the olfactory system seems to be highly developed and very sensitive. To allow fine-tuned behavioral responses to different tasks, adaptations within the olfactory system of different sized workers are expected. In a recent study, two different phenotypes of the antennal lobe of Atta vollenweideri workers were found: MG- and RG-phenotype (with and without a macroglomerulus, MG). The existence of the macroglomerulus is correlated to the body size of workers, with small workers showing the RG-phenotype and large workers showing the MG-phenotype. In the MG, the information about the releaser component of the trail-pheromone is processed. In the first part of my PhD-project, I focus on quantifying behavioral differences between different sized workers in Atta vollenweideri. The study analyzes the trail following behavior; which can be generally performed by all workers. An artificial trail consisting of the releaser component of the trail-pheromone in decreasing concentration was used to test the trail-following performance of individual workers. The trail-following performance of the polymorphic workers is depended of the existence of the MG in the antennal lobe. Workers possessing the MG-phenotype were significantly better in following a decreasing trail then workers showing the RG-phenotype. In the second part I address the question if there are more structural differences, besides the MG, in the olfactory system of different sized workers. Therefore I analyze whether the glomerular numbers are related to worker size. The antennal lobes of small workers contain ~390 glomeruli (low-number; LN-phenotype), and in large workers I found a substantially higher number of ~440 glomeruli (high-number; HN-phenotype). All LN-phenotype workers and some of the small HN-phenotype workers do not possess an MG (LN-RG-phenotype and HN-RG-phenotype) at all, whereas the remaining majority of HN-phenotype workers do possess an MG (HN-MG-phenotype). Mass-stainings of antennal olfactory receptor neurons revealed that the sensory tracts divide the antennal lobe into six clusters of glomeruli (T1-T6). In the T4-cluster ~50 glomeruli are missing in the LN-phenotype workers. Selective staining of single sensilla and their associated receptor neurons showed that T4-glomeruli are innervated by receptor neurons from the main type of olfactory sensilla, the Sensilla trichodea curvata which are also projecting to glomeruli in all other clusters. The other type of olfactory sensilla, the Sensilla basiconica, exclusively innervates T6-glomeruli. Quantitative analyses revealed a correlation between the number of Sensilla basiconica and the volume of T6 glomeruli in different sized workers. The results of both behavioral and neuroanatomical studies in Atta vollenweideri suggest that developmental plasticity of antennal-lobe phenotypes promotes differences in olfactory-guided behavior which may underlie task specialization within ant colonies. The last part of my project focuses on the evolutionary origin of the macroglomerulus and the number of glomeruli in the antennal lobe. I compared the number, volumes and position of the glomeruli of the antennal lobe of 25 different species from all three major Attini groups (lower, higher and leaf-cutting Attini). The antennal lobes of all investigated Attini comprise a high number of glomeruli (257-630). The highest number was found in Apterostigma cf. mayri. This species is at a basal position within the Attini phylogeny, and a high number of glomeruli might have been advantageous in the evolution of the advanced olfactory systems of this Taxa. The macroglomerulus can be found in all investigated leaf-cutting Attini, but in none of the lower and higher Attini species. It is found only in large workers, and is located close to the entrance of the antennal nerve in all investigated species. The results indicate that the presence of a macroglomerulus in large workers of leaf-cutting Attini is a derived overexpression of a trait in the polymorphic leaf-cutting species. It presumably represents an olfactory adaptation to elaborate foraging and mass recruitment systems, and adds to the complexity of division of labor and social organization known for this group.
Fragmentation, deterioration, and loss of habitat patches threaten the survival of many insect species. Depending on their trophic level, species may be differently affected by these factors. However, studies investigating more than one trophic level on a landscape scale are still rare. In the present study we analyzed the effects of habitat size, isolation, and quality for the occurrence and population density of the endangered leaf beetle Cassida canaliculata Laich. (Coleoptera: Chrysomelidae) and its egg parasitoid, the hymenopteran wasp Foersterella reptans Nees (Hymenoptera: Tetracampidae). C. canaliculata is strictly monophagous on meadow sage (Salvia pratensis), while F. reptans can also parasitize other hosts. Both size and isolation of habitat patches strongly determined the occurrence of the beetle. However, population density increased to a much greater extent with increasing host plant density ( = habitat quality) than with habitat size. The occurrence probability of the egg parasitoid increased with increasing population density of C. canaliculata. In conclusion, although maintaining large, well-connected patches with high host plant density is surely the major conservation goal for the specialized herbivore C. canaliculata, also small patches with high host plant densities can support viable populations and should thus be conserved. The less specialized parasitoid F. reptans is more likely to be found on patches with high beetle density, while patch size and isolation seem to be less important.
The chick midbrain is subdivided into functionally distinct ventral and dorsal domains, tegmentum and optic tectum. In the mature tectum, neurons are organized in layers, while they form discrete nuclei in the tegmentum. An interesting characteristic of the embryonic brain is the development of a large optic tectum, of which the growth becomes obvious at embryonic day 3 (E3). Dorsoventral (DV) specification of the early midbrain should thus play a crucial role for the organization of the neuronal circuitry in optic tectum and tegmentum. In the first part of my thesis, I investigated regional commitment and establishment of cellular differences along the midbrain DV axis. I examined the commitment of gene expression patterns in isolated ventral and dorsal tissue in vivo and in vitro, and studied their cell mixing properties. Explant cultures, and grafting of dorsal midbrain into a ventral environment or vice versa, revealed a gradual increase in the autonomy of region-specific gene regulation between, which was accompanied by a gradual increase in differential adhesive properties from E2 to E3, once the DV axis polarity was fixed. These events happened at a time-point when the majority of midbrain cells are not yet differentiated. Long-term transplantation (6 - 9 days) using quail cells from ventral midbrain as grafts showed the same result. Hence, the results suggest that progressive specification of the midbrain DV axis is accompanied by progressively reduced cell mixing between dorsal and ventral precursors, leading to a partial regionalization of midbrain tissue into autonomous units of precursor cell populations. In the second part I investigated the genes that might be involved in regulating the growth of the tectum. In particular, I focused on the role of Pax7 transcription factor, a paired domain protein. The results suggested that Pax7 was involved in regulating the medial-lateral extension of the tectum. Over expression of Pax7 in dorsal midbrain led to an enlarged tectum accompanied by a raise in cell division, while Pax7 knockdown by shrank caused a reduction in tectum. The overall pattern of neuronal differentiation was not disturbed by an up or down regulation of Pax7. Pax7 also positively regulated Pax3, another pair-ruled gene expressed dorsally. These results suggest that Pax7 very likely together with Pax3 could facilitate or maintain neural cell proliferation in the midbrain at early stages and that a regulation of the size in that region does not influence the neuronal patterning of the developmental field. I further checked the expression and function of a GFPase Rab 23, that was suggested to be involved in the DV patterning in mouse neural tube as a negative regulator of Shh signaling. Overexpression of Rab23 indicated that it facilitated the expression of Pax7 and Pax3 in the neural tube and suppressed ventral genes like Nkx6.1 cell autonomously, however, it did not disturb neuronal patterning. Interestingly, a thorough expression study of Rab 23 during chick early development revealed that Rab23 is already expressed very early and asymmetrically during gastrulation, suggesting a possible role of Rab23 on the left-right determination of Hensen’s node. In combination with the result that Rab23 is expressed in the notochord early in development, I assume that both Rab23 and Shh exist in all neural progenitor cells initially, and when their expression patterns separate gradually the neural cells adopt a ventral or dorsal fate according to their location along the dorsoventral axis. The avian embryo is a classic system used widely to investigate questions of vertebrate development. The easy and cheap accessibility of the embryo for in ovo or ex ovo experiments all around the year make it an ideal animal model to work with. The only recently developed method of over expressing genes in specific cells or regions in the chick embryo by electroporation enabled me to study different ways of gene suppression using this way of gene transfection. Thus, I compared the effect of long-hairpin and short hairpin dsRNA in different vectors and antisense morpholino oligonucleotides. The results revealed that all hairpin dsRNA constructs did reduce gene and protein expression often accompanied by morphological changes. Most efficiently were shRNAi constructs cloned into a siRNA-specific vector – pSilencer 1.0-U6. Gene silencing was already well observed 36 hours after transfection. In comparison antisense morpholino oligonucleotides did not show such big gene reduction as the shRNA in pSilencer. Taken together, this methodical research proposes that the shRNA in the pSilencer vector was a good and effective tool to reduce gene and protein expression locally.
