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- D-1221-2009 (1)
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Die Technik des optischen Imaging unter Verwendung DNA-codierter Sensoren ermöglicht es, Messungen neuraler Aktivitäten in genetisch definierten Populationen von Neuronen durchzuführen. In der Vielzahl der verschiedenen entwickelten Sensoren konnten die Calciumsensoren bisher das beste Verhältnis zwischen Signal und Rauschen und die beste zeitliche Auflösung aufzeigen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um zwei Typen von Sensoren, zum einen ratiometrische Sensoren, deren Signal auf einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) basiert, und zum anderen um zirkulär permutierte Sensoren, die auf einem modifizierten GFP-Molekül basieren, wobei das Signal auf einer veränderten Protonierung des Chromophors beruht. Beide Arten dieser Sensoren wurden schon erfolgreich zum Messen neuraler Aktivitäten in Nervensystemen verschiedener Tierarten verwendet. Ein Teil dieser Arbeit bestand darin, zu untersuchen, welche Sensoren sich für die Messung an einem lebenden Organismus am besten eignen. Hierfür wurden die Eigenschaften von vier verschiedenen FRET basierten Sensoren und zwei der zyklisch permutierten Sensoren nach Expression im zentralen Nervensystem von Drosophila charakterisiert. Die Sensoren wurden in Neuronen zweiter und dritter Ordnung des olfaktorischen Signalwegs exprimiert und ihre Antworten auf physiologische Duftstimulation oder artifiziell induzierte Depolarisation des Gehirns untersucht. Während die calciumabhängigen Signale der zyklisch permutierten Sensoren in der Regel größer waren als die der FRET basierten Sensoren, zeichneten sich letztere durch ein besseres Signal zu Rausch-Verhältnis aus, wenn Bewegungen der fluoreszierenden Strukturen nicht zu vermeiden waren. Dies war auch der ausschlaggebende Grund für die Verwendung eines FRET basierten Sensors im anschließenden Teil der Arbeit. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt untersucht, den die Paarung eines neutralen Stimulus mit einem bestrafenden Stimulus auf dopaminerge Neurone hat. Eine solche Paarung kann zu einer klassischen Konditionierung führen, einer einfachen Form des Lernens, in welcher das Tier einem ursprünglich neutralen Stimulus einen Wert zuordnet, und dadurch sein Verhalten dem Stimulus gegenüber ändert. Die olfaktorische klassische Konditionierung in Drosophila wird seit vielen Jahren intensiv untersucht, um die molekularen und neuronalen Grundlagen von Lernen und Gedächtnis zu charakterisieren. Dabei hat sich gezeigt, dass besonders die Pilzkörper von essentieller Bedeutung für die Ausbildung eines olfaktorischen Gedächtnisses sind. Während das olfactorische System bei Insekten bereits detailiert analysiert wurde, ist über die Neurone, die den bestrafenden Stimulus vermitteln, nur sehr wenig bekannt. Unter Anwendung des funktionellen optischen Calcium Imaging konnte im Rahmen der Arbeit gezeigt werden, dass die Projektionen von dopaminergen Neuronen im Bereich der Loben der Pilzkörper schwach auf die Präsentation eines Duftes, jedoch sehr stark auf eine Stimulation durch einen Elektroschock antworten. Nach mehrmaliger Paarung eines Duftes mit einem Elektroschock während eines Trainings, verlängert sich die Aktivität dieser dopaminergen Neurone auf den bestraften Duft hin im Test ohne Elektroschock drastisch, während die Antwort auf den Kontrollduft keine signifikanten Veränderungen aufweist. Während bei Säugetieren belohnende Reize bei appetitiven Lernvorgängen über dopaminerge Neurone vermittelt werden, spielen bei Drosophila diese Neurone offensichtlich eine Rolle bei der aversiven Konditionierung. Jedoch blieb, auch wenn sich die Rolle des Dopamins im Laufe der Evolution geändert zu haben scheint, die Fähigkeit dieses Neuronentyps, nicht nur auf einen eintreffenden verstärkenden Stimulus zu reagieren, sondern diesen auch vorhersagen zu können, zwischen Säugern und Drosophila erhalten.
Summary Timber harvesting is currently the most common commercial utilisation activity in tropical forests. Assessing the effects of logging on different aspects of biodiversity and general ecosystem properties is hence of prime importance if the few remaining areas of intact tropical forest are to be protected effectively and efficiently. Tropical amphibian communities are an appropriate model system for studies on the impacts of human-induced environmental changes on the dynamics of complex biological systems. This thesis elaborates on patterns of diversity changes in tropical forest amphibian communities facing habitat alterations associated with selective logging in two globally important eco-regions (Côte d’Ivoire, Upper Guinea, West Africa and Guyana, the Guiana Shield, northern South America). The thesis is organised along two main themes. After a general introduction, a section on general methodology and an introduction to the model systems studied, the first theme moves from general patterns to underlying processes. A second theme running through both chapters carries from undisturbed systems to disturbed systems. A final section integrates findings and addresses implications for conservation management of anthropogenically altered tropical forests. Several case studies at the species- population and community level are being presented and data on the direct and indirect impacts of anthropogenic habitat alteration on respective organizational levels are provided. A key statement that is stressed on throughout the studies is the fact that common measures of diversity, such as species richness and species-diversity only inadequately reflect processes of diversity change following anthropogenic disturbance. They also fail to describe actual impacts on the dynamics of complex biological systems. It is argued that commonly used measures produce an incoherent and insufficient picture of diversity patterns and the underlying processes that shape these patterns. Thus, an understanding of higher levels of diversity, such as β-diversity and functional diversity (and hence compositional patterns) appears to be the key to effectively mitigating the impacts of human-induced disturbance on amphibian communities. It is shown that the predictability of amphibian community composition depends on the respective level of anthropogenic disturbance imposed on a particular habitat. Hence, human activities that lead to changes in the structure of a forest, such as logging, not only alter simple system descriptors, such as the number of species in a given community, but rather alter the dynamics of the entire system. In this context, functional diversity is shown to be an important aspect underlying the actual mechanism that leads to the observed change of predictability patterns. Functional differences between species, rather than number of species per se appear to be the decisive factor in sustaining desirable ecosystem states and thus in maintaining important ecosystem services. Because biological diversity appears to play a substantial role in ecosystem resilience required to safeguard essential ecosystem functions in the face of environmental change, the thesis calls for a critical revision of common diversity assessments approaches. The studies advocate the reconsideration of the uncritical use of widespread measures and descriptors of biodiversity on grounds of inconsistent patterns found throughout numerous studies, including those presented herein.
This work deals with channel-tunnel dependent multidrug efflux pumps and type I secretion systems, more concrete with the improved classification of the adaptor protein family, the characterization of the TolC-homologue protein HI1462 of Haemophilus influenzae, and the molecular characterization of the interaction between TolC and AcrA of Escherichia coli.
Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell
(2006)
Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte.
Herbivorous insects are the major link between primary producers and a multitude of animals at higher trophic levels. Elucidating the causes and consequences of their distribution patterns in the "green world" is thus essential for our understanding of numerous ecological processes on multiple spatial scales. We can ask where and why a certain herbivore can be found in the landscape, within the habitat, on which plant within the habitat and finally, where on that plant. Depending on spatial scale the distribution of herbivores is shaped by different processes (fitness considerations, physiological abilities, population dynamics, dispersal behavior, history of the landscape etc.). Scaling down from fragmented landscapes to individual host plants this thesis analyzes the distribution patterns of the strictly monophagous herbivore Cassida canaliculata Laich. (Coleoptera: Chrysomelidae), which feeds and oviposits exclusively on meadow sage, Salvia pratensis L. (Lamiales: Lamiaceae), and compares it to those of the polyphagous tansy leaf beetle Galeruca tanaceti L. (Coleoptera: Chrysomelidae), which does not oviposit on its host plants, but on dry non-host structures. The specialist Cassida canaliculata depended on all spatial scales (fragmented landscape, microhabitat and host plant individual) mainly on the distribution and quality of its single host plant species Salvia pratensis, whereas enemy-free-space - i.e. avoidance of parasitism and predation of egg clutches, larvae, and pupae - seemed to influence oviposition site choice only on the scale of the host plant individual. On this spatial scale, offspring of Cassida canaliculata had a higher chance of survival on large host plant individuals, which were also preferred for oviposition by the females. In contrast, the distribution patterns of the generalist Galeruca tanaceti was shaped by the interaction with its parasitoid regarding both microhabitat choice and egg distribution within individual host plants. On the microhabitat scale, beetles could escape from their parasitoids by ovipositing into high and dense vegetation. Regarding oviposition site choice within a host plant individual, females oviposited as high as possible in the vegetation and could thus reduce both the risk of parasitism and the probability of winter mortality. The results of my thesis show that the degree of specificity of a herbivore is of central importance for the resulting egg distribution pattern on all spatial scales.
In this study pore forming proteins of the gram-negative bacteria B. burgdorferi, B. duttonii and E.coli were investigated. Therefore the study is subdivided into three parts. In the first part outer membrane preparation of three relapsing fever Borrelia were investigated. In the second part the putative TolC homologue BB0124 of B. burgdorferi, the Lyme borreliosis agent, was studied. In the last part the influence of point mutants within the greasy slide of the maltose specific porin (LamB) of E. coli were shown. In the first part of this study outer membrane preparations of three Borrelia relapsing fever strains have been studied for pore-forming activity in the black lipid bilayer assay. Histograms of conductance fluctuations were obtained from single-channel experiments with outer membrane preparations of B. hermsii, B. recurentis and B. duttonii. All strains had a different conductance fluctuation pattern with a broad range of single-channel conductance values varying from 0.5 nS – 11 nS. Common for all three strains was a high pore-forming activity at around 0.5 nS. Furthermore the proteins of the outer membrane of B. duttonii were separated by chromatographic methods. Some eluate fractions contained a channel-forming protein, which was forming stable channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. Characterization of this channel showed that it is slightly anionic selective and voltage independent. The small single-channel conductance suggests that it is a specific pore. However, a substrate specificity could not be determined. In the second part, for the B. burgdorferi HB19 and p66 knock out strain HB19/K02, their outer membrane preparations were characterized in the black lipid bilayer assay. Comparing the histograms of single-channel conductions fluctuations of both strains showed no single-channel activity at 11.5 nS for the p66 knock out strain. This verifies earlier studies that P66 is a pore-forming protein in B. burgdorferi. Furthermore, one fraction obtained by anion exchange chromatography of the p66 knock out outer membrane protein preparation showed a uniform channel-forming activity with a single channel conductance of 300 pS. The electrophysically characterization of the 300 pS channel showed that it is not ionselective or voltage dependent. By mass spectrometry using peptide mass finger prints, BB0142 could be identified as the sole channel forming candidate in the active fraction. A BLAST search and a conserved domain search showed that BB0142 is a putative TolC homologue in B. burgdorferi. Furthermore the location of the bb0142 gene within the chromosome is in an operon encoding a multidrug efflux pump. In this study the expression of an outer membrane component of a putative drug efflux system of B. burgdorferi was shown for the first time. In the third part functional studies of the maltooligosaccharide-specific LamB channel were performed. The 3D-structure of LamB suggests that a number of aromatic residues (Y6, Y41, W74, F229, W358 and W420) within the channel lumen is involved in carbohydrate and ion transport. All aromatic residues were replaced by alanine (A) scanning mutagenesis. Furthermore, LamB mutants were created in which one, two, three, four and five aromatic residues were replaced to study their effects on ion and maltopentaose transport through LamB. The purified mutant proteins were reconstituted into lipid bilayer membranes and the single-channel conductance was studied. The results suggest that all aromatic residues provide some steric hindrance for ion transport through LamB. Highest impact is provided by Y6 and Y41, which are localized opposite to Y118, which forms the central constriction of the LamB channel. Stability constants for binding of maltopentaose to the mutant channels were measured using titration experiments with the carbohydrate. The mutation of one or several aromatic amino acids led to a substantial decrease of the stability constant of binding. The highest effect was observed when all aromatic amino acids were replaced by alanine because no binding of maltopentaose could be detected in this case. However, binding was again possible when Y118 was replaced by tryptophane (W). The carbohydrate-induced block of the channel function could also be used for the study of current noise through the different mutant LamB-channels. The analysis of the power density spectra of some of the mutants allowed the evaluation of the on- and off-rate constants (k1 and k-1) of carbohydrate binding to the binding-site inside the channels. The results suggest that both on- and off-rate constants were affected by the mutations. For most mutants k1 decreased and k-1 increased.
Mitochondrien verändern dynamisch durch ein balanciertes Verhältnis von Teilung und Fusion die Gestalt ihrer Netzwerke und reagieren so auf interne und externe Signale. Ein Schlülsselprotein der mitochondrialen Teilung ist die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1p, die in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Da Mitochondrien aufgrund ihres endosymbiontischen Ursprungs zwei Membranen besitzen, erfordert deren Teilung eine besondere Koordination. Unter Verwendung von photokonvertierbarem GFP wird in dieser Arbeit gezeigt, dass in S. cerevisiae die Teilung der inneren und äußeren Membran zeitlich eng gekoppelt verläuft. Dieser Prozess wird durch die GTPase Dnm1p, aber auch durch die Adaptor-Proteine Mdv1p und Caf4p sowie dem integralen Membrananker Fis1p v ermittelt. Dnm1p lagert sich zu Spiralen um den tubulären Strang an und trennt GTP-abhängig die Mitochondrien voneinander. Eine Voraussetzung für die Anlagerung dieser Spiralen stellen Matrix-Konstriktionen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Dnm1p und auch Fis1p für die Ausbildung dieser mitochondrialen Einschnürungen nicht essentiell sind. Die Untersuchung der Verteilung, Orientierung und Größe der Epitop-markierten Dnm1p-Cluster bildet den Schwerpunkt der Arbeit. Weiterhin wird der Einfluss der Teilungsproteine Fis1p, Mdv1p und Caf4p auf diese Dnm1p-Charakteristika ermittelt. Die Analyse basiert auf quantitativen Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zusätzlich werden auch neue hochauflösende Lichtmikroskope (4Pi und STED) zur genauen Lokalisation und Größenbestimmung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionsstämmen die Mehrheit der Cluster mit den Mitochondrien assoziiert ist, während in Fis1p- und Caf4p-Deletionszellen die Rekrutierung der Cluster zu den Mitochondrien gestört erscheint. Nur wenige Cluster bilden Spiralen um Matrix-Konstriktionen aus, die überwiegende Mehrheit der nicht an aktuellen Teilungsprozessen beteiligten Dnm1p-Aggregate weist dagegen im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionszellen eine polare Orientierung Richtung Zellcortex auf. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Polarität ist in Fis1p- und Caf4p-Deletionsstämmen aufgehoben, bleibt jedoch auch nach der Zerstörung des Aktin-Gerüstes aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass Dnm1p in einem Komplex mit Fis1p und Caf4p zusätzlich zu seiner Funktion als Teilungsprotein an der Anheftung der Mitochondrien an den Zellcortex beteiligt ist. Zudem scheinen die Adaptorproteine Mdv1p und Caf4p trotz molekularer Ähnlichkeit unterschiedliche Aufgaben in der Zelle zu erfüllen.
Amphibian communities of the dry forest of Western Madagascar : taxonomy, ecology and conservation
(2006)
The amphibian fauna of the Kirindy dry forest in western Madagascar Abstracts of chapter 5 and 6 Living apart together – patterns of tadpole communities in a western Madagascan dry forest Whether communities are established in a deterministic or in a stochastic manner depends to a large degree on the spatial scale considered. In this study we use a tadpole community in the dry forest of western Madagascar to show that when within-site habitat diversity is considered, communities may also differ in two community parameters (species composition and species richness) within one geographic scale. Forest ponds and riverbed ponds are two types of breeding habitat that are both used by anurans but that differ generally in their temporal availability, predation pressure, and environmental characteristics. In forest ponds, tadpole communities were very predictable by the physical properties of the ponds and by their vegetation characteristics. In contrast, the riverbed communities were not predictable. We offer two hypotheses to explain this phenomenon. This study clearly demonstrates differing patterns in community organization in two natural habitats within one site, and therefore, highlights the importance of considering local conditions and within-site habitat diversity in community studies. Modeling the habitat use of an endangered dry-forest frog from Western Madagascar A crucial factor for the successful reproduction and thus conservation of an amphibian species is the availability of suitable waters as breeding sites. In this chapter, we examine the use of breeding sites of an endangered, local endemic frog of Western Madagascar, Aglyptodactylus laticeps, over a three year period. Logistic regression was used to model the relationship between the species’ breeding habitat use and environmental variables. This model was aimed to be predictive, rather than explanatory, and only environmental variables were included that are assessable in a time and cost effective manner, and that can therefore be used as an easy-to-use management tool in applied conservation. On the local scale of the Kirindy concession, A. laticeps is restricted to forest with a relatively low degree of disturbance and closed canopy cover. The model identified three environmental variables that suffice to satisfactorily predict the use of respective breeding sites, namely leaf litter, vegetation coverage and surface water plants. Based on these results, we present recommendations for the conservation management of this frog. Furthermore, the presence or absence of this species within its natural range indicates the relative degree of environmental integrity of its habitat, and we therefore consider this species as a suitable indicator species of temporary aquatic habitats within the dry forest that are characterized by a low water permanency and high leaf litter coverage. This study demonstrates that models constructed from basic ecological knowledge of relevant species may serve as valuable management tools in applied conservation.
Study of Omp85 Family Proteins YaeT and YtfM and Multidrug Export Machineries in Escherichia coli
(2006)
In this study the Omp85 family proteins YaeT and YtfM of Escherichia coli were investigated by using biochemical and electrophysiological methods as well as bioinformatical and structural analysis. In addition, knock-out strains were constructed to further study the relevance of these proteins in vivo. The prediction that Omp85 proteins are composed of two domains, a periplasmic amino-terminal POTRA (polypeptide translocation associated) domain and a carboxy-terminal domain anchoring these proteins in the outer membrane, was confirmed by the construction of mutants. It could be shown that the carboxy-terminal part of the proteins is able to insert into the outer bacterial membrane, even if the POTRA domain is removed. Furthermore, pore-forming activity in the black-lipid bilayer was observed for both full-length proteins as well as their carboxy-terminal membrane located parts. The channels formed by both proteins in the black lipid bilayer showed variable single channel conductance states rather than a defined value for conductance. In 1M KCl, e.g. YaeT forms pores with a channel conductance of 100 to 600 pS containing a most abundant value at 400 pS. This variability is at least reasonable for YaeT due to a prerequisite flexibility of its channel for OMP insertion. YaeT was identified to form a cation selective, YtfM an anion selective channel, which is less pH dependent than YaeT. Another feature of the YaeT channel is that its selectivity and conductance is influenced by charged detergent molecules indicating an accumulation of these molecules in hydrophobic pockets inside the compact channel. YaeT revealed heat-modifiable mobility in SDS-PAGE which is characteristic for β-barrel OMPs, whereas YtfM did not show this behaviour. This result could be explained by sequence alignment and structural comparison of YaeT and YtfM via CD and FTIR spectra displaying much higher β-strand content for the carboxy-terminal part of YaeT compared to YtfM. Since the carboxy-terminal parts were shown to have pore forming ability and are inserted in the OM in vivo, the substitution of the essential protein YaeT by its carboxy-terminal mutant was attempted in a yaeT knock-out strain. The carboxy-terminal half of YaeT was not sufficient to compensate depletion of the full-length protein indicating an important role of the amino-terminus for cell viability. In contrary, YtfM is shown to be a non-essential protein and lack of YtfM had no effects on the composition and integrity of the OM. However, chromosomal deletion of ytfM remarkably reduced the growth rate of cells. This study provides the first detailed investigation of the structure of YaeT and describes its electrophysiological behaviour, which could be a basis for further studies of YaeT and its substrate proteins. Furthermore, YtfM was characterised and its in vivo function was investigated revealing YtfM as the second Omp85 family protein of importance in E. coli. In a second part of this study assembly and function of multidrug efflux pumps were investigated. Drug efflux pumps are tripartite export machineries in the cell envelope of Gram-negative bacteria conferring multidrug resistance and therefore causing severe problems for medical treatment of diseases. Protein structures of all three efflux pump components are solved, but the exact interaction sites are still unknown. Assembly of a hybrid exporter system composed of the Pseudomonas aeruginosa channel tunnel OprM, the E. coli adaptor protein AcrA and its associated transporter AcrB could be shown by chemical cross-linking, even though this efflux pump is not functional. Exchange of the hairpin domain of AcrA by the corresponding hairpin from the adaptor protein MexA of P. aeruginosa restored functionality tested by antibiotic sensitivity assays. This shows the importance of the MexA hairpin domain for functional interaction with the OprM channel tunnel. Interestingly, the hybrid protein was also able to assemble with TolC as outer membrane component to form a functional efflux pump indicating a higher flexibility of TolC compared to OprM concerning interaction partners. Based on these results, an interaction model of the hairpin domain and the channel tunnel on molecular level for AcrA and TolC as well as MexA and OprM, respectively, is presented. This model provides a basis for directed mutagenesis to reveal the exact contact sites of the hairpin of the adapter protein and the outer membrane component
Sugar reward learning in Drosophila : neuronal circuits in Drosophila associative olfactory learning
(2006)
Genetic intervention in the fly Drosophila melanogaster has provided strong evidence that the mushroom bodies of the insect brain act as the seat of memory traces for aversive and appetitive olfactory learning (reviewed in Heisenberg, 2003). In flies, electroshock is mainly used as negative reinforcer. Unfortunately this fact complicates a comparative consideration with other inscets as most studies use sugar as positive reinforcer. For example, several lines of evidence from honeybee and moth have suggested another site, the antennal lobe, to house neuronal plasticity underlying appetitive olfactory memory (reviewed in Menzel, 2001; Daly et al., 2004). Because of this I focused my work mainly on appetitive olfactory learning. In the first part of my thesis, I used a novel genetic tool, the TARGET system (McGuire et al., 2003), which allows the temporally controlled expression of a given effector gene in a defined set of cells. Comparing effector genes which either block neurotransmission or ablate cells showed important differences, revealing that selection of the appropriate effector gene is critical for evaluating the function of neural circuits. In the second part, a new engram of olfactory memory in the Drosophila projection neurons is described by restoring Rutabaga adenlylate cyclase (rut-AC) activity specifically in these cells. Expression of wild-type rutabaga in the projection neurons fully rescued the defect in sugar reward memory, but not in aversive electric shock memory. No difference was found in the stability of the appetitive memories rescued either in projection neurons or Kenyon cells. In the third part of the thesis I tried to understand how the reinforcing signals for sugar reward are internally represented. In the bee Hammer (1993) described a single octopaminergic neuron – called VUMmx1 – that mediates the sugar stimulus in associative olfactory reward learning. Analysis of single VUM neurons in the fly (Selcho, 2006) identified a neuron with a similar morphology as the VUMmx1 neuron. As there is a mutant in Drosophila lacking the last enzymatic step in octopamine synthesis (Monastirioti et al., 1996), Tyramine beta Hydroxylase, I was able to show that local Tyramine beta Hydroxylase expression successfully rescued sugar reward learning. This allows to conclude that about 250 cells including the VUM cluster are sufficient for mediating the sugar reinforcement signal in the fly. The description of a VUMmx1 similar neuron and the involvement of the VUM cluster in mediating the octopaminergic sugar stimulus are the first steps in establishing a neuronal map for US processing in Drosophila. Based on this work several experiments are contrivable to reach this ultimate goal in the fly. Taken together, the described similiarities between Drosophila and honeybee regarding the memory organisation in MBs and PNs and the proposed internal representation of the sugar reward suggest an evolutionarily conserved mechanism for appetitive olfactory learning in insects.
Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise für eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So können Mineralocorticoide nach zerebraler Ischämie zu einem vermehrten vaskulären Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration führen und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verstärken. Daher wäre eine mögliche Erklärung für die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu überprüfen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erhöht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Primärkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen bestätigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. Über den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung auslösen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders für therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivität des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivität im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Domäne für die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Domänen C, D, E und F genügt nicht, um den EGFR-Promoter vollständig zu aktivieren. Um Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellulärmatrix in glatten Gefäßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt für die vermehrte Bildung von extrazellulärer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskulären und renalen System kommt es über eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, nämlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und könnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zusätzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron führen diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und führt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte können folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron führt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabhängig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabhängig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen für eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorgängen.
Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3.
In this century new experimental and computational techniques are adding an enormous amount of information, revealing many biological mysteries. The complexities of biological systems still broach new questions. Till now the main approach to understand a system has been to divide it in components that can be studied. The upcoming new paradigm is to combine the pieces of information in order to understand it at a global level. In the present thesis we have tried to study infectious diseases with such a global ‘Systems Biology’ approach. In the first part the apoptosis pathway is analyzed. Apoptosis (Programmed cell death) is used as a counter measure in different infections, for example viral infections. The interactions between death domain containing proteins are studied to address the following questions: i) How specificity is maintained - showing that it is induced through adaptors, ii) how proliferation/ survival signals are induced during activation of apoptosis – suggesting the pivotal role of RIP. The model also allowed us to detect new possible interacting surfaces. The pathway is then studied at a global level in a time step simulation to understand the evolution of the topology of activators and inhibitors of the pathway. Signal processing is further modeled in detail for the apoptosis pathway in M. musculus to predict the concentration time course of effector caspases. Further, experimental measurements of caspase-3 and viability of cells validate the model. The second part focuses on the phagosome, an organelle which plays an essential role in removal of pathogens as exemplified by M. tuberculosis. Again the problem is addressed in two main sections: i) To understanding the processes that are inhibited by M. tuberculosis; we focused on the phospholipid network applying a time step simulation in section one, which plays an important role in inhibition or activation of actin polymerization on the phagosome membrane. ii) Furthermore, actin polymers are suggested to play a role in the fusion of the phagosome with lysosome. To check this hypothesis an in silico model was developed; we find that the search time is reduced by 5 fold in the presence of actin polymers. Further the effect of length of actin polymers, dimensions of lysosome, phagosome and other model parameter is analyzed. After studying a pathway and then an organelle, the next step was to move to the system. This was exemplified by the host pathogen interactions between Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica. The limited availability of quantitative information was the crucial factor behind the choice of the model type. A Boolean model was developed which was used for a dynamic simulation. The results predict important factors playing a role in Bordetella pathology especially the importance of Th1 related responses and not Th2 related responses in the clearance of the pathogen. Some of the quantitative predictions have been counterchecked by experimental results such as the time course of infection in different mutants and wild type mice. All these computational models have been developed in presence of limited kinetic data. The success of these models has been validated by comparison with experimental observations. Comparative models studied in chapters 6 and 9 can be used to explore new host pathogen interactions. For example in chapter 6, the analysis of inhibitors and inhibitory paths in three organism leads to the identification of regulatory hotspots in complex organisms and in chapter 9 the identification of three phases in B. bronchiseptica and inhibition of IFN-γ by TTSS lead us to explore similar phases and inhibition of IFN-γ in B. pertussis. Further an important significance of these models is to identify new components playing an essential role in host-pathogen interactions. In silico deletions can point out such components which can be further analyzed by experimental mutations.
Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine führt zu einer frühzeitigen Neurodegeneration in Mäusen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellulärer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- Mäusen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erhöht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erhöhten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E lässt eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung während der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten.
Obwohl Protein-Mikroarrays ursprünglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repräsentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilität der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilität und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antikörper–Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen Lösungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begründete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antikörper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie für deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antikörpern für verschiedene Oberflächen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antikörper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberflächen am besten geeignet sind. Diese Oberfläche ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde für alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der nötigen Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und für den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM ermöglicht auf eine phänomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensität oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein müssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Berücksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die phänomenologischen TCM-Werte interpretieren zu können und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, für die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl für konventionelle als auch für Mikrospot-Immunoassays ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte für einen typischen Standard-Antikörper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabhängige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegenübersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen fürs Design und die zukünftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antikörper-Mikroarray ein kritischer Punkt für die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Größe eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosität des Inkubationspuffers und Mischintensität die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Größenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gewährleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinität, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter berücksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivität von Antikörper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der etablierten Antikörper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen für die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet für eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivitäten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antikörper-Mikroarrays sowohl für eine markierte Antigenmischung als auch für komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren öffnet zusätzliche Möglichkeiten für schnelle, kostengünstige und unbeschränkt erweiterungsfähige Mikrospot-Immunoassays.
Allergic disease are inflammatory disorders in which aberrant immune regulation occurs, and susceptible individuals mount allergen specific T helper 2 (Th2) responses, which drives disease pathology. Recent studies indicate that Th2 responses that are characteristic of allergic manifestations can be regulated by both naturally occurring CD4+CD25+ regulatory (Treg) cells and antigen-driven IL-10-secreting CD4+ regulatory T cells. Evidence is also emerging that successful Allergen specific immunotherapy (SIT) might work through the induction of IL-10-secreting regulatory T cells. In the first part of this work, I demonstrated the efficiency of allergen specific immunotherapy in the mouse model for allergic airway inflammation. Here I could show that intranasal administration of SIT abrogates allergic symptoms more efficiently, than the subcutaneous treatment. Furthermore, an IL-4/IL-13 (QY) inhibitor was used as an adjuvant for SIT, which has been demonstrated to have an anti-allergic potential, when administered prophylactically during allergic sensitization. However, the combination therapy with SIT and the inhibitory molecule QY did not show any significant enhancement in regards to all measured allergic parameters, when compared to monotherapy with SIT. These results provide the evidence, that shift from Th2 to Th1 cytokine profile might not be a key event in successful SIT. Subsequently, the investigation of immune mechanisms under successful SIT demonstrate that the increase of IL-10 secreting CD4+ T regulatory cells is associated with the suppression of airway inflammation in our mouse system, suggesting that these T cell subsets might be involved in the regulatory mechanisms of allergic disorders. In agreement with these findings is the second part of this work, where superagonistic a-CD28 mAb´s were used for the expansion of T regulatory cell subsets in our murine model for allergic airway inflammation. Here I could show, that the application of a-CD28 mAb during allergic sensitization, resulted in the establishment of a Th2 state, rather than a stimulation of a Treg cell population, supporting the Th2 promoting role of a-CD28 mAb together with TCR engagement. However, interesting findings were obtained by application of the superagonistic a-CD28 mAb in the challenge phase in established allergy. Conversely to the previous experiment, therapeutic administration of a-CD28 mAb lead to the generation of IL-10 secreting CD4+CD25+ T cell population in line with the induction of anti-allergic effects. Taking together the results of this study argue for the anti-inflammatory properties of T regulatory cells in allergic disease and highlights importance of these T cell subsets in the suppression of Th2 cell-driven response to allergen. Moreover, these observations suggest that the induction of IL-10 in vivo by T regulatory cells may represent a novel treatment strategy for allergic disorders.
Im Genom von Listeria monocytogenes konnten zwei Gene identifiziert werden, die mutmaßlich für niedermolekulare Protein-Tyrosin Phosphatasen (LMW-PTPs) kodieren, Lmo0938/Ptp-1 und Lmo2540/Ptp-2, beide ähneln LMW-PTPs von B. subtilis. Einzel- und Doppeldeletionen der ptp-Gene beeinflussten die Transkription zahlreicher Gene, wie anhand von Gesamtgenom-DNA-Microarray-Analysen und quantitativer RT-PCR gezeigt werden konnten. Insbesondere waren die Gene für i) die Internaline A und B, ii) den Osmoprotektanten-Transporter OpuC, iii) MCP, notwendig zur Flagellen-Bewegung und iv) eine Anzahl von den Proteinen, die in die Nährstoffaufnahme sowie den intrazellulären Metabolismus involviert sind, in vitro herunterreguliert. Die PrfA-regulierten Virulenzgene wurden in den Mutanten verstärkt exprimiert. Im Wesentlichen konnte das gleiche Transkriptionsmuster in infizierten Caco-2-Enterocyten beobachtet werden. Die verringerte Invasivität (abhängig von InlA) und die Unbeweglichkeit der Mutanten passt zu den Transkriptionsergebnissen. Jedoch wurden weder die intrazelluläre Replikation innerhalb eukaryontischer Wirtszellen noch die Resistenz gegen Stressbedingungen durch die Deletion beeinträchtigt. Die Proteome des Wildtyps und der ptp-Mutanten wurden durch 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen und es zeigte sich, dass die Transkriptionsergebnisse nicht vollständig im Proteom reflektiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ptps in die Regulationsnetzwerke des alternativen Stress-Sigmafaktor SigB und von PrfA eingreifen. Der ähnliche Effekt beider Ptps auf die Transkription oder auf den Proteinlevel deutet eine Interaktion oder Kooperation der beiden Enzyme an.