Die vorliegende Dissertation beschreibt detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten. Für die beiden pathogenen Vertreter sind bereits impermebable Zellwandstrukturen beschrieben worden (Daffe et al., 1993; Rodriguez-Torres et al., 1993). Für Streptomyces Arten ist keine vergeichbare, definierte äußere Zellwandbarriere bekannt. Im Fall von S. griseus konnten dennoch undefinierte, kovalente Lipidverknüpfungen mit der Peptidoglykanschicht nachgewiesen werden (Kim et al., 2001). Daher besteht die Notwendigkeit des Transports von Nährstoffen und anderer Moleküle auch bei Streptomyces Arten durch porenformende Proteine, so genannte Porine. Unter Porinen versteht man wassergefüllte Kanäle, die in zwei Klassen unterteilt werden können: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Allgemeine Diffusionsporen filtern entsprechend der molekularen Masse der gelösten Substrate und weisen ein lineares Verhältnis zwischen Translokationsrate und Substratkonzentrationsgradient auf. Dagegen kann der Transport bestimmter Substanzen durch spezifische Porine mit einer Substrat-Bindestelle im Kanal durch die Michaelis-Menten-ähnliche Kinetik beschrieben werden. Diese Kanäle ermöglichen den schnellen Influx bestimmter Klassen von Substraten.
Around 10.000 – 150.000 endogenous DNA damage-induced lesions occur in a human body per day and cell. Accumulation of unrepaired lesions can lead to aneuploidy and the loss of genomic integrity which in turn contributes to tumor formation. Therefore, an efficient DNA damage response has to be initiated, in the end leading to cell cycle inhibition and induction of repair. Since it is known that a recently characterized human multiprotein complex named LINC (or human dREAM) together with B-MYB is involved in the regulation of G2/M gene expression (Plk1, cyclin B1, cdc2 etc.), its function in the DNA damage response was analyzed in this study. In growing cells B-MYB is associated to the LIN core complex which consists of 5 different proteins named LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 and RbAp48. After induction of DNA damage B-MYB leaves the complex and binding of E2F4 and p130 to LINC is induced. Importantly, the upstream pathway leading to LINC rearrangement is dependent on the activation of p53 and p21. Interestingly, p53 -/- cells solely have the potential to block in the G2 phase of the cell cycle, thereby making them vulnerable for errors during G2 arrest induction or maintenance. Here I demonstrate that LINC rearrangement is absent in p53 -/- cells and that B-MYB/LINC binding to target gene promoters is increased. This in turn leads to an increased G2/M gene expression after DNA damage induction and triggers premature cell cycle re-entry (checkpoint adaptation). Significantly, B-MYB expression is increased in p53 mutated primary breast cancer tumors and correlates with poor prognosis and reoccurrence probably due to its function in checkpoint adaptation. This study gives evidence that inhibition of B-MYB gene expression or B-MYB function in p53 mutant tumors could be a good choice for adjuvant therapy.
Die Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch äußerst heterogene, autosomal rezessiv und X-chromosomal vererbte Erkrankung dar. Sie ist gekennzeichnet durch chromosomale Instabilität, ein chronisch progredientes Knochenmarkversagen, multiple kongenitale Fehlbildungen und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Auf zellulärer Ebene ist die FA durch eine erhöhte spontane Chromosomenbrüchigkeit sowie einer Hypersensitivität gegenüber DNA-schädigenden Agenzien charakterisiert. Bislang konnten 13 Komplementations-gruppen (FA-A bis FA-N) und ihre jeweiligen Gene identifiziert werden. Die FA-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrang-brüchen. Die breite genetische Heterogenität der Fanconi Anämie und die große Anzahl privater Mutationen, aufgrund derer kaum interindividuelle Vergleiche möglich sind, erschweren eine Genotyp-Phänotyp Korrelation ebenso wie der compound-heterozygote Mutationsstatus vieler FA-Patienten. Bisherige Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Art der jeweiligen Mutation einen größeren Einfluß auf die phänotypische Ausprägung der Erkrankung hat als die Art des betroffenen Gens. Zusätzlich zeichnet die Fanconi Anämie eine große phänotypische Variabilität aus, die sich in höchst unterschiedlichen Krankheitsausprägungen und –verläufen äußert. Um aussagekräftige Genotyp-Phänotyp Korrelationen etablieren zu können, bedarf es einer ausreichenden Anzahl von FA-Patienten, bei denen sowohl die Komplementationsgruppe als auch die zugrunde liegende Mutation eindeutig definiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden exemplarisch die Krankheitsverläufe einiger Patienten (4 x FA-A, 1 x FA-B, 3 x FA-C, 1 x FA-D2 und 2 x FA-G) analysiert und mit den jeweiligen molekulargenetischen Befunden korreliert. Im Anschluss daran wurden in der Literatur beschriebene Genotyp-Phänotyp Korrelationen erläutert, verschiedene Mechanismen der phänotypischen Variabilität dargestellt und abschließend prägnante Kasuistiken nochmals hervorgehoben.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der monoklonale Antikörper IV´D4 biochemisch charakterisiert und die zelluläre Verteilung des Antigens mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Durch elektronenmikroskopische Lokalisierungsexperimente wurde gezeigt, dass es sich dabei um Nuage handelt. Obwohl der Antikörper eine oozytenspezifische Struktur markierte, färbte er in der Immunfluoreszenz überraschenderweise auch somatische Xenopus Kulturzellen (A6 und XTC) an. Als nächstes wurde das Antigen von IV´D4 und damit eine neue Proteinkomponente der Nuage identifiziert. Durch Immunblots von prävitellogenen Oozyten und Expression rekombinanter Proteine wurde festgestellt, dass der Antikörper das Protein 42Sp50 erkennt. Es war nicht auszuschließen, dass die Nuage lediglich die somatischen EF1A-Isoformen akkumulieren. Tatsächlich werden alle drei EF1A-Isoformen in Oozyten exprimiert, wie RT-PCR-Experimente belegten. Die ubiquitäre Expression und hohe Sequenzverwandtschaft der beiden traditionellen Xenopus EF1A-Isoformen mit denen der Säuger veranlassten uns, die Nomenklatur anzugleichen (Xenopus EF1A-1 für EF1A-S und EF1A-2 für EF1A-O). Durch Mikroinjektion entsprechender mRNAs wurden Fluoreszenz-EF1A Fusionsproteine (gekoppelt an EGFP, monomeres DsRed oder monomeres RFP) in lebenden Oozyten exprimiert und lokalisiert. Neben 42Sp50 wurde auch die zweite Proteinkomponente der 42S Partikel, 42Sp43, in Form von fluoreszierenden Fusionsproteinen in Oozyten exprimiert und lokalisiert. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Dynamik der Nuage untersucht. Dazu wurden Versuche mit verschiedenen Inhibitoren durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob die Hemmung unterschiedlicher zellulärer Prozesse Einfluss auf die strukturelle Organisation der Nuage hat. Zu Beginn der Arbeit lagen keine Kenntnisse darüber vor, in welchem Zellkompartiment das Assembly der 42S RNPs stattfindet. Zunächst wurden deshalb die beiden Proteine 42Sp50 und 42Sp43 als fluoreszierende Fusionsproteine in prävitellogenen Ooyzten koexprimiert. Ein eindeutiger Nachweis der spezifischen Interaktion zwischen 42Sp43 und 42Sp50 gelang insbesondere durch die transiente Expression der entsprechenden fluoreszenzmarkierten Proteinpaare in somatischen Kulturzellen (Xenopus A6 und Säuger COS-7 Zellen). Die hier beschriebene Koexpression von Proteinpaaren mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen in Säugerzellen stellt eine einfache Methode dar, um in vivo Interaktionen mikroskopisch sichtbar zu machen. Damit sollte es möglich sein, durch gezielte Mutationen und Deletionen von 42Sp50 und 42Sp43 diejenigen Aminosäuren und strukturellen Determinanten zu identifzieren, die bei der spezifischen Interaktion und damit beim Assembly der 42S Partikel eine Rolle spielen.