BAKTERIELLE ENDOSYMBIONTEN DER BIENENWÖLFE Symbiontische Interaktionen zwischen verschiedenen Arten stellen allgegenwärtige und essentielle Bestandteile natürlicher Systeme dar und haben wahrscheinlich die Evolution jedes rezenten Lebewesens beeinflusst. Insekten als die diverseste Metazoen-Klasse der Erde profitieren von dem außerordentlichen metabolischen Potenzial vieler Mikroorganismen in einer großen Anzahl mutualistischer Assoziationen. Die große Mehrheit der bisher untersuchten Symbiosen zwischen Insekten und Mikroorganismen stellen Interaktionen dar, in denen die Wirte durch die Symbionten mit essentiellen Nährstoffen versorgt werden. Es sind jedoch auch einige Fälle bekannt, in denen symbiontische Bakterien eine wichtige Rolle für die intraspezifische olfaktorische Kommunikation spielen oder zur Verteidigung gegen Pathogene oder Parasitoide dienen. Die vorliegende Arbeit untersucht eine hoch spezialisierte Assoziation zwischen einer Grabwespen-Art, dem Europäischen Bienenwolf (Philanthus triangulum, Hymenoptera, Crabronidae), und Bakterien aus der Familie der Actinomyceten. Die bakteriellen Symbionten sind an einem einzigartigen Ort zu finden: Sie werden in den Reservoiren spezialisierter Antennendrüsen weiblicher Bienenwölfe kultiviert. Das Weibchen sezerniert vor der Eiablage große Mengen dieser Bakterien in die unterirdischen Brutkammern. Wenn die Bienewolf-Larve einige Tage später ihre Nahrungsaufnahme an den von der Mutter als Nahrungsvorrat bereitgestellten Honigbienen beendet hat, nimmt sie die Bakterien auf und spinnt sie in ihren Kokon mit ein. Dort erfüllen die Symbionten eine wichtige Funktion, indem sie den Schimmelbefall herabsetzen und dadurch die Überlebenschancen der Larve im Kokon während der langen und gefährlichen Winterruhe signifikant erhöhen. Experimente, in denen Bienenwolf-Weibchen ohne die Bakterien aufgezogen wurden, und Beobachtungen an Bienenwolf-Larven deuten darauf hin, dass die Symbionten vertikal von der Mutter an die Töchter weitergegeben werden. Vermutlich werden die Bakterien während des Schlupfes oder kurz davor vom Kokon in die Antennendrüsen-Reservoire aufgenommen. Phylogenetische Untersuchungen von Wirten und Symbionten sowie Transfer-Experimente mit den Bakterien wären notwendig, um herauszufinden, ob ein horizontaler Austausch der Symbionten zwischen verschiedenen Bienenwolf-Arten möglich ist. Genetische Analysen zeigen, dass die Symbionten einer unbeschriebenen Art der Gattung Streptomyces innerhalb der Actinomyceten angehören. 16s rDNA Primer und eine fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonde wurden entwickelt, um die Bienenwolf-Symbionten mittels PCR und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) spezifisch nachweisen zu können. Mit Hilfe von PCR und Sequenzierungen der 16s rDNA konnten nah verwandte Endosymbionten in den Antennen von 28 Arten und Unterarten der Gattung Philanthus festgestellt werden, nicht aber in anderen Gattungen der Unterfamilie Philanthinae (Aphilanthops, Clypeadon, Cerceris), so dass die Symbiose auf die Gattung Philanthus beschränkt zu sein scheint. Phylogenetische Untersuchungen auf der Grundlage nahezu kompletter 16s rDNA-Sequenzen belegen, dass die Symbionten aller analysierten Bienenwolf- Arten eine monophyletische Gruppe innerhalb der Gattung Streptomyces bilden, was darauf hindeutet, dass die Symbiose hoch spezifisch ist und wahrscheinlich das Ergebnis einer langen Koevolution und Kospeziation darstellt. Anhand von Sequenzunterschieden zwischen den Symbionten lässt sich das Alter der Assoziation zwischen Philanthus und Streptomyces auf etwa 26-67 Millionen Jahre schätzen, was der Entstehung der Gattung Philanthus entsprechen könnte. Auf der Basis von 16s rDNA Sequenzen und Ultrastruktur-Daten wurden die Antennensymbionten der Bienenwölfe als neues Taxon ‚Candidatus Streptomyces philanthi’ beschrieben, wobei die Symbionten verschiedener Wirtsarten als Ökotypen behandelt und nach der Wirtsart benannt wurden (z.B. ‚Candidatus Streptomyces philanthi triangulum’). Wie die Bakterien von der Assoziation mit Bienenwölfen profitieren, ist noch unklar. Auf jeden Fall wird ihnen vom Wirt eine unbesetzte und wahrscheinlich konkurrenzfreie ökologische Nische in den Antennen sowie eine zuverlässige Weitergabe an die nächste Generation garantiert. Außerdem sprechen einige Hinweise für eine Versorgung der Bakterien mit Nährstoffen durch den Bienenwolf: (1) Weibchen legen manchmal mehrere Brutkammern pro Tag an und sezernieren jedes Mal große Mengen an Bakterien; die Bakterien müssen sich also in den Drüsen-Reservoiren schnell vermehren, um den Vorrat an Symbionten wieder aufzufüllen. (2) Die Reservoire sind von Typ 3-Drüsenzellen umgeben, die die Bakterien mit Nährstoffen versorgen könnten. (3) Eine der Reservoir-Wände weist eine netzartige Struktur auf, die möglicherweise den Eintritt von Hämolymphe und damit von Nährstoffen in das Reservoir zulässt. Dies wird durch chemische Analysen der Kohlenwasserstoffe in der Hämolymphe und in dem Antennendrüsen-Sekret untermauert, die sehr ähnliche Zusammensetzungen aufweisen. Die Assoziation zwischen Bienenwölfen und Streptomyceten stellt den ersten bekannten Fall einer Symbiose dar, bei der Bakterien in den Antennen von Insekten kultiviert werden, und sie repräsentiert eines von wenigen Beispielen für Actinomyceten als Symbionten von Insekten. Weitere Untersuchungen evolutionärer und ökologischer Aspekte dieser Symbiose werden wertvolle Erkenntnisse über die Bedeutung von Actinomyceten für die Pathogen-Abwehr bei Insekten liefern und könnten sogar zur Entdeckung neuer Sekundärmetabolite mit antibiotischen Eigenschaften für die Verwendung in der Humanmedizin führen. CHEMISCHE KOMMUNIKATION UND PARTNERWAHL BEIM EUROPÄISCHEN BIENENWOLF Chemische Signale stellen sowohl die älteste als auch die am weitesten verbreitete Form von Kommunikation zwischen Organismen dar. Bei Insekten spielen Pheromone eine essentielle Rolle für die intraspezifische Kommunikation, und eine Vielzahl aktueller Untersuchungen belegt die Bedeutung olfaktorischer Signale für die Balz und Paarung. Die meisten dieser Studien konzentrieren sich jedoch auf Weibchen-Pheromone, während von Männchen produzierte Pheromone trotz ihrer ökologischen und evolutionären Bedeutung für die Partneranlockung und Partnerwahl bisher wenig Beachtung gefunden haben. Männchen des Europäischen Bienenwolfes etablieren und verteidigen Territorien, die sie mit einem Kopfdrüsen-Sekret markieren. Dieses Sekret wirkt höchstwahrscheinlich als ein Sex- Pheromon und lockt paarungsbereite Weibchen an. Da Männchen-Territorien meist aggregiert in der Nähe von Weibchennestern auftreten, haben die Weibchen die Möglichkeit, zwischen verschiedenen potenziellen Paarungspartnern zu wählen. Die chemischen Analysen der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Zusammensetzung und Menge des männlichen Markierpheromons vom Verwandtschaftsgrad, der Herkunft, dem Alter und der Größe der Männchen abhängen. Das Pheromon beinhaltet demnach Informationen über eine Vielzahl von Eigenschaften der Männchen, die für die Weibchenwahl von Bedeutung sein könnten. Sowohl die genetische Distanz („optimal outbreeding“) als auch die allgemeine genetische Qualität („good genes“) eines Männchens könnte die Partnerwahl der Bienenwolf-Weibchen beeinflussen. In dieser Arbeit für den Europäischen Bienenwolf entwickelte polymorphe Mikrosatelliten legen den Grundstein für Vaterschaftsanalysen und ermöglichen so die Durchführung und Auswertung von Experimenten zur Weibchenwahl bei dieser Art.
Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären.
Bakterien müssen ständig in der Lage sein auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren zu können. Zur Wahrnehmung dieser Veränderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu zählen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und fünf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell für das Überleben von H. pylori, während HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugehörigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht für die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach Säure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur Säureresistenz beitragen, während ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines für das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese bestätigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bezüglich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. Für die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugehörige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Primärsequenzen für die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-Stämme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bezüglich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend für die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien dafür gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom üblichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Phänotypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung für ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das natürlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminosäurerest trägt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellulärem Acetylphosphat benötigt werden, einen normalen Wachstums-Phänotyp zeigt. Zusätzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivität von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht für die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori Stämme 26695 und 26695 1021Δ konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden.
Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als Überlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizität. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizität und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zunächst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum für die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bezüglich BDNF keine Veränderungen in Hippocampi CNTF-defizienter Mäuse gegenüber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten Mäusen eine eingeschränkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verständnis der – laut LTP-Untersuchungen – veränderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-Färbung nachweisbar. Zur Klärung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout Mäusen durchgeführt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in ähnlichem Maße hochreguliert, was für alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF&LIF-defizienten Mäusen, wobei LIF-defiziente Tiere keine veränderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorläuferzellen bestätigten die Hypothese, wonach cortikale Vorläuferzellen zunächst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorläuferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo für die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist.
1) Wenn der Erhalt der biologischen Vielfalt gesellschaftliche Zielvorgabe ist und dafür landwirtschaftlich genutzte Flächen einbezogen werden sollen, sind Maßnahmen zu präferieren, deren Opportunitätskosten gering sind. Diese Arbeit stellt den Versuch dar, solche Maßnahmen am Beispielsystem „Weinbau“ zu entwickeln. 2) Die Anbauform „Weinbau“ ist für diese Studie aus folgenden Gründen besonders geeignet: Rebflächen sind an Standorte mit besonderen klimatischen Bedingungen gebunden, die ebenfalls für Lebensgemeinschaften von Bedeutung sind, die in Deutschland als besonders gefährdet gelten (thermophile und xerothermophile Gemeinschaften). Auch die speziellen, früher artenreichen „Weinbergsgesellschaften“ (Flora und Fauna) verdienen besondere Beachtung; zudem ist in Unterfranken eine starke räumliche Beziehung zwischen Naturschutzgebieten, die thermophile und xerothermophile Artengemeinschaften schützen sollen, und umgebenden Rebflächen gegeben. Weiterhin erscheinen Rebflächen durch die Trennung der Anbaufläche in die Bereiche „Zeile“ (die den linienförmig angepflanzten Reben entspricht) und „Gasse“ (ein etwa zwei Meter breiter Streifen zwischen den Zeilen) hervorragend geeignet, landwirtschaftliche Produktion und biodiversitäts-orientierte Maßnahmen zu verbinden. 3) In der Region „Mainfranken“ (Deutschland, Bayern) wurden drei Vergleichsflächenpaare in Ertragsrebflächen ausgewählt, die einerseits praxisüblich, andererseits nach den Vorschriften des „ökologischen Landbaus“ i.S. des BML wirtschaften. 4) In der naturschutzfachlichen Analyse wurden folgende Gesellschaften der Vergleichsflächen faunistisch untersucht: bodenaktive (epigäische) Spinnen (Araneae), Laufkäfer (Carabidae), Zikaden (Auchenorrhyncha) und Heuschrecken (Saltatoria). Im betriebswirtschaftlichen Teil wurde nach Literaturdaten und Arbeitstagebüchern die Außenwirtschaft der Weinbaubetriebe analysiert. Beide Datengruppen wurden zusammengeführt, um die Auswirkungen betrieblicher Maßnahmen der Außenwirtschaft sowohl im Hinblick auf ihre naturschutzfachliche als auch betriebswirtschaftliche Wirksamkeit zu ermitteln und hieraus Umstellungsstrategien im Weinbau abzuleiten. Zudem wurden die monetären Differenzen quantifiziert, um die Höhe etwaiger Ausgleichszahlungen bestimmen zu können. 5) Die naturschutzfachliche Analyse zeigte, dass mit Ausnahme der Heuschrecken alle Gruppen eine starke Förderung durch den ökologischen Anbau erfuhren; die Förderung betraf sowohl die allgemeine Diversität wie naturschutzfachlich bedeutsame Arten. Diese Effekte konnten vor allem auf den Faktor „Einführung einer struktur- und artenreichen Dauerbegrünung“ sowie auf die Etablierung ungestörter Rückzugsbereiche zurückgeführt werden. Die Veränderungen des Pflanzenschutzes wurden als nicht wirksam eingestuft, die Kupferbehandlungen im ökologischen Weinbau werden sogar als problematisch angesehen. Weiterhin wurde die Maßnahme „Mulchen“ des ökologischen Weinbaus als problematische Maßnahme der Begrünungspflege identifiziert. 6) Die betriebswirtschaftliche Analyse zeigte, dass für die Ertragssituation der Betriebe vor allem der Pflanzenschutz bedeutsam ist. Von der Einführung einer Dauerbegrünung gehen moderate Effekte aus, die zudem oftmals auf eine „Umstellungsphase“ befristet sind. 7) In der Zusammenführung beider Analysen wird ein Anbauschema vorgeschlagen, dass ein modifiziertes Begrünungsmodell nach ökologischer Wirtschaftsweise mit einem modifizierten Pflanzenschutzsystem nach praxisüblicher Wirtschaftsweise kombiniert. Die Kalkulation eines solchen Systems zeigt, dass auf Ausgleichszahlungen verzichtet werden könnte, bzw. geleistete Zahlungen nicht als Kompensation i.e.S., sondern als Anreizzahlungen zu verstehen wären. 8) Die Notwendigkeit einer Überprüfung des entwickelten Schemas in einem Konversionsexperiment wird dargelegt.
Die Gattung Listeria umfasst sechs bekannte Arten ubiquitär vorkommender Gram-positiver, nicht sporulierender Stäbchenbakterien. Von diesen Spezies sind Listeria monocytogenes und L. ivanovii in der Lage bei Mensch und Tier das Krankheitsbild der Listeriose zu verursachen (Rocourt & Seeliger, 1985; Vázquez-Boland et al., 2001b; Weis & Seeliger, 1975), wobei L. ivanovii vorwiegend bei Tieren als Krankheitserreger vorkommt (Cummins et al., 1994; Hof & Hefner, 1988). L. monocytogenes gilt als wichtiges Modell für ein intrazelluläres Pathogen, das mit Hilfe seiner Internaline auch in nicht-professionelle Phagozyten invadieren (Gaillard et al., 1991; Lingnau et al., 1995) und sich dank einer Reihe weiterer Virulenzfaktoren im Zytoplasma vermehren, fortbewegen und Nachbarzellen infizieren kann (Tilney & Portnoy, 1989). Die beiden pathogenen Arten und das apathogene L. seeligeri besitzen eine als LIPI-1 bezeichnete Pathogenitätsinsel (Gouin et al., 1994; Kreft et al., 2002). Internalingene sind bei L. monocytogenes teilweise geclustert und bei L. ivanovii zu einem großen Teil in einer LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel organisiert (Domínguez-Bernal et al., 2006; Dramsi et al., 1997; Gaillard et al., 1991; Raffelsbauer et al., 1998). Die Expression vieler dieser Virulenzgene wird durch das zentrale Regulatorprotein PrfA gesteuert, dessen Gen prfA selbst Teil der LIPI-1 ist (Domínguez-Bernal et al., 2006; Leimeister-Wächter et al., 1990; Lingnau et al., 1995; Mengaud et al., 1991a). Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Internaline InlC, InlE, InlG und InlH von L. monocytogenes näher untersucht werden. Dazu wurden rekombinante His6-markierte Internaline aufgereinigt und polyklonale Antiseren gegen die Internaline A, B, E, G und H hergestellt. Darüber hinaus gelang die Herstellung zweier monoklonaler Antikörper gegen InlG. Obwohl die Antikörper gegen InlG und InlE ihre rekombinanten Antigene gut dekorieren, konnten mit ihnen keine Proteine in Zellwand- oder Überstandspräparaten von L. monocytogenes EGD und EGDe detektiert werden. Das Antiserum gegen InlH kreuzreagierte mit InlA und auch schwach mit anderen Internalinen. In Zellwandpräparaten von L. monocytogenes dekorierte es ein ~50 kDa schweres Protein, welches mit InlH identisch sein könnte. Es fehlt in inlG/H/E Deletionsmutanten und wird in einer inlA/B Deletionsmutante stärker exprimiert. Im Kulturüberstand ist es etwas schwerer, wie man es von einem Protein mit LPXTG Motiv erwartet, das nicht von Sortase (Bierne et al., 2002; Garandeau et al., 2002) prozessiert wurde. In L. monocytogenes EGDe wird dieses ~50 kDa Protein um ein bis zwei dekadische Größenordungen stärker exprimiert als in L. monocytogenes EGD. Die Expression des Proteins war bei 30 und 37 °C gleich stark und wurde nicht durch PrfA reguliert. In Zellwandpräparaten von L. ivanovii ATCC 19119 dekorierten die Seren gegen InlA und InlH ein Protein das in seiner Größe dem InlA von L. monocytogenes entspricht. Mit Hexosaminidase Assays zur Untersuchung von Zelladhärenz (nach Landegren, 1984) an rekombinante His6-markierte Internaline konnte keine Interaktion der Internaline InlE, InlG oder InlH mit Oberflächenfaktoren von Caco-2, HeLa oder HepG2 Zellen nachgewiesen werden, während Positivkontrollen mit InlA und InlB weitestgehend erwartungsgemäß ausfielen. InlC besitzt jedoch offenbar einen bisher noch nicht genauer identifizierten Rezeptor auf der Zelloberfläche. An InlC und EGF adhärierten Caco-2 Zellen stark wachstumsphasenabhängig und etwa tausendfach schwächer als an InlA. Die beste Bindung erfolgte bei semikonfluent gewachsenen Zellen, die am Vortag ausgesät wurden. Unter diesen Bedingungen war auch die von Bergmann et al. beobachtete unterstützende Wirkung von InlC auf die InlA-abhängige Invasion am größten (Bergmann et al., 2002). In dieser Arbeit wurden außerdem die Promotoren von Internalingenen aus L. ivanovii, sowie weitere Virulenzgene (plcA, hly, actA) der Spezies L. monocytogenes, L. ivanovii und L. seeligeri mit Hilfe eines zellfreien in vitro Transkriptionssystems (Lalic-Mülthaler et al., 2001) untersucht, um deren PrfA-Abhängigkeit und Aktivität unabhängig von physiologischen Faktoren analysieren zu können, da die PrfA-Aktivität in vivo pleiotrop reguliert wird (Dickneite et al., 1998; Ermolaeva et al., 2004; Milenbachs et al., 1997; Milenbachs Lukowiak et al., 2004; Renzoni et al., 1997; Ripio et al., 1996). Dafür wurde in dieser Arbeit RNA-Polymerase aus L. monocytogenes ΔprfA ΔsigB (Stritzker et al., 2005) isoliert. Gleichzeitig wurde die Aktivität von rekombinanten His6-markierten PrfA Proteinen untersucht. Dazu wurden die PrfA Proteine von L. monocytogenes (m-PrfA und hyperaktives m-PrfA* (Ripio et al., 1997b)), L. ivanovii (i-PrfA) und L. seeligeri (s-PrfA), so wie ein Hybridprotein (sm-PrfA) aufgereinigt. Das Hybridprotein sm-PrfA entspricht s-PrfA bis auf die letzten 38 Aminosäurereste, die durch jene von m-PrfA ersetzt wurden. ...
Regulation of mitotic progression : Focus on Plk1 function and the novel Ska complex at kinetochores
(2006)
During mitosis the duplicated chromosomes have to be faithfully segregated into the nascent daughter cells in order to maintain genomic stability. This critical process is dependent on the rearrangement of the interphase microtubule (MT) network, resulting in the formation of a bipolar mitotic spindle. For proper chromosome segregation all chromosomes have to become connected to MTs emanating from opposite spindle poles. The MT attachment sites on the chromosomes are the kinetochores (KTs), which are also required to monitor the integrity of KT-MT interactions via the spindle assembly checkpoint (SAC). The first part of this work concerns the action of Polo-like kinase 1 (Plk1). Plk1 is one of the most prominent mitotic kinases and is involved in the regulation of multiple essential steps during mitosis consistent with its dynamic localisation to spindle poles, KTs and the central spindle. Despite a nice model of Plk1 targeting to different mitotic structures via its phosphopeptide binding Polo-box domain (PBD), the exact molecular details of Plk1 functioning, in particular at the KTs, remain obscure. By two different approaches we obtained cells with an unlocalised Plk1 kinase activity: first by generating stable HeLa S3 cell lines, which upon induction expressed the PBD and thus displaced endogenous Plk1 from its sites of action. Secondly, by rescuing cells RNAi-depleted of Plk1 with the catalytic Plk1 domain only. Centrosome maturation, bipolar spindle assembly and loss of cohesion between the chromatid arms proceeded normally in either cells, in contrast to Plk1-depleted cells, arguing that PBD-mediated targeting of Plk1 is less critical for the tested functions. Remarkably, however, both the PBD expressing as well as the Plk1-depleted cells rescued with the catalytic domain of Plk1 arrested in early mitosis in a SAC-dependent manner with uncongressed chromosomes. These data disclose a so far unrecognised role of Plk1 in proper chromosome congression and point at a particular requirement for PBD-mediated localised Plk1 activity at the KTs. In the second part of the thesis, we characterised a novel spindle and KT associated protein, termed Ska1, which was originally identified in a spindle inventory. Ska1 associated with KTs following MT attachment during prometaphase and formed a complex with at least another novel protein of identical localisation, called Ska2. Ska1 was required for Ska2 stability in vivo and depletion of either Ska1 or Ska2 resulted in the loss of both proteins from the KTs. The absence of Ska proteins did not disrupt overall KT structure but most strikingly induced cells to undergo a prolonged SAC-dependent delay in a metaphase-like state. The delay was characterised by weakened kinetochore-fibre stability, recruitment of Mad2 protein to a few KTs and the occasional loss of individual chromosomes from the metaphase plate. These data indicate that the Ska1/2 complex plays a critical role in the maintenance of a KT-MT attachments and/or SAC silencing.
Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.
Das Hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die für die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimhäute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgelöst und manifestieren sich häufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottisödem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalität aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgewählte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingefügt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivitäts-Assays überprüft. Während bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalität für das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivitäten bestätigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeinträchtige Aktivitäten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen dürften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss über die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verfügbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindomäne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollständig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten Fällen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationsträger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivitätsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein nützliches Hilfsmittel um die Kausalität von Missense-Mutationen aufzuklären und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminosäuren im C1-INH-Protein.
Der Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) spielt eine zentrale Rolle in entzündlichen Prozessen. Die Behandlung mit Antikörpern, die murines GM-CSF neutralisieren, zeigte signifikante Behandlungseffekte in Maus-Modellen für Rheumatoide Arthritis, Autoimmune Enzephalomyelitis, entzündliche Erkrankungen der Lunge und Psoriasis. Diese Arbeit beschreibt die Generierung des ersten vollständig humanen Einzelketten (scFv)-Antikörpers, der effektiv humanes GM-CSF (hGM-CSF) neutralisiert. Dieser humane scFv-Antikörper wurde mit Hilfe der Phage-Display-Technologie, ausgehend von einem monoklonalen Ratten-Antikörper mit hGM-CSF-neutralisierender Aktivität, konstruiert. In einem ersten Schritt wurde die VH-Domäne des parentalen Ratten-Antikörpers mit einem humanen leichte Ketten V-Repertoire kombiniert. Nach Phage-Display-Selektion wurde ein dominanter Klon identifiziert, der für ein chimäres Ratte/Human scFv-Fragment kodiert. Dieser scFv-Antikörper neutralisiert hGM-CSF mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50) im nanomolaren Bereich. Die humane leichte Kette dieses Klons wurde dann mit einem humanen schwere Ketten V-Repertoire kombiniert. Um die Bindungsspezifität des Ursprungsantikörpers für den neutralisierenden Bereich auf dem Antigen zu erhalten, enthielt dieses Repertoire die Komplementaritäts-bestimmende Region 3 (CDR3) der parentalen VH-Domäne. Nach Phage-Display-Selektion wurden mehrere scFv-Antikörper identifiziert, die hGM-CSF im niedrig nanomolaren Konzentrationsbereich neutralisierten. Das scFv-Fragment mit der höchsten hGM-CSF-neutralisierenden Aktivität (3077) wurde in verschiedene therapeutisch relevante Antikörperformate überführt. Zum einen wurde das scFv-Fragment über einen zusätzlichen C-terminalen Cystein-Rest an ein verzweigtes, 40 kD-grosses Polyethylenglycol (PEG) –Polymer konjugiert. Zum anderen wurde das scFv-Fragment durch Fusion mit humanen konstanten Immunglobulin-Domänen zu einem ganzen IgG1/kappa-Antikörper vervollständigt. Die so generierten Konstrukte mit identischer Spezifität wurden dann in vitro im Hinblick auf Bindungsaffinität, Neutralisierungsaktivität und Stabilität untersucht. Die Konjugation des PEG-Polymers hatte einen vernachlässigbaren Effekt auf das Neutralisierungspotential des scFv-Fragments in vitro, obwohl sie aufgrund einer verlangsamten Assoziationsrate eine reduzierte Bindungsaffinität verursachte. Der humane IgG1-Antikörper zeigte sowohl eine verbesserte Bindungsaffinität als auch eine erhöhte Neutralisierungsaktivität im Vergleich zum nicht-PEGylierten wie auch zum PEGylierten scFv-Fragment. Wir konnten außerdem zeigen, dass die PEGylierung in der thermischen Stabilität des scFv-Antikörpers einen deutlichen Anstieg um 10°C vermittelte. Aufgrund der hohen Neutralisierungsaktivität und Stabilität des IgG1-Antikörpers 3077 wie auch des PEGylierten scFv-Fragments 3077 sind beide Moleküle - in unterschiedlichen klinischen Anwendungsbereichen - potentielle Kandidaten für eine Behandlung humaner entzündlicher Erkrankungen.
Clonality analysis in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) associated with Richter's syndrome
(2006)
B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) comprises 90% of chronic lymphoid leukemias in Western countries and patients with B-CLL have a heterogeneous clinical course. Approximately 3-5% of B-CLL patients encounter transformation to an aggressive lymphoma, mainly diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) or Hodgkin’s lymphoma (HL) which has been defined as Richter’s syndrome and is associated with a poor clinical outcome. The mutational status of the immunoglobulin heavy chain variable region (IgVH) gene not only implies the developmental stage at which the neoplastic transformation occurs in a given B-cell lymphoma, but also constitutes an important prognostic factor in B-CLL, since B-CLL patients with unmutated IgVH genes usually have a poor clinical outcome. Sparse molecular analyses performed in Richter’s syndrome so far suggest that it can occur in B-CLL patients carrying mutated or unmutated IgVH genes, and tumor cells in DLBCL or HL can be clonally identical to the B-CLL clone or arise as an independent, secondary lymphoma. To determine the clonal relationship between DLBCL or Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) cells and pre-existing B-CLL cells in a larger series, to identify the IgVH gene usage and the mutational status and to explore possible prognostic factors in B-CLL undergoing Richter’s transformation, we utilized a PCR-based GeneScan approach with subsequent sequencing of the IgVH genes. In cases with HRS/HRS-like cells laser capture microdissection (LCM) was employed to isolate these cells. In addition, a thorough morphological and immunohistochemical analysis was performed. In total, specimens from 48 patients were investigated including 40 cases of Richter’s syndrome and additional 8 cases of B-CLL cases with the presence of CD30-positive HRS-like cells. Among 40 cases of Richter’s syndrome, 34 B-CLL cases showed transformation to DLBCL and 6 cases transformed from B-CLL to HL. Sequencing was performed in 23 paired B-CLL and DLBCL cases. In 18 cases, B-CLL and DLBCL were clonally identical, whereas DLBCL developed as a clonally independent neoplasm in 5 patients. Among the clonally related pairs, 11 out of 15 cases carried unmutated IgVH genes in both the B-CLL and DLBCL component, whereas 5 of 6 B-CLL cases that showed transformation to HL carried mutated IgVH genes. HRS cells in two samples and HRS-like cells in one sample were clonally distinct from the B-CLL clone and infected by EBV, whereas one sample of HRS-like cells was related to the clone from the surrounding B-CLL cells and did not express latent membrane protein-1 (LMP1). The VH genes VH3-23, VH3-74, VH1-2 and VH3-9 were overused in B-CLL cases that transformed to DLBCL, whereas VH4-34 and VH3-48 were used in over half of the B-CLL cases with transformation to HL. Immunohistochemical staining of ZAP70 was significantly associated with unmutated IgVH genes in B-CLL cases undergoing Richter’s transformation. Clinical follow-up data could be obtained from 24 patients. The median survival times of B-CLL patients with transformation to DLBCL or HL were 7 and 21 months, respectively. No significantly different survival times were found between clonally related or unrelated cases, or between IgVH-mutated or -unmutated cases. We conclude that in Richter’s transformation, DLBCL can evolve by clonal transformation of the pre-existing B-CLL clone or occur as an independent, clonally unrelated neoplasm. In the majority of cases (78% in our series), B-CLL and DLBCL are clonally identical. In a subset of patients, however, DLBCL develops as an independent secondary neoplasm that is not clonally related to the B-CLL. Clonal transformation into DLBCL predominantly occurs in B-CLL patients with unmutated IgVH genes, whereas most B-CLL patients that show transformation to HL or CD30-positive HRS-like cells carry mutated IgVH genes. The tendency that IgVH-unmutated B-CLL transforms to DLBCL and IgVH-mutated B-CLL transforms to HL implies different transformation pathways in the two subtypes of Richter’s syndrome. In addition, important pathogenetic differences are likely to exist between DLBCL cases derived from a pre-existing B-CLL as compared to de novo DLBCL cases, since de novo DLBCL is usually characterized by mutated IgVH genes. The biased usage of IgVH genes in the two subtypes of Richter’s syndrome suggests a possible role for antigen involvement in tumorigenesis also in B-CLL cases that undergo Richter’s transformation. Finally, EBV-association in the HL variant of Richter’s syndrome occurs more frequently in clonally unrelated secondary malignancies.
DNA microarrays have become a standard technique to assess the mRNA levels for complete genomes. To identify significantly regulated genes from these large amounts of data a wealth of methods has been developed. Despite this, the functional interpretation (i.e. deducing biological hypothesis from the data) still remains a major bottleneck in microarray data analysis. Most available methods display the set of significant genes in long lists, from which common functional properties have to be extracted. This is not only a tedious and time-consuming task, which becomes less and less feasible with increasing numbers of experimental conditions, but is also prone to errors, since it is commonly done by eye. In the course of this work methods have been developed and tested, that allow for a computerbased analysis of functional properties being relevant in the given experimental setting. To this end the Gene Ontology was chosen as an appropriate source of annotation data, because it combines human-readability with computer-accessibility of the annotations term and thus allows for a statistical analysis of functional properties. Here the gene-annotations are integrated in a Correspondence Analysis which allows to visualize genes, hybridizations and functional categories in a single plot. Due to the increasing amounts of available annotations and the fact that in most settings only few functional processes are differentially regulated, several filter criteria have been developed to reduce the number of displayed annotations to a set being relevant in the given experimental setting. The applicability of the presented visualization and filtering have both been validated on datasets of varying complexity. Starting from the well studied glucose-pathway in S. cerevisiae up to the comparison of different tumor types in human. In both settings the method generated well interpretable plots, which allowed for an immediate identification of the major functional differences between the experimental conditions [90]. While the integration of annotation data like GO facilitates functional interpretation, it lacks the capability to identify key regulatory elements. To facilitate such an analysis, the occurrence of transcription factor binding sites in upstream regions of genes has been integrated to the analysis as well. Again this methodology was biologically validated on S. cerevisiae as well human cancer data sets. In both settings TFs known to exhibit central roles for the observed transcriptional changes were plotted in marked positions and thus could be immediately identified [206]. In essence, integration of supplementary information in Correspondence Analysis visualizes genes, hybridizations and annotation data in a single, well interpretable plot. This allows for an intuitive identification of relevant annotations even in complex experimental settings. The presented approach is not limited to the shown types of data, but is generalizable to account for the majority of the available annotation data.
Aufklärung der Struktur und Charakterisierung des ternären Komplexes aus BMP-2, BMPR-IA und ActR-IIB
(2006)
„Bone Morphogenetic Proteins“ (BMPs) kontrollieren eine Vielzahl unterschiedlichster Prozesse bei der Embryonalentwicklung und der postnatalen Gewebehomöostase. Wie TGF-betas, Activine und andere Mitglieder der TGF-beta Superfamilie vermitteln BMPs ihr Signal durch die Bildung eines aus dem Liganden und zwei Rezeptorsubtypen bestehenden Signalkomplexes. Für die Rezeptoraktivierung ist ein Zwei-Schritt Mechanismus allgemein akzeptiert. Bisher wurde nur der erste Schritt, die Bindung des Liganden an seinen hochaffinen Rezeptor, strukturell untersucht. Der molekulare Mechanismus der anschließenden Rekrutierung des niederaffinen Rezeptortyps war bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Präparation, Kristallisation und Strukturaufklärung des ternären Komplexes aus BMP-2 und den extrazellulären Domänen von BMPR-IA und ActR-IIB. Mit der Kristallstruktur dieses ternären Komplexes kann erstmals der Mechanismus der BMP Rezeptoraktivierung von der Bindung des Liganden bis hin zur Transaktivierung untersucht werden. Der Ligand BMP-2 präsentiert sich hier, im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der TGF-beta Superfamilie, als nahezu starre Komponente, um welche die beiden Rezeptortypen symmetrisch angelagert werden. Zwischen den extrazellulären Domänen der Rezeptoren können keine direkten Kontakte beobachtet werden. Die in Zellen beobachtete Kooperativität bei der Rekrutierung des niederaffinen Rezeptors im BMP-2 System ist folglich weder durch allosterische Effekte, noch durch direkte Rezeptor-Rezeptor-Kontakte erklärbar. Vielmehr repräsentiert die Bindung des niederaffinen Rezeptors von BMP-2 einen Minimalmechanismus, bei dem Kooperativität über die Verringerung der Freiheitsgrade durch Lokalisation des Liganden in der Zellmembran erzeugt wird. Die durchgeführten Mutations-/Interaktionsanalysen erlauben vertiefende Einblicke wie Affinität und Spezifität im BMP/Activin-System generiert werden. Es zeigt sich, dass sowohl bei der niederaffinen Interaktion von ActR-IIBecd mit BMP-2 bzw. BMP-7 als auch bei der hochaffinen Bindung von ActA mit ActR-IIBecd ein Großteil der freien Bindungsenergie von denselben hydrophoben Interaktionen getragen wird. Während polare Interaktionen bei der niederaffinen Bindung der BMPs an ActR-IIBecd kaum eine Rolle spielen, stellt die zentrale Wasserstoffbrücke zwischen ActA Ser90(OG) und ActR-IIB Leu61(N) bei der Bildung des Komplexes ActA/ActR-IIBecd eine entscheidende Determinante der hochaffinen Bindung dar. BMP-2 bindet an die Typ II Rezeptoren BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB mit nahezu identischer Affinität, daher wird eine promiske Verwendung dieser Rezeptoren angenommen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die spezifische Erkennung und Bindung der Typ II Rezeptoren durch den Austausch einzelner Aminosäuren modulierbar ist. Mit den hier gewonnenen Kenntnissen über den molekularen Mechanismus der Typ II Rezeptorerkennung ist nun eine Generierung von BMPs mit definierter Typ II Rezeptorspezifität möglich. Diese BMP-2 Varianten können als Werkzeuge zur Aufklärung von Typ II Rezeptor-spezifischen Signalwegen verwendet werden. Ebenso wäre es denkbar, BMP-2 Varianten mit ausgeprägter Typ II Rezeptor Spezifität in vivo zur Modulation TypII Rezeptor spezifischer Signalwege zu benutzen. Beispielsweise könnte ein auf BMP-2 basierendes ActR-IIB-spezifisches Protein als Myostatin-Antagonist zur Behandlung von Muskeldystrophie eingesetzt werden.
Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex.
1. Oviposition site selection is crucial for the reproductive success of herbivorous insects. According to the preference–performance hypothesis, females should oviposit on host plants that enhance the performance of their offspring. More specifically, the plant vigour hypothesis predicts that females should prefer large and vigorously growing host plants for oviposition and that larvae should perform best on these plants. 2. The present study examined whether females of the monophagous leaf beetle Cassida canaliculata Laich. (Coleoptera: Chrysomelidae) prefer to oviposit on large host plant individuals of the meadow clary and whether large host plants are of higher nutritional quality than small host plants. Subsequently, it was tested whether the female preference correlates with offspring performance and survival. 3. In the field, females preferred large host plant individuals for oviposition and host plant quality, i.e. leaf nitrogen content, was significantly higher in leaves of large than of small host plants. 4. In the laboratory, larval development time was shorter on leaves of large host plant individuals than on small host plant individuals, but this could not be shown in the field. 5. However, a predator-exclusion experiment in the field resulted in a higher survival of larvae on large host plants than on small host plants when all predators had free access to the plants. On caged host plants there was no difference in survival of larvae between plant size categories. 6. It is concluded that females of C. canaliculata select oviposition sites that enhance both performance and survival of their offspring, which meets the predictions of the plant vigour hypothesis.
We examined the regulation of NFATc1 in different lymphomas and observed an inversed correlation between the methylation status and expression of NFATc1. Our data demonstrate that aberrant DNA methylation associated with chromatin remodeling within nfatc1 locus is a major mechanism for the repression of NFATc1 expression, suggesting that the DNA methylation-mediated transcriptional silencing of NFATc1 may be a critical event in the tumorogenesis of ALCLs and cHLs. Furthermore, the DNA methylation of human nfatc1 promoter region could be used as a novel biomarker of tumor progression. Our results indicate a close link between the loss of immunoreceptor signaling and NFATc1 expression in human lymphomas. For both ALCLs and cHLs, defects in immunoreceptor signaling have been described which result in a loss of receptor-mediated gene expression programs (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T cells, one indicator gene of these programs appears to be the nfatc1 gene whose expression is controlled by TCR signals (Chuvpilo et al., 2002a). In contrast, in T cells NFATc1 expression is unaffected by TCR signals, and NFATc2 was found to be expressed at normal levels in ALCLs and cHLs (L.K., unpubl. data). Moreover, the activity of NF-kappaB factors which can bind to certain NFAT binding sites and share a distantly-related DNA binding domain with NFATs is strongly elevated in cHL cells (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002) suggesting that NFATs and NF-kappaBs exert very different effects on generation and maintenance of Hodgkin’s lymhomas. However, it should be mentioned that in Burkitt’s and further B cell lymphomas in which NFATc1 proteins are strongly expressed and controlled by receptor signals (Kondo et al., 2003), they could exert a promoting function in tumor development. The genes of p53 family members p63 and p73 are prominent examples for mammalian genes whose products can act both as oncoproteins and tumor suppressor genes (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), and it is likely that more genes exist which encode both tumor suppressors and oncoproteins. It remains to be shown whether the nfatc1 gene is one of them.
Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes besitzt die Fähigkeit, eukaryotische Wirtszellen zu penetrieren, sich in diesen zu vermehren, fortzubewegen und zwischen den Zellen auszubreiten. Im Zuge des intrazellulären Lebenszyklus gehen Listerien Wechselwirkungen mit ver-schiedenen zellulären Proteinen ein. Als eines dieser Proteine konnte das zelluläre Phosphoprotein Stathmin identifiziert werden. Dieses Protein bindet an Untereinheiten des Tubulins und destabilisiert dadurch Mikrotubuli (MT). Es wird durch Phosphorylierung von vier spezifischen Serinresten in seiner MT-destabilisierenden Aktivität reguliert. Da Stathmin als Antwort auf externe Signale zelluläre Funktionen, z. B. Zell-Proliferation und Differenzierung reguliert, vermutet man seine Funktion in einer Art Relais welches verschiedene Signale aus dem Umfeld der Zelle integriert. In mit L. monocytogenes infizierten Wirtszellen wird Stathmin an die Oberfläche intrazellulärer Bakterien rekrutiert. Inwiefern diese Rekrutierung das Phosphorylierungsmuster von Stathmin und damit dessen Aktivität beeinflusst, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Stathmin knock-out Mäuse sollten sich gut eignen, um die Rolle von Stathmin während einer Infektion mit L. monocytogenes EGD in vitro und in vivo zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass in Stathmin(-/-)-Makrophagen der intrazelluläre Lebenszyklus der Listerien nicht signifikant beeinflusst ist. Nach intravenöser Verabreichung von 5x103 L. monocytogenes waren drei Tage nach der Infektion in Leber und Milz der knock-out Mäuse allerdings signifikant mehr Listerien nachzuweisen, als in den Organen wildtypischer Mäuse. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und einem anti-Stathmin-Antiersum konnte an mit verschiedenen L. monocytogenes-Mutanten infizierten Zellen gezeigt werden, dass Stathmin mit der Oberfläche intrazellulärer Listerien kolokalisiert. Allerdings konnten dabei die Angaben in der Literatur nicht bestätigt werden, wonach für diese Kolokalisation die Expression von ActA notwendig ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Gegensatz zu den publizierten Daten dafür, dass Stathmin über einen bisher noch unbekannten Mechanismus ActA-unabhängig an intrazelluläre Listerien rekrutiert wird. Zweikomponentensysteme ermöglichen Bakterien eine rasche Anpassung an sich verändernde Umweltbedingungen, da sie extra- und intrazelluläre Stimuli in zelluläre Signale umwandeln. Um die 16 in der Genomsequenz von L. mono-cytogenes EGDe identifizierten Zweikomponentensysteme charakterisieren zu können, wurden individuelle Mutanten konstruiert, in denen individuelle Response Regulatorgene deletiert sind. Die erhaltenen Mutanten wurden in vitro und in vivo auf ihr Wachstumsverhalten hin untersucht. Es zeigte sich, dass unter den angewandten Kultur- und Versuchsbedingungen keines der Zweikomponentensysteme eine signifikante Rolle bei der Anpassung an Temperatur, sowie an oxidativen oder osmotischen Stress spielt. Die Zugabe von 5 % Ethanol hatte einen stark hemmenden Effekt auf das Wachstum von 4 Mutanten, wohingegen zwei andere Mutanten in Gegenwart des Alkohols deutlich besser wuchsen. Unter anaeroben Bedingungen konnte kein Unterschied im Wachstum beobachtet werden. Die Expression wichtiger Virulenzgene war in keiner der untersuchten Mutanten im Vergleich zum Ausgangsstamm verändert. Die intrazelluläre Replikation sowie intrazelluläre Bewegung und Ausbreitung im Zellrasen waren durch die Deletion der Response Regulatorgene nicht beeinträchtigt. Abgesehen von geringen Unterschieden in der Invasivität einiger Deletionsmutanten für Cos-1 und Caco-2 Zellen zeigte sich keiner der Response Regulatoren für den intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes erforderlich. Es zeigte sich, dass der in der vorliegenden Arbeit verwendete L. monocyto-genes-Wildstamm auch bei der für die Flagellenexpression normalerweise nicht-permissiven Temperatur von 37° C noch beweglich ist. Die L. monocytogenes ΔdegU-Mutante war dagegen auf Weichagar temperaturunabhängig unbeweglich. Die elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass dieser Stamm im Gegensatz zum Wildtyp auch bei 24° C keine Flagellen ausbildet. Durch vergleichende Proteomanalysen konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes ΔdegU bei 24° C wesentliche Proteine des Flagellenapparates nicht synthetisiert. Mittels Transkriptomanalysen konnten die Ergebnisse der Proteomanalysen bestätigt werden. Es wurden neben Genen, die für Proteine der Flagellenbiosynthese und Chemotaxis codieren, noch weitere Gene identifiziert, die offensichtlich unter der transkriptionellen Kontrolle des Response Regulators DegU stehen. Die Ergebnisse der in vivo Studien zeigten, dass L. monocytogenes ΔdegU deutlich virulenzattenuiert ist. Für die restlichen L. monocytogenes ΔTCS-Mutanten waren im Vergleich zum Wildtyp die Unterschiede in Leber und Milz nur leicht verändert und statistisch nicht signifikant.
Cloning and functional characterization of novel genes expressed preferentially in the human retina
(2005)
The human retina is a multi-layered neuronal tissue specialized for the reception and processing of visual information. The retina is composed of a great diversity of neuronal cell types including rod and cone photoreceptors, bipolar cells, ganglion cells, amacrine cells, horizontal cells and Müller glia. In response to light, a coordinated series of molecular events, the so-called phototransduction cascade, is triggered in photoreceptor cells and the signals from the photoreceptors are further processed by the bipolar and ganglion cells to the higher centers of the brain. The retina as highly complex system may be greatly susceptible to genetic defects which can lead to a wide range of disease phenotypes. Therefore, isolation and characterisation of the genes active in the human retina will facilitate our deeper understanding of retinal physiology and mechanisms underlying retinal degeneration and provide novel candidates for the retinal disease genes. To identify novel genes that are specifically or predominantly expressed in the human retina, a cDNA library enriched for retina specific transcripts was generated using suppression subtractive hybridization (SSH) technique. In total, 1113 clones were randomly isolated from the retina SSH cDNA library and partially sequenced. On the basis of BLASTN algorithm analysis these clones were classified into four categories including those with I) significant homology to known human genes (766/1113), II) significant homology to partial transcripts and hypothetical gene predictions (162/1113), III) no homology to known mRNAs (149/1113), and IV) vector sequences and clones derived from mitochondrial genes (36/1113). After correcting for redundancy, category I represented 234 known human genes and category II a total of 92unknown transcripts. Clones from category I, were selected for expression analysis by RT-PCR in a great number of human tissues. This resulted in the identification of 16 genes which were expressed exclusively in the retina, 13 which were highly expressed in the retina compared to other tissues, 12 genes which were specifically expressed in neuronal tissues and 48 ubiquitously expressed genes. Thus, our expression analysis resulted in the identification of 29 genes exclusively or abundantly transcribed in the human retina. Of those, retina specific genes L25,L33, L35, L37, L38 and L40 were selected for further analysis. To characterize the complete mRNA sequences of these transcripts a full-length human retina cDNA library was constructed. The analysis of the L25 gene revealed three splicing variants of the ABCC5 gene, consequently named ABCC5_SV1 (SV1), ABCC5_SV2 (SV2) and ABCC5_SV3 (SV3).These isoforms comprise the first five exons of ABCC5 and additional novel exons named 5a, 5b and 5c, generated by differential exon usage. The determined lengths of the three transcripts are 2039 bp, 1962 bp, and 1887 bp in size, respectively. RT-PCR, real-time PCR and Northern blot analysis of ABCC5 as well as the isoforms SV1, SV2 and SV3demonstrated high levels of expression for all transcripts in the retina compared to other tissues. Analysis of their nucleotide sequences revealed that inclusion of exon 5a in splicing variant SV1 produced a frame shift and premature termination codon (PTC). Our data show that this splice variant is the target of nonsense mediated mRNA decay (NMD). This was shown by inhibition of protein synthesis with antibiotics puromycin and anisomycin in human cell lines A-RPE 19 and Y79. Our analysis resulted in an increase of the PTC containing transcript and a decrease of the ABCC5 transcript. Conversely, the amount of both transcripts (SV1 and ABCC5) returned to pre-treatment levels after removal of the inhibitors. Together, our results suggest that alternative splicing of the ubiquitously expressed ABCC5 gene in addition to NMD is involved in retina-specific transcriptional regulation of the mRNA level of ABCC5. In contrast, additional experiments demonstrated that the levels of expression ofSV2 and SV3 isoforms do not appear to influence ABCC5 transcription. Several of the cloned genes were selected for additional genotyping of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in order to construct their SNP maps which are going to be used for future association studies of complex disease AMD. Thus, identification of novel retinal genes and their functional characterization will further our elucidation of retinal physiology in general and in the diseased state in particular, by providing candidate retinal disease genes.
A large variety of sex determination systems have been described in fish. However, almost no information is available about sex determination in the classical fish models, the zebrafish Danio rerio and the pufferfish Takifugu rubripes. A DNA-binding protein gene called dmrt1bY (or DMY) has been recently described as an outstanding candidate for the primary sex-determining gene in the medaka fish Oryzias latipes. But this gene is not the universal master sex-determining gene in teleost fish, since dmrt1bY is not found in most other fishes. Hence, other fish models need to be examined including the platyfish Xiphophorus maculatus. Xiphophorus maculatus has three types of sex chromosomes (X, Y and W; females are XX, WX or WY; males are XY or YY). Its gonosomes are at an early stage of differentiation. The sex-determining locus on the sex chromosomes is flanked by two receptor tyrosine kinase genes, the Xmrk oncogene and its protooncogenic progenitor gene egfrb, which both delimit a region of about 0.6 centiMorgans. This situation should allow the positional cloning of the sex-determining gene (SD) of the platyfish. For this purpose, Bacterial Artificial Chromosome (BAC) contigs were assembled from a BAC library of XY males constructed in our laboratory, using the oncogene Xmrk, egfrb, as well as a Y-specific pseudogene called ps-criptY as starting points. The ps-criptY sequence was found to be closely linked to the SD gene, since no recombination was observed between SD and ps-criptY in more than 400 individuals tested. Two major BAC contigs for the X chromosome (about 2.5 Mb) and three major BAC contigs for the Y chromosome (about 3.5 Mb) were built up and analyzed by strategic sequencing. These are some of the largest contigs ever assembled for the sex chromosomes of a non-mammalian vertebrate species. The molecular analysis of the ps-criptY contig was the major objective of this work. The Y-specific ps-criptY contig has been extended over 1 Mb in this work with 58 identified molecular markers. Approximatively 700 kb of non-redundant sequences has been obtained from this contig by strategic sequencing. Numerous Y-linked markers from the contig including ps-criptY were also detected on the X chromosome. Nevertheless, major structural differences were observed between the X and Y chromosomes. Particularly, a large region, which is present at one copy on the X chromosome and contains several candidate genes, was found to be duplicated on the Y chromosome. Evidence for an inversion in the sex-determining region and for the Y-specific accumulation of a repeated sequence called XIR was also obtained. Such events might correspond to an initiation of differentiation between both types of gonosomes. Accumulation of transposable elements was also observed in the ps-criptY contig. A DNA transposable element, helitron, was isolated from the sex-determining region of X. maculatus. Three copies of helitron are located on the ps-criptY contig and one copy on the X-linked contig (helitron has roughly 15 copies per haploid genome). No in-frame stop codon, truncation or intron was found in these four copies, which present high nucleotide identities to each other. This suggests that helitron elements might be active or have been recently active in X. maculatus. A consensus open reading frame of helitron was also assembled from medaka (Oryzias latipes) genomic sequences. Two candidate genes from the ps-criptY contig are also located on the W chromosome in the X. maculatus Usumacinta strain (heterogamety). These markers show the relationship between the different types of gonosomes and allow to compare the male and female heterogameties in the platyfish. Several gene candidates were identified in the ps-criptY contig. However, some of them such as msh2, cript, igd and acr probably correspond to pseudogenes. Interestingly, a novel gene, called swimy, is exclusively expressed in spermatogonia of the adult testis. Swimy is a gene encoding a DNA-binding protein with several putative DNA-binding domains. The data suggest that swimy is a very promising candidate for the master SD gene. Another novel gene, which is called fredi and encodes a novel helix-turn-helix protein, is predominately expressed in the adult testis and currently under scrutiny. There is no doubt that the master SD gene of X. maculatus will be identified by positional cloning. Further molecular analysis of the contigs built in this work will shed new light on the molecular mechanism of sex determination and the evolution of sex chromosomes in fish.
The development of ethanol tolerance is due to changes in synaptic plasticity. Since the mechanisms mediating synaptic plasticity are probably defective in the mutant hangAE10, it was a goal of the present study to find out how HANG contributes to synaptic plasticity. In particular, it was important to clarify in which neuronal process HANG plays a role. Antibody stainings against HANG revealed that the protein is localized in all neuronal nuclei of larval and adult brains; the staining is absent in hangAE10, thus confirming that this P-element insertion stock is a protein null for HANG. Detailed analysis of the subnuclear distribution of HANG showed that HANG immunoreactivity is enriched at distinct spots in the nucleus in a speckled pattern; these speckles are found at the inside of the nuclear membrane and do not colocalize with chromatin nor with the nucleolus; thus, HANG is probably involved in the stabilization, processing or export of RNAs. As synaptic plasticity can be studied in single neurons at the larval neuromuscular junction, the morphology of the synaptic terminals of hangAE10 mutants was analyzed at muscle 6/7, segment A4. These studies revealed that hangAE10 mutants display a 40 % increase in bouton number and axonal branch length; in addition, some boutons have an abnormal hourglass-like shape, suggesting that they are arrested in a semi-separated state following the initiation of bouton division. The increase in bouton number of hang mutants is mainly due to an increase in numbers of type Ib boutons. The analysis of the distribution of several synaptic markers in hang mutants did not show abnormalities. The presynaptic expression of HANG in hang mutants rescues the increase in bouton number and axonal branch length, thus proving that the phenotypes seen in the P-element insertion hangAE10 are attributable to the lack of HANG rather than to effects of the P-element marker rosy or to a secondary hit on the same chromsome during mutagensis. This finding is further supported by the fact that postsynaptic expression of HANG does not rescue the abnormal NMJ morphology of hangAE10. Alterations in cAMP levels regulate the number of boutons; since hang mutants display an increase in bouton number, the questions was whether this morphological abnormality was due to defects in cAMP signalling. To test this hypothesis, hangAE10 NMJs were compared to those of the hypomorphic allele dnc1 that has a defective cAMP cascade. Some aspects of the NMJ phenotype (e.g. the increase in bouton number and the unaltered ratio of active zones per bouton area) are similar in hangAE10 and dnc1, other differ. Expression of a UAS-dnc transgene in hangAE10 mutants does not modify the phenotype. In summary, the results of this study indicate that nuclear protein HANG might be involved in isoform-specific splicing of genes required for synaptic plasticity at the NMJ.
Chemical neurotransmission is a complex process of central importance for nervous system function. It is thought to be mediated by the orchestration of hundreds of proteins for its successful execution. Several synaptic proteins have been shown to be relevant for neurotransmission and many of them are highly conserved during evolution- suggesting a universal mechanism for neurotransmission. This process has checkpoints at various places like, neurotransmitter uptake into the vesicles, relocation of the vesicles to the vicinity of calcium channels in order to facilitate Ca2+ induced release thereby modulating the fusion probability, formation of a fusion pore to release the neurotransmitter and finally reuptake of the vesicles by endocytosis. Each of these checkpoints has now become a special area of study and maintains its own importance for the understanding of the overall process. Ca2+ induced release occurs at specialized membrane structures at the synapse known as the active zones. These are highly ordered electron dense grids and are composed of several proteins which assist the synaptic vesicles in relocating in the vicinity of Ca2+ channels thereby increasing their fusion probability and then bringing about the vesicular fusion itself. All the protein modules needed for these processes are thought to be held in tight arrays at the active zones, and the functions of a few have been characterized so far at the vertebrate active zones. Our group is primarily interested in characterizing the molecular architecture of the Drosophila synapse. Due to its powerful genetics and well-established behavioural assays Drosophila is an excellent system to investigate neuronal functioning. Monoclonal antibodies (MABs) from a hybridoma library against Drosophila brain are routinely used to detect novel proteins in the brain in a reverse genetic approach. Upon identification of the protein its encoding genetic locus is characterized and a detailed investigation of its function is initiated. This approach has been particularly useful to detect synaptic proteins, which may go undetected in a forward genetic approach due to lack of an observable phenotype. Proteins like CSP, Synapsin and Sap47 have been identified and characterized using this approach so far. MAB nc82 has been one of the shortlisted antibodies from the same library and is widely used as a general neuropil marker due to the relative transparency of immunohistochemical whole mount staining obtained with this antibody. A careful observation of double stainings at the larval neuromuscular junctions with MAB nc82 and other pre and post-synaptic markers strongly suggested an active zone localization of the nc82 antigen. Synaptic architecture is well characterized in Drosophila at the ultrastructural level. However, molecular details for many synaptic components and especially for the active zone are almost entirely unknown. A possible localization at the active zone for the nc82 antigen served as the motivation to initiate its biochemical characterization and the identification of the encoding gene. In the present thesis it is shown by 2-D gel analysis and mass spectrometry that the nc82 antigen is a novel active zone protein encoded by a complex genetic locus on chromosome 2R. By RT-PCR exons from three open reading frames previously annotated as separate genes are demonstrated to give rise to a transcript of at least 5.5 kb. Northern blots produce a prominent signal of 11 kb and a weak signal of 2 kb. The protein encoded by the 5.5 kb transcript is highly conserved amongst insects and has at its N-terminus significant homology to the previously described vertebrate active zone protein ELKS/ERC/CAST. Bioinformatic analysis predicts coiled-coil domains spread all over the sequence and strongly suggest a function involved in organizing or maintaining the structure of the active zone. The large C-terminal region is highly conserved amongst the insects but has no clear homologues in veretebrates. For a functional analysis of this protein transgenic flies expressing RNAi constructs under the control of the Gal4 regulated enhancer UAS were kindly provided by the collaborating group of S.Sigrist (Gِttingen). A strong pan-neuronal knockdown of the nc82 antigen by transgenic RNAi expression leads to embryonic lethality. A relatively weaker RNAi expression results in behavioural deficits in adult flies including unstable flight and impaired walking behavior. Due to this peculiar phenotype as observed in the first knockdown studies the gene was named “bruchpilot” (brp) encoding the protein “Bruchpilot (BRP)” (German for crash pilot). A pan-neuronal as well as retina specific downregulation of this protein results in loss of ON and OFF transients in ERG recordings indicating dysfunctional synapses. Retina specific downregulation also shows severely impaired optomotor behaviour. Finally, at an ultrastructural level BRP downregulation seems to impair the formation of the characteristic T-shaped synaptic ribbons at the active zones without significantly altering the overall synaptic architecture (in collaboration with E.Asan). Vertebrate active zone protein Bassoon is known to be involved in attaching the synaptic ribbons to the active zones as an adapter between active zone proteins RIBEYE and ERC/CAST. A mutation in Bassoon results in a floating synaptic ribbon phenotype. No protein homologous to Bassoon has been observed in Drosophila. BRP downregulation also results in absence of attached synaptic ribbons at the active zones. This invites the speculation of an adapter like function for BRP in Drosophila. However, while Bassoon mutant mice are viable, BRP deficit in addition to the structural phenotype also results in severe behavioural and physiological anomalies and even stronger downregulation causes embryonic lethality. This therefore suggests an additional and even more important role for BRP in development and normal functioning of synapses in Drosophila and also in other insects. However, how BRP regulates synaptic transmission and which other proteins are involved in this BRP dependant pathway remains to be investigated. Such studies certainly will attract prominent attention in the future.
Flagellar motility and chemotaxis are essential virulence traits required for the ability of Helicobacter pylori to colonize the gastric mucosa. The flagellar regulatory network and the complex chemotaxis system of H. pylori are fundamentally different from other bacteria, despite many similarities. In H. pylori expression of the flagella is controlled by a complex regulatory cascade involving the two-component system FlgR-HP244, the sigma factors 54 and 28 and the anti-sigma 28 factor FlgM. Thus far, the input signal for histidine kinase HP244, which activates the transcriptional regulator FlgR, which triggers sigma factor 54-dependent transcription of the flagellar class 2 genes, is not known. Based on a yeast two-hybrid screen a highly significant protein-protein interaction between the H. pylori protein HP137 and both the histidine kinase HP244 and the flagellar hook protein HP908 (FlgE´) has been reported recently (Rain et al., 2001). So far, no function could be assigned to HP137. Interestingly, the interaction between HP137 and histidine kinase HP244 was observed in the characteristic block N sequence motif of the C-terminal ATP-binding kinase domain. In this work a potential role of HP137 in a feedback regulatory mechanism controlling the activity of histidine kinase HP244 in the flagellar regulation of H. pylori was investigated. Although the substitution of the gene encoding HP137 by a kanamycin cassette resulted in non-motile bacteria, the failure to restore motility by the reintroduction of hp137 in cis into the mutant strain, and the observation that HP137 has no significant effect on the activity of histidine kinase HP244 in vitro indicated that HP137 is not directly involved in flagellar regulation. Therefore, it was demonstrated that HP137 does not participate in the regulation of flagellar gene expression, neither in H. pylori nor in the closely related bacterium C. jejuni. Chemotactic signal transduction in H. pylori differs from the enterobacterial paradigm in several respects. In addition to a CheY response regulator protein (CheY1) H. pylori contains a CheY-like receiver domain (CheY2) which is C-terminally fused to the histidine kinase CheA. Furthermore, the genome of H. pylori encodes three CheV proteins consisting of an N-terminal CheW-like domain and a C-terminal receiver domain, while there are no orthologues of the chemotaxis genes cheB, cheR, and cheZ. To obtain insight into the mechanism controlling the chemotactic response of H. pylori the phosphotransfer reactions between the purified two-component signalling modules were investigated in vitro. Using in vitro phosphorylation assays it was shown that both H. pylori histidine kinases CheAY2 and CheA´ lacking the CheY-like domain (CheY2) act as ATP-dependent autokinases. Similar to other CheA proteins CheA´ shows a kinetic of phosphorylation represented by an exponential time course, while the kinetics of phosphorylation of CheAY2 is characterized by a short exponential time course followed by the hydrolysis of CheAY2~P. Therefore, it was demonstrated that the presence of the CheY2-like receiver domain influences the stability of the phosphorylated P1 domain of the CheA part of the bifunctional protein. Furthermore, it was proven that both CheY1 and CheY2 are phosphorylated by CheAY2 and CheA´~P and that the three CheV proteins mediate the dephosphorylation of CheA´~P, although with a clearly reduced efficiency as compared to CheY1 and CheY2. Moreover, CheA´ is capable of donating its phospho group to the CheY1 protein from C. jejuni and to CheY protein from E. coli. Retrophosphorylation experiments indicated that CheY1~P is able to transfer the phosphate group back to the HK CheAY2 and the receiver domain present in the bifunctional CheAY2 protein acts as a phosphate sink fine tuning the activity of the freely diffusible CheY1 protein, which is thought to interact with the flagellar motor. Hence, in this work evidence of a complex phosphorelay in the chemotaxis system was obtained which has similarities to other systems with multiple CheY proteins. The role of the CheV proteins remain unclear at the moment, but they might be engaged in a further fine regulation of the phosphate flow in this complex chemotaxis system and the independent function of the two domains CheA´ and CheY2 is not sufficient for normal chemotactic signalling in vivo.
The vertebrate spinal cord is composed of billions of neurons and glia cells, which are formed in a highly coordinated manner during early neurogenesis. Specification of these cells at distinct positions along the dorsoventral (DV) axis of the developing spinal cord is controlled by a ventrally located signaling center, the medial floor plate (MFP). Currently, the origin and time frame of specification of this important organizer are not clear. During my PhD thesis, I have analyzed the function of the novel secreted growth factor Midkine-a (Mdka) in zebrafish. In higher vertebrates, mdk and the related factor pleiotrophin (ptn) are widely expressed during embryogenesis and are implicated in a variety of processes. The in-vivo function of both factors, however, is unclear, as knock-out mice show no embryonic phenotype. We have isolated two mdk co-orthologs, mdka and mdkb, and one single ptn gene in zebrafish. Molecular phylogenetic analyses have shown that these genes evolved after two large gene block duplications. In contrast to higher vertebrates, zebrafish mdk and ptn genes have undergone functional divergence, resulting in mostly non-redundant expression patterns and functions. I have shown by overexpression and knock-down analyses that Mdka is required for MFP formation during zebrafish neurulation. Unlike the previously known MFP inducing factors, mdka is not expressed within the embryonic shield or tailbud but is dynamically expressed in the paraxial mesoderm. I used epistatic and mutant analyses to show that Mdka acts independently from these factors. This indicates a novel mechanism of Mdka dependent MFP formation during zebrafish neurulation. To get insight into the signaling properties of zebrafish Mdka, the function of both Mdk proteins and the candidate receptor Anaplastic lymphoma kinase (Alk) have been compared. Knock-down of mdka and mdkb resulted in the same reduction of iridophores as in mutants deficient for Alk. This indicates that Alk could be a putative receptor of Mdks during zebrafish embryogenesis. In most vertebrate species a lateral floor plate (LFP) domain adjacent to the MFP has been defined. In higher vertebrates it has been shown that the LFP is located within the p3 domain, which forms V3 interneurons. It is unclear, how different cell types in this domain are organized during early embryogenesis. I have analyzed a novel homeobox gene in zebrafish, nkx2.2b, which is exclusively expressed in the LFP. Overexpression, mutant and inhibitor analyses showed that nkx2.2b is activated by Sonic hedgehog (Shh), but repressed by retinoids and the motoneuron-inducing factor Islet-1 (Isl1). I could show that in zebrafish LFP and p3 neuronal cells are located at the same level along the DV axis, but alternate along the anteroposterior (AP) axis. Moreover, these two different cell populations require different levels of HH signaling and nkx2.2 activities. This provides new insights into the structure of the vertebrate spinal cord and suggests a novel mechanism of neural patterning.