Im Jahre 2004 wurden in unserem Labor zwei Gene einer neuen Proteinfamilie kloniert, deren Charakterisierung seither im Gange ist. Das eine Protein, VKORC1, konnte durch Mutationsanalysen und biochemische Untersuchungen als eine zentrale Komponente des so genannten Vitamin K-Zyklus identifiziert werden. Vitamin K wird für die γ-Carboxylierung der Vitamin K-abhängigen Proteine wie z.B. der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X als Cofaktor der γ-Glutamyl-Carboxylase benötigt. Da Vitamin K essentiell ist, wird seine Epoxidform vom Organismus wieder in eine physiologisch aktive Hydrochinon-Form überführt. Für diese Reaktion wird die Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1) benötigt. Mutationen in VKORC1 führen einerseits zu einem erblich bedingten Mangel an Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren vom Typ 2 (VKCFD2) mit starken Blutungen durch eine nicht oder nur unvollständig ablaufende Blutgerinnung. Das VKORC1 ist andererseits auch das Ziel von Medikamenten der Coumaringruppe, der sog. Vitamin K-Antagonisten, die zur Verhinderung einer unzeitigen Gerinnung eingesetzt werden. In höheren Dosen wird diese Substanzklasse als Rattenbekämpfungsmittel eingesetzt. Bei manchen Rattenpopulationen, aber auch bei einigen Patienten, ist die Wirksamkeit der Coumarine durch bestimmte Mutationen im VKORC1-Protein, welche eine Warfarinresistenz hervorrufen, erheblich eingeschränkt. Zu diesem VKORC1 existiert ein paraloges Protein, das Vitamin K-Epoxid-Reduktase Komplex 1-like 1 Protein (VKORC1L1), dessen Funktion bislang unbekannt ist und welches Gegenstand der vorliegenden Arbeit war. Es wurden unterschiedliche Methoden angewandt, um das VKORC1L1-Protein zu charakterisieren und seine mögliche Funktion(en) aufzuklären. Zum einen sollte die Herstellung einer Knockout-Maus dazu dienen, durch den erhaltenen Phänotyp Hinweise auf die mögliche physiologische Aufgabe zu erhalten. Allerdings gelangten die Versuche nur bis zur Generierung der Chimären, so dass dieses Teilprojekt nicht zum Abschluss gebracht werden konnte. Die biochemische Charakterisierung des Proteins zeigte eine Expression des VKORC1L1-Gens in allen untersuchten Geweben, wobei keine starke Expression für ein bestimmtes Gewebe ermittelt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass das Protein Vitamin K-Epoxid auf gleiche Weise wie das VKORC1 recyceln kann und durch Warfarin gehemmt wird. Einige der in eingeführten VKORC1L1 Mutationen vermitteln darüber hinaus eine Warfarinresistenz. Des Weiteren wurden Enzymkinetiken für die Spezies Maus und Ratte sowie für die Stachelmaus erstellt. Die erhaltenen Werte für die Michaelis-Menten-Konstante und die Maximalgeschwindigkeit sind untereinander sehr ähnlich und sprechen für eine Oxido-Reduktase-Aktivität des VKORC1L1-Proteins. Bioinformatische Analysen konzentrierten sich auf die Aufklärung von konservierten Aminosäureresten im VKORC1L1. Dadurch konnten funktionell wichtige Positionen des Proteins ermittelt werden. Ein evolutiver Stammbaum konnte weiterhin zeigen, dass die paralogen Proteine VKORC1 und VKORC1L1 sehr wahrscheinlich aus einem gemeinsamen Vorläuferprotein bei der Entwicklung der Wirbeltiere aus einer Duplikation entstanden sind und nach der Entstehung der Landwirbeltiere ihre spezifischen Funktionen ausgebildet haben. Ein Homologievergleich zwischen den humanen Chromosomen 7 und 16 und den jeweiligen Chromosomen verschiedener Spezies zeigte, dass sich nach der Duplikation die Gene für das VKORC1 und das VKORC1L1 bei fast allen betrachteten Spezies unabhängig voneinander auf verschiedenen Chromosomen evolutiv entwickelt haben. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass die Duplikation schon sehr lange zurück liegt.