In this thesis, I introduce the Virtual Brain Protocol, which facilitates applications of the Standard Brain of Drosophila melanogaster. By providing reliable and extensible tools for the handling of neuroanatomical data, this protocol simplifies and organizes the recurring tasks involved in these applications. It is demonstrated that this protocol can also be used to generate average brains, i.e. to combine recordings of several brains with the same features such that the common features are emphasized. One of the most important steps of the Virtual Insect Protocol is the aligning of newly recorded data sets with the Standard Brain. After presenting methods commonly applied in a biological or medical context to align two different recordings, it is evaluated to what extent this alignment can be automated. To that end, existing Image Processing techniques are assessed. I demonstrate that these techniques do not satisfy the requirements needed to guarantee sensible alignments between two brains. Then, I analyze what needs to be taken into account in order to formulate an algorithm which satisfies the needs of the protocol. In the last chapter, I derive such an algorithm using methods from Information Theory, which bases the technique on a solid mathematical foundation. I show how Bayesian Inference can be applied to enhance the results further. It is demonstrated that this approach yields good results on very noisy images, detecting apparent boundaries between structures. The same approach can be extended to take additional knowledge into account, e.g. the relative position of the anatomical structures and their shape. It is shown how this extension can be utilized to segment a newly recorded brain automatically.
Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is a rare genetic disorder characterised by early contractures of the elbows, Achilles tendons and spine, slowly progressive muscle wasting and cardiomyopathy associated with cardiac conduction defect. The autosomal dominant form is caused by mutations in the LMNA gene which gives rise to lamin A and lamin C proteins by alternative splicing. These A-type lamins, together with B-type lamins, form the nuclear lamina, a network of intermediate filament proteins underlining the nuclear envelope. In order to ascertain the role lamin A and C separately contribute to the molecular phenotype, we analysed ten LMNA mutations and one single nucleotide polymorphism (SNP) in transfection studies in COS7 fibroblasts and, partially, in C2C12 myoblasts. The EGFP or DsRed2 tagged lamins were exogenously expressed either individually or both A-types together and examined by light and electron microscopy. The protein mobility of lamin A mutants was determined by FRAP analysis. Additionally, a co-immunoprecipitation binding assay of in vitro synthesised A-type lamins and emerin was performed.Eight of the LMNA mutations (R50S, R133P, E358K, E358K+C<T1698, E361K, R527P, L530P, R541S and G602S) and the SNP C<T1698, when expressed in lamin A, exhibited a range of nuclear mis-localisation patterns from a wild type phenotype to the formation of nuclear aggregates. Two mutations (T150P and delQ355) led to the severe mis-localisation of the exogenous protein and additionally affected nuclear envelope reassembly and mid-body protein composition after mitosis. Exogenously expressed DsRed2 tagged wild type and mutant lamin C was only inserted into the nuclear lamina if co-expressed with the equivalent EGFP tagged lamin A construct, except for the T150P mutation which prevented either lamin from reaching the nuclear lamina. The T150P, R527P and L530P mutations reduced the ability of lamin A, but not lamin C from binding to emerin. These data indicate that mutations in the rod domain of lamin A mainly impair its function as a structural protein, whereas mutations of the globular tail domain appear to disrupt protein-protein interactions important for gene regulation and signal transduction processes. In addition, our results suggest specific functional roles for the emerin-lamin A and emerin-lamin C containing protein complexes; this is the first report to propose that the A-type lamin mutations may be differentially dysfunctional for the same LMNA mutation.
It has been known for a long time that Drosophila can learn to discriminate not only between different odorants but also between different concentrations of the same odor. Olfactory associative learning has been described as a pairing between odorant and electric shock and since then, most of the experiments conducted in this respect have largely neglected the dual properties of odors: quality and intensity. For odorant-coupled short-term memory, a biochemical model has been proposed that mainly relies on the known cAMP signaling pathway. Mushroom bodies (MB) have been shown to be necessary and sufficient for this type of memory, and the MB-model of odor learning and short-term memory was established. Yet, theoretically, based on the MB-model, flies should not be able to learn concentrations if trained to the lower of the two concentrations in the test. In this thesis, I investigate the role of concentration-dependent learning, establishment of a concentration-dependent memory and their correlation to the standard two-odor learning as described by the MB-model. In order to highlight the difference between learning of quality and learning of intensity of the same odor I have tried to characterize the nature of the stimulus that is actually learned by the flies, leading to the conclusion that during the training flies learn all possible cues that are presented at the time. The type of the following test seems to govern the usage of the information available. This revealed a distinction between what flies learned and what is actually measured. Furthermore, I have shown that learning of concentration is associative and that it is symmetrical between high and low concentrations. I have also shown how the subjective quality perception of an odor changes with changing intensity, suggesting that one odor can have more than one scent. There is no proof that flies perceive a range of concentrations of one odorant as one (odor) quality. Flies display a certain level of concentration invariance that is limited and related to the particular concentration. Learning of concentration is relevant only to a limited range of concentrations within the boundaries of concentration invariance. Moreover, under certain conditions, two chemically distinct odorants could smell sufficiently similarly such, that they can be generalized between each other like if they would be of the same quality. Therefore, the abilities of the fly to identify the difference in quality or in intensity of the stimuli need to be distinguished. The way how the stimulus is analyzed and processed speaks in favor of a concept postulating the existence of two separated memories. To follow this concept, I have proposed a new form of memory called odor intensity memory (OIM), characterized it and compared it to other olfactory memories. OIM is independent of some members of the known cAMP signaling pathway and very likely forms the rutabaga-independent component of the standard two-odor memory. The rutabaga-dependent odor memory requires qualitatively different olfactory stimuli. OIM is revealed within the limits of concentration invariance where the memory test gives only sub-optimal performance for the concentration differences but discrimination of odor quality is not possible at all. Based on the available experimental tools, OIM seems to require the mushroom bodies the same as odor-quality memory but its properties are different. Flies can memorize the quality of several odorants at a given time but a newly formed memory of one odor interferes with the OIM stored before. In addition, the OIM lasts only 1 to 3 hours - much shorter than the odor-quality memory.
Die BMPs (Bone morphogenetic proteins) sind Zytokine, die in fast allen Tieren exprimiert werden und zur TGF-β Superfamilie gehören. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Knochenentwicklung, unter anderem auf Grund ihrer Fähigkeit, die Neubildung von Knochen auszulösen. Eine weitere Aufgabe der BMPs liegt in der Beeinflussung der Embryogenese. Hier tragen sie zur Differenzierung der einzelnen Keimblätter bei und werden während der Organogenese in vielen Organanlagen exprimiert. Ep45, ein Protein aus Xenopus laevis, gehört zur Familie der Serinproteaseinhibitoren und ist ein extrazellulärer Ligand von BMP4, ohne jedoch dessen Rezeptorbindung bzw. dessen Aktivität zu beeinflussen. Ep45, auch bekannt unter dem Namen pNiXa, wird in der Embryogenese von Xenopus laevis wirksam: Es induziert die Reifung von Oozyten, kann im weiteren Verlauf in verschiedenen Organanlagen nachgewiesen werden und wird in Zusammenhang gebracht mit Teratogenität, die durch Ni2+ hervorgerufen wird. Um auf die aufwendige Isolierung von Ep45 aus Xenopus-Oozyten bzw. –Embryonen verzichten zu können, sollte in dieser Arbeit eine Methode zur rekombinanten Expression und Isolierung von aktivem Ep45 entwickelt werden. Zunächst wurde die Expression von Ep45 in E. coli als lösliches Einzelprotein mit dem Vektor pET25b(+) angestrebt. Da sich jedoch zeigte, dass das Protein zum Großteil als unslösliche Aggregate in Form von inclusion bodies vorlag, wurden diese präpariert, denaturiert und eine Isolierung von Ep45 durch verschiedene Chromatographie-Verfahren (Kationenaustauschersäule, Gelchromatographie) unternommen. Durch die nachfolgenden Renaturierungsversuche konnte jedoch kein aktives Protein gewonnen werden. Zum Nachweis von aktivem Ep45 dienten ein Enzymassay, der auf der Serinproteaseinhibitor-Funktion von Ep45 beruht, sowie ein Bindungsassay. Dieser weist den Ep45-Chymotrypsin-Komplex nach, der bei der Inhibition von Chymotrypsin durch Ep45 entsteht. Als alternatives Expressionssystem kam deshalb das pMal™-Fusionsprotein-System zur Anwendung. Dazu wurde Ep45 an MBP gekoppelt, so dass eine Aufreinigung mittels Chromatographie an einer Amylosesäule möglich werden sollte. Nach Spaltung durch Faktor Xa sollten die beiden Proteine durch Chromatographie voneinander getrennt werden, so dass schließlich Ep45 als reines aktives Protein vorliegt. Trotz des Einsatzes diverser Chromatographie-Verfahren (Ionentauschersäule, hydrophobe Säule, Nickelsäule) gelang keine Isolierung von Ep45. Da in E. coli zwar eine Expression jedoch keine Aufreinigung von aktivem Ep45 gelang, wurde ein Expressionssystem unter Verwendung von Sf9-Zellen (Insektenzellen) eingesetzt. Nach Herstellung des Plasmids pIZT/V5-xEp45 wurden Versuche zur transienten Expression von Ep45 in Sf9-Zellen mittels des InsectSelect™ Systems durchgeführt, die bis zum Abschluss meiner praktischen Arbeit nicht zum Erfolg führten, aber innerhalb der Arbeitsgruppe weiter bearbeitet werden.
HMG-Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und regulieren durch ihre Bindung an das Chromatin auf verschiedene Weise DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Um zu verstehen, wie HMG-Proteine ihre vielfältigen Funktionen erfüllen können, wurde mit Hilfe von EGFP- und DsRed2-Fusionsproteinen ihre Funktion in vivo untersucht. Im Wesentlichen wurde dabei mit Hilfe von Bleichtechniken ihr dynamisches Verhalten charakterisiert. Daneben wurde für die HMGN-Proteine ihr bislang unbekanntes Expressionsverhalten in Tumorzellen bestimmt. So konnte für die HMGN-Proteine gezeigt werden, dass bestimmte Tumorzelllinien (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) eine relativ erhöhte Expression von HMGN2 aufweisen, die mit der Tumordifferenzierung korreliert. Eine relativ verringerte Expression von HMGN1 steht dagegen in Mammakarzinomen und Non-Hodgkin-Lymphomen in direktem Zusammenhang mit der Aggressivität der Tumore. Somit kann die HMGN-Expression bei diesen Tumoren als diagnostischer Marker verwendet werden. FRAP-Analysen mit EGFP-Fusionsproteinen führten zu der Erkenntnis, dass HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b und HMGB1 sich sehr schnell durch den Zellkern bewegen und nur transient an das Chromatin gebunden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifischen DNA/Chromatin-Bindungsmotive im Wesentlichen entscheiden, wo die Bindung der HMG-Proteine in vivo erfolgt, ihre Verweildauer im Euchromatin, Heterochromatin und zellzyklusabhängig dann aber durch Modifikationen (Phosphorylierungen, Acetylierungen) reguliert wird. Dies wurde beispielhaft durch punktmutierte und deletierte Fusionsproteine, sowie durch Inkubation der Zellen mit spezifischen Drogen für die HMGA1a-Proteine gezeigt. FRAP-Analysen haben außerdem gezeigt, dass die Spleißvarianten hHMGA1a und hHMGA1b unterschiedliche kinetische Parameter besitzen. Dies zeigt, dass beiden Varianten unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden können. Die gefundenen spezifischen, transienten Verweildauern der einzelnen HMG-Proteine führen zu einem Modell eines dynamischen Chromatin-Netzwerkes, wobei alle HMG-Proteine in Wechselwirkungen innerhalb eines dynamischen Chromatinprotein-Cocktails DNA-abhängige Prozesse regulieren können. Die jeweiligen, wie hier gezeigt, durch Modifikationen regulierten Verweildauern der HMG-Proteine bestimmen darüber, welche anderen Chromatinproteine wie lange am Chromatin verbleiben und bestimmte Funktionen, wie beispielsweise die Modifikation der Core-Histone, übernehmen können. Die dynamischen Parameter einzelner HMG-Proteine erklären so, wie diese Proteine ihre vielfältigen Funktionen als Architekturelemente und bei der Regulation DNA-abhängiger Prozesse erfüllen können. Einige Vertreter, wie die HMGB1-Proteine, bewegen sich so schnell durch den Zellkern, dass ihre kinetischen Parameter durch das beschränkte zeitliche Auflösungsvermögen konfokaler Mikroskope der älteren Generation nicht erfassbar sind. Die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Drogen, welche die kinetischen Parameter von HMGB1-Proteinen beeinflussen können, ist inzwischen mit Mikroskopen der neuen Generation möglich. Im Verlaufe der Arbeit zeigte sich, dass andere verwendete Fluorophore wie DsRed2 die kinetischen Eigenschaften von HMG-Fusionsproteinen beeinflussen können. Durch eine erhöhte Verweildauer können auch sehr transiente Interaktionen sichtbar gemacht werden. Wie gezeigt wurde, kann eine erhöhte Verweildauer aber auch zur Verdrängung anderer Proteine führen, die die gleichen Bindungsstellen benutzen und so eine Modulation des Chromatins bewirken. Die Nutzung von DsRed-Fluorophoren ermöglicht interessante neue Erkenntnisse. Diese müssen aber stets vor dem Hintergrund eines veränderten dynamischen Verhaltens der Fusionsproteine interpretiert werden. Zusammengenommen liefern die hier vorgestellten Ergebnisse zur Dynamik der HMG-Proteine grundlegende Informationen, die zur Klärung ihrer Funktion bei Chromatinmodulationen, etwa bei Differenzierungsprozessen oder der Entstehung von Tumorzellen entscheidend beitragen. Die Erkenntnis, dass diese Proteine lediglich transiente Interaktionen mit ihren Bindungspartnern eingehen können, sind im Hinblick auf die Behandlung von Tumoren, bei denen HMG-Proteine im Vergleich zu Normalgewebe häufig überexprimiert sind, von großer Bedeutung.
3. Zusammenfassung Ein noch immer unvollständig verstandenes Problem sind die exakten Mechanismen der Arbeitsteilung und Koordination innerhalb von Bienenvölkern Apis mellifera. Auf der einen Seite muss die sensorische und neuronale Ausstattung jedes Individuums das Potential zur Kommunikation und Aufgabenbewältigung enthalten, zum anderen müssen jedem Bienenvolk Mechanismen zur Steuerung zur Verfügung stehen, die auch so weit in die Zukunft reichenden Notwendigkeiten wie Wintervorbereitungen zuverlässig durchführen. Die vorliegende Arbeit beleuchtet daraus ausgewählte Aspekte. Zum einen werden Aspekte der kognitiven Fähigkeiten der Einzelbienen untersucht, die im Hinblick auf ihre Rolle als sammelnde Arbeiterinnen eine wichtige Rolle spielen. Das Erkennen und Verarbeiten von Mustern spielt eine wichtige Rolle beim Auffinden von potentiellen Nahrungsquellen. Hier konnte mittels des DMTS – Paradigma ein hoher Abstraktionsgrad der Musterverarbeitung sowie eine Speicherung auch komplexer Muster gezeigt werden. Zum anderen wird die Bruttemperatur als ein Einfluss auf die Puppenentwicklung und dessen mögliche Folgen auf kognitive Fähigkeiten und Lebenshistorie untersucht. Variation der Bruttemperatur wurde in verschiedenen Zusammenhängen als starker Einfluss auf unterschiedliche Aspekte der Entwicklung gezeigt. In der vorliegenden Arbeit kann diese Bruttemperatur als möglicher Faktor der nachfolgend unterschiedlichen Ausprägung von Verhaltensmustern gezeigt werden. Dabei wird ebenso auf die Unterschiede im Verhaltensmuster von täglichen Stocktätigkeiten wie auf die resultierenden Unterschiede in der Lebensgeschichte und –spanne eingegangen, die aus unterschiedlichen Brutaufzuchtstemperaturen resultieren können. Als Aufzuchtstemperaturen werden dabei 32°C, 35°C sowie 36°C verwendet, um eine Vari ation zwischen der an anderer Stelle berichteten mittleren, der niedrigsten und der höchsten Temperatur für morphologisch vollständig entwickelte Bienen zu erreichen und die daraus resultierenden Arbeiterinnen zu untersuchen. Sowohl die Ergebnisse der Verhaltensuntersuchungen von Stockbienen wie auch der Vergleich von Lebensaktivität und –spanne zeigen dabei signifikante Unterschiede zwischen den bei unterschiedlichen Temperaturen aufgezogenen Arbeiterinnen in deren analysiertem Verhalten.
The genus Pogonomyrmex is predisposed for analyzing the evolution of ant colony characteristics in general and the sociogenetic structure in particular, due to the renowned biology of several species and the diversity of mating frequency and queen number. This variation in the sociogenetic structure of colonies produces a high variance in intracolonial relatedness which can be a major component driving the evolution of various colony characteristics. To exactly determine the variability of the intracolonial relatedness in the genus Pogonomyrmex both were analyzed, the number of matrilines and patrilines, in selected members of Pogonomyrmex, namely P. (sensu stricto) rugosus, P. (sensu stricto) badius and P. (Ephebomyrmex) pima using DNA fingerprint techniques. The evolution of these colony characteristics were tried to be explained within a phylogenetic framework. For that purpose we constructed a gene-tree of 39 species of the genus Pogonomyrmex. The taxon sampling covered about 83 % of the North American species and 43 % of the South American species. Effective multiple mating of queens was confirmed for P. rugosus (me=4.1) and P. badius (me=6.7). Additionally, both species are monogynous. These results corroborate behavioral observations of multiple mating for these species. Multiple mating is now known from 9 Pogonomyrmex species (behavioral evidence for 3 species – genetic evidence for 6 species). However, in P. (E.) pima all queens that were analyzed were single mated (me=1.0). Therefore, multiple mating may have either evolved early during the evolution of the genus Pogonomyrmex and has subsequently been lost in the subgenus Ephebomyrmex (plesiomorphic hypothesis), or it has first been evolved in the subgenus Pogonomyrmex sensu stricto (apomorphic hypothesis). In P. huachucanus, a species basal to the North- American sensu stricto complex, smaller effective mating number of queens compared to its sensu stricto relatives (J. Gadau and C.-P. Strehl, unpublished) probably do mirror a change from monandry to polyandry during the evolution of more advanced sensu stricto species, which would support the apomorphic hypothesis. The intracolonial relatedness in P. (E.) pima is however rather low. This is probably the result of multiple reproducing queens (polygyny). Polygyny is also documented for at least four other species of the subgenus Ephebomyrex, but so far P. (E.) pima is the only species with genetic evidence. It might be that there was an evolutionary trade-off within the subgenus Ephebomyrmex between polyandry and polygyny. Therefore, both subgenera retained a high intracolonial genetic diversity. This high genetic diversity might be one cause for the success and radiation of the genus Pogonomyrmex in arid environments. Evolution might have favored high genetic diversity of Pogonomyrmex colonies, because it helps colonies to improve their colonial organization and efficiency in performing external tasks. At least in P. badius a link between patrilines and physical polyethism was found, indicative of an improvement of colonial organization via polyandry. Furthermore, the documented extreme levels of polyandry might help P. badius females to overcome the possibility of inbreeding due to restricted dispersal. Restricted dispersal is also found in P. (E.) pima due to wingless, intermorphic queens. However, in P. (E.) pima inbreeding is probably prevented by outcrossing via males because no significant inbreeding is found. In the presented gene trees the subgenus Pogonomyrmex Ephebomyrmex was separated from the subgenus Pogonomyrmex sensu stricto. Therefore, P. Ephebomyrmex might be elevated to generic status, also due to its distinct morphological and life history characters. Nevertheless, for a precise taxonomic revision a broader complement of species has to be applied. Regularly a low number of unrelated workers was found in P. rugosus colonies, which probably stem from brood raids between mature and founding colonies. It is well known that most founding colonies are destroyed by neighboring conspecific mature colonies, but so far it was assumed that the brood of these colonies was also destroyed. This often neglected aspect might be an important fitness token for mature colonies.
Rhodococcus equi is a Gram-positive intracellular pathogen which can cause severe bronchopneumonia in foals. In recent years, the role of this bacterium as human pathogen has been noted, as R.equi infections in humans have increase in frequency. This increase is associated with the rise in immunosupressed individuals, specially AIDS patients, where infection leads to symptoms and pathology similar to those seen in foals with a high mortality rate. Due to its capability to survive and multiply in murine and equine macrophages, R.equi has been classified as a facultative intracellular bacterium. R.equi is found frequently in macrophages in alveolar infiltrate from infected animals. The pathogenicity of R.equi depends on its ability to exist and multiply inside macrophages and has been associated with the presence of virulence plasmids. It has been observed that, inside foal alveolar macrophages, R.equi-containing vacuoles (RCVs) do not mature into phagolysosomes. However, most of the intracellular events during R.equi infection have not been investigated in detail. The aim of this study was to elucidate the intracellular compartmentation of R.equi and the mechanism by which the bacteria avoid destruction in host macrophages. The importance of the virulence-associated plasmids of R.equi for the establishment of RCVs was also evaluated. Furthermore, the intracellular fate of viable and non-viable R.equi was compared in order to study whether viability of R.equi influeciantes the establishment of RCVs. In this study, the RCV was characterized by using a variety of endocytic markers to follow the path of the bacteria trhough murine macropages. Transmission electron microscopy-base analysis showed that R.equi was found equally frequently in phagosomes with loosely or thightly apposed membranes, and RCV often contains numerous membranous vesicles. Laser scanning microscopy of infected macrophages showed that the majority of phagosomes containing R.equi acquired transiently the early endosomal markers Rab5, Ptlns3P, and EEA-1, suggesting initially undisturbed phagosome maturation. Although the RCV acquired some late endosomal markers, such as Rab7, LAMP-1, and Lamp-2, they did not acquired vATPase, did not interact with pre-labeled lysosomes, and failed to acidify. These data clearly suggest that the RCV is a compartment which has left vacuoles that resemble multivesicular body compartments (MVB), which are transport intermediates between early and late endosomes and display internal vesicles very similar to the ones observed within RCVs. Analyisis of several R.equi strains containing either VapA- or VapB-expressing plasmids or neither demonstrated that the possession of the virulence-associated plasmids does not affect phagosome trafficking over a two hour period of infection. The finding that non-viable R.equi was still able to inhibit phagosome maturation (although not to the same extent as viable R.equi did) suggests that heat-insensitive factors, such as cell periphery lipids, may play a major role in inhibition of phagosome maturation, although heat-sensitive factors may also be involved.
The genetics of species differences is an outstanding question in evolutionary biology. How do species evolve to become phenotypically distinct and how is the genetic architecture organized that underlie species differences? Phenotypic diverged traits are supposed to be frequently involved in prezygotic isolation, i.e. they prevent the formation of hybrids, whereas postzygotic isolation occurs when hybrids experience a fitness reduction. The parasitic wasp genus Nasonia represents an appropriate model system to investigate the genetics of species differences as well as the genetics of postzygotic isolation. The genus consists of three species N. vitripennis, N. longicornis and N. giraulti that differ particularly in male traits that are assumed to posses an adaptive significance: courtship behaviour and wing size differences. The courtship behaviour consists of cyclically repeated series of head nods that are separated by pauses. The stereotypic performance allowed to split up the display into distinct courtship components. Males of N. vitripennis bear vestigial forewings and are incapable of flight, whereas N. longicornis wear intermediate sized wings and N. giraulti is fully capable of flying. Nasonia species can produce interspecific hybrids after removing Wolbachia bacteria induced hybrid incompatibilities with antibiotics. Postzygotic isolation occurs to different extent and is asymmetric among reciprocal crosses, e.g. inviability is stronger in the N. vitripennis (♀) x N. longicornis (♂) cross than in the N. longicornis (♀) x N. vitripennis (♂) cross. The formation of hybrids allow to study the genetic of species differences in QTL (quantitative trait locus) analyses as well as the genetics of postzygotic isolation causing hybrid inviability. The aim of the study was to investigate the genetic architecture of differences in courtship behaviour and wing size between N. vitripennis and N. longicornis and to assess the genetics of postzygotic isolation to gain clues about the evolutionary processes underlying trait divergence and establishment of reproductive isolation between taxa. In a QTL analysis based on 94 F2-hybrid individuals of an LV cross only few QTL for wing size differences have been found with relatively large effects, although a large proportion of the phenotypic variance remained unexplained. The QTL on courtship behaviour analysis based on 94-F2 hybrid males revealed a complex genetic architecture of courtship behaviour with QTL of large phenotypic effects that explained more than 40 % of the phenotypic variance in one case. Additionally, an epistatic analysis (non-additive interlocus interaction) of courtship QTL revealed frequent genetic interchromsomal relations leading in some instances to hybrid specific effects, e.g. reversion of phenotypic effects or the transgression of phenotypes. A QTL analysis based on a threefold sample size revealed, however, an overestimation of QTL effects in the analysis based on smaller sample size pointing towards a genetic architecture of many loci with small effects governing the phenotypic differences in courtship behaviour. Furthermore, the the study comprised the analysis of postzygotic isolation in the reciprocal crosses N. vitripennis (♀) x N. longicornis (♂) versus N. longicornis (♀) x N. vitripennis (♂) located several loci distributed over different chromosomes that are involved in hybrid incompatibility. The mapping of hybrid incompatibility regions reproduced for the first time the observed asymmetries in the strength of postzygotic isolation in reciprocal crosses of between the more distant related taxa within the genus Nasonia. Stronger postzygotic incompatibilities in the VL cross are supposed to result from the superposition of nuclear-nuclear incompatibilities with nuclear-cytoplasmic incompatibilities, whereas the coincidences of these to types of incompatibilities were found to be much weaker in the reciprocal LV cross.
Somites are repeated epithelial segments that are generated in a rhythmic manner from the presomitic mesoderm (PSM) in the embryonic tailbud. Later, they differentiate into skeletal muscle, cartilage and dermis. Somitogenesis is regulated by a complex interplay of different pathways. Notch/Delta signaling is one of the pathways well characterized in zebrafish through mutants affected in its different components. Previous work in mouse, chicken and zebrafish has shown that also additional components are required during somitogenesis, most importantly through an FGF and Retinoic acid (RA) gradient, as well as Wnt signaling. However, no zebrafish mutants with defects in these pathways showing specific somite malformations are described. This was explained by functional redundancies among related genes that have resulted from a whole genome duplication which occurred in a teleost fish ancestor 350 million years ago. As distinct duplicates exist in different teleost species, a large scale mutagenesis screen in the medaka (Oryzias latipes) has been performed successfully in Kyoto, Japan. I analyzed nine of the isolated medaka mutants that show variable aspects of somitic phenotypes. This includes a complete or partial loss of somite boundaries (e.g. bms and sne), somites with irregular sizes and shapes (e.g. krz and fsl) or partially fused and enlarged somites (e.g. dpk). Although some of these medaka mutants share characteristics with previously described zebrafish somite mutants, most of the mutants represent unique phenotypes, not obtained in the zebrafish screens. In-situ hybridization analyses with marker genes implicated in the segmentation clock (e.g. her7), establishment of anterior-posterior (A-P) polarity (e.g. mesp) and differentiation of somites (e.g. myf5, lfng) revealed that the medaka mutants can be separated into two classes. Class I shows defects in tailbud formation and PSM prepatterning, and lateron somite boundary formation was impaired in these mutants. A unique member of this class with a novel phenotype is the doppelkorn (dpk) mutant that has single fused or enlarged somites. This phenotype has not been reported till now in zebrafish somite mutants. In-situ analyses on dpk showed that stabilization of the cyclically expressed somitogenesis clock genes must be affected in this mutant. This is accompanied by a disrupted regulation of A-P polarity genes like mesp. This suggests that dpk is a mutant deficient in the wave front, which is necessary for the down-regulation of oscillating genes in the anterior PSM. Furthermore, as the initiation of oscillation of all three cyclic her genes was unaffected in dpk embryos, I could exclude that this mutant in affected in the Notch/Delta pathway. Another mutant that belongs to this class is the samidare (sam) mutant. Morphologically, sam mutants are similar to zebrafish after eight (aei). In both cases, the first 7-9 somites are formed properly, but after this somite formation ceases. Different to the situation in aei, sam mutant embryos presented an additional defect in the mid-hindbrain boundary (MHB) region. Similar MHB defects were described in the zebrafish fgf8 mutant acerebellar (ace). In ace zebrafish mutant, somites were only slightly defective, although FGF signaling has been shown to be important for somite formation in chicken, mouse and zebrafish. This was explained by functional redundancy between fgf8 and fgf24 ligands in the tailbud of zebrafish. Thus, it is interesting to suggest that the sam mutant, based on the parallel defects in somites and MHB, is a potential member of the FGF signaling pathway muatnts. It was shown that FGF plays a crucial role during MHB formation in medaka. In addition, I showed that fgf8 acts non-redundantly during tailbud formation and somitogenesis in medaka. Furthermore, I showed that FGF signaling regulates somite size also in medaka and that fgfr1 is the only FGF receptor expressed in the tailbud and somites. In class II medaka somite mutants, PSM prepatterning appears normal, whereas A-P polarity, boundary formation, epithelialization or the later differentiation of somites appears to be affected. Such mutants have not been isolated so far in zebrafish, mice or chicken. Therefore, medaka class II somite mutants seem to be a novel group of mutants that opens new perspectives to analyze A-P polarity regulation, determination and boundary formation in the presence of a normally functioning clock in the PSM. Identifying the encoding genes for all analyzed medaka somite mutants will contribute to the understanding of the molecular interactions of different signaling pathways involved during somitogenesis, and is expected to result in the identification of new components.
This study investigates the abundance and geographic distribution of the hawkmoth species (Lepidoptera: Sphingidae) of Southeast-Asia and analyses the resulting patterns of biodiversity, biogeography and macroecology. Data on the distribution of species were retrieved from published and unpublished faunal lists and museum collections (in close cooperation with the Natural History Museum, London). Over 34,500 records of the global distribution of the 380 species that occur in Southeast-Asia (including New Guinea and the Solomon Islands) were used for a GIS-supported estimate of distributional ranges, which can be accessed at http://www.sphingidae-sea.biozentrum.uni-wuerzburg.de, an Internet site that also provides pictures of the species and checklists for 114 islands of the Malesian region. The abundance of species in local assemblages was assessed from nightly collections at artificial light sources. Using a compilation of own samples as well as published and unpublished data from other sources, local abundance data on 93 sites were used for analysis, covering 159 species or 17,676 specimens.
Das four-jointed (fj) Gen in Drosophila ist zum einen am proximo-distalen Längenwachstum der Extremitäten beteiligt, zum anderen spielt es auch eine Rolle in dem in neuerer Zeit verstärkt untersuchten planaren Zellpolaritätssignalweg (PCP-Signalweg). Über das in der Maus identifizierte homologe fjx1 Gen ist dagegen vergleichsweise wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war daher die nähere Charakterisierung von fjx1 sowie die Identifizierung möglicher Interaktionspartner. Durch RNA in situ Hybridisierung wurde zunächst das räumliche und zeitliche Expressionsmuster von fjx1 in Embryonen und adulten Organen untersucht. Dabei zeigte sich, dass fjx1 in allen Stadien vor allem im Gehirn, aber auch in epithelialen Strukturen verschiedener Organe exprimiert war. Obwohl die Expression von fjx1 ebenso wie die von fj über den Notch-Signalweg reguliert wird, konnte im Gegensatz zu Drosophila jedoch keine Regulation von fjx1 über den Wnt- und/oder den JAK/STAT-Signalweg nachgewiesen werden. Da Fj in Drosophila zumindest teilweise sezerniert wird und nicht-zellautomome Effekte zeigt, wurde ein Fjx1-Rezeptor gesucht. Mit Hilfe eines Fjx1-AP Fusionsproteins konnten Bindungsstellen überlappend bzw. angrenzend zu Regionen mit fjx1-Expression gefunden werden. Beispielsweise zeigten in der embryonalen Lunge und der Niere sowohl die in situ Hybridisierung (fjx1-Expression) als auch die Inkubation mit dem Fusionsprotein (Lokalisation des Bindungspartners) Färbung in epithelialen Strukturen, während im adulten Gehirn die Färbungen in jeweils benachbarten Schichten des Hippocampus und des Kleinhirns detektiert wurden. Durch Expressionsklonierung bzw. Coimmunpräzipitation konnte der Rezeptor jedoch nicht identifiziert werden. Aufgrund der Tatsache dass fj in Drosophila in enger Beziehung zu dachsous (ds) und fat (ft) steht, wurden die homologen Gene in der Maus gesucht und deren Expressionsmuster analysiert. In Embryonalstadien war dchs1 komplementär zu fjx1 in mesenchymalen Geweben zu finden, ähnlich der Situation in Drosophila, wo fj und ds in gegenläufigen Gradienten exprimiert sind. Das homologe Gen von ft, fat-j, war hingegen nicht ubiquitär exprimiert, sondern wie dchs1 im Mesenchym. Ergänzend dazu wurden die fat-like (ftl) Homologen, fat1-3, epithelial detektiert. Die Expression in adulten Organen wurde mit Real-Time-PCR untersucht, die zeigte, dass alle Gene (fj, ds und fat Homologe) relativ stark im adulten Gehirn zu finden sind. Mit Hilfe von RNA in situ Hybridisierungen konnten die Gene im Riechhirn, im Hippocampus und im Kortex des Großhirns sowie in der Körnerschicht des Kleinhirns lokalisiert werden. Um Hinweise auf die Funktion von Fjx1 zu erhalten, wurde in Datenbanken nach Proteinen mit ähnlicher Aminosäuresequenz gesucht, die eventuell Auskunft über mögliche Proteindomänen geben sollten. Bei den gefundenen fünf Mausproteinen handelte es sich jedoch um hypothetische bzw. noch nicht untersuchte Proteine, so dass Rückschlüsse auf die Funktion von Fjx1 nicht möglich waren. Die Expression dieser Gene war nach Datenbankangaben entweder sehr spezifisch, beschränkt auf ein bestimmtes Gewebe (z.B. Milchdrüse oder Nebenniere) oder schwach und dafür ubiquitär, was sich auch durch eine schwache, einheitliche Färbung in der RNA in situ Hybridisierung bestätigte. Die Proteinstruktur von Fjx1 und der Fjx1-ähnlichen Proteine sowie die Art der konservierten Reste geben Grund zu der Annahme, dass es sich um (sezernierte) Glykosyltransferasen handeln könnte, was durch die zumindest zeitweise Lokalisation von Fjx1 im Golgi-Apparat bestärkt wird. Auch die in Drosophila gefundenen Ergebnisse sprechen für eine derartige Funktion von Fj, obwohl auch hier noch keine konkreten biochemischen Belege vorliegen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine Konservierung des in Drosophila entdeckten Fj/Ds/Ft-Siganlwegs in Vertebraten hin, wenn auch der genaue Mechanismus der Interaktion zwischen den Proteinen noch nicht geklärt ist und weiterer Untersuchungen bedarf.
Listeria monocytogenes ist ein fakultativ humanpathogenes Bakterium und aufgrund seiner Fähigkeit, in Zellen des Wirtes einzudringen und sich im Zytoplasma der befallenen Wirtszelle zu vermehren, ein attraktiver Träger, um heterolog exprimierte Antigene in den MHC-I- und -II-Präsentationsweg antigenpräsentierender Zellen (APC) einzuschleusen und so eine effektive zelluläre Immunreaktion zu erzeugen. Dabei hat die Art und Weise der Antigenexpression einen wesentlichen Einfluss auf die Erzeugung der antigenspezifischen Immunität. So konnte unter Verwendung extrazellulärer Trägerbakterien gezeigt werden, dass insbesondere die Verankerung von Antigenen auf der Zelloberfläche der Bakterien zu einer effektiven Induktion einer humoralen Immunantwort führt. Mit dem Ziel, mit einem derartigen Ansatz auch eine zelluläre Immunität zu erzeugen, wurde ein Plasmidsystem für die Expression von heterologen Proteinen in der Zellwand von L. monocytogenes entwickelt. Dabei gelang die Verankerung zahlreicher Proteine eukaryontischer wie auch prokaryontischer Herkunft über das LPXTG-Ankermotiv von Internalin A. Die so erzielte starke Expression in der Zellwand setzte aber sowohl die Fitness der Bakterien als auch deren Invasivität in vitro deutlich herab und verhinderte damit eine effektive MHC-I-Präsentation des verwendeten Modellantigens. Alternativ wurde L. monocytogenes bereits erfolgreich zur Übertragung von DNA-Vakzinen eingesetzt, um so auch die Synthese gegebenenfalls posttranslationell modifizierter Antigene in ihrer korrekten Konformation durch die infizierte Wirtszelle zu erzielen. Allerdings erfolgte die Expression des als Reporterprotein verwendeten EGFP insbesondere in APC sehr langsam und war von geringer Effizienz. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass nach bakterieller Übertragung von DNA-Vakzinen der Import der Plasmidmoleküle in den Kern insbesondere sich nicht teilender Zellen einen der wichtigsten Engpässe für eine möglichst frühzeitige und effektive Reportergenexpression darstellt. Einen Ausweg bietet die bakterielle Übertragung codierender mRNA, die unmittelbar nach der Freisetzung aus der Bakterienzelle im Zytoplasma der infizierten Wirtszelle zur Translation zu Verfügung steht. Dazu wurde das 5’-Ende der EGFP-codierenden Sequenz mit dem IRES-Element des Encephalomyocarditisvirus genetisch fusioniert. Um eine möglichst hohe Syntheserate zu erzielen und damit dem Abbau der mRNA in der Bakterienzelle entgegenzuwirken, erfolgte die Synthese der mRNA in L. monocytogenes mit Hilfe eines T7-RNA-Polymerase-basierten Transkriptionssystems. Im Gegensatz zur bakteriellen Übertragung von Plasmid-DNA konnte so bereits 4 h nach Infektion sowohl in epithelialen als auch in APC wie Makrophagen und humanen dendritischen Zellen eine deutliche EGFP-Expression nachgewiesen werden sowie bei Verwendung von Ovalbumin als Reporterprotein eine effektive MHC-I-Präsentation in vitro. Damit stellt die bakterielle Übertragung von mRNA einen vielversprechenden neuartigen Ansatz dar zur Erzeugung einer zellulären und gegebenenfalls auch humoralen Immunantwort gegen posttranslational modifizierte Antigene.
Insights into the evolution of protein domains give rise to improvements of function prediction
(2005)
The growing number of uncharacterised sequences in public databases has turned the prediction of protein function into a challenging research field. Traditional annotation methods are often error-prone due to the small subset of proteins with experimentally verified function. Goal of this thesis was to analyse the function and evolution of protein domains in order to understand molecular processes in the cell. The focus was on signalling domains of little understood function, as well as on functional sites of protein domains in general. Glucosaminidases (GlcNAcases) represent key enzymes in signal transduction pathways. Together with glucosamine transferases, they serve as molecular switches, similar to kinases and phosphatases. Little was known about the molecular function and structure of the GlcNAcases. In this thesis, the GlcNAcases were identified as remote homologues of N-acetyltransferases. By comparing the homologous sequences, I was able to predict functional sites of the GlcNAcase family and to identify the GlcNAcases as the first family member of the acetyltransferase superfamily with a distinct catalytic mechanism, which is not involved in the transfer of acetyl groups. In a similar approach, the sensor domain of a plant hormone receptor was studied. I was able to predict putative ligand-binding sites by comparing evolutionary constraints in functionally diverged subfamilies. Most of the putative ligand-binding sites have been experimentally confirmed in the meantime. Due to the importance of enzymes involved in cellular signalling, it seems impossible to find substitutions of catalytic amino acids that turn them catalytically inactive. Nevertheless, by scanning catalytic positions of the protein tyrosine phosphatase families, I found many inactive domains among single domain and tandem domain phosphatases in metazoan proteomes. In addition, I found that inactive phosphatases are conserved throughout evolution, which led to the question about the function of these catalytically inactive phosphatase domains. An analysis of evolutionary site rates of amino acid substitutions revealed a cluster of conserved residues in the apparently redundant domain of tandem phosphatases. This putative regulatory center might be responsible for the experimentally verified dimerization of the active and inactive domain in order to control the catalytic activity of the active phosphatase domain. Moreover, I detected a subgroup of inactive phosphatases, which presumably functions in substrate recognition, based on different evolutionary site rates within the phosphatase family. The characterization of these new regulatory modules in the phosphatase family raised the question whether inactivation of enzymes is a more general evolutionary mechanism to enlarge signalling pathways and whether inactive domains are also found in other enzyme families. A large-scale analysis of substitutions at catalytic positions of enzymatic domains was performed in this work. I identified many domains with inactivating substitutions in various enzyme families. Signalling domains harbour a particular high occurrence of catalytically inactive domains indicating that these domains have evolved to modulate existing regulatory pathways. Furthermore, it was shown that inactivation of enzymes by single substitutions happened multiple times independently in evolution. The surprising variability of amino acids at catalytic positions was decisive for a subsequent analysis of the diversity of functional sites in general. Using functional residues extracted from structural complexes I could show that functional sites of protein domains do not only vary in their type of amino acid but also in their structural location within the domain. In the process of evolution, protein domains have arisen from duplication events and subsequently adapted to new binding partners and developed new functions, which is reflected in the high variability of functional sites. However, great differences exist between domain families. The analysis demonstrated that functional sites of nuclear domains are more conserved than functional sites of extracellular domains. Furthermore, the type of ligand influences the degree of conservation, for example ion binding sites are more conserved than peptide binding sites. The work presented in this thesis has led to the detection of functional sites in various protein domains involved in signalling pathways and it has resulted in insights into the molecular function of those domains. In addition, properties of functional sites of protein domains were revealed. This knowledge can be used in the future to improve the prediction of protein function and to identify functional sites of proteins.
Honigbienen (Apis mellifera carnica) regulieren die Temperatur ihrer Brut in einem sehr engen Temperaturfenster, da vor allem die gedeckelte Brut sehr temperaturempfindlich reagiert (Groh et al. 2004). Die Thermoregulation ist nicht – wie lange angenommen – Beiprodukt von alltäglichen Arbeiten der Bienen im Brutbereich, sondern eine aktive und Energie- und Zeitaufwändige eigene Tätigkeit. Arbeiterinnen ziehen sich mit ihren Beinen an die Brutoberfläche, drücken ihren warmen Thorax auf die Brutdeckel und verharren so für einige Minuten um mit der eigenen Körperwärme die Brut zu temperieren (Bujok et al. 2002). Wie erwartet korrelierte die Thoraxtemperatur einer Arbeiterin mit der Frequenz der abdominalen Atembewegungen, bei sehr hohen Thoraxtemperaturen (über 40°C) erreichten die Bienen Atemfrequenzen von über 8Hz. Eine weitere Methode die Brut effektiv zu wärmen übten Bienen aus, die leere Zellen im gedeckelten Brutbereich besuchen (Kleinhenz et al. 2003). Arbeiterinnen gingen dabei bevorzugt in Zellen, die von möglichst vielen gedeckelten Zellen umgeben waren. Sowohl die Dauer der Zellbesuche, als auch die mittlere Thoraxtemperatur bei Ein- und Austritt der Zelle korrelierten mit der Anzahl der benachbarten Brutzellen – je mehr Brutzellen eine leere Zelle in ihrer direkten Nachbarschaft hatte umso länger dauerte der Besuch einer Biene und umso höher ist die Ein- bzw. Austrittstemperatur der Biene. Mindestes 48 Stunden alte Bienen unterschieden sich signifikant in ihrem Wärmeverhalten von jüngeren Bienen. Tote gedeckelte Brut wurde in manchen Fällen über viele Tage (durchgehend bis 10 Tage) gewärmt, sie unterschied sich in ihrer Temperatur nicht von unbehandelter gedeckelter Brut. In weiteren Versuchen lag die Bruttemperatur von toter Brut zwar unter der eines Kontrollbereiches, die Temperatur lag aber weiterhin im optimalen Bereich von 33,5 bis 35°C (Groh et al. 2004). In diesen Versuchen wurde die tote Brut vor dem Einsetzen in den Beobachtungsstock wieder auf 35°C erwärmt. Wachskegel in gedeckelten Zellen wurden erkannt und ausgeräumt. Aktive Signale, die von der Brut ausgehen scheinen also nicht notwendig für die effektive Bruttemperaturregulierung zu sein. Untersuchungen mittels Laser-Doppler-Vibrometrie zeigten auch keine Hinweise auf eine mechanische Kommunikation zwischen den Puppen und den Arbeiterinnen. Das Brutwärmen scheint eine Aktion zu sein, die von den Bienen nur in Gemeinschaft sinnvoll durchgeführt werden kann. In einigen Fällen kam es während der Puppenphase zu unerklärlichen Abfällen in der Bruttemperatur, die nur durch einen positiven Rückkopplungseffekt seitens der Arbeiterinnen erklärt werden kann. Beim Brutwärmen spielen die Antennen der Arbeiterinnen wahrscheinlich eine wichtige Rolle. Während sich die Bienen beim aktiven Brutwärmen den Brutdeckel annähern sind die Antennenspitzen immer auf die Brutdeckel gerichtet. Fehlen den Arbeiterinnen die Antennen, dann ist die Thermoregulation eingeschränkt oder unzureichend. Die Bruttemperatur korreliert mit der Anzahl der abgetrennten Antennensegmente, je mehr Antennensegmente fehlen, desto weniger gut wird die Temperatur im Brutbereich hoch und konstant gehalten. Zusätzlich scheint es eine Lateralität in der Antennenfunktion zu geben, wurde die rechte Antenne gekürzt wärmten die Bienen die Brut signifikant schlechter, als beim Kürzen der linken Antenne. Durch das Kürzen der Antennen änderte sich auch das Verhalten der Tiere: Kontrollbienen verharrten ruhig im Brutbereich, während Bienen mit gekürzten Antennen teilweise ähnlich warm waren, aber nicht mehr das oben beschriebene aktive Brutwärmeverhalten zeigten.
Olfaction plays an important role in a variety of behaviors throughout the life of the European honeybee. Caste specific, environmentally induced and aging/experiencedependent differences in olfactory behavior represent a promising model to investigate mechanisms and consequences of phenotypic neuronal plasticity within the olfactory pathway of bees. This study focuses on the two different female phenotypes within the honeybee society, queens and workers. In this study, for the first time, structural plasticity in the honeybee brain was investigated at the synaptic level. Queens develop from fertilized eggs that are genetically not different from those that develop into workers. Adult queens are larger than workers, live much longer, and display different behaviors. Developmental trajectory is mainly determined by nutritional factors during the larval period. Within the subsequent post-capping period, brood incubation is precisely controlled, and pupae are incubated close to 35°C via thermoregulatory activity of adult workers. Behavioral studies suggest that lower rearing temperatures cause deficits in olfactory learning in adult bees. To unravel possible neuronal correlates for thermoregulatory and caste dependent influences on olfactory behavior, I examined structural plasticity of developing as well as mature olfactory synaptic neuropils. Brood cells were reared in incubators and pupal as well as adult brains were dissected for immunofluorescent staining. To label synaptic neuropils, I used an antibody to synapsin and fluophore-conjugated phalloidin which binds to filamentous (F-) actin. During development, neuronal F-actin is expressed in growing neurons, and in the mature nervous system, F-actin is most abundant in presynaptic terminals and dendritic spines. In the adult brains, this double labeling technique enables the quantification of distinct synaptic complexes microglomeruli [MG]) within olfactory and visual input regions of the mushroom bodies (MBs) prominent higher sensory integration centers. Analyses during larval-adult metamorphosis revealed that the ontogenetic plasticity in the female castes is reflected in the development of the brain. Distinct differences among the timing of the formation of primary and secondary olfactory neuropils were also revealed. These differences at different levels of the olfactory pathway in queens and workers correlate with differences in tasks performed by both female castes. In addition to caste specific differences, thermoregulation of sealed brood cells has important consequences on the synaptic organization within the MB calyces of adult workers and queens. Even small differences in rearing temperatures affected the number of MG in the olfactory calyx lip regions. In queens, the highest number of MG in the olfactory lip developed at 1°C below the temperature where the maximum of MG is found in workers (33.5 vs. 34.5°C). Apart from this developmental neuronal plasticity, this study exhibits a striking age-related plasticity of MG throughout the extended life span of queens. Interestingly, MG numbers in the olfactory lip increased with age, but decreased within the adjacent visual collar of the MB calyx. To conclude, developmental and adult plasticity of the synaptic circuitry in the sensory input regions of the MB calyx may underlie caste- and age-specific adaptations and long-term plasticity in behavior.
Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein.
BMPs influence a variety of cellular processes. They have been shown to regulate proliferation, differentiation, migration and apoptosis and thus play central roles during developmental processes and tissue homeostasis. Ligand mediated signal transduction is transmitted via BMP type I and BMP type II receptors, both members of the serine/threonine kinase superfamily. The BMP receptor mediated signal transduction is not explored in detail. Therefore our aim was to address different aspects of BMP mediated signal transduction with main focus on BRII and its regulation. Due to the existence of two alternative splice variants, a long and a short form, the function of the two variants and the impact of the C-terminal extension are of general interest. Moreover, mutations in the BMPR2 gene were identified to be responsible for PPH, a autosomal dominant lung disease. In this thesis, BRII phosphorylation and signalling mediated by different receptor oligomers were investigated and multiple BRII associated proteins were identified. We could show that the oligomerization pattern of BMP receptors exhibits a higher degree of flexibility compared to other receptors of that superfamily. In the present work the BMP2 mediated signal transduction should be examined, depending on the receptor oligomerization pattern. Using kinase-deficient mutants, it could be demonstrated, that signalling via preformed BMP receptor complexes is mediated by the well characterized Smad1/5/8 pathway, whereas signalling initiated by BMP2 induced recruitment of the receptors activates the p38 pathway and leads to Alkaline Phosphatase production. To further study signalling events triggered directly from the BRII a proteomics-based screen for BRII associated proteins was performed. 53 associated proteins were found, the majority being signal transducing molecules, but in addition metabolic proteins, transcriptional regulators and others were identified. These proteins enable to gain a deeper insight in BMP mediated signalling. One of the interactors, the receptor tyrosine kinase c-kit, was characterized in more detail. It could be demonstrated, that BRII and c-kit form a complex in vitro and in vivo, and the interaction is enhanced upon BMP2 stimulation. 2D phosphopeptid mapping showed that BRII is phosphorylated at S757 upon activation of c-kit by SCF. Moreover, c-kit and its ligand SCF are modulating BMP2 pathways, by enhancing Smad1/5 phosphorylation, Smad-transcriptional activity, Alkaline Phosphatase production and expression of Cbfa1. All these pathways hint towards modulation of the osteoblast development via c-kit. Thus, we were able to develop a novel paradigm for the BMP2 meditated signalling. One of the initial triggers for BRII is the auto-phosphorylation of BRII. Here we analyze ligand-independent as well as ligand-dependent phosphorylation of BRII. Some phosphorylation sites in BRII were identified. The general phosphorylation occurs mostly on serines. S815, S818 and Y825 are identified targets of phosphorylation whose function is still unclear. However phosphorylation of S336 is demonstrated to be essential for BRII activation. The elucidation of BMP receptor phosphorylation and oligomerization as well as the impact of a number of BRII associated proteins (such as c-kit), demonstrated in this thesis that BMP signalling has to be regulated precisely on multiple levels. This can be useful for the development of selective signalling inhibitors for basic research and therapeutic approaches of PPH and other diseases.
Corynebacterium glutamicum is together with C. callunae and C. efficiens a member of the diverse group of mycolic-acid containing actinomycetes, the mycolata. These bacteria are potent producer of glutamate, lysine and other amino acids on industrial scale. The cell walls of most actinomycetes contain besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex large amounts of mycolic acids. This three-layer envelope is called MAP (mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan) complex and it represents a second permeability barrier beside the cytoplasmic membrane similar to the outer membrane of Gram-negative bacteria. In analogy to the situation in the outer membrane of Gram-negative bacteria, channels are present in the mycolic acid layer of the mycobacterial cell wall for the passage of hydrophilic solutes. Molecular studies have provided far-reaching findings on the amino acid flux and its balance in C. glutamicum in general, but the L-glutamate export still remains unknown. The properties of the outer layers, typical of mycolata, seem to be of major importance in this process, and diffusion seems to play a key role for this part of the cell wall. The major aim of this thesis was to identify and study novel channel-forming proteins of the amino acid producers C. glutamicum, C. callunae and C. efficiens. Cell wall extracts of the organisms were investigated and a novel pore-forming protein, named PorH, that is homologue in all three organisms, was detected and characterized. PorHC.glut was isolated from C. glutamicum cells cultivated in minimal medium. The protein was identified in lipid bilayer experiments and purified to homogeneity by fast-protein liquid chromatography across a HiTrap-Q column. The purified protein forms cation-selective channels with a diameter of about 2.2 nm and an average single-channel conductance of about 2.5 nS in 1 M KCl in the lipid bilayer assay. Organic solvent extracts were used to study the permeability properties of the cell wall of C. callunae and C.efficiens. The cell extracts contained channel-forming activity, the corresponding proteins were purified to homogeneity by fast-protein liquid chromatography across a HiTrap-Q column and named PorHC.call and PorHC.eff. Channels formed by PorHC.call are cation-selective with a diameter of about 2.2 nm and an average single-channel conductance of 3 nS, whereas PorHC.eff forms slightly anion selective channels with an average single-channel conductance of 2.3 nS in 1 M KCl in the lipid bilayer assay. The PorH proteins were partially sequenced and the corresponding genes, which were designated as porH, were identified in the published genome sequence of C. glutamicum and C. efficiens. The chromosome of C. callunae is not sequenced, but PorHC.call shows a high homology to PorHC.eff and PorHC.glut. The proteins have no N-terminal extension, only the inducer methionine, which suggests that secretion of the proteins could be very similar to that of PorAC.glut of C. glutamicum. PorHC.glut is coded in the bacterial chromosome by a gene that is localized in the vincinity of the porAC.glut gene, within a putative operon formed by 13 genes that are encoded by the minus strand. Both porins are cotranscribed and coexist in the cell wall, which was demonstrated in RT-PCR and immunological detection experiments. The arrangement of porHC.glut and porAC.glut on the chromosome is similar to that of porBC.glut and porCC.glut and it was found that PorAC.glut, PorHC.glut, PorBC.glut and PorCC.glut coexist in the cell wall of C. glutamicum. The molecular mass of about 6 kDa of the PorH channel forming proteins is rather small and suggests that the cell wall channels are formed by oligomers. A possibly hexameric form was demonstrated for PorHC.glut in Western blot analysis with anti- PorHC.glut antibodies. Secondary structure predictions for PorHC.glut, PorHC.call and PorHC.eff predict that a stretch of about 42 amino acids of PorHC.glut and 28 amino acids of PorHC.call and PorHC.eff forms amphipathic -helices with a total length of 6.3 nm and 4.2 nm respectively. This should be sufficient to cross the mycolic acid layer. Another objective of this work was to establish an heterologous expression system for corynebacterial channel-forming proteins, to investigate the channel-forming properties of the up to now only hypothetical porins PorA, PorB, PorC from C. efficiens and PorC from C. glutamicum. We could demonstrate with recombinant expression experiments in E. coli that porBC.eff and porCC.eff encode for channel-forming proteins. They are, like PorBC.glut, anion-selective with a similar single-channel conductance of 1 nS in 1 M KCl.
The bacteriophage Lambda is a virus which infects bacteria carrying LamB protein in their outer membrane. GpJ, a protein of the tail of the phage, is involved in the binding to LamB. The study of the interaction between GpJ expressed as fusion protein and LamB was performed in order to investigate the interaction between the bacteriophage Lambda and LamB. The fusion proteins are called MBP-gpJ and His-gpJ. MBP-gpJ is a chimeric protein representing Maltose Binding Protein connected to the Cterminal part of the GpJ protein (residue 684 until 1132), graciously given by Pr. Charbit (Paris, France). MBP-gpJ, expressed in E.coli and purified, bound to the exoplasmic side of LamB and LamB variants in planar lipid bilayer experiments and allowed a complete and reversible blockage of LamB channels. In order to obtain data about the binding of the GpJ fragment alone to LamB, an other fusion protein without MBP was created, called His-gpJ. His-gpJ is the C-terminal part of GpJ (684-1132) in fusion with a 6×Histidine-tag, produced as insoluble form in E.coli. After renaturation, a soluble protein can be obtained. Without MBP, the GpJ fragment still bound to LamB in planar lipid bilayer experiments, but did not block significantly its channels, as previously observed after addition of MBP-gpJ. The interaction between His-gpJ and LamB or LamB mutants was also demonstrated on SDSPAGE and immunodetection by the presence of high molecular mass bands. Furthermore, the use of variants of lamB allowed to demonstrate that the C-terminal fragment of GpJ does not bind to the same area on the surface of LamB than GpJ involved in the tail of the Lambda phage.
Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann.
Insects exhibit complex systems of communication with chemical signalling being the most important mode. Although there are many studies on chemical communication in insects, the evolution of chemical signals is not well understood. Due to the conflict of interests between individuals, different selective pressures might act on sender and receiver. In this thesis I investigate different types of communication where either the sender, the receiver or both parties yield benefits. These studies were conducted with one digger wasp species, honeybees, one chrysidid wasp, and three ant species. Senders might benefit by exploiting existing preferences of receivers. Such sensory exploitation might influence the evolution of male signals that are designed to attract females. The sex pheromone of male European beewolves Philanthus triangulum (Hymenoptera, Crabronidae) might have evolved according to the sensory exploitation hypothesis. A three-step scenario is supported by our studies. First, a major component of the honeybee alarm pheromone, (Z)-11-eicosen-1-ol, is also found on the cuticles and in the air surrounding foraging honeybees. Second, it could be shown, that (Z)-11- eicosen-1-ol plays a crucial role as kairomone for prey identification of honeybees by beewolf females. Third, a reanalysis of the beewolf male sex pheromone shows a remarkable similarity of compounds between the pheromone and the honeybee cuticle, besides the co-occurrence of (Z)-11-eisosen-ol. The majority of the cuticular hydrocarbons of honeybees occur also in the headspace of foraging workers. These results strongly support the hypothesis that beewolf males evolved a pheromone that exploits the females’ pre-existing sensory sensitivity. In addition, the male sex pheromone shows a significantly higher similarity among brothers than among non-related individuals, which might enable beewolf females to discriminate against brothers and avoid detrimental effects of breeding. Together with the studies on the possible sensory exploitation this result shows that both, male and female beewolves probably gain more benefits than costs from the pheromone communication and, thus, the communication system as a whole can be regarded as cooperative. To maintain the reproductive division of labour in eusocial colonies, queens have to signal their presence and fecundity. In the ant Camponotus floridanus (Hymenoptera, Formicidae) queens mark their own eggs with a distinctive pattern of cuticular hydrocarbons. Two different hypotheses have been developed. One suggests a form of worker manipulation by the queen. The alternative hypothesis assumes a cooperative signal that provides information on the condition of the queen. The results of our investigation clearly favour the latter hypothesis. Chemical mimicry is a form of non-cooperative communication that benefits predominantly the sender. We provided conclusive evidence that the cockoo wasp, Hedychrum rutilans (Hymenoptera, Chrysididae), the primary brood parasitoid of Philanthus triangulum, evades recognition by beewolf females most probably by chemical mimicry of the odour of its host. Furthermore, the adaptation of the chemical signature in the social ant parasite Protomognathus americanus (Hymenoptera, Formicidae) to its Leptothorax (Hymenoptera, Formicidae) hosts was investigated. Although this parasite is principally adapted to its hosts’ cuticular hydrocarbon profile, there are still pronounced differences between the profiles of parasites and hosts. This might be explained by the trade-off, which the parasites faces when confronted locally with two host species with different cuticular hydrocarbon profiles. Non-cooperative communication in the sense that only receivers benefit was discovered in the exploitation of honeybees volatile cuticular hydrocarbons by beewolf females. By using emitted (Z)-11-eicosen-1-ol as a kairomone, the receiver, the beewolf female, yields the benefits and the sender, the honeybee prey, bears all the costs. The results of these studies contribute to the understanding of the evolution of cooperative and non-cooperative communication with chemical signals taking into account differential benefits for sender and/or receiver.
Die Messung der räumlich aufgelösten Aktivität von neuronalen Zellverbänden ist ein wichtiges Werkzeug, um die Funktionsweise von Gehirnen zu verstehen. Für diese Arbeit diente die Fruchtfliege Drosophila melanogaster mit ihrer gut beschriebenen Genetik und Neurobiologie als Untersuchungsobjekt. Bei der vorgelegten Arbeit lag eine zweigeteilte Aufgabenstellung vor: Zum einen wurde die Technik des in – vivo Calcium – Imagings mit Hilfe des genetisch codierten Sensors Yellow Cameleon 2.1 am Lehrstuhl komplett neu etabliert, zum anderen wurde mit der neuen Technik das Zusammenspiel der funktionellen Elemente neuronaler Systeme anhand der Fliegenolfaktorik untersucht. Sowohl die Experimente zur Depolarisation durch KCl, als auch die Experimente zur olfaktorischen Codierung, wurden mit dem Calciumsensor Yellow Cameleon 2.1 durchgeführt. Es wurde ausgehend von der Vorgängerversion Yellow Cameleon 2.0 durch gezielte Mutagenese von Sören Diegelmann erstellt. Eine Photomultiplier – basierte in – vitro Funktionsanalyse des rekombinanten Sensorproteins ergab eine Zunahme der Ratio EYFP / ECFP mit steigender Calciumkonzentration. Dabei konnte auch der ratiometrische FRET – Effekt des Cameleons verdeutlicht werden: Mit steigender Calciumkonzentration verschiebt sich das Verhältnis von EYFP – Fluoreszenz zu ECFP – Fluoreszenz zu höheren Ratiowerten. Durch Zugabe des Calciumchelators EGTA konnte außerdem die reversible Arbeitsweise des Sensors nachgewiesen werden. Das in die Fliege eingebrachte Yellow Cameleon 2.1 – Konstrukt wurde mittels der GAL4 – UAS – Technik in verschiedenen olfaktorischen Gehirnzentren exprimiert. Von besonderer Relevanz für die Experimente zur olfaktorischen Codierung war dabei die GAL4 – Treiberlinie GH146. Mit ihrer Hilfe konnte das Fusionsprotein in den olfaktorischen Projektionsneuronen des Fliegengehirns exprimiert, und so die Duftrepräsentation im postsynaptischen Neuropil der Antennalloben bzw. in den präsynaptischen Neuropilen der Calyces und des lateralen Protocerbrums untersucht werden: Die Stimulation von 3 individuellen Fliegen mit den Düften Benzaldehyd, Isoamylacetat und Octanol liefert duftspezifische neuronale Aktivitätsmuster im Antenallobus. Die auf die Duftstimuli mit Calciumsignalen reagierenden Areale haben eine Größe von 10 – 30 µm, liegen also in der Größenordnung von individuellen Glomeruli. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben zeigt außerdem einen kombinatorischen Aspekt: Jeder Duft evoziert ein charakteristisches Aktivitätsmuster bestehend aus einem oder mehreren Glomeruli. Die Aktivitätsmuster verschiedener Düfte können sich überlagern, d.h. individuelle Glomeruli können durch verschiedene Düfte aktiviert werden, das gesamte Aktivitätsmuster, d.h. die Summe der aktivierten Glomeruli eines bestimmten Duftes, ist jedoch charakteristisch. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben von Drososophila geschieht also in Form eines glomerulären Codes, ein Prinzip der Duftverarbeitung, das auch in anderen Insekten und Vertebraten nachgewiesen werden konnte. Für den Calyx des Pilzkörpers ergaben sich innerhalb eines Individuums, bei wiederholter Stimulation mit demselben Duft, ebenfalls duftspezifische Aktivitätsmuster. Dabei waren die auf den Duftstimulus hin antwortenden neuronalen Areale diskret über den Calyx hinweg verteilt. Insgesamt zeigt das hohe Maß an Reproduzierbarkeit der Aktivitätsmuster für einen gegebenen Duft, dass im Calyx, wie in den Antennalloben, eine duftspezifische räumliche Repräsentation vorliegt. Der kombinatorische Aspekt der Codierung konnte auch hier beobachtet werden. Die einzelnen Spots der im Calyx gemessenen Aktivitätsmuster liegen in der Größenordnung von 5 +/- 2 µm und entsprechen somit in ihrer Größe den elektronenmikroskopisch beschriebenen Microglomeruli. Durch die Calcium – Imaging Experimente am lateralen Protocerebrum konnte nachgewiesen werden, dass die Erhöhung der Duftkonzentration eine räumliche Ausdehnung des aktivierten Neuropils zur Folge hat. Die EYFP –, ECFP – und Ratio – Intensitäten, die aus einer “Region of Interest“ im anterioren Bereich des lateralen Protocerebrums berechnet wurden, zeigen weiterhin, dass mit steigender Duftkonzentration auch die Stärke des Calciumsignals zunimmt. Dabei gibt es zwischen den 4 getesteten Düften statistisch signifikante Unterschiede: Methylcyclohexanol evoziert über den gesamten Verdünnungsbereich hinweg die schwächste neuronale Aktivität, Isoamylacetat evoziert in den Verdünnungsstufen 10-3 und 10-1 die stärkste neuronale Aktivität. D.h. neben der räumlichen Ausdehnung des Signals, führt die Konzentrationserhöhung auch zu einer gesteigerten Intensität des Calciumsignals, wobei sich die Signalintensitäten für verschiedene Düfte und Verdünnungsstufen unterscheiden können. Mit der verwendeten Versuchsanordnung und Datenauswertung, war es jedoch bislang nicht möglich eine räumliche Repräsentation der Düfte im lateralen Protocerebrum nachzuweisen.