Bakterien sind in der Lage, sich schnell an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung von verschiedensten Umweltreizen und der zellulären Antwort spielt die Genregulation durch Zweikomponenten-Systeme. Gut charakterisiert ist das ArsRS Zweikomomponenten-System in H. pylori, welches an der Ausbildung der Säureresistenz beteiligt ist und dem Bakterium so die Kolonisierung der Magenschleimhaut ermöglicht. Die Histidin-Kinase ArsS wird in Gegenwart von Säure aktiviert und phosphoryliert den Response-Regulator ArsR, der die Transkription von Target-Genen reguliert. In der periplasmatischen Sensordomäne der Histidin-Kinase ArsS sind sieben Histidinreste vorhanden, die aufgrund ihres pKa-Wertes von 6,0 bei Absenken des pH Wertes von pH 7 auf pH 5, was eine Aktivierung der Histidin-Kinase zur Folge hat, protoniert werden könnten. Es konnte gezeigt werden, dass der Histidinrest H94 der periplasmatischen Sensordomäne einen wesentliche Rolle bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS spielt. Die Einführung einer positiv geladenen AS an dieser Position allein reicht jedoch nicht aus, um die Kinase zu aktivieren, weshalb unklar bleibt, ob eine Protonierung des Histidinrestes H94 in vivo die Säurewahrnehmung vermittelt. Weiterhin konnten Indizien darauf erhalten werden, dass neben dem Histidinrest H94 noch weitere Aminosäuren an der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase beteiligt sind. Der Aspartatrest D124 leistet unter den negativ geladenen AS vermutlich den größten Beitrag zur Säurewahrnehmung. In den mit H. pylori nahe verwandten Arten Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes und Campylobacter jejuni sind Orthologe zu dem ArsRS Zweikomponenten-System vorhanden. Um zu untersuchen, ob es sich bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS um eine spezifische Anpassung von H. pylori an sein Habitat handelt oder ob Säure einen allgemeinen Stimulus der ArsS-orthologen Kinasen darstellt, wurden Mutanten im genetischen Hintergrund von H. pylori G27 konstruiert, in welchen die Histidin-Kinase ArsS durch die orthologen Kinasen HH1608, CJ1262 und WS1818 substituiert wurde. Durch Transkriptionsstudien konnte gezeigt werden, dass die Kinase WS1818 eine gesteigerte Aktivität bei saurem pH-Wert aufweist. Auch die Kinase HH1607 kann Säure als einen Umweltreiz wahrnehmen, jedoch deutlich weniger effektiv als die Kinasen ArsS und WS1818. Ob die Zweikomponenten-Systeme HH1608/HH1607 und WS1817/WS1818 in vivo in H. hepaticus und W. succinogenes an der Wahrnehmung von Säure und evtl. an der Ausbildung einer Säureresistenz beteiligt sind, ist unklar, da über die Funktion dieser Zweikomponenten-Systeme bisher nichts bekannt ist. Die Kinase CJ1262 ist nicht in der Lage, Säure als einen Umweltreiz wahrzunehmen. Die beiden Response-Regulatoren HP1043 und HP1021 spielen vermutlich eine Rolle bei der Regulation von Genen, deren Produkte eine wichtige Funktion für das vegetative Zellwachstum haben. Die Aktivität der beiden RR wird entgegen dem gängigen Zweikomponenten-System-Paradigma nicht über eine Phosphorylierung moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob eine strikte Expressionskontrolle für die wachstumsassoziierten Funktion dieser Response-Regulatoren von Bedeutung ist. Zu diesem Zweck wurden verschieden Mutanten konstruiert, in welchen die Transkription der Gene hp1021 und hp1043 unter der Kontrolle von unterschiedlich regulierten Promotoren stattfindet. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Gens hp1043 sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell und/oder posttranslational strikt reguliert wird. Es kann deshalb postuliert werden, dass die Aktivität des RR HP1043 über die vorhandene Konzentration an Regulator in der Bakterienzelle beeinflusst wird. Die Expression des Gens hp1021 wird nicht strikt reguliert. Auf welche Weise die Aktivität des RR HP1021 moduliert wird, bleibt unklar.
Background: Male killing endosymbionts manipulate their arthropod host reproduction by only allowing female embryos to develop into infected females and killing all male offspring. Because the resulting change in sex ratio is expected to affect the evolution of sex-specific dispersal, we investigated under which environmental conditions strong sex-biased dispersal would emerge, and how this would affect host and endosymbiont metapopulation persistence. Results: We simulated host-endosymbiont metapopulation dynamics in an individual-based model, in which dispersal rates are allowed to evolve independently for the two sexes. Prominent male-biased dispersal emerges under conditions of low environmental stochasticity and high dispersal mortality. By applying a reshuffling algorithm, we show that kin-competition is a major driver of this evolutionary pattern because of the high within-population relatedness of males compared to those of females. Moreover, the evolution of sex-specific dispersal rescues metapopulations from extinction by (i) reducing endosymbiont fixation rates and (ii) by enhancing the extinction of endosymbionts within metapopulations that are characterized by low environmental stochasticity. Conclusion: Male killing endosymbionts induce the evolution of sex-specific dispersal, with prominent male-biased dispersal under conditions of low environmental stochasticity and high dispersal mortality. This male-biased dispersal emerges from stronger kin-competition in males compared to females and induces an evolutionary rescue mechanism.
Many organisms show polymorphism in dispersal distance strategies. This variation is particularly ecological relevant if it encompasses a functional separation of short- (SDD) and long-distance dispersal (LDD). It remains, however, an open question whether both parts of the dispersal kernel are similarly affected by landscape related selection pressures. We implemented an individual-based model to analyze the evolution of dispersal traits in fractal landscapes that vary in the proportion of habitat and its spatial configuration. Individuals are parthenogenetic with dispersal distance determined by two alleles on each individual‘s genome: one allele coding for the probability of global dispersal and one allele coding for the variance of a Gaussian local dispersal with mean value zero. Simulations show that mean distances of local dispersal and the probability of global dispersal, increase with increasing habitat availability, but that changes in the habitat's spatial autocorrelation impose opposing selective pressure: local dispersal distances decrease and global dispersal probabilities increase with decreasing spatial autocorrelation of the available habitat. Local adaptation of local dispersal distance emerges in landscapes with less than 70% of clumped habitat. These results demonstrate that long and short distance dispersal evolve separately according to different properties of the landscape. The landscape structure may consequently largely affect the evolution of dispersal distance strategies and the level of dispersal polymorphism.
Gene and genome duplications are major mechanisms of eukaryotic genome evolution. Three rounds of genome duplication have occurred in the vertebrate lineage, two rounds (1R, 2R) during early vertebrate evolution and a third round, the fish-specific genome duplication (FSGD), in ray-finned fishes at the base of the teleost lineage. Whole genome duplications (WGDs) are considered to facilitate speciation processes and to provide the genetic raw material for major evolutionary transitions and increases in morphological complexity. In the present study, I have used comparative genomic approaches combining molecular phylogenetic reconstructions, synteny analyses as well as gene function studies (expression analyses and knockdown experiments) to investigate the evolutionary consequences and significance of the three vertebrate WGDs. First, the evolutionary history of the endothelin signaling system consisting of endothelin ligands and receptors was reconstructed. The endothelin system is a key component for the development of a major vertebrate innovation, the neural crest. This analysis shows that the endothelin system emerged in an ancestor of the vertebrate lineage and that its members in extant vertebrate genomes are derived from the vertebrate WGDs. Each round of WGD was followed by co-evolution of the expanding endothelin ligand and receptor repertoires. This supports the importance of genome duplications for the origin and diversification of the neural crest, but also underlines a major role for the co-option of new genes into the neural crest regulatory network. Next, I have studied the impact of the FSGD on the evolution of teleost pigment cell development and differentiation. The investigation of 128 genes showed that pigmentation genes have been preferentially retained in duplicate after the FSGD so that extant teleost genomes contain around 30% more putative pigmentation genes than tetrapods. Large parts of pigment cell regulatory pathways are present in duplicate being potentially involved in teleost pigmentary innovations. There are also important differences in the retention of duplicated pigmentation genes among divergent teleost lineages. Functional studies of pigment synthesis enzymes in zebrafish and medaka, particularly of the tyrosinase family, revealed lineage-specific functional evolution of duplicated pigmentation genes in teleosts, but also pointed to anciently conserved gene functions in vertebrates. These results suggest that the FSGD has facilitated the evolution of the teleost pigmentary system, which is the most complex and diverse among vertebrates. In conclusion, the present study supports a major role of WGDs for phenotypic evolution and biodiversity in vertebrates, particularly in fish.
Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden.