Der Zellkern ist ein wichtiges Organell von eukaryotischen Zellen, der durch eine Doppelmembran vom Cytoplasma abgetrennt wird. Mit Hilfe des Zebrafischs als Modellorganismus und kultivierten Zellen verschiedener Vertebraten wurde in mehreren Teilprojekten Untersuchungen an integralen (Lamina assoziiertes Polypeptid 2, Lamin B Rezeptor) und peripheren Membranproteinen (Lamine) der in inneren Kernmembran durchgeführt. Eines der am besten untersuchten integralen Membranproteine der inneren Kernmembran ist das Lamina assoziierte Polypeptid 2 (LAP2). Durch alternatives Splicen entstehen aus einem einzigen Gen eine Reihe verschiedener Isoformen die entwicklungs- und gewebespezifisch exprimiert werden. In Säuger sind 6 verschiedene Isoformen (LAP2α, β, δ, ε, γ, ζ) bekannt, von denen alle mit Ausnahmen von LAP2α und ζ, in die innere Kernmembran integriert sind. Das LAP2α ist ausschließlich im Nukleoplasma lokalisiert und wurde bis jetzt nur bei Säugern beschrieben. Durch die Identifikation eines genomischen Klons ICRFc 7101293Q5 (RZPD) sowie vergleichende Datenbankanalysen konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LAP2-Gens ermittelt werden. Das Gen kodiert innerhalb von 19 kb (ohne regulatorische Sequenzen) 15 Exons aus denen durch alternatives Splicen 3 verschieden Isoformen hervorgehen (zLAP2 β, γ, ω). Mit Hilfe des “Radiation Hybrid mappings“ wurde das LAP2 Gen auf der “Linkage group“ 4 des Zebrafischs, zwischen den EST-Markern fc01g04 (213,97) und fb49f01 (215,69cR) lokalisiert. Aufgrund der zusätzlichen Identifikation der genomischen Sequenz des Hühner LAP2-Gens konnten die genomischen Sequenzen der LAP2 Gene von niederen Vertebraten (Zebrafisch), über die Vögel (Huhn), bis zum Säuger (Mensch) miteinander verglichen werden. Dabei zeigte sich einerseits, dass die ω Isoform des Zebrafischs nicht im Genom von Huhn und Säugern vorhanden ist: Andererseits ist die α Isoform der Säuger ebenfalls in keinem der anderen Spezies (Huhn, Zebrafisch) zu finden ist. Weiterhin konnte bei zusätzliche Proteinanalysen mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, gegen die konservierte aminoterminale Domäne der LAP2 Proteine, in 10 Tage alten Hühner Embryonen nur ein Protein mit einem vergleichbaren Molekulargewicht zum LAP2β anderer Spezies eindeutig detektiert werden. Aufgrund dieser Befunde und der Tatsache, dass die kodierenden Exonsequenzen zwischen Mensch und Huhn eine größere Ähnlichkeit zeigen als zwischen Mensch und Zebrafisch, liegt die Vermutung nahe, dass die α-Isoform eine Neuheit der Säugern darstellt. Ein weiteres integrales Membranprotein, dass erstmals beim Zebrafisch untersucht wurde, ist der Lamin B Rezeptor (zLBR). Mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden, konnte zwei Klone identifiziert werden die sowohl die gesamte cDNA-Sequenz (MPMGp567K10194Q3 (RZPD) als auch die gesamte genomische Sequenz (ICRFc71M10137Q5 (RZPD) beinhalten. Anhand von vergleichenden Datenbankanalysen, konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LBR-Gens ermittelt werden. Dieses kodiert innerhalb von 12 kb (ohne regulatorische Sequenzen) mit 13 Exons für ein 616 Aminosäure großes Protein. Vergleichbar mit dem LBR anderer Spezies besitzt der Zebrafisch LBR ebenfalls 8 Transmembrandomänen in seiner carboxyterminalen Domäne mit denen er in der inneren Kernmembran verankert ist. Der Aminosäurenvergleich mit anderen Spezies zeigte, dass die Aminosäurensequenz sowohl des aminoterminalen Bereichs als auch im Bereich der Transmembrandomänen hoch konserviert ist. Weiterhin wurden polyklonalen Antikörpern gegen die ersten 210 Aminosäuren des zLBRs hergestellt, die für zukünftige immunologische Analysen verwendet werden können. Ebenso wie die integralen Membranproteine spielen auch die Lamine eine wichtige Rolle bei nukleären Prozessen. Die B-Typ Lamine zeichnen sich alle durch ein konserviertes CxxMMotiv am Carboxyterminus aus. Das CxxM-Motiv wird nach posttranslational modifiziert, wodurch es lipophile Eigenschaften erlangt und somit für die anfängliche Verankerung der Lamine in der inneren Kernmembran verantwortlich ist. Bei A-Typ Laminen ist dieses Motiv nicht in der Primärsequenz enthalten oder es wird nach dem Einbau in die Kernlamina proteolytisch abgespalten. Eine Besonderheit stellt das meiotische Lamin C2 dar, welches ein Spliceprodukt des Lamin A Gens der Säuger ist. Das Lamin C2 besitzt zwar kein CxxMMotiv an seinem Aminoterminus, dafür aber ein Hexapeptid (GNAEGR) nach dem Startmethionin. Die posttranslationale Modifikation dieser Sequenz verleiht dem Protein lipoplile Eigenschaften. Anhand von funktionellen Analysen konnte durch die Überexpression GFP-Fusionsproteinen verschiedener wildtypischer Lamine und Lamin Mutanten gezeigt werden, dass die Interaktion der Lamine über das CxxM-Motiv oder das GNAEGR-Motiv mit der inneren Kernmembran, das Wachstum der Kernhülle induziert. In einem letzten Projekt konnte mit Hilfe spezifischer “antisense-“ Oligonukleotide, die als "Morpholinos" bezeichnet werden, die Expression von LAP2, LBR und den B-Typ Laminen B1 und B2 in Zebrafisch Embryonen reprimiert werden. Die Blockade der mRNA-Translation der entsprechenden Gene erfolgte in allen Fällen innerhalb der ersten 24 Stunden vollständig. Obwohl die Anzahl der beobachteten Embryonen relativ gering war, so zeigte sich bei allen Embryonen eine deutliche Entwicklungsverzögerung und unterschiedlich starke Entwicklungsstörungen. Die morphologischen Auswirkungen waren bei der Reduktion des LAP2 oder der Lamine geringer als bei der Reduktion des LBR, da in beiden Fällen maternale Proteine, wie das LA2ω oder das B-Typ Lamin LIII, nicht reduziert werden konnten.
Darwin’s theory of sexual selection explains the evolution of flamboyant male traits through female choice. It does not, however, address the question why males typically court and females choose. This asymmetry is now thought to be the result of the dichotomy in reproductive expenditures: Females invest primarily in parental care and males invest predominantly in mate attraction or competition. Based on this view, several hypotheses for the origin and maintenance of female preferences have been proposed. They include the classical sexual selection models, i.e. female choice for direct and indirect benefits as well as the more recent concepts of female choice for genetic compatibility and receiver bias models. The complementary choice scenario assumes that females choose mates with regard to genetic compatibility. The receiver bias concept views male traits and female preferences within the framework of communication theory and encompasses various more or less distinct models, two of which are sensory exploitation and sensory trap. Both models postulate that male signals evolved in response to pre-existing perceptual biases of females. The sensory trap hypothesis additionally emphasizes that pre-existing female preferences for certain cues evolved in non-sexual contexts, like e.g. foraging. Males that mimic these cues and elicit a favourable out-of-context response by females may increase their reproductive success. This thesis examines the evolution of the pheromone communication in the European Beewolf Philanthus triangulum. Beewolf females are specialized hunters of honeybees and provision their progeny with paralyzed prey. Male beewolves establish and scent mark territories with a pheromone from a head gland to court females. The concordant occurrence of the otherwise rare alcohol (Z)-11-eicosen-1-ol in the male pheromone and in the alarm pheromone of honeybees, the exclusive prey of the females, suggests a sensory trap process as an explanation for the evolution of the male pheromone in P. triangulum. According to this hypothesis, we tested three predictions: First, foraging honeybees should emit eicosenol. Via chemical analysis we could show that honeybee workers in fact smell of eicosenol during foraging. The occurrence of eicosenol on the cuticle and in the headspace of honeybees is a new finding. Second, beewolf females should use eicosenol as a cue for prey detection or identification. Using behavioural assays, we demonstrated that prey recognition in beewolf females is accomplished by olfactory cues and that eicosenol is an essential cue in this process. The sensory sensitivity of beewolf females to eicosenol must be extremely high, since they perceive the trace amounts present in the head space of honeybees. This sensitivity may be due to specialized olfactory receptors on the antennae of beewolf females. An inventory of the flagellar sensilla of both sexes showed that females carry one type of sensillum that is missing in males, the large sensillum basiconicum. This chemo-sensitive sensillum most likely plays a role in prey recognition. The third prediction is that beewolf males incorporate bee-like substances, including eicosenol, into their pheromone, and possibly catch females in a sensory trap. A reanalysis of the male pheromone revealed, among others, eicosenol and several alkanes and alkenes as pheromonal compounds. Our own analyses of the chemical profiles of honeybee workers and beewolf pheromone disclosed a surprisingly strong resemblance between the two. Eight of the eleven substances of the male pheromone are also present on the cuticle and in the headspace of honeybees. Notwithstanding this similarity, the male pheromone does not function as a sensory trap for females. Nevertheless, the extensive congruence between the odour bouquets of the females’ prey and the male pheromone strongly suggests that the male signal evolved to exploit a pre-existing female sensory bias towards bee odour, and, thus represents a case of sensory exploitation. In addition to the above described scenario concerning mostly the ‘design’ of the male pheromone, we addressed possible indirect benefits female beewolves may gain by basing their mating decisions on signal ‘content’. We show that the pheromone of male beewolves varies between families and may, thus, contain information about the degree of relatedness between the female and a potential mate. Females could use this information to choose genetically complementary males to avoid inbreeding and the production of infertile diploid sons. Collectively, our results provide strong evidence for a receiver bias process in the evolution of the male pheromone of P. triangulum. They further indicate that the pheromone composition may subsequently have been influenced by other natural or sexual selection pressures, like e.g. complementary female choice.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden visuelle Einflüsse auf die Beinplatzierung beim Laufen und auf das Kletterverhalten der Fliege Drosophila melanogaster analysiert. Während sich die Beinplatzierung als vorwiegend taktil gesteuert herausstellte, ist das Klettern sowohl bezüglich der Entscheidung zur Durchführung (Motivationssteuerung) als auch bezüglich der Ausführung selbst unter präziser visueller Kontrolle. Für die Untersuchungen wurde ein Lücken-Überwindungsparadigma entwickelt und die Kinematik des Kletterns über verschieden breite Lücken mit einer eigens entwickelten 3D-Hochgeschwindigkeits-Videoanlage erstmals quantitativ beschrieben. Drei wesentliche Verhaltensanpassungen sorgen dafür, dass die Fliegen die maximal mögliche Spannbreite ihrer Beine voll ausnützen und Lücken von bis zu 170% der eigenen Körperlänge überqueren können. Das Kletterverhalten wird abhängig von der Lückenbreite initiiert und sinnlose Versuche an unüberwindbar breiten Lücken vermieden. Die visuelle Lückenbreitenmessung wurde analysiert; sie beruht auf der Auswertung von Bewegungsparallaxe beim Anlauf. Einige Erkenntnisse aus der Laufforschung an Fliegen wurden auf einem im Rahmen dieser Arbeit modifizierten hexapoden Laufroboter umgesetzt und die Verbesserungen quantifiziert.
Kälteschockproteine werden in Bakterien, gleichermaßen wie die gut charakterisierten Hitzeschockproteine, bei hohen Temperaturschwankungen stark induziert und ermöglichen der Zelle durch unterschiedliche Funktionen ein Wachstum in der Kälte. In dieser Promotionsarbeit wurde begonnen, die Kälteschock-Antwort von Bakterien des Genus Bordetella zu charakterisieren. Sowohl B. bronchiseptica als auch B. pertussis codieren für fünf Kälteschockproteine, die als CspA, CspB, CspC, CspD und CspE bezeichnet werden. Die fünf Proteine weisen eine signifikante Homologie zum Haupt-Kälteschockprotein CspA aus E. coli auf. Während in den Modellorganismen E. coli und B. subtilis mindestens vier (E. coli) bzw. alle drei (B. subtilis) csp-Gene deletiert sein müssen, um einen Wachstumsdefizit zu erkennen, genügt im Falle von B. bronchiseptica eine einzige Insertionsmutation im Gen cspB, um einen temperaturunabhängigen Wachstumsdefekt zu beobachten. Nach einem Kälteschock werden in B. bronchiseptica drei der fünf csp-Gene, cspA, cspB und cspC, deutlich induziert. Betrachtet man das Expressionsmuster der fünf csp-Gene unter verschiedenen Stressbedingungen, wie Zugabe von translationshemmenden Antibiotika, Hitzeschock oder osmotischer Stress, so lässt sich ein komplexes Expressionsmuster aufzeichnen. Außerdem besitzen die drei kälteinduzierbaren Gene cspA, cspB und cspC mehrere Transkriptionsstartpunkte, deren Transkriptmengen unter den verschiedenen Schockbedingungen stark variieren. Es stellte sich heraus, dass eine Überexpression von CspB aus B. bronchiseptica für die E. coli – Zelle toxisch ist, daher wurde das CspB-Protein als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Glutathion-Sepharose aufgereinigt. Um eine potentielle Funktion von CspB in der Zelle zu untersuchen, wurden Filterbindeassays mit CspB::GST durchgeführt. Es wurde eine hochaffine, aber unspezifische Bindung an ssDNA festgestellt, was auf eine mögliche Funktion von CspB als Chaperon hindeutet. Nach Synthese eines CspB-spezifischen Antikörpers wurde die Kälteinduktion von CspB auch auf Proteinebene nachgewiesen. Durch 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrische Charakterisierung konnten 17 weitere kälteinduzierbare Proteine aus B. bronchiseptica identifiziert werden. Darunter waren u. a. ein Chaperon mit Ähnlichkeit zu GroES, ein Translationsinhibitor BB2940 und das CspB. Diese kälteinduzierbaren Proteine ähneln den CIPs aus E. coli. Weiterhin konnten noch das UspA und mehrere am Metabolismus beteiligte Proteine als CIPs aus B. bronchiseptica identifiziert werden, was signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kälteadaptation zwischen den beiden Organismen aufzeigt. Betrachtet man die Promotorbereiche aller identifizierten csp-Gene, so fällt eine für diese Gene typische sehr lange 5’UTR auf. Innerhalb dieser upstream Region findet man in vier der fünf csp-Gene einen 9 bp langen Consensus mit der Sequenz TCCTTGATT, der in nahezu gleichem Abstand vom postulierten Startcodon vorkommt. Diese identifizierte 9bp-box ist für eine effiziente Transkription in der Kälte jedoch nicht von Bedeutung. Auf posttranskriptioneller Ebene wird die lange 5’UTR für die Stabilisierung der cold-shock mRNA in der Kälte verantwortlich gemacht. Außerdem ist das Vorhandensein der kompletten 5’UTR essentiell für eine effiziente Translation bei niedriger Temperatur, wobei eine Mutation der 9bp-box einen geringen, aber signifikanten negativen Effekt auf die Translation ausübt. Sechs Gene, der neu identifizierten CIPs, beinhalten ebenfalls eine 9bp-box in ihrer upstream Region. Interessanterweise werden zwei der fünf csp-Gene, cspC und cspD, vom BvgAS Zweikomponentensystem, dem Haupttranskriptionsregulator der Virulenzgene im Genus Bordetella, reguliert. Die beiden Gene gehören zu den Bvg-negativ regulierten Genen, die in der Bvg-minus-Phase exprimiert werden. Weiterhin beeinflusst eine leichte Überexpression von CspB aus B. pertussis die Expression der Adenylatzyklase sowohl in B. pertussis, als auch in B. bronchiseptica negativ. Dieser für das CspB spezifische Effekt erinnert an das strukturell verwandte Tex-Protein (Fuchs et al, 1996; König et al, 2002). Beide Proteine beeinflussen die Expression der Virulenzfaktoren negativ, wobei für CspB gezeigt werden konnte, dass es einen direkten Einfluss auf die verminderte cyaA-Expression auf Transkriptionsebene besitzt. Dies zeigt eine Verbindung der Kälteschockantwort mit dem Virulenz-Regulon der Bordetellen, deren Rolle im Infektionszyklus bislang ungeklärt ist.
T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekundären lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekundären lymphatischen Organen angekommen, präsentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molekülen. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigeführt werden können, die ein T-Zell priming außerhalb der sekundären lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerstörung führte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines tertiären lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses tertiäre lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Präsenz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und naïven T-Zellen alle Voraussetzungen für ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifität der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Ausschüttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen für wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verstärkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabhängig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika führte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so führte dies zu einem stärkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl naïve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die Überexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, müssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming ermöglichen sollten. Dementsprechend riefen diese Veränderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekundärer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, naïven T-Zellen entscheiden zu sein. Die Möglichkeit des in vitro primings bekräftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekundären lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Veränderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben ermöglicht.
The exploitation of landscapes increases fragmentation of valuable areas with high biodiversity. Consequently, many populations nowadays exist as metapopulations. In such cases, the balance between extinction and colonisation of patches determines the regional survival of species. To determine long term survival of species and to assess the impact of different management regimes proper knowledge of species habitat requirements as well as information on their dispersal behaviour is needed. The aim of this thesis was to develop methods and measures for the identification of suitable areas for grasshoppers and bush crickets, as well as to quantify the reachability of single patches by individuals. The first part of my work focuses on the quantification of habitat suitability for grasshoppers and bush crickets. Based on presence/absence data, I developed statistical habitat suitability models using logistic regression analyses. The resulting models are evaluated and validated in space and time. It turned out that habitat selection of the species mainly took place on an intermediate spatial scale. The relevant scale falls into the same range as the species’ mean dispersal distances. Besides the rather coarse grained factor ‘type of habitat’ structural factors as well as abiotic factors are correlated with the occurrence of the species. The model of S. lineatus, including the parameters ‘type of biotope’ and ‘vegetation height’ was most successful in predicting the occurrences of the bush cricket species. To further test whether the occurrence of species of different insect groups can be predicted with a common model, I tested the usefulness of the orthoptera models for the prediction of butterflies in the same region and vice versa. While transferability of the orthoptera models was poor, the model of the moth Z. carniolica performed quite successful. It included the proportion of suitable habitat as well as the occurrence of the two sucking plants C. jacea and S. columbaria as relevant factors. Z. carniolica is classified as stenoecious and thus represents other species typically found on fringes and mesoxerophytic grasslands. The high mobility of Z. carniolica simultaneously guarantees the reachability of regional suitable areas and thus ensures that the influence of the random effects of colonisation on the model are marginal. Unfortunately, the factors predicting habitat quality for a species are normally not available at the landscape level. Thus, they cannot be used for the prediction of occurrences without extensive censuses in the field. Nevertheless, my results show that the sole use of the variable ‘type of habitat’, which often is available landscape wide, will be sufficient for the classification of habitat suitability in a landscape. I conclude that for practical use in conservation biology the type of biotope can be used to predict occurrence of the studied species. Besides quality/quantity of suitable habitat, dispersal of individuals between patches is a key factor influencing the survival of populations. Thus, the second part of my work concentrates on theoretical as well as empirical studies on the dispersal behaviour of bush crickets. In field experiments I could show that the assumption of a dichotomous movement behaviour does not apply for bush crickets. Instead, movement pattern changes continuously with structural resistance, temperature, mortality risk and resource availability. This result is confirmed in my experiments on the behaviour of bush crickets at habitat borders. For different borders I could demonstrate different edge permeabilities. Additionally, I observed that grasshoppers could detect suitable habitat from a certain distance. Because the dispersal behaviour plays an important role in theoretical models, my empirical data can be used to parameterise such models. In addition to the influence of movement pattern on the reachability of suitable habitats, I could demonstrate, with simulation models, that the influence of the landscape context in which dispersal takes place has a critical impact on the exchange of individuals between patches. This effect is enhanced if mortality risk during dispersal is accounted for. The results from my studies on habitat suitability can be used to identify suitable habitat for grasshoppers and bush crickets in a landscape. Consequently, the potential suitability of an area as habitat, based on predictions on changes in the type of biotope by management regime, can be predicted. But this information alone is not sufficient to determine regional survival probability of a species. My investigations concerning the dispersal behaviour clearly show, that the reachability of suitable areas is dependent on the spatial configuration of patches and the structure of areas between habitats. Additionally, factors specific for individuals, like motivation and physiological factors play a crucial role for the reachability of suitable habitats.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden offene Fragen zur Objektwahl, zur Objektbeibehaltung und zur Aufgabe von Zielobjekten bei laufenden Taufliegen (Drosophila melanogaster) untersucht. Die Erkenntnisse zur Objektwahl wurden als kybernetisches Modell formuliert, auf einem eigens dafür konstruierten, autonom navigierenden Roboter mit Kameraauge implementiert und dessen Verhalten bei verschiedenen Landmarkenkonstellationen quantitativ mit dem Orientierungsverhalten laufender Fliegen verglichen. Es war bekannt, dass Drosophila in einer Wahlsituation zwischen unterschiedlich weit entfernten Objekten eine ausgeprägte Präferenz für nahe Objekte zeigt, wobei die Entfernung über das Ausmaß der retinalen Bildverschiebung auf dem Auge (Parallaxe) erfasst wird. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob die Parallaxe streng aus der Eigenbewegung der Fliege resultieren muss oder ob Eigenbewegung der Objekte Nähe vortäuschen und deren Attraktivität erhöhen kann. Es wurde gezeigt, dass die Präferenz für ein Objekt bei Drosophila umso größer wird, je mehr Bewegung dessen Abbild auf der Retina erzeugt; die relative Verschiebung des Objektabbildes muss dabei nicht mit der Eigenbewegung der Fliege gekoppelt sein. Überraschenderweise verschwand die Präferenz für nahe Objekte, wenn eine zusammenstehende Gruppe aus einer nahen und mehreren fernen Objekten präsentiert wurden, solange sie zusammen einen Sehwinkel von weniger als etwa 90° einnahmen. Diese Beobachtung ist konform mit einer Vorstellung, wonach Bewegung über größere Augenbereiche integriert und nicht einzelnen Objekten zugeordnet wird. Obwohl Drosophila bei gleichem Präsentationsort auf der Retina die größere parallaktische Bewegung bevorzugte, wurden bei gleicher Entfernung dennoch frontalere gegenüber lateraleren Objekten bevorzugt. Es wird postuliert, dass der frontale und der caudale Sehbereich eine Verstärkung erfahren, die die physikalisch bedingt geringere Parallaxe überkompensiert. Laufende Fliegen reagieren verzögert auf die Präsentation eines Objekts; dies wird im Sinne einer zeitlichen Bewegungsintegration interpretiert. Die darauf folgende Richtungsänderung hängt vom Präsentationswinkel des Objektes ab. Erscheint das Objekt frontolateral, findet eine Hinwendung statt, erscheint es caudolateral, kommt es bevorzugt zur Abwendung. Eine weitere wichtige kognitive Leistung der Fliege ist das Aufgeben eines zuvor ausgewählten Ziels, wenn sich dieses Ziel während des Anlaufs als unerreichbar herausstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Fliegen mit stark reduzierten Pilzkörpern erheblich mehr Zeit benötigen als wildtypische Fliegen, um vom gewählten Zielobjekt abzulassen. Dieser dem Perseveranzverhalten bei Parkinson-kranken Menschen ähnliche Phänotyp wurde unabhängig von der Methode der Ausschaltung der Pilzkörper gefunden. Die Dauer der Perseveranz nahm mit zunehmender Attraktivität des Zielobjekts, d. h. mit abnehmender Distanz, zu. Es wird vorgeschlagen, dass die Pilzkörper für die Evaluierung von eingehender sensorischer Information oder für Entscheidungsfindungen im Allgemeinen benötig werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Minimalmodell für die visuelle Orientierung nach Landmarken entwickelt. Das Modell beinhaltet eine zeitliche Integration des optischen Flusses in einem frontolateralen und einem caudolateralen Kompartiment pro Auge. Je nachdem, in welchem Kompartiment eine festgesetzte Schwelle zuerst erreicht wird, kommt es entweder zu einer Hin- (frontolateral) oder zu einer Abwendungsreaktion (caudolateral). Eine Gewichtungsfunktion kompensiert die geringe parallaktische Verschiebung in diesen Sehregionen. Das Modell wurde in einem mobilen Roboter mit Kameraauge implementiert und mit dem visuellen Orientierungsverhalten der Fliege quantitativ verglichen. Der Roboter war in der Lage, viele Aspekte der Landmarkenwahl von laufenden Fliegen erfolgreich zu reproduzieren und fliegenähnliches, autonomes Orientierungsverhalten unter verschiedenen Landmarkenkonfigurationen zu zeigen.
Die in dieser Arbeit etablierte Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM ermöglicht es, das Genom von pathogenen Bakterien zu mutagenisieren und die so generierte Mutantenbank im high-throughput-Format auf Gene zu untersuchen, die unter bestimmten Bedingungen für das infektiöse Potential oder für das Überleben dieser Keime von Bedeutung sind. Die Grundlage von IDM bildet ein konditional replizierender Vektor, in den eine Genbank des Wirtsorganismus kloniert wird und der unter nicht-permissiven Replikationsbedingungen mittels homologer Rekombination ins Chromosom integriert und dadurch einen Gen-Knockout bedingt. Das IDM-Verfahren weist gegenüber der Transposon-Mutagenese den Vorteil auf, dass das Genom nach dem Zufallsprinzip saturierend mutagenisiert werden kann und dass keine hot spots für die Insertion auftreten. Darüber hinaus kann der mutierte Genlocus nach Screening der Mutanten schnell per PCR identifiziert werden, indem die Exzision des Vektors induziert und das klonierte, homologe Fragment sequenziert wird. Die Insertion des Vektors ins Chromosom und damit der Gen-Knockout ist selbst ohne Selektionsdruck sehr stabil, so dass die Mutanten im Zellkultur- oder Tier-System untersucht werden können. IDM wurde im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf Salmonella enterica Serovar typhimurium und Listeria monocytogenes angewandt. Die Applikation von IDM auf S. typhimurium hatte zum Ziel, Gene zu identifizieren, deren Produkte für das Überleben dieses Gram-negativen Keims in Vollmedium unter Laborbedingungen essentiell sind. Ausgehend von 14.000 S. typhimurium Fragmentbank-Klonen konnten durch Induktion der Integration des Vektors 262 Klone identifiziert werden, für welche die Mutation zu einem lethalen Phänotyp führte. 116 der 262 entsprechenden Proteine konnte durch IDM erstmalig eine essentielle Funktion für die Vitalität von S. typhimurium zugewiesen werden. Darunter befinden sich sowohl Proteine, die homolog sind zu Proteinen anderer klinisch-relevanter Keime, als auch Proteine, die Salmonella-spezifisch sind. Der größte Teil der identifizierten Proteine ist in die Speicherung und Weitergabe von Information (Transkription, Translation, DNA-Reparatur etc.) involviert, viele sind allerdings auch Proteine unbekannter Funktion. Die Essentialität der durch IDM identifizierten Gene konnte durch die Konstruktion von konditional lethalen Mutanten bestätigt werden. IDM ist demnach das erste Mutagenese-Verfahren, welches das essentielle Gen-Set von S. typhimurium für das Überleben in Vollmedium zu definieren vermochte. Basierend auf den IDM Daten konnte es auf 511 Gene, d.h. auf 11 % des Gesamt-Genoms beziffert werden. Bei der Applikation von IDM auf L. monocytogenes lag der Fokus auf der Identifizierung von Genen, die für das Überleben dieses Gram-positiven Bakteriums im Zytosol von eukaryontischen Zellen von Bedeutung sind. Im Screening von bis dato 720 der 1491 L. monocytogenes Insertionsmutanten auf ein attenuiertes Replikationsverhalten in Caco-2 Zellen konnten 69 Mutanten selektioniert werden. In diesen Mutanten sind Gene ausgeknockt, deren Produkte hauptsächlich wichtige Funktionen in der Nährstoffbereitstellung, in der Energiesynthese und im Metabolismus inne haben. Mit der Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM steht ein molekulares Werkzeug zur Verfügung, welches für die Identifzierung neuer targets für sowohl Breitband- als auch Spezies-spezifische Antiinfektiva eingesetzt werden kann und welches unbekannten Proteinen eine biologische Funktionen zuweisen kann.
In a variety of established tumour cell lines, but also in primary mammary epithelial cells metalloprotease-dependent transactivation of the EGFR, and EGFR characteristic downstream signalling events were observed in response to stimulation with physiological concentrations of GPCR agonists such as the mitogens LPA and S1P as well as therapeutically relevant concentrations of cannabinoids. Moreover, this study reveals ADAM17 and HB-EGF as the main effectors of this mechanism in most of the cancer cell lines investigated. However, depending on the cellular context and GPCR agonist, various different members of the ADAM family are selectively recruited for specific ectodomain shedding of proAR and/or proHB-EGF and subsequent EGFR activation. Furthermore, biological responses induced by LPA or S1P such as migration in breast cancer and HNSCC cells, depend on ADAM17 and proHB-EGF/proAR function, respectively, suggesting that highly abundant GPCR ligands may play a role in tumour development and progression. Moreover, EGFR signal transactivation could be identified as the mechanistic link between cannabinoid receptors and the activation of mitogen activated protein kinases (MAPK) ERK1/2 as well as pro-survival Akt/PKB signalling. Depending on the cellular context, cannabinoid-induced signal cross-communication was mediated by shedding of proAmphiregulin and/or proHB-EGF by ADAM17. Most importantly, our data show that concentrations of THC comparable to those detected in the serum of patients after THC administration accelerate proliferation of cancer cells instead of apoptosis and thereby may contribute to cancer progression in patients.
The hoatzin (Opisthocomus hoazin) is an enigmatic bird that lives in the riparian lowlands of northern South America. Among its peculiar attributes are 1) microbial foregut fermentation, unique in birds, to convert plant cellulose in the foliage which it consumes into simple sugars, 2) an ongoing debate about the puzzling taxonomic position, although a relationship to the Cuculiformes appears likely, 3) adaptive wing claws in the young which are used for climbing, and 4) co-operative breeding behaviour. Despite the information available on digestive mode and taxonomy little has been published on its breeding biology and behaviour and until now almost all knowledge was based on a study in the savannah of Venezuela. This is the first detailed study of the hoatzin’s nesting ecology in a rainforest habitat. From 1995-1998 and in 2000 I monitored a hoatzin population which consisted of approximately 700 individuals in an Amazonian rainforest in Ecuador situated in the Cuyabeno Wildlife Reserve (between 0°02’ N, 76°0’ W, 0°03’ S, and 76°14’ W). The area is composed of various black water lagoons and small rivers, flooded forests and terra firme forest. Primarily, I examined group composition and breeding pattern and success related to traits such as clutch and egg size, offspring sex ratio and the number of parents involved in a common breeding attempt. Apart from standardised observations and monitoring I took blood samples from chicks, which were later used for molecular sexing and for DNA fingerprints. Food plants were collected and determined and a rough habitat mapping was conducted. Since the impacts of boat tourism in the area became apparent I investigated the interactions of adult and young hoatzins with tourists and measured the plasma concentration of the hormone corticosterone in chicks as an indicator of stress. Each chapter has its own introduction to the specific topic and can be read independently. The main findings of this study are: The reproduction of the hoatzin was timed strictly following the bimodal rainy pattern in the area. There was only one breeding attempt per year. Only 18% of breeding attempts ended successfully with at least one fledgling. Incubation started with the first egg laid and led to hatching asynchrony. In most cases only the A-chick survived and there is evidence for a brood reduction strategy. I observed egg size variation patterns both within the clutches and between the clutches. Approximately 80% of breeding attempts were carried out with auxiliaries. Units with alloparentals had a higher breeding success than single pairs. The results indicate a trade-off between helping and group size. DNA band-sharing comparisons revealed the existence of joint-nests, where several females laid their eggs in one single nest. The clutches of these joint-nests suffered severe egg loss during all stages of incubation. Breeding success did not differ between single- and joint-nests. The primary offspring sex ratio was biased towards daughters. There was no differential mortality between the sexes until fledging. Individual breeding units employed an adaptive production of offspring of each sex according to their current group size. Rainforest tourism negatively influenced the survival and growth of young, not yet fledged hoatzins. In addition tourist-exposed young showed a stronger hormonal stress response than their conspecifics from undisturbed sites. In contrast, breeding adults appear to have habituated to tourist boats and exposure to observers.
Für BMPs wie auch die anderen Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie beginnt der Signalweg mit der Bindung des Liganden an zwei Typen transmembranärer Rezeptoren. Die Ligand-Rezeptor Interaktionen sind dabei durch unterschiedliche Affinität und Spezifität gekennzeichnet und bilden wahrscheinlich die Grundlage für das breite Spektrum biologischer Funktionen. In dieser Arbeit wurde mittels einer Struktur- und Funktionsanalyse von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen die molekulare Basis für die Affinität und Spezifität dieser Wechselwirkungen untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur des BMP-2 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplexes bei einer Auflösung von 1,9Å ermittelt. Mit der höheren Auflösung war die Charakterisierung der geometrischen Parameter eines Netzwerks von zehn Wasserstoff-Brückenbindungen in der Interaktionsfläche zwischen BMP-2 und BR-IAec möglich. Deren zentrale Bedeutung für dieWechselwirkung konnte auch durch funktionelle Analyse bestätigt werden. So stellen die im Zentrum der Bindungsfläche liegenden Wasserstoff-Brückenbindungen BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) und BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1), sowie die BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-Brücke die Hauptdeterminanten der Ligand-Rezeptor Bindung dar. Darüber hinaus ließ sich aus der strukturellen Analyse des "wrist"-Epitops von BMP-2 eine besondere Bedeutung der Prä-Helix Schleife L2, sowie der im Kontakt eingeschlossenen Wassermoleküle für die Anpassung der Bindungsfläche an unterschiedliche Interaktionspartner ableiten. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für ein neues Modell zur Beschreibung von Affinität und Spezifität der hochaffinen BMP-Typ I Rezeptor Interaktion. Dabei stellen die Wasserstoff-Brückenbindungen den Hauptanteil zur Bindungsenergie, während die hydrophobe Umgebung in der Interaktionsfläche die Bildung von Wasserstoff-Brückenbindungen energetisch begünstigen und hydrophobe Wechselwirkungen nur geringfügigen Einfluss auf die Affinität nehmen. Die vorliegenden Arbeit beschreibt zudem die Präparation und Kristallisation von binären Ligand-Typ I Rezeptor Komplexen für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie die der ternären Komplexe von BMP-2, BR-IAec und ActR-IIec bzw. BR-IIec. Die extrazellulären Domänen der hierfür verwendeten Rezeptoren wurden durch Expression in E.coli oder Sf-9 Insektenzellen erhalten. Ihre funktionelle Charakterisierung erfolgte durch BIAcore Interaktionsanalyse an immobilisierten Liganden, wobei in Abhängigkeit vom Ligand-Rezeptor Komplex unterschiedliche Affinitäten ermittelt werden konnten. In Übereinstimmung mit den hierbei erhaltenen Daten wurden die Ligand-BMP Typ IB Rezeptor Komplexe für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie der GDF-5 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplex präpariert. Des Weiteren konnte die Bildung des ternären BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec Ligand-Rezeptor Komplexes in Lösung nachgewiesen werden. Für all diese Komplexe konnten Kristallisationsbedingungen ermittelt werden. Trotz Optimierung dieser Bedingungen reichte die Qualität der erhaltenen Kristalle nicht für eine Aufklärung der Struktur aus. Für eine detailliertes Verständnis der Mechanismen der Rezeptoraktivierung muss die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen fortgeführt werden. Die präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass über die Kenntnis der einzelnen Affinitäten und die gezielte Modifikation der Interaktionspartner eine erfolgreiche Strukturanalyse dieser Ligand-Rezeptor Komplexe möglich ist.
HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären.
The studies inventoried the species of the families Dytiscidae and Noteridae (Coleoptera) in Comoé National Park in northern Ivory Coast, West Africa and investigated the ecological role of temporary and permanent water bodies for the aestivation of these aquatic beetles. The ecological studies focused on the question how the beetles cope with the temporary loss of their aquatic habitats during dry season. The climate in the study area is characterised by a pronounced dry season from about November to March/April, in which the temporary ponds and creeks in the savannah entirely desiccate. The only available water bodies during dry season in Comoé National Park are the Comoé River, pools in some of its tributaries, and a few of the large savannah ponds. The taxonomic and faunistic analysis revealed a high species richness in the study area and yielded a total of twelve species of Noteridae in four genera and 95 species of Dytiscidae in 22 genera. Thirty of these species had not yet been reported from the Ivory Coast. A description of a new species in the genus Laccophilus is given, named L. comoensis in honour of the National Park. Strong incidences exist that the material includes more species yet unknown to science. Concerning the mode of aestivation, observations in pilot studies led to the working hypothesis that the beetles pass the dry season as adults in aquatic habitats. Consequently, presence of adults in aquatic habitats throughout the dry season and cyclic migration of adults between temporary and permanent water bodies was expected. Regular sampling of water bodies throughout the dry season and beginning rainy season yielded 33,705 individuals in 72 species and 26 genera. In all the sample periods Noteridae and / or Dytiscidae were recorded. The number of species per period was between 36 and 58. It is concluded that in Comoé National Park a) at least parts of the populations of the recorded species pass the dry season as adults and b) aquatic habitats serve as a refuge for aestivation of these adult beetles. In a rocky area in the riverbed of the permanent Comoé River four sets of studies were performed during dry and beginning rainy season. According to the working hypothesis beetles should be searching for adequate aquatic habitats as long as temporary savannah waters are becoming inhospitable and are falling dry. Seven rock pools in the riverbed of the Comoé River were artificially filled and thus offered for colonization at the peak of the dry season (end of January). After five days the rock pools were quantitatively sampled by completely emptying them. All the rock pools were colonized by Dytiscidae and / or Noteridae and with a total of 1,507 individuals in 26 species abundance and diversity were high. Habitats for aestivation are needed most, when the majority of the savannah waters are fallen dry. Little precipitation on February 18th 1999 had filled rock pools in the riverbed of the Comoé River but no pools in the savannah, where the rain was immediately absorbed by the very dry soil. An inventory of beetles was performed in 21 naturally filled rock pools five to 20 days after this precipitation. The sampling yielded 8,456 individuals in 41 species. Except the smallest, all rock pools contained beetles. The result showed that Dytiscidae and Noteridae utilise the rock pools as aquatic habitat during dry season. Beetles adapted to a highly seasonal environment like the aquatic system in the study area should be good colonizers. Sampling of four, respectively five rock pools at two occasions within 24 hours after the start of precipitation examined the potential of colonizers at that period (March). Prior to these precipitations the pools had been completely dry. Dytiscidae were already present in all rock pools and a total of 434 Dytiscidae in 14 species was found. The working hypothesis of cyclic migration suggests that the beetles should leave the rock pools at the onset of the rainy season when precipitation had filled temporary water bodies in the savannah. After several precipitation events an inventory of 13 rock pools of the Comoé River in May controlled for adult beetles. Only four species with 126 individuals were still found, of which Yolina chopardi contributed 81.7%. This species seems to differ from the other recorded species in the use of habitats, since it was never recorded in the savannah. In general, however, diversity and abundance of Dytiscidae and Noteridae in the rock pools, as expected, was low after the onset of the rainy season. During the entire study of the rock pools in the riverbed of the Comoé River 10,523 individuals in 44 species and 18 genera were collected. Thus, more than half of the species recorded in Comoé National Park were found in the rock pools. The results suggest that the Comoé River and the rock pools in the riverbed serve as aquatic retreat for adult Dytiscidae and Noteridae during dry season when temporary water bodies in the savannah are desiccated. The suggested cyclic migration between water bodies predicts that newly formed savannah waters are recolonized by the beetles at the onset of the rainy season. This colonization should be a) by adults and b) airborne. Two artificial ponds in the open savannah were offered only for aerial colonization at the beginning of the rainy season. The ponds were controlled for adult Noteridae and Dytiscidae daily during one continuous phase of eleven and a second one of 16 days (end of March to end of April). On every sampling date Noteridae or Dytiscidae were recorded. In the entire study 2,744 individuals in 44 species and 16 genera were collected. After precipitation, abundance and species richness increased. Thirty-five of the encountered species had been recorded in rock pools of the Comoé River before. The principal species in the artificial savannah ponds had been principal species in samplings of the rock pools as well. The results support the hypothesis of cyclic migration: most species of Dytiscidae and Noteridae of the Comoé National Park fly from desiccating savannah waters to permanent water bodies or water bodies holding water for extended times during dry season. They pass the dry season in these waters and fly back into the savannah after precipitation at the onset of the rainy season. Exceptions from this general rule are discussed.
The gram-positive, facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is the causal agent of listeriosis. Most of well-known virulence genes are controlled by PrfA that belongs to the Crp-Fnr family of transcriptional activators. A PrfA-mediated transcription initiating at a virulence gene promoter, inlC promoter (PinlC) that regulates the expression of the small, secreted internalin C, was in-depth characterized by an in vitro transcription system to unravel the essential features of a PrfA-dependent promoter in this study. The obtained results indicate a dual promoter for inlC that leads to PrfA-dependent and -independent transcription in vitro and in vivo. The PrfA-dependent transcription requires, as expected, the PrfA-box, a conserved 14 bp sequence of dyad symmetry located about 40 bp upstream of the transcriptional start site of each PrfA-regulated gene. Another important structural feature for this PrfA-dependent promoter is the distance between the 3´-end of the PrfA-box and the 5´-end of the SigA-recognized –10 box fixed to 22 or 23 bp, which is observed in the interspace regions of the other known PrfA-dependent promoters, e.g. PactA, PplcA, Phly and Pmpl. The –35 box of PinlC is not necessary for PrfA-dependent transcription. The –10 box of PinlC and also that of the other PrfA-dependent promoters of L. monocytogenes closely resemble SigA-recognized –10 promoter sequences of the well-characterized gram-positive bacterium B. subtilis. Even the extended –10 motif (5´-TRTG-3´) considered to be a basic element for many SigA-recognized promoters in B. subtilis is present in PinlC. Primer extension studies reveal that both the PrfA-dependent and the independent promoter share the same –10 box. The PrfA-independent transcription of inlC depends on a –35 box located directly downstream of the PrfA-box, and the close proximity of the two sites inhibits strongly the transcription activity of the PrfA-independent promoter when the PrfA-RNA polymerase complex binds to the PrfA-box. Deletion of the PrfA-box results in PrfA-independent transcription from PinlC, which is no longer inhibited by PrfA. High concentration of GTP appears to be necessary for PrfA-dependent transcription initiated at the inlC promoter and at other PrfA-dependent promoters. Based on transcriptome analysis, Milohanic and his co-workers identified three groups of genes that were regulated differently by PrfA. Some of these genes containing putative PrfA-boxes in their 5´-upstream regulatory regions were selected for analysis of their transcriptional dependency on PrfA using again the in vitro transcription system. The data show that among these “PrfA-regulated” promoters tested, only the promoter of the hpt gene belonging to group I is clearly activated by PrfA. This promoter is also the only one that exhibited all essential features of a typical PrfA-dependent promoter as described above. In vitro transcription starting at most of the other promoters was neither positively nor negatively affected by PrfA. Transcription initiated at some of the promoters of group III genes (lmo0596 and lmo2067) is rather inefficient with SigA-loaded RNA polymerase, but is highly activated with RNA polymerase loaded with purified SigB. Addition of purified PrfA protein has no effect on the SigB-dependent transcription. These in vitro transcription results indicate that the in vivo observed PrfA effect on the expression of most of the new genes is either indirect or PrfA-mediated transcription of these genes requires - in contrast to the PrfA-dependent transcription of the known virulence genes (including hpt) - additional factors not present in the in vitro transcription assay. In addition to these new genes described by Milohanic, the promoters of two genes (lmo2420 and lmo2840) that contain putative PrfA-boxes with only a single mismatch in their upstream regulatory regions were analyzed in this study. However, transcription of none of these genes is regulated by PrfA, suggesting that these genes are either not truly regulated by PrfA or regulated by other global transcription activators that interact with PrfA by yet unknown mechanisms. By exchanging corresponding sequences between a functionally inactive promoter ParoAP2 and a typical PrfA-dependent promoter PplcA, it is found that PrfA-dependent in vitro transcription can be initiated from the hybrid promoter containing the putative PrfA-box and the SigA-recognized –10 box (TTTAAT) from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter, but it is inhibited strongly by the interspace sequence between these two sites apparently due to an additional RNA polymerase binding site [the –10 box (TAATAT) for the PrfA-independent transcription of ParoAP1)] within this region. Furthermore, a symmetric sequence downstream of the –10 box (TTTAAT) is also shown to be a strongly inhibitory for PrfA-dependent transcription from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter.
Zur Gattung Bordetella gehören mehrere zum Teil sehr eng miteinander verwandte Keime, die bislang, mit Ausnahme des Umweltisolats B. petrii, ausschließlich in Assoziation mit einem Wirtsorganismus nachgewiesen werden konnten. Hierzu gehören zum einen die „klassischen“ Arten, deren pathogenes Potential vom obligat humanpathogenen Erreger des Keuchhustens, B. pertussis, dem ebenfalls humanpathogenen Keim B. parapertussis bis hin zu B. bronchiseptica, dem Erreger von Atemwegserkrankungen in verschiedenen Säugetieren, reicht. Zum anderen wurde dieser Gattung mit B. avium, B. hinzii, B. trematum, B. holmesii und B. petrii in den letzten Jahren „neue“ Arten zugeordnet, die zum Teil humanpathogenes, zum Teil tierpathogenes Potential besitzen. Da die evolutionären Beziehungen der „neuen“ Bordetella-Arten innerhalb der Gattung Bordetella bislang noch wenig untersucht wurden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Verbreitung und Konservierung von bekannten Bordetella-Genen und IS-Elementen bei den „neuen“ Bordetella-Arten untersucht. Aufgrund der vermehrten Hinweise auf ein humanpathogenes Potential von B. holmesii und seiner Assoziation mit einem dem Keuchhusten ähnlichen Krankheitsbild wurde der Schwerpunkt dieser Untersuchungen auf die Analyse der phylogenetischen Beziehungen zwischen B. holmesii und dem B. bronchiseptica-Cluster gelegt. Während durch den Nachweis der bei dem B. bronchiseptica-Cluster vorkommenden IS-Elemente IS481 und IS1001 die durch die 16S rDNA-Sequenz ermittelte Position von B. holmesii innerhalb des B. bronchiseptica-Clusters bestätigt werden konnte, ergab eine vergleichende Sequenzanalyse der in der Gattung Bordetella hoch konservierten Proteine OmpA, BvgA und BvgS die interessante Beobachtung, dass dieser Organismus in dieser Hinsicht viel mehr Ähnlichkeiten zu den „neuen“ Bordetella-Arten besitzt und in diesem Zusammenhang phylogenetisch eher im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Bei der Charakterisierung von vier unterschiedlichen B. holmesii-Blutisolaten wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei variante B. holmesii-Stämme identifiziert, die sich hinsichtlich der fehlenden Expression des intakten Response-Regulators BvgABH von wildtypischen B. holmesii-Isolaten unterscheiden. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass bei diesen phasenvarianten Stämmen die fehlende Expression auf eine Punktmutation innerhalb der bvgABH-Nukleotidsequenz zurückzuführen ist. Diese wird in beiden Fällen an der selben Nukleotidposition durch die Insertion eines Adenosinrestes hervorgerufen. Obwohl dieser Sequenzabschnitt nicht durch eine repetitive Nukleotidfolge gekennzeichnet ist und somit keinerlei Ähnlichkeiten mit einer für Frameshift-Mutationen anfälligen Stelle besitzt, könnte es sich bei der identifizierten DNA-Region dennoch um einen „hot spot“ für eine Punktmutation handeln, da die zwei varianten B. holmesii-Stämmen unabhängig voneinander aus unterschiedlichen Blutkulturen isoliert wurden. Von besonderer Bedeutung war zudem die Beobachtung, dass sich unter diesen varianten Stämmen auch der bei den Stammsammlungen als Referenzstamm abgelegte B. holmesii-Stamm ATCC51541 befindet. Da im Rahmen dieser Arbeit keinerlei offensichtliche phänotypische Unterschiede zwischen den varianten und den wildtypischen B. holmesii-Stämmen festgestellt werden konnten, bleibt die Bedeutung der Phasenvariation bei B. holmesii bislang noch ungeklärt. Im weiteren wurde mit Hilfe eines „Genome Walks“ die an den bvgABH-Leserahmen angrenzenden DNA-Bereiche für B. holmesii ermittelt. Dabei konnte 5 bp nach dem bvgABH-Stoppcodon ein weiterer Leserahmen (bvgSBH) identifiziert werden, welcher Homologien zu der Histidinkinase BvgS aus B. pertussis besitzt. Interessanterweise stellte sich bei der Sequenzanalyse heraus, dass der Konservierungsgrad des bvgASBH-Locus aus B. holmesii und des bvgAS-Locus aus B. pertussis auf DNA-Ebene sehr gering ist. Diese Beobachtung erklärt wiederum, warum der bvgASBH-Genlocus aus B. holmesii früher nicht durch DNA/DNA- Hybridisierungs-Experimente mit einer B. pertussis spezifischen DNA-Sonde nachgewiesen werden konnte und sein Vorhandensein erst nach dem Einsatz von degenerierten Primern über PCR-Analysen detektiert werden konnte. Im weiteren konnte über den „Genome Walk“ gezeigt werden, dass die an dem bvgAS-Locus angrenzenden DNA-Bereiche innerhalb der Gattung Bordetella nicht konserviert sind. Zum einen ist der bvgASBH-Locus aus B. holmesii nicht wie bei dem B. bronchiseptica-Cluster in 5´-Richtung von dem fhaB-orthologen Genlocus benachbart, da sich an dieser Stelle ein weiterer, potentieller Response-Regulator befindet. Ebenso konnten stromaufwärts von bvgASBH keinerlei Hinweise auf das Vorhandensein eines, dem bvgR-Gen der „klassischen“ Arten orthologen Leserahmens erzielt werden. Über weitere Sequenzanalysen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass der Promotorbereich des bvgASBH-Genlocus überraschenderweise keinerlei offensichtliche Sequenzhomologien zu dem entsprechenden Promotorbereich der bvgAup-Region der „klassischen“ Arten zeigt. Dennoch konnten über in silico-Analysen mehrere Sequenzmotive innerhalb der bvgABHup-Region identifiziert werden, die als „inverted repeat“-Strukturen angeordnet sind und die zum Teil eine hohe Übereinstimmung zu der für die „klassischen“ Bordetella-Arten beschriebene BvgA-Konsensussequenz 5´-T/A T T C C/T T A-3 besitzen. Während sich diese Wiederholungssequenzen hinsichtlich ihrer Symmetrie und ihrer Anordnung von denen innerhalb der für das B. bronchiseptica-Cluster beschriebenen bvgAup-Region unterscheiden, konnten auffällige Parallelen zu der Promotorregion des vag- (virulence activated gene) Gens bvgR festgestellt werden. Obwohl sowohl der Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii als auch das BvgA-Protein aus B. pertussis in vitro an die „inverted repeat“ Strukturen der bvgABHup-Region binden kann, führte eine Analyse der GFP-Expression der Reportergenfusion bvgABHup-gfp zu der erstaunlichen Beobachtung, dass die Reportergenfusion in B. pertussis durch die Bindung des BvgA-Proteins reprimiert wird, während sie im Gegensatz dazu in B. holmesii durch die Bindung des BvgABH-Proteins aktiviert wird. Die molekulare Grundlage für diese unterschiedlichen Regulationsmechanismen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht ermittelt werden. Trotz einer umfangreichen Sequenzkonservierung zwischen dem Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii und BvgA aus B. pertussis ist das BvgABH-Protein nicht in Lage, die Funktion des BvgA-Proteins aus B. pertussis in vitro bzw. in vivo zu ersetzen. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe von Komplementationsexperimenten gezeigt werden, dass die Histidinkinase BvgSBH aus B. holmesii in der Lage ist, die Funktion des in dem B. pertussis Stamm 347 mutierten BvgS-Proteins zu übernehmen. Überraschenderweise unterschiedet sich jedoch das BvgSBH-Protein hinsichtlich der Wahrnehmung der Umweltstimuli von BvgS, da die Aktivität der Histidinkinase BvgSBH in dem hybriden B. pertussis Stamm BP 347 (pRK415-bvgASBH ATCC51541) nicht vollständig durch Sulfationen moduliert werden kann. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass im Gegensatz zu den cytoplasmatischen Regionen die BvgSBH- und BvgS- Sensorproteine vor allem in ihren sensorischen Bereichen einen sehr geringen Konservierungsgrad aufweisen.
We present the results of individual-based simulation experiments on the evolution of dispersal rates of organisms living in metapopulations. We find conflicting results regarding the relationship between local extinction rate and evolutionarily stable (ES) dispersal rate depending on which principal mechanism causes extinction: if extinction is caused by environmental catastrophes eradicating local populations, we observe a positive correlation between extinction and ES dispersal rate; if extinction is a consequence of stochastic local dynamics and environmental fluctuations, the correlation becomes ambiguous; and in cases where extinction is caused by dispersal mortality, a negative correlation between local extinction rate and ES dispersal rate emerges. We conclude that extinction rate, which both affects and is affected by dispersal rates, is not an ideal predictor for optimal dispersal rates.
Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk
(2003)
Überexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus führt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung führt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden können, scheinen somit über entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellulären Signaltransduktion verfügen zu müssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu gehören die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu können, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchimäre HER-mrk, deren extrazellulärer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellulärer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abhängigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen führt zu IL-3 unabhängigem Wachstum und zu Langzeitüberleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeitüberleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeitüberleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer höheren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verkürzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß für die Auslösung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, während für eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und für Langzeitüberleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf für die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine führt, während der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß für die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber möglicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verstärken. Für die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das für ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schwächere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, während der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 führen. Da diese Mutante kein Langzeitüberleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend für Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeitüberleben zu sichern. Expression der Rezeptorchimäre HER-mrk in murinen Melanozyten führt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivität von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, während STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivität aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein ähnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen führt (Wellbrock, unveröffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend für die Antiapoptose von Melanomen zu sein.
Zars and co-workers were able to localize an engram of aversive olfactory memory to the mushroom bodies of Drosophila (Zars et al., 2000). In this thesis, I followed up on this finding in two ways. Inspired by Zars et al. (2000), I first focused on the whether it would also be possible to localize memory extinction.While memory extinction is well established behaviorally, little is known about the underlying circuitry and molecular mechanisms. In extension to the findings by Zars et al (2000), I show that aversive olfactory memories remain localized to a subset of mushroom body Kenyon cells for up to 3 hours. Extinction localizes to the same set of Kenyon cells. This common localization suggests a model in which unreinforced presentations of a previously learned odorant intracellularly antagonizes the signaling cascades underlying memory formation. The second part also targets memory localization, but addresses appetitive memory. I show that memories for the same olfactory cue can be established through either sugar or electric shock reinforcement. Importantly, these memories localize to the same set of neurons within the mushroom body. Thus, the question becomes apparent how the same signal can be associated with different events. It is shown that two different monoamines are specificaly necessary for formation of either of these memories, dopamine in case of electric shock and octopamine in case of sugar memory, respectively. Taking the representation of the olfactory cue within the mushroom bodies into account, the data suggest that the two memory traces are located in the same Kenyon cells, but in separate subcellular domains, one modulated by dopamine, the other by octopamine. Taken together, this study takes two further steps in the search for the engram. (1) The result that in Drosophila olfactory learning several memories are organized within the same set of Kenyon cells is in contrast to the pessimism expressed by Lashley that is might not be possible to localize an engram. (2) Beyond localization, a possibible mechanism how several engrams about the same stimulus can be localized within the same neurons might be suggested by the models of subcellular organisation, as postulated in case of appetitive and aversive memory on the one hand and acquisition and extinction of aversive memory on the other hand.
Hereditäre Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auffällig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen einiger ausgewählter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgeklärt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte für 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine häufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge Männer weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Veränderungen der zentralen Retina führen. Ungefähr 50 % der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert für ein putatives 224 Aminosäuren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindomänen-Motiv enthält. Discoidindomänen sind in Zelladhäsion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten bestätigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfläche der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der äußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell für die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren führen. Gegenwärtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgeführt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß darüber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein möglicher Therapieansatz für RS auch beim Menschen sein könnte.
Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Domänen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).
Soluble guanylyl cyclase (sGC) is the best established receptor for nitric oxide (NO) and regulates a great number of important physiological functions. Surprisingly, despite the wellappreciated roles of this enzyme in regulation of vascular tone, smooth muscle cell proliferation, platelet aggregation, renal sodium secretion, synaptic plasticity, and other functions, extremely little is known about the regulation of sGC activity and protein levels. To date, the only well-proven physiologically relevant sGC regulator is NO. In the present study, some additional possibilities for sGC regulation were shown. Firstly, we evaluated the ability of different NO donors to stimulate sGC. Significant differences in the sGC stimulation by SNP and DEA/NO were found. DEA/NO stimulated sGC much stronger than did SNP. Interestingly, no correlation between the sGC protein and maximal activity distribution was found in rat brain regions tested, suggesting the existence of some additional regulatory mechanisms for sGC. The failure of SNP to stimulate sGC maximally might be one of the reasons why the lack of correlation between the distribution of sGC activity and proteins in brain was not detected earlier. Prolonged exposure of endothelial cells to NO donors produced desensitization of the cGMP response. This desensitization cannot be explained by increased PDE activity, since PDE inhibitors were not able to prevent the NO donor-induced decrease of the maximal cGMP response in endothelial cells. The failure of SH-reducing agents to improve the cGMP response after its desensitization by NO suggests that a SH-independent mechanism mediates NO effects. Demonstration that the potency of the recently described activator of oxidized (heme-free) sGC, BAY58-2667, to stimulate sGC increases after prolonged exposure of the cells to an NO donor, DETA/NO, suggests that oxidation of heme may be a reason for NOinduced desensitization of sGC and decrease in sGC protein level. Indeed, the well-known heme-oxidizing agent ODQ produces a dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells and BAY58-2667 prevents this effect. Although the mechanism of sGC activation and stabilization by BAY58-2667 is unknown, this substance is an interesting candidate to modulate sGC under conditions where sGC heme iron is oxidized. Very little is known about regulation of sGC by intracellular localization or translocation between different intracellular compartments. In the present study, an increase in sGC sensitivity to NO under membrane association was demonstrated. Treatment of isolated lung with VEGF markedly increased sGC in membrane fractions of endothelial cells. Failure of VEGF to stimulate sGC membrane association in cultured endothelial cells allows us to propose a complex mechanism of regulation of sGC membrane association and/or a transient character of sGC membrane attachment. A very likely mechanism for the attachment of sGC to membranes is via sGCinteracting proteins. These proteins may participate also in other aspects of sGC regulation. The role of the recently described sGC interaction partner, Hsp90, was investigated. Shortterm treatment of endothelial cells with an Hsp90 inhibitor does not affect NO donor or calcium ionophore-stimulated cGMP accumulation in the cells. However, inhibition of Hsp90 results in a rapid and dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells. These effects were unrelated to changes in sGC transcription, since inhibition of transcription had much slower effect on sGC protein levels. In contrast, inhibitors of proteasomes abolished the reduction in sGC protein levels produced by an Hsp90 inhibitor, suggesting involvement of proteolytic degradation of sGC proteins during inhibition of Hsp90. All these data together suggest that Hsp90 is required to maintain mature sGC proteins. In conclusion, in the present study it was demonstrated that multiple mechanisms are involved in the regulation of sGC activity and its sensitivity to NO. Oxidation of sGC heme by NO seems to be one of the mechanisms for negative regulation of sGC in the presence of high or prolonged stimulation with NO. Another possible means of regulating sGC sensitivity to NO is via the intracellular translocation of the enzyme. It has been also demonstrated here that attachment of sGC to the membrane fraction results in an apparent increase in the enzyme sensitivity to NO. Additionally, Hsp90 was required to maintain sGC protein in endothelial and other cell types. However, we could not find any acute affect of Hsp90 on sGC activity, as reported recently. All these findings demonstrate that the regulation of sGC activity and protein level is a much more complex process than had been assumed earlier.