In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivität entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repräsentation der Duftidentität und der Duftintensität untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente führten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivitätsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivitätsmuster der präsentierten Düfte zeigten interessanterweise einen hohen Ähnlichkeitsgrad, wohingegen andere unähnlich waren. In höheren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzkörper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilität der duftevozierten Aktivitätsmuster vor, was generelle Interpretationen unmöglich macht und höchstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zulässt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie prä- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erhöhung der Konzentration der verschiedenen präsentierten Düfte über einen Bereich von mindestens drei Größenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzkörper-Calyx und der Pilzkörper-Loben ist diese Konzentrationsabhängigkeit weniger deutlich ausgeprägt und im Falle der Loben nur für bestimmte Düfte detektierbar. Eine Bestätigung des postulierten „sparsed code“ der Duftpräsentation in den Pilzkörpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was möglicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellauflösung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabhängigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verstärkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz für einen aversiven Reiz führte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Gedächtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz für einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Gedächtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren.
Von TRAIL, FasL und APRIL, drei Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie, ist bekannt, dass Trimerstabilität und Oligomerisierungsstatus maßgeblich das Rezeptoraktivierungspotential dieser Liganden beeinflussen. Für die immunstimulatorischen TNF-Liganden CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL und GITRL war hingegen vor der Durchführung dieser Arbeit praktisch nicht bekannt, inwieweit Trimerbildung, Stabilisierung und Oligomerisierung wichtig für deren Aktitvität sind. Dies wurde in dieser Arbeit systematisch untersucht. CD40L besaß bereits als trimeres Molekül eine hohe Aktivität, die durch sekundäre Oligomerisierung nur wenig gesteigert wurde. Die spezifische Aktivität konnte durch Stabilisierung mit Hilfe der Tenascin-C (TNC)-Trimerisierungsdomäne nur geringfügig gesteigert werden. CD27L war als lösliches Flag-markiertes sowie als hexameres Fc-Protein selbst nach Quervernetzen nicht in der Lage, seinen Rezeptor CD27 zu binden und zu aktivieren. Die TNC-stabilisierte trimere Form des CD27L hingegen induzierte nach Oligomerisierung mit einem anti-Flag-Antikörper ein starkes Signal. Trimerer OX40L und trimerer 41BBL konnten nur in oligomerisierter Form ihre Rezeptoren aktivieren, wobei die Aktivität der TNC-stabilisierten Form signifikant stärker ausgeprägt war. GITRL aktivierte seinen Rezeptor bereits als stabilisiertes Trimer und Hexamer, die Aktivität konnte durch Quervernetzen nur gering gesteigert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass CD27L, OX40L und 41BBL zu der Untergruppe der TNF-Ligandenfamilie gehört, für die eine Stabilisierung des trimeren Moleküls und dessen Oligomerisierung nötig sind, um eine starke Rezeptoraktivierung zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu zeigten CD40L und GITRL bereits oligomerisierungsunabhängig eine hohe Aktivität. GITRL benötigte allerdings die Stabilisierung des trimeren Moleküls durch die TNC-Domäne, um gute Aktivität zu zeigen. Im Weiteren wurden Antikörperfragment (scFv-)-TNF-Ligand-Fusionsproteine konstruiert und untersucht, die ein Zelloberflächenantigen binden. Eine starke Zelloberflächenantigen-spezifische Aktivierung des jeweiligen Rezeptors konnte für scFv-41BBL und für scFv-OX40L gezeigt werden, wohingegen scFv-CD40L und scFv-GITRL bereits auf antigennegativen Zellen stark aktiv waren. scFv-CD27L war selbst auf antigenpositiven Zellen inaktiv. Verwendet man an Stelle des Antikörperfragments eine extrazelluläre Proteinbindedomäne, z.B. die eines TNF-Rezeptors, erhält man Fusionsproteine, die zum einen eine selektive Aktivierung der TNF-Ligandendomäne und somit die Aktivierung des korrespondierenden Rezeptors auf der Zielzelle ermöglichen, zum anderen aber durch die Bindung an den membranständigen Liganden dessen Aktitvät neutralisieren können. Für CD40-, RANK- und B7-2-FasL konnte der immobilisationabhängige Aktivierungseffekt auf entsprechenden Zelloberflächenmolekül-exprimierenden Zellen gezeigt werden. Anhand von T47D-Zellen, die durch eine autokrine CD40L-CD40-Signalschleife vor Apoptose geschützt sind, konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von CD40-FasL an membranständigen CD40L die CD40L-CD40-Interaktion gestört und gleichzeitig Apoptose verstärkt induziert werden kann. Das Prinzip der antigenabhängigen Aktivierung von TNF-Liganden könnte Anwendung in der Tumortherapie finden, da bei Verwendung entsprechender selektiv exprimierter Marker eine lokale Rezeptoraktivierung erreicht und so Nebenwirkungen minimiert werden können.
Chlamydia are Gram-negative obligate intracellular bacteria responsible for a wide spectrum of relevant diseases. Due to their biphasic developmental cycle Chlamydia depend on an intact host cell for replication and establishment of an acute infection. Chlamydia have therefore evolved sophisticated strategies to inhibit programmed cell death (PCD) induced by a variety of stimuli and to subvert the host immune system. This work aimed at elucidating whether an infection with C. trachomatis can influence the cellular response to double-stranded RNA (dsRNA). The synthesis of dsRNA is a prominent feature of viral replication inside infected cells that can induce both PCD and the activation of a cellular innate immune response. In order to mimic chlamydial and viral co-infections, Chlamydia-infected cells were transfected with polyinosinic:polycytidylic acid (polyI:C), a synthetic dsRNA. In the first part of this work it was investigated whether C. trachomatis-infected host cells could resist apoptosis induced by polyI:C. A significant reduction in apoptosis, determined by PARP cleavage and DNA fragmentation, could be observed in infected cells. It could be shown that processing of the initiator caspase-8 was inhibited in infected host cells. This process was dependent on early bacterial protein synthesis and was specific for dsRNA because apoptosis induced by TNFalpha was not blocked at the level of caspase-8. Interestingly, the activation of cellular factors involved in apoptosis induction by dsRNA, most importantly PKR and RNase L, was not abrogated in infected cells. Instead, RNA interference experiments revealed the crucial role of cFlip, a cellular caspase-8 inhibitor, for chlamydial inhibition of dsRNA-induced apoptosis. First data acquired by co-immunoprecipitation experiments pointed to an infection-induced concentration of cFlip in the dsRNA-induced death complex of caspase-8 and FADD. In the second part of this work, the chlamydial influence on the first line of defense against viral infections, involving expression of interferons and interleukins, was examined. Activation of the interferon regulatory factor 3 (IRF-3) and the NF-kappaB transcription factor family member p65, both central regulators of the innate immune response to dsRNA, was altered in Chlamydia-infected epithelial cells. polyI:C-induced degradation of IkappaB-alpha, the inhibitor of NF-kappaB, was accelerated in infected cells which was accompanied by a change in nuclear translocation of the transcription factor. Translocation of IRF-3, in contrast, was significantly blocked upon infection. Together the data presented here demonstrate that infection with C. trachomatis can drastically alter the cellular response to dsRNA and imply an impact of chlamydial infections on the outcome of viral super-infections.