Fische der Gattung Xiphophorus stellen eines der am besten untersuchten Modellsysteme zur Untersuchung genetischer Geschlechtsbestimmung innerhalb dieser Klasse von mehr als 24.000 Arten dar. X. maculatus kann männliche (XX/ XY) oder weibliche (WY/ YY) Heterogametie aufweisen. Zusätzlich sind atypische Geschlechtsbestimmungssysteme beschrieben worden, die auf autosomale Modifikatoren zurückgeführt wurden. Obwohl kürzlich das Mastergen der Geschlechtsbestimmung im Medaka (Oryzias latipes) als ein Mitglied der Dmrt-Genfamilie identifiziert wurde, konnte Dmrt1bY als Mastergen der Geschlechtsbestimmung von Xiphophorus und anderen Fischen ausgeschlossen werden. Xiphophorus wurde zum wissenschaftlichen Modellsystem, da bestimmte zwischenartliche Kreuzungshybride maligne Melanome entwickeln. Das dafür verantwortliche Onkogen Xmrk und sein physiologisches Gegenstück egfrb liegen eng gekoppelt (< 0,6 cM) in der Geschlechtsbestimmungsregion von X. maculatus. Die Kopplungsgruppe umfasst noch weitere Loci wie den geschlechtsbestimmenden Locus SD, den Locus RY für rötliche und gelb-bräunliche Farbmuster und den Locus Mdl, der außer schwarzen Pigmentflecken auch noch den Bildungsort und die Schwere der Melanome in Hybriden mit X. helleri steuert. Die enge Kopplung dieser Loci entspricht einem physikalischen Abstand von ca. 1 Megabase (Mb) und ermöglicht eine Strategie der positionellen Klonierung der von diesen Loci kodierten Gene. Die Analyse großer Cosmid- und BAC- (Bacterial Artificial Chromosome) Contigs, welche im Rahmen dieser Arbeit erstellt wurden und die mehr als 1 Mb sowohl des X- als auch des Y-Chromosoms des Platys X. maculatus abdecken, zeigte eine hohe Dichte von Retroelementen und anderen repetitiven Sequenzen, besonders im Bereich des dominanten Onkogens Xmrk und in einer durch das duplizierte Gen ps-criptY gekennzeichneten, Y-spezifischen Region. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eines dieser Elemente (XIR) spezifisch auf dem Y-Chromosom akkumuliert, was möglicherweise einen frühen Schritt der Differenzierung der Geschlechtschromosomen des Platys darstellt. Es konnten mehrere Duplikationsereignisse in diese Region nachgewiesen werden. Erstens wurde egfrb dupliziert, dessen Kopie zum Onkogen Xmrk wurde. Zweitens konnte die mehrfache Duplikation eines Melanocortin-Rezeptorgens mc4r nachgewiesen werden, von dem 9 Kopien auf dem X-Chromosom in einer Tandem-ähnlichen Struktur vorliegen und mindestens 9 Kopien auf dem Y-Chromosom. Mindestens 11 der insgesamt 19 Kopien besitzen nicht unterbrochene offene Leseraster, deren konzeptionelle Translationsprodukte die strukturellen Charakteristika funktionaler Rezeptoren zeigen. Drittens wurde das autosomale Gen cript dupliziert und liegt nun in jeweils einer Kopie (ps-cript1) direkt stromabwärts von Xmrk auf beiden Geschlechtschromosomen und in einer zusätzlichen Kopie auf dem Y-Chromosom (ps-criptY), wo es eine Region mit Syntenie zum menschlichen Chromosom 2p markiert. Andere potentielle Gene zeigen Homologien zu den menschlichen Genen CHRNA, CHRND und TMEFF und lassen auf eine syntenische Region zum menschlichen Chromosom 2q schließen. Diese Region ist involviert in autosomale Geschlechtsumkehr im Mensch, allerdings wurde noch kein dafür verantwortliches Gen identifiziert. Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse der Analyse von Sequenzen in der geschlechtsbestimmenden Region von X. maculatus bilden die Basis für ein tieferes Verständnis der Mechanismen, die zur Plastizität der von der Xmrk-SD-Region vermittelten Eigenschaften führen. Auf dieser Grundlage sollten zukünftige Arbeiten zur Identifizierung des Mastergens der Geschlechtsbestimmung führen. Die Identifizierung dieses neuen Gens könnte außerdem zur Aufklärung anderer Geschlechtsbestimmungsmechanismen innerhalb der Fische beitragen, was besonders im Hinblick auf kommerziell genutzte Arten z.B. in der Aquakultur großen Nutzen bringen kann. Einige der analysierten Gene der Xmrk-Region zeigen geschlechtsspezifische Expressionsmuster, allerdings steht die funktionelle Analyse noch am Anfang. Phänotypen, die mit Pigmentmusterbildung und dem Zeitpunkt der sexuellen Reifung in Zusammenhang stehen, könnten auf den in dieser Arbeit identifizierten Melanocortin-Rezeptoren (mc4r) beruhen. Ihre strukturellen Eigenschaften und Expressionsmuster weisen auf ihre mögliche Rolle in einem oder mehreren dieser Vorgänge hin. Verglichen mit den nicht duplizierten Melanocortin-Rezeptoren anderer Vertebraten könnte die ungewöhnlich hohe Anzahl an Kopien als Grundlage für evolutionäre Veränderungen dieser Gene dienen. Obwohl ihre Funktionalität noch gezeigt werden muss, könnten diese Kopien typische evolutionäre Veränderungen duplizierter Gene wie die Übernahme einer neuen Funktion durch das Codieren neuer Proteine nach Mutationen, die Reduktion ihrer Funktion durch die auf weniger Gewebe eingeschränkte Expression und den Verlust ihrer Funktion durch Mutationen, die das Leseraster unterbrechen, zeigen.
Age related macular degeneration (AMD) is the leading cause of visual impairment in the elderly and the major cause of blindness in the developed world. To date, the molecular mechanisms underlying the disease are not well understood although in recent years a primary involvement of the retinal pigment epithelium (RPE) has become evident. The aim of the present study is to systematically analyse genes which are differentially expressed in the RPE, and to assess their possible association with mechanisms and pathways likely to be related to retinal disease, in particular AMD. Towards this goal, 2379 expressed sequence tags (ESTs) were established from an inhouse generated RPE cDNA library. This library was constructed by using the suppression subtraction hybridization (SSH) technique which normalises redundant sequences and ensures enrichment of rare transcripts. In a first phase, 1002 ESTs were sequenced and subjected to comprehensive alignment with public nucleotide and protein databases. A search of the 1002 ESTs against the human genome draft sequence yielded 168 known genes, 51 predicted genes, 15 unknown transcripts and 41 clones with no significant similarity. Reverse Northern blot hybridization was performed for 318 EST clusters to identify abundantly expressed genes in the RPE and to prioritize subsequent analyses. Representative clones were spotted onto a nylon membrane and hybridized with cDNA probes of driver (heart and liver) and tester (RPE) used in the cDNA library construction. Subsequently, 107 EST clusters were subjected to Northern blot hybridizations. These analyses identified 7 RPE-specific, 3 retina-specific, 7 RPE/retina-specific, and 7 tissue restricted transcripts, while 29 EST clusters were ubiquitously expressed, and evaluation was not possible for another 54 EST clusters. Of the 24 transcripts with specific or restricted expression, 16 clones were selected for further characterization. The predicted gene MGC2477 and 2 novel isoforms of the human transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3 (TRPM3) were cloned and further described in detail. In addition, polymorphic variations for these 2 genes as well as for the human MT-Protocadherin gene were determined. For MGC2477, 15 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, with 13 having a frequency of the minor allele greater than 20%. 10 of the 15 SNPs have not been reported in so far in public SNP repertoires. Partial assessment of the TRPM3 gene yielded 35 SNPs. Of these, 30 (85.7%) were highly frequent (0.17-0.5%), and 14 (40%) were novel. The MT-Protocadherin gene revealed 35 SNPs, including 28 (80%) with high frequency of the minor allele. 23 (65.7%) were novel SNPs. These SNPs will be used to construct the most common haplotypes. These will be used in case/control association studies in 400 AMD patients and 200 ethnically and aged matched controls to assess a possible contribution of these genes in the etiology of AMD.
In the last years it became evident that many cytokines do not only bind to their specific cell surface receptors but also interact with components of the extracellular matrix. Mainly in Drosophila, several enzymes were identified, that are involved in glycosaminoglycan synthesis. Mutations in these enzymes mostly result in disturbances of several signaling pathways like hedgehog, wingless, FGF or dpp. In most cases it was, due to these pleiotropic effects, not possible to examine the relevance of matrix interactions for single pathways. The aim of this work was to examine the relevance of matrix interactions for the TGF-ß superfamily member DPP. Based on the fact that DPP is highly homologous to human BMP-2, the basic N-terminus of mature DPP was mutated, which has been shown to contain a heparin-binding site in BMP-2. Thus, a wildtype variant (D-MYC), a deletion variant (D-DEL), which lacked the whole basic part of the N-terminus and a duplication variant (D-DUP), which contained a second copy of the basic core moitiv, were generated. In order to characterise the variants biochemically, they were expressed in E.coli and refolded in a bioactive form. In chicken limbbud assay, the deletion variant was much more active than the wildtype variant, comparable to data of BMP-2. By means of biacore mesurements with the immobilised ectodomain of the high affinity type I receptor thick veins, it could be demonstrated, that the variants differ only in matrix binding and not in their receptor affinity. Different matrix binding was shown by Heparin FPLC. The biological relevance of the matrix interaction of DPP was examined in transgenic flies. To allow expression of the different variants under the control of various Gal4 driver lines, they were cloned behind an UAS-promoter site. In early tracheal development, a strong dependence of DPP signaling on matrix binding was observed. While ectopic expression of the deletion variant caused only minor defects, the branching pattern was strongly disturbed by overexpression of wildtype and duplication variant. Ubiquitous expression of the variants in the wing imaginal disc caused overproliferation of the disc and expansion of the omb target gene expression. The extent of phenotypes correlated with the matrix binding ability of the variants. Corresponding disturbances of the wing vein pattern was observed in adult flies. By the crossing of different dpp allels, transheterozygous animals were created, that lack dpp only in imaginal discs. Expression of the variants under the control of a suitable dpp-Gal4 driver line revealed insights into the biological relevance of matrix binding on DPP gradient formation and specific target gene activation in wing imaginal discs. It was shown, that all variants were able to generate a functional DPP gradient with correct expression of the target genes omb and spalt. Again a correlation between extent of target gene domains and matrix binding ability of the corresponding variants was found. Thus by mutating the N-terminus of DPP, it could be shown that this is responsible for DPP`s matrix interaction. Also the relevance of matrix binding of DPP in different tissues was examined. It turned out, that the reorganisation of tracheal branching by DPP strongly depends on matrix interactions wheras the establishing of a gradient in wing imaginal discs depends only gradually on matrix interactions. Based on these data a model for the action of DPP/TGFßs as morphogens was established. While a deletion of matrix binding leads to a decrease in specific bioactivity of the cytokine, the latter is increased by additional matrix binding sites.
SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie gehört. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner für das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt.
Immuntherapien auf der Basis gut charakterisierter, tumorspezifischer Antigene stellen ein vielversprechendes Konzept der Tumortherapie dar. Ein potentielles Antigen für immuntherapeutische Strategien sollte möglichst tumorspezifisch exprimiert sein und es sollte einen Hinweis auf bereits erfolgte Immunantworten im Patienten geben, wie z.B. die Existenz spezifischer Antikörper oder zytotoxischer T-Zellen (CTL). Eine membranständige Lokalisation ist für die Verwendung von Tumorantigenen in Antikörpertherapien notwendig. Während für viele Neoplasien Tumorantigene bekannt sind, wurden für das kutane T-Zell Lymphom (CTCL) bislang nur sehr wenige tumorassoziierte Antigene identifiziert. Die Antigene se57-1, se70-2, cTAGE-1 und GBP-5ta wurden durch serologisches Durchsuchen einer Phagenbank aus Testis- bzw. Tumorgewebe (SEREX-Methode) identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunogenität dieser vier Tumorantigene in einem neu entwickelten ELISA mit CTCL-, Parapsoriasis-, Melanom- und Kontrollseren untersucht. se70-2 und cTAGE-1 Protein erkannten nur wenige Patientenseren. Für GBP-5ta konnte dagegen eine signifikant höhere Reaktivität der CTCL-Seren im Vergleich zu den Kontrollseren ermittelt werden. Bei se57-1 waren die CTCL- und die Parapsoriasisseren hoch signifikant verschieden zu den Kontrollseren. Dieses putativ virusinduzierte Antigen sollte in zukünftigen Arbeiten auf seine mögliche Funktion als Entzündungsmarker weiter untersucht werden. Für das CTCL sollten weitere Kombinationen von Tumorantigenen auf ihren diagnostischen Wert in der Serologie getestet werden. Des Weiteren konnten in dieser Arbeit die CTCL assoziierten Antigene se2-2 und die GBP-5 Familie genauer charakterisiert werden: Die Expressionsanalyse von se2-2 Protein und mRNA in verschiedenen Normalgeweben zeigte ein differentielles Expressionsmuster. Im SEREX wurde se2-2 serologisch spezifisch nur von CTCL-Seren erkannt. Möglicherweise wäre se2-2 eine geeignete Zielstruktur für die serologische Diagnostik des CTCL. Aufgrund seiner fehlenden Tumorspezifität ist se2-2 für die Immuntherapie jedoch wenig geeignet. Die neu identifizierte GBP-5 Familie besteht aus mindestens drei Spleißvarianten (GBP-5ta, GBP-5a und GBP-5b), die zwei Proteine, GBP-5ta und GBP-5a/b, kodieren. GBP-5ta ist gegenüber GBP-5a/b C-terminal um 97 AS verkürzt. GBP-5ta mRNA wird differentiell exprimiert, während GBP-5ta Protein PBMC-spezifisch exprimiert wird. In CTCL-Tumorgewebe konnte GBP-5ta nachgewiesen werden, wogegen in Melanomzelllinien fast ausschließlich GBP-5a/b vorliegt. Gegen GBP-5ta konnte eine humorale Immunantwort bei CTCL-Patienten nachgewiesen werden: Im SEREX wurde GBP-5ta nur von CTCL-Patientenseren erkannt. Auch in der ELISA-Methode reagierten signifikant mehr Patientenseren als Kontrollseren mit GBP-5ta. Die höhere Immunogenität von GBP-5ta gegenüber GBP-5a/b im SEREX unterstreicht die Bedeutung der verkürzten Variante. Ob CTL gegen GBP-5ta präsentierende Zellen existieren, wird momentan untersucht. Die GBP-5 Spleißvarianten sind hoch homolog zur Familie der GTPasen, zu denen auch das Onkogen Ras gehört. Das verkürzte Protein von GBP-5ta könnte durch den Verlust der C-terminalen Domäne seine eventuelle anti-proliferierende Funktion verlieren. Ein Knock-out Versuch von GBP-5 könnte die Bedeutung von GBP-5 in der Tumorzelle untersuchen. Darüber hinaus wäre es vielversprechend, die GTPase Aktivität der GBP-5 Varianten in einem GTP-Bindungs-Assay zu überprüfen. GBP-5ta könnte eine mögliche Ursache des unkontrollierten Wachstums der Tumorzelle und somit eine vielversprechende potentielle Zielstruktur für therapeutische Ansätze für das CTCL sein.
Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitterausschüttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Domänen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Domäne mit 50%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Domäne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Phänotyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskulären Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Präparats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgeführt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Domänen für die Funktion von csp weiter aufgeklärt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Präparat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau möglich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskuläre Synapse für die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgeführt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgeführt. Die Reiz-Intensität wurde an jedes Präparat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollständiges EJP ausgelöst wurde. Zunächst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitterausschüttung bei erhöhter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch Rückkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue“-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage für alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Phänotyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollständig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in Übereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Phänotyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Phänotyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. Für die Mutante L∆8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Domäne um acht Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Phänotypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabhängigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie für das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivität, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte für die X-chromosomale Linie eine deutlich schwächere Expression des L∆8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C∆27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Phänotyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabhängig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Phänotyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erhöhter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante für csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 möglicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach Überprüfung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Präparat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabhängigem Phänotyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf.
Im Karpfenfisch Alburnus alburnus wurden die bisher größten überzähligen Chromosomen bei Wirbeltieren entdeckt. Dies ermöglichte eine umfangreiche zytogenetische und molekulare Studie dieser außergewöhnlichen Genomelemente. Aus Populationsstudien, die mehrere Fundorte in Deutschland einschlossen, konnten Informationen über die Verteilung der B Chromosomen in Fischen verschiedener Herkunftsorte ermittelt werden. Eine derartige Studie könnte zukünftig auch auf andere Länder ausgedehnt werden. Eine detaillierte, zytogenetische Analyse mit allen konventionellen Hellfeld- und Fluoreszenzbänderungen sowie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit den ribosomalen 5S, 18S/28S rDNA-Proben und der Telomerprobe (TTAGGG)n, zeigte, dass die außergewöhnlich großen B Chromosomen von A. alburnus heterochromatisch, GC-reich und spät replizierend sind. Es wurden bei Alburnus alburnus keinerlei Hinweise auf heteromorphe Geschlechtschromosomen gefunden. Die molekularen Untersuchungen basierten hauptsächlich auf AFLP-Analysen, mit denen eine B Chromosomen-spezifische Bande entdeckt und isoliert werden konnte. Nach Klonierung und Sequenzierung sowie dem Durchsuchen einer Fischspezifischen Datenbank konnte eine retrotransposable Sequenz (Gypsy/Ty3 LTRRetrotranpson) gefunden werden. Ferner konnte eine deutliche Homologie zu dem Nterminalen Teil der reversen Transkriptase von Medaka, Oryzias latipes, dokumentiert werden. Die Southern blot-Untersuchungen und der PCR-Test zeigten, dass es sich bei der entdeckten 203 bp-Sequenz um eine B Chromosomen- und Alburnus alburnus-spezifische Sequenz handelt, welche hochrepetitiv über die beiden Arme der überzähligen Chromosomen verteilt ist. Der Ursprung und die Funktion der massiven überzähligen Chromosomen blieb offen. Da es aber nach wie vor wenig Information über B Chromosomensequenzen und DNA-Organisation im Allgemeinen und besonders bei Fischen gibt (Mestriner et al., 2000), sind die Ergebnisse dieser Studie für die Aufdeckung des Ursprungs und der Evolution überzähliger Chromosomen von allgemeiner Bedeutung, da sie wohl den Hauptanteil der DNA-Zusammensetzung des größten, bisher unter den Wirbeltieren entdeckten überzähligen Chromosoms darstellen. Die Analyse meiotischer Chromosomen zeigte, dass das B Chromosom in der Diakinese als selbstpaarendes Ringchromosom vorliegt. Zusammenfassung und Ausblick 101 Mittels durchflußzytophotometrischer DNA-Messungen konnte der Beitrag des außerordentlich großen B Chromosoms zum Gesamt-DNA-Gehalt von A. alburnus bestimmt werden und Fische auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms, allerdings unter Tötung, analysiert werden. Dies kann in Zukunft durch Ausnutzung von Sequenzinformation über das B Chromosom und der damit einhergehenden Konstruktion spezifischer PCR-Primer („minimal-invasiver Flossentest“) vermieden werden. Fische aus unterschiedlichen Populationen, eventuell auch europaweit, können so schnell und zuverlässig auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms hin untersucht werden, mit dem Zweck, durch künftige Verpaarung der Tiere mit 0, 1 oder 2 B Chromosomen den Vererbungs- bzw. Weitergabemechanismus der überzähligen Chromosomen auf die nächste Generation zu studieren.
The first goal of this study was to develop cell lines with a stable expression of bio-fluorescent topo II and topo I. This was successfully achieved using a bicistronic vector system. Control experiments showed that proteins of expected size were expressed, and that GFP-tagged topos I, IIa, and IIb were active in the cells and fully integrated in the endogenous pools of the enzymes. These cell-lines provided a novel tool for investigating the cell biology of human DNA topoisomerases. Our most important finding was, that both types of mammalian topoisomerases are entirely mobile proteins that are in continuous and rapid flux between all compartments of the nucleus and between the cytososl and the chromosomes of mitotic cells. This was particularly surprising with regard to topo II, which is considered to be a structural component of the nuclear matrix and the chromosome scaffold. We must conclude that if this was the case, then these architectural structures appear to be much more dynamic than believed until now. In this context it should also be mentioned, that the alignment of topo II with the central axes of the chromosome arms, which has until now been considered a hall-mark of the enzyme’s association with the chromosomal scaffold, is not seen in vivo and can be demonstrated to be to some extent an artefact of immunohistochemistry. Furthermore, we show that the two isoforms of topo II (a and b) have a different localisation during mitotic cell division, supporting the general concept that topo II functions at mitosis are exclusively assigned to the a-form, whereas at interphase the two isoenzymes work in concert. Despite unrestricted mobility within the entire nuclear space, topoisomerases I and II impose as mostly nucleolar proteins. We show that this is due to the fact that in the nucleoli they are moving slower than in the nucleoplasm. The decreased nucleolar mobility cannot be due to DNA-interactions, because compounds that fix topoisomerases to the DNA deplete them from the nucleoli. Interestingly, the subnucleolar distribution of topoisomerases I and II was complementary. The type II enzyme filled the entire nucleolar space, but excluded the fibrial centers, whereas topo I accumulated at the fibrial centers, an allocation directed by the enzyme’s N-terminus. During mitosis, it also mediates association with the nucleolar organising regions of the acrocentric chromosomes. Thus, topo I stays associated with the rDNA during the entire cell-cycle and consistently colocalizes there with RNA-polymerase I. Finally, we show that certain cancer drugs believed to act by stabilising covalent catalytic DNA-intermediates of topoisomerases, do indeed immobilize the enzymes in living cells. Interestingly, these drugs do not target topoisomerases in the nucleoli but only in the nucleoplasm.
Säugerzellen sind die bevorzugten Wirtszellen zur Produktion komplexer biopharmazeutischer Proteine, da die post-translational durchgeführten Modifikationen sowohl in funktionaler als auch in pharmakokinetischer Hinsicht humankompatibel sind. Ein großes Problem bei der Etablierung von Zelllinien mit hoher Expression des gewünschten Proteins ergibt sich aus der willkürlichen und ungerichteten Integration des rekombinanten Vektors in transkriptionsaktive oder -inaktive Loki des Wirtszellgenoms. Dadurch erhält man eine Population von Zellen, die völlig unterschiedliche Expressionsraten des heterologen Gens aufweist, wobei die Produktivität der Zellen in der Regel einer Normalverteilung folgt. Zur Identifizierung von Zellklonen, die eine sehr hohe Expression des heterologen Produktgens aufweisen, muss deshalb eine Vielzahl von Klonen überprüft und getestet werden, resultierend in einem hohen Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand. Optimierungen des zur Transfektion eingesetzten Vektorsystems zielen deshalb darauf ab, durch geeignete Selektionsstrategien den Anteil von Hochproduzenten in der transfizierten Zellpopulation zu erhöhen und somit den Aufwand in der Klonidentifizierung zu reduzieren. Die Entwicklung eines derartigen Expressionssystemes ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zwei alternative Strategien, die beide auf der Beeinträchtigung des Selektionsmarkers basieren wurden untersucht. Die Beeinträchtigung des Selektionsmarkers sollte bewirken, dass Klone mit einer Integration in transkriptionsinaktiven Genloki die Selektion nicht überstehen und absterben, während Klone mit einer Integration in transkriptionsaktiven Genloki die Beeinträchtigung des Selektionsmarkers durch eine erhöhte Expression kompensieren können. Diese Klone sollten überleben und gleichzeitig eine hohe Produktexpression aufweisen. Eine der Strategien beruhte auf der Beeinträchtigung der Enzymfunktion des Selektionsmarkers, indem Mutationen in das Leseraster des Enzyms eingeführt wurden. Diese Arbeit zeigt, dass die Verwendung von mutierten Neomycin Phosphotransferase-Varianten als Selektionsmarker in CHO-DG44-Zellen für die Anreicherung von Hochproduzenten geeignet ist. Eine weitere Möglichkeit, die Expressionsrate eines stabil integrierten Produktgens zu erhöhen, ist der Einsatz von cis- und transwirkenden genetischen Elementen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Sequenz aus dem Genom von CHO-Zellen auf mögliche expressionssteigernde Wirkung hin untersucht (Transcription Enhancing TE-Element). Es konnte gezeigt werden, dass dieses TE-Element die Expression eines rekombinanten Antikörpers in stabil transfizierten CHO-DG44-Zellpools verdoppelt.
Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).
Das menschliche MHS2 Gen ist eine sehr gut charakterisierte Komponente des Mismatch-Reparatur-Systems (MMR) und häufig mit der HNPCC Erkrankung assoziiert. Der Mechanismus über den MSH2 an der Karzinomentwicklung beteiligt ist, sind Defekte in der DNA-Reparatur. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen in den kodierenden Regionen dieses Gens direkt in die Mikrosatelliteninstabilität involviert sind. Generell ist MSH2 ein Teil des postreplikativen Reparatursystems der Zellen, und schützt so vor der Akkumulation von Mutationen. Dadurch wird die genetische Stabilität und Integrität gewährleistet. Ein anderer Teil der zellulären Krebsabwehr ist das p53 Tumorsuppressorgen. Ein möglicher DNA Schaden, der in der Lage ist, p53 zu aktivieren, ist UV-Licht. Eine weitere gut charakterisierte Komponente der zellulären UV Reaktion ist der Transkriptionsfaktor c-Jun. Ziel der Arbeit war es die Regulation und Signalfunktion von MSH2 näher zu charakterisieren. Dazu wurde der Promotor des Gens in ein Luziferase Promotorgenkonstrukt kloniert. Dieses Konstrukt wurde in menschliche Keratinozyten transfiziert, die nachfolgend mit UV bestrahlt wurden. Es konnte eine zeit- und dosisabhängige Hochregulation von MSH2 gezeigt werden. Diese Transkriptionserhöhung wurde von p53 initiiert, denn durch eine gezielte Mutation der p53-Bindungsstelle im MSH2 Promotor war dieser Effekt vollkommen aufgehoben. Interessanterweise war dieser Effekt von einem zusätzlichen Faktor abhängig, ohne den keine Hochregulation erkennbar war. Verantwortlich hierfür war der Transkriptionsfaktor c-Jun. Dadurch konnte eine funktionelle Interaktion von p53 und c-Jun in der transkriptionellen Aktivierung von hMSH2 gezeigt werden. Dieser zeit- und dosisabhängige Effekt war sowohl auf RNA als auch auf Proteinebene nachvollziehbar. Der größte Anstieg war bei 50 J/m2 zu verzeichnen, wohin gegen bei Verwendung von 75 J/m2 die Transkriptmenge geringer wurde, um bei 100 J/m2 erneut anzusteigen. Um diesen erneuten Anstieg des Proteins näher zu beschreiben wurden bei den stark bestrahlten Zellen TUNEL-Untersuchungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Menge an MSH2 Protein und an TUNEL-positiven apoptotischen Zellen. Um weiter zu zeigen, dass der zweite Anstieg des Proteins nicht mit einer Reparaturfunktion verbunden ist, wurde ein biochemisch basierter Test durchgeführt, welcher die Reparaturkapazität semiquantitativ beschreibt. Dabei konnte klar gezeigt werden, dass die mit 100 J/m2 bestrahlten Zellen keine Reparaturfunktion mehr erfüllen. FACS-Analysen und Zellfärbungen gegen Annexin V und mit Propidiumiodid bestätigten die stattfindende Apoptose in den Zellen. Eine weitere Komponente des MMR-Systems ist MSH6. MSH6 bildet mit MSH2 ein Dimer, welches den Fehler in der DNA erkennt und das weitere Reparaturprogramm einleitet. Die Expression dieses Proteins konnte nur bis zu einer Dosis von 50-75 J/m2 UV nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu MSH2 war MSH6 nicht in 100 J/m2 bestrahlten Keratinozyten detektierbar. Um über die Lokalisation dieser Proteine mehr zu erfahren wurden Immunfärbungen gegen MSH2 durchgeführt. Es zeigte sich eine Translokation des Proteins vom Kern in das Zytoplasma in Korrelation zum zunehmenden DNA-Schaden durch höhere Dosen an UV-Licht. Dies stellt eine mögliche Verbindung zwischen dem Mismatch-Reparatursystem und apoptotischen Signalwegen dar.
IL-4 und IL-13 sind wichtige Faktoren bei der Entwicklung allergischer Erkrankungen. In dieser Arbeit wird die Rolle von IL-4 und IL-13 in einem Maus-Modell für allergisches Asthma während der allergischen Sensibilisierung und in einer etablierten asthmatischen Erkrankung untersucht. Weiterhin wird die Rolle von IL-4 und IL-13 in frühen Stadien der atopischen Dermatitis in einem Maus-Modell betrachtet. In einem Maus-Modell für allergisches Asthma mit anhaltender IgE-Synthese und einer persistierenden allergischen Atemwegspathologie konnte gezeigt werden, dass die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems während der allergischen Sensibilisierung zu einer dosisabhängigen Reduktion der allergen-spezifischen IgE-Titer, zur Inhibition der Atemwegseosinophilie, zur Reduktion der IL-5-Spiegel in der BAL und zu einer gesenkten Anzahl von IL-4 sezernierenden CD4+ T-Zellen. Weiterhin konnte durch die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems die Becherzellmetaplasie signifikant gesenkt werden. Die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems nach der Entwicklung der allergischen Atemwegspathologie führte hingegen nicht zu einer signifikanten Reduktion der gemessenen Allergie-Parameter. Daraus lässt sich schließen, dass IL-4 und IL-13 nur eine untergeordnete Rolle in einer etablierten Allergie spielt. Diese Ergebnisse sind insbesondere wichtig, wenn man über das Verwendungspotential eines IL-4/IL-13-Inhibitors in der Allergie-Therapie bei asthmatischen Patienten spekuliert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die NC/Nga-Maus ein Modell für die humane atopische Dermatitis darstellt. NC/Nga Mäuse, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden, entwickeln makroskopische und histologische Hautpathologien, die der humanen atopischen Dermatitis sehr ähneln. Weiterhin entwickeln unter konventionellen Bedingungen gehaltenen NC/Nga Mäuse hohe IgE-Titer im Serum, die mit einer erhöhten Produktion an Th2-Zytokinen verbunden war. Die Inhibition des IL-4/IL-13-Systems führte in diesem Modell jedoch nicht zu einer Reduktion von Symptomen und Pathologien der humanen atopischen Dermatitis. Deswegen kann man spekulieren, dass die Inhibition des IL-4/IL-13-Systems zu einem zu späten Zeitpunkt erfolgte. Des Weiteren kann eine nicht-standardisierte Sensibilisierung bei Mäusen, die in einer konventionellen Tierhaltung gehalten werden, zu einem sehr unterschiedlichen Ausbruch der Dermatitis führen. Deshalb werden weitere Tierversuche mit einer höheren Anzahl von Tieren, die zwischen den Würfen randomisiert werden, nötig sein, um die Rolle von IL-4 und IL-13 in der atopischen Dermatitis zu klären.
Durch genaue Kartierung der Defizienzen in den Mutanten konnten bislang unbekannte regulatorische Elemente des Synapsin Gens identifiziert werden. Mit dieser Information sollte es möglich sein, einen Synapsin-„Rescue“ Vektor zu konstruieren, der nach Transformation in die Nullmutante den wildtypischen Phänotyp wiederherstellt. Beim Vergleich der im Rahmen des Berkeley Drosophila Genom Projekt veröffentlichten Sequenz des Synapsin Gens mit vor sieben Jahren publizierten Sequenzdaten fielen Diskrepanzen sowohl in der genomischen Sequenz als auch in der cDNA auf. Um zu klären, ob es sich hier um Artefakte, Polymorphismen oder systematische Modifikationen handelt, wurde der entsprechende Bereich von neun an verschiedenen Orten gefangenen Wildtypen genomisch und auf der cDNA Ebene amplifiziert und sequenziert. In allen Fällen wurde die genomische Sequenz des Genomprojekts verifiziert, so dass von einem Sequenzierfehler in der früheren Sequenz auszugehen ist. Als Folge ergibt sich eine Exon-Intron Struktur, bei der die Spleiß-Konsensussequenz (GT-AG Regel) im Intron 4 des Synapsins gewahrt bleibt. Dagegen bestätigten die RT-PCR Sequenzen die früheren cDNA-Daten, so dass ein A zu G Austausch zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA des Proteins aufgedeckt wird. Dieser Austausch führt zu einer Veränderung der in allen bisher bekannten Synapsinen konservierten Zielsequenz der Proteinkinase CaMK I/ IV und PKA, was interessante Fragen zu seiner funktionellen Bedeutung aufwirft. Die Basensubstitution spricht für ein A-zu-I RNA-Editing auf der Ebene der Ribonukleinsäure. Dieser Vorgang wird durch das Enzym dADAR katalysiert und wurde bereits für verschiedene neuronale Proteine nachgewiesen. Die für die Reaktion benötigte doppelsträngige Sekundärstruktur der RNA kann durch die Sequenz der prä-mRNA des Synapsins gebildet werden. Die potentielle „Editing site Complementary Sequence“ (ECS) konnte im Intron 4 in einem Abstand von ca. 90 Basen stromabwärts der Editing-Stelle durch ein Computerprogramm ermittelt werden. Der A zu G Austausch wird in allen Laborwildtypen und allen neu etablierten Stämmen, sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet. Lediglich in einem cDNA-Gemisch aus Eiern, Embryonen und 1. Larven findet man neben der editierten auch die nicht-editierte Sequenz. Um in späteren Experimenten die Funktion der Phosphorylierung und die Auswirkung der mRNA Editierung ermitteln zu können wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erkennungsstellen der PKA in der cDNA durch Mutationen modifiziert, so dass Phosphorylierungstests an den Konstrukten durchgeführt werden können. Zur phänotypischen Charakterisierung der Nullmutante wurde die Defizienz-Linie Syn97 durch extensive Rückkreuzung in den genetischen Hintergrund des Wildtyps CantonS eingebracht, der als Standard-Kontrollstamm für Verhaltensexperimente und insbesondere Lernversuche dient. Die Linie Syn97CS wurde im Rahmen einer Kooperation von Mitarbeitern des Lehrstuhls in verschiedenen Verhaltenstests und Lernparadigmen auf phänotypische Veränderungen überprüft. Dabei fanden sich mehrere Verhaltensunterschiede zum Wildtyp, die vermutlich auf geringfügigen Modifikationen in komplexen neuronalen Netzwerken beruhen. In operanten Lernparadigmen konnte ein Einfluss der Synapsin-Elimination