Mechanismen zur Regulierung der Nestgröße während des Koloniewachstums bei Blattschneiderameisen
(2009)
Die Strukturen der Ameisennester, so wird seit einiger Zeit vermutet, entstehen aufgrund eines selbstorganisierten Prozesses, bei dem die einzelne Ameise nur über lokale Informationen verfügt, ohne eine Übersicht über das globale Muster zu haben. Die Gesamtstruktur resultiert demnach viel eher durch multiple Interaktionen, die entweder direkt zwischen den Individuen oder zwischen den Individuen und ihrer Umgebung stattfinden. Ziel dieser Arbeit war es, die Kriterien zu untersuchen, nach denen sich die Blattschneiderameisen während des Nestbaus richten, um so die Frage zu beantworten, ob es für die Entstehung der Strukturen nur der Interaktion mit der Umgebung bedarf oder ob direkte soziale Interaktionen auch einen Einfluss darauf haben. Betrachtet wurde dazu die Kontrolle der Nestgröße während verschiedener Stadien der Kolonieentwicklung: in der Gründungsphase, in der die Königin die Entscheidungen alleine und ohne soziale Interaktionen fällt; in der darauf folgenden Etablierungsphase, in der Arbeiterinnen entweder alleine oder in kleinen Gruppen die bereits existierenden Strukturen verändern; sowie im adulten Stadium, in der die Bautätigkeit von mehreren Tausend Arbeiterinnen ausgeführt werden kann. Königinnen graben unverzüglich nach dem Hochzeitsflug ein Gründungsnest, das aus einem vertikalen Tunnel und einer horizontalen Kammer besteht, in welcher die erste Brut und der Pilz gezüchtet werden. Um ein Gründungsnest zu graben, muss die Königin zuerst mit ihren Mandibeln kopfüber am Boden graben. Hierbei legt sie einen Tunnel an, der einen etwas größeren Durchmesser als sie selbst besitzt. Ist dann die gewünschte Tunnellänge erreicht, so wechselt sie vom vertikalen Tunnel zum horizontalen Kammergraben, worauf anschließend der Tunnel verschlossen wird. Die Frage, die sich nun stellt, ist, wie Atta vollenweideri Königinnen die Länge des Tunnels bewerten, um den Wechsel zum Kammergraben einzuleiten. Aufgrund der Ergebnisse wird angenommen, dass die Königinnen sowohl die Länge des Tunnels, wahrscheinlich über Propriozeption, als auch die Grabezeit abschätzen und mit einer internen Referenz vergleichen. Wurde demnach weder die erwartete Länge noch die maximal schon investierte Zeit erreicht, so fuhren die Königinnen fort den Tunnel zu verlängern. Der Wechsel vom Tunnel zum Kammergraben wurde dann eingeleitet, wenn die Königinnen, in Abhängigkeit von den jeweiligen Bodenbedingungen, entweder zuerst die erwartete Länge oder die zu investierende Zeit erreicht hatten. Daraufhin fingen sie an die Kammer zu bauen, wobei sie die nun ausgegrabenen Lehmpartikel dazu benutzten, den Tunnel zu verschließen. Diese wurden von oben bis unten komplett verschlossen, womit die Kammergrößen von den Tunnellängen abhängig waren. Wurden die Königinnen jedoch mit Tunneln konfrontiert, die experimentell über die erwartete Länge hinaus verlängert wurden, so wurden diese nicht mehr über die komplette Strecke, sondern in mehreren Teilabschnitten verschlossen. Dies deutet darauf hin, dass bei der Regulierung der Kammergröße ein weiterer Mechanismus involviert ist. Nach 2-3 Monaten schlüpfen in der Regel die ersten Arbeiterinnen, womit die Kolonie in die Wachstumsphase eintritt. Mit dem Wachsen der Kolonie wird das Gründungsnest verändert, wobei die Arbeiterinnen die bereits existierende Pilzkammer vergrößern und neue Tunnel anlegen. Nach welchen Kriterien sie sich dabei richten, war allerdings nicht bekannt. Gezeigt werden konnte, dass Acromyrmex lundi Arbeiterinnen anfangen ein Nest zu vergrößern, wenn sich der frei für die Ameisen zur Verfügung stehende Platz innerhalb des Nestes reduziert und dass sie aufhören, wenn wiederum genügend Platz vorhanden ist. Eine Zunahme in der Gruppengröße (1, 2, 6 und 12 Tiere) bewirkte somit, einen proportionalen Anstieg des ausgegrabenen Volumens und damit der Arbeitsleistung der Kolonie. Ob beim Graben aber eher die schon vorhandenen Pilzkammer vergrößert oder neue Tunnel angelegt werden, hing von der Stimuluskombination ab. So bewirkte ein Platzmangel, ausgelöst durch eine, relativ zur Nestgröße, große Zahl an Arbeiterinnen, das bereits existierende Tunnel verlängert oder neue angelegt wurden. Eine Kammervergrößerung konnte dagegen nur beobachtet werden wenn Pilz vorhanden und der Platz in der Kammer reduziert war. Die Arbeiterinnen reagierten dabei, auf dieselben Stimuli mit denselben Verhaltensmustern, unabhängig davon ob sie alleine oder in einer Gruppe gruben. Je mehr Ameisen sich aber in der Gruppe befanden desto mehr wurden die Kammern zunächst vergrößert, wobei sich jedoch keine Korrelation mit der Gruppengröße zeigte. Dies lässt darauf schließen, dass die Vergrößerung von den sich gleichzeitig am Graben beteiligenden Ameisen abhängt, die die Kammern so lange vergrößern bis genügend Platz vorhanden ist. Die Zahl der Ameisen die sich jedoch am Graben beteiligen nimmt mit steigender Gruppengröße zu, weswegen die Kammern bei großen Ameisenzahlen größer wurden. Gleichzeitig mit dem Vergrößern fingen die Ameisen jedoch an ausgegrabene Lehmpartikel in der Kammer zu deponieren. Dies bewirkte, dass vor allem größere Kammern im Nachhinein verkleinert wurden, bis ein bestimmter Abstand zum Pilz erreicht war, bei dem eventuell zwei Ameisen aneinander vorbeilaufen konnten. Somit hatte die Einlagerung der Lehmpartikel in der Kammer zur Folge, dass die Kammergröße im Nachhinein besser dem Pilzvolumen angepasst wurde. Ähnlich wie bei der Kammervergrößerung verhielt es sich beim Anlegen der Tunnel. Auch diese wurden umso breiter je mehr Tiere sich gleichzeitig am Graben beteiligten und wurden dann im Nachhinein durch Einlagerung von Lehmpartikeln auf eine bestimmte Breite reduziert. Zusätzlich wurden die Tunnel aber auch umso länger je mehr Ameisen sich in der Gruppe befanden, weshalb die Nestgröße über die Größe der Gruppe reguliert wurde. Acromyrmex lundi Nester bestehen in der Regel aus einer großen zentralen Pilzkammer und aus mehreren Tunneln, die diese mit der Erdoberfläche verbinden. Wie die Ameisen in dem adulten Stadium die Größe der Pilzkammer regulieren, wurde bisher noch nicht untersucht. Als mögliche Kriterien, nach denen sich die Ameisen richten könnten, wurde sowohl das vorhandene Pilzvolumen als auch die Anzahl an Arbeiterinnen in Betracht gezogen. Gezeigt werden konnte, dass die Kammern umso größer werden, je mehr Pilzvolumen vorhanden ist. Aufgrund dessen wird angenommen, dass der Pilz beim Bau der Pilzkammer als Vorlage dient und somit das Grabeverhalten räumlich organisiert. Eine Erhöhung der Ameisenzahlen bewirkte dagegen eine Vergrößerung des Nestvolumens durch das Anlegen von Tunneln. Dadurch nahm das insgesamt ausgegrabene Volumen und damit die Grabeaktivität mit der Größe der Kolonie zu. Allerdings stieg es nicht, wie bei den kleinen Gruppen beobachtet werden konnte, proportional zur Koloniegröße an. Vermutet wird, dass sowohl die Kammer- als auch die Nestvergrößerung über die Individuendichte reguliert wird. Demnach würden die Tiere anfangen zu graben, wenn die Individuendichte über einen Schwellenwert ansteigt und aufhören, wenn die Dichte wiederum unter diesen Schwellenwert fällt. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass die Grabeaktivität nicht nur über die Individuendichte, sondern zusätzlich noch durch ein rhythmisches Graben in der Nacht geregelt zu sein scheint. Zusammengenommen konnte also gezeigt werden, dass Königinnen auf Stimuli in ihrer Umgebung reagieren, indem sie die Tiefe des Gründungsnestes durch das Abschätzen der schon gegrabenen Tunnellänge bestimmen. Das Nestgraben erfolgt allerdings nicht nach einem einfachen Stimulus-Antwort-Mechanismus, sondern die Königinnen richten sich zusätzlich noch nach der Zeit, was einen internen Messfaktor darstellt. Ebenfalls scheint die Kammergröße durch mindestens zwei Mechanismen reguliert zu werden. Somit fließen sowohl bei der Bestimmung der Tunnellänge als auch bei der Regulation der Kammergröße mehrere Kriterien in die Entscheidung mit ein. Ebenso wie die Königinnen reagieren einzelne Individuen auf unterschiedliche Stimuli in ihrer Umgebung, wodurch unterschiedliche Neststrukturen entstehen können. So fangen Ameisen an ein Nest zu vergrößern, wenn sich der zur Verfügung stehende Platz innerhalb des Nestes reduziert. Wächst der Pilz so reduziert sich der Abstand zwischen Pilz und Kammerwand, was für die Tiere ein Signal ist, die Kammer zu vergrößern. Dabei wird der Pilz als Vorlage verwendet, der das Graben räumlich organisiert. Ist der Platz innerhalb des Nestes dagegen aufgrund des Koloniewachstums reduziert, so fangen die Arbeiterinnen an Tunnel auszugraben, so dass die Nestgröße der Koloniegröße angepasst wird. Allerdings, so wird vermutet, hängt die Anzahl der sich am Graben beteiligenden Ameisen sowie auch deren Arbeitsleistung von der Größe der Gruppe ab. Demnach sind die Individuen nicht nur sensitiv auf die Stimuli, die aus ihrer Umgebung kommen, sondern ändern ihr Verhalten auch in Abhängigkeit von dem sozialen Umfeld, in dem sie sich befinden.
Genome sequence analysis A combination of genome analysis application has been established here during this project. This offers an efficient platform to interactively compare similar genome regions and reveal loci differences. The genes and operons can be rapidly analyzed and local collinear blocks (LCBs) categorized according to their function. The features of interests are parsed, recognized, and clustered into reports. Phylogenetic relationships can be readily examined such as the evolution of critical factors or a certain highly-conserved region. The resulting platform-independent software packages (GENOVA and inGeno), have been proven to be efficient and easy to handle in a number of projects. The capabilities of the software allowed the investigation of virulence factors, e.g., rsbU, strains’ biological design, and in particular pathogenicity feature storage and management. We have successfully investigated the genomes of Staphylococcus aureus strains (COL, N315, 8325, RN1HG, Newman), Listeria spp. (welshimeri, innocua and monocytogenes), E.coli strains (O157:H7 and MG1655) and Vaccinia strains (WR, Copenhagen, Lister, LIVP, GLV-1h68 and parental strains). Metabolic network analysis Our YANAsquare package offers a workbench to rapidly establish the metabolic network of such as Staphylococcous aureus bacteria in genome-scale size as well as metabolic networks of interest such as the murine phagosome lipid signalling network. YANAsquare recruits reactions from online databases using an integrated KEGG browser. This reduces the efforts in building large metabolic networks. The involved calculation routines (METATOOL-derived wrapper or native Java implementation) readily obtain all possible flux modes (EM/EP) for metabolite fluxes within the network. Advanced layout algorithms visualize the topological structure of the network. In addition, the generated structure can be dynamically modified in the graphic interface. The generated network as well as the manipulated layout can be validated and stored (XML file: scheme of SBML level-2). This format can be further parsed and analyzed by other systems biology software, such as CellDesigner. Moreover, the integrated robustness-evaluation routine is able to examine the synthesis rates affected by each single mutation throughout the whole network. We have successfully applied the method to simulate single and multiple gene knockouts, and the affected fluxes are comprehensively revealed. Recently we applied the method to proteomic data and extra-cellular metabolite data of Staphylococci, the physiological changes regarding the flux distribution are studied. Calculations at different time points, including different conditions such as hypoxia or stress, show a good fit to experimental data. Moreover, using the proteomic data (enzyme amounts) calculated from 2D-Gel-EP experiments our study provides a way to compare the fluxome and the enzyme expression. Oncolytic vaccinia virus (VACV) We investigated the genetic differences between the de novo sequence of the recombinant oncolytic GLV-1h68 and other related VACVs, including function predictions for all found genome differences. Our phylogenetic analysis indicates that GLV-1h68 is closest to Lister strains but has lost several ORFs present in its parental LIVP strain, including genes encoding CrmE and a viral Golgi anti-apoptotic protein, v-GAAP. Functions of viral genes were either strain-specific, tissue-specific or host-specific comparing viral genes in the Lister, WR and COP strains. This helps to rationally design more optimized oncolytic virus strains to benefit cancer therapy in human patients. Identified differences from the comparison in open reading frames (ORFs) include genes for host-range selection, virulence and immune modulation proteins, e.g. ankyrin-like proteins, serine proteinase inhibitor SPI-2/CrmA, tumor necrosis factor (TNF) receptor homolog CrmC, semaphorin-like and interleukin-1 receptor homolog proteins. The contribution of foreign gene expression cassettes in the therapeutic and oncolytic virus GLV-1h68 was studied, including the F14.5L, J2R and A56R loci. The contribution of F14.5L inactivation to the reduced virulence is demonstrated by comparing the virulence data of GLV-1h68 with its F14.5L-null and revertant viruses. The comparison suggests that insertion of a foreign gene expression cassette in a nonessential locus in the viral genome is a practical way to attenuate VACVs, especially if the nonessential locus itself contains a virulence gene. This reduces the virulence of the virus without compromising too much the replication competency of the virus, the key to its oncolytic activity. The reduced pathogenicity of GLV-1h68 was confirmed by our experimental collaboration partners in male mice bearing C6 rat glioma and in immunocompetent mice bearing B16-F10 murine melanoma. In conclusion, bioinformatics and experimental data show that GLV-1h68 is a promising engineered VACV variant for anticancer therapy with tumor-specific replication, reduced pathogenicity and benign tissue tropism.
Members of the enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important regulators of the actin cytoskeleton dynamics. VASP functions as well as its interactions with other proteins are regulated by phosphorylation at three sites - serine157 (S157), serine239 (S239), and threonine278 (T278) in humans. cAMP- and cGMP- dependent protein kinases phosphorylate S157 and S239, respectively. In contrast, the kinase responsible for T278 was as yet unknown and identified in the first part of this thesis. In a screen for T278 phosphorylating kinases using a phospho-specific antibody against phosphorylated T278 AMP-activated protein kinase (AMPK) was identified in endothelial cells. Mutants of AMPK with altered kinase-activity modulate T278-phosphorylation levels in cells. AMPK-driven T278-phosphorylation impaired stress fiber formation and changed cell morphology in living cells. AMPK is a fundamental sensor of cellular and whole body energy homeostasis. Zucker Diabetic Fatty (ZDF) rats, which are an animal model for type II diabetes mellitus, were used to analyze the impact of phosphorylated T278 in vivo. AMPK-activity and T278-phosphorylation were substantially reduced in arterial vessel walls of ZDF rats in comparison to control animals. These findings demonstrate that VASP is a new AMPK substrate, that VASP phosphorylation mediates the effects of metabolic regulation on actin cytoskeleton rearrangements, and that this signaling system becomes down-regulated in diabetic vessel disorders in rats. In the second part of this thesis, a functional analysis of differential VASP phosphorylations was performed. To systematically address VASP phosphorylation patterns, a set of VASP phosphomimetic mutants was cloned. These mutants enable the mimicking of defined phosphorylation patterns and the specific analysis of single kinase-mediated phosphorylations. VASP localization to the cell periphery was increased by S157- phosphorylation and modulated by phosphorylation at S239 and T278. Latter phosphorylations synergistically reduced actin polymerization. In contrast, S157- phosphorylation had no effect on actin-dynamics. Taken together, the results of the second part show that phosphorylation of VASP serves as a fine regulator of localization and actin polymerization activity. In summary, this study revealed the functions of VASP phosphorylations and established novel links between signaling pathways and actin cytoskeleton rearrangement.
Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 % of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110.
Like many other social insect societies, honeybees collectively share the resources they gather by feeding each other. These feeding contacts, known as trophallaxis, are regarded as the fundamental basis for social behavior in honeybees and other social insects for assuring the survival of the individual and the welfare of the group. In honeybees, where most of the trophallactic contacts are formed in the total darkness of the hive, the antennae play a decisive role in initiation and maintenance of the feeding contact, because they are sensitive to gustatory stimuli. The sequences of behaviors performed by the receiver bees at the beginning of a feeding contact includes the contact of one antenna with the mouthparts of a donor bee where the regurgitated food is located. The antennal motor action is characterized by behavioral asymmetry, which is novel among communicative motor actions in invertebrates. This preference of right over left antenna is without exception even after removal of the antennal flagellum. This case of laterality in basic social interaction might have its reason in the gustatory asymmetry in the antennae, because the right antenna turns out to be significantly more sensitive to stimulation with sugar water of various concentrations than the left one. Trophallactic contacts which guarantee a constant access to food for every individual in the hive are vitally important to the honeybee society, because honeybees are heterothermic insects which actively regulate their thoracic temperature. Even though the individual can regulate its body temperature, its heating performance is strictly limited by the amount of sugar ingested. The reason for this is that honeybees use mostly the glucose in their hemolymph as the energy substrate for muscular activity, and the heat producing flight muscles are among the metabolically most active tissues known. The fuel for their activity is honey; processed nectar with a sugar content of ~80% stored in the honeycomb. The results show that the sugar content of the ingested food correlates positively with the thoracic temperature of the honeybees even if they are caged and show no actual heating-related behavior as in brood warming or heating in the centre of the winter cluster. Honeybees actively regulate their brood temperature by heating to keep the temperature between 33 °C to 36 °C if ambient temperatures are lower. Heating rapidly depletes the worker’s internal energy; therefore the heating performance is limited by the honey that is ingested before the heating process. This study focused on the behavior and the thoracic temperature of the participants in trophallactic food exchanges on the brood comb. The brood area is the centre of heating activity in the hive, and therefore the region of highest energy demand. The results show that the recipients in a trophallactic food exchange have a higher thoracic temperature during feeding contacts than donors, and after the feeding contact the former engage in brood heating more often. The donor bees have lower thoracic temperature and shuttle constantly between honey stores and the brood comb, where they transfer the stored honey to heating bees. In addition, the results show a heat-triggered mechanism that enables donor and recipient to accomplish trophallactic contacts without delay in the total darkness of the hive in the brood area as the most energy consuming part of the hive. Providing heat-emitting workers with small doses of high performance fuel contributes to an economic distribution of resources consistent with the physiological conditions of the bees and the ecological requirements of the hive, resulting in a highly economical resource management system which might be one of the factors favouring the evolution of perennial bee colonies in temperate regions. The conclusion of these findings suggests a resource management strategy that has evolved from submissive placation behavior as it is seen in honeybees, bumblebees and other hymenopterans. The heat-triggered feedback mechanism behind the resource management of the honeybee´s thermoregulatory behavior reveals a new aspect of the division of labor and a new aspect of communication, and sheds new light on sociality in honeybees.
Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability.
In this work, a behavioural analysis of different mutants of the fruit fly Drosophila melanogaster has been carried out. Primarily, the gap climbing behaviour (Pick & Strauss, 2005) has been assayed as it lends itself for the investigation of decision making processes and the neuronal basis of adaptive behaviour. Furthermore it shows how basic motor actions can be combined into a complex motor behaviour. Thanks to the neurogenetic methods, Drosophila melanogaster has become an ideal study object for neurobiological questions. Two different modules of climbing control have been examined in detail. For the decision making, the mutant climbing sisyphus was analysed. While wild-type flies adapt the initiation of climbing behaviour to the width of the gap and the probability for a successful transition. climbing sisyphus flies initiate climbing behaviour even at clearly insurmountable gap widths. The climbing success itself is not improved in comparison to the wild-type siblings. The mutant climbing sisyphus is a rare example of a hyperactive mutant besides many mutants that show a reduced activity. Basic capabilities in vision have been tested in an optomotor and a distance-estimation paradigm. Since they are not affected, a defect in decision making is most probably the cause of this behavioural aberration. A second module of climbing control is keeping up orientation towards the opposite side of the gap during the execution of climbing behaviour. Mutants with a structural defect in the protocerebral bridge show abnormal climbing behaviour. During the climbing attempt, the longitudinal body axis does not necessarily point into the direction of the opposite side. Instead, many climbing events are initiated at the side edge of the walking block into the void and have no chance to ever succeed. The analysed mutants are not blind. In one of the mutants, tay bridge1 (tay1) a partial rescue attempt used to map the function in the brain succeeded such that the state of the bridge was restored. That way, a visual targeting mechanism has been activated, allowing the flies to target the opposite side. When the visibility of the opposing side was reduced, the rescued flies went back to a tay1 level of directional scatter. The results are in accord with the idea that the bridge is a central constituent of the visual targeting mechanism. The tay1 mutant was also analysed in other behavioural paradigms. A reduction in walking speed and walking activity in this mutant could be rescued by the expression of UAS-tay under the control of the 007Y-GAL4 driver line, which concomitantly restores the structure of the protocerebral bridge. The separation of bridge functions from functions of other parts of the brain of tay1 was accomplished by rescuing the reduced optomotor compensation in tay1 by the mb247-GAL4>UAS-tay driver. While still having a tay1-like protocerebral bridge, mb247-GAL4 rescue flies are able to compensate at wild-type levels. An intact compensation is not depended on the tay expression in the mushroom bodies, as mushroom body ablated flies with a tay1 background and expression of UAS-tay under the control of mb247-GAL4 show wild-type behaviour as well. The most likely substrate for the function are currently unidentified neurons in the fan-shaped body, that can be stained with 007Y-GAL4 and mb247-GAL4 as well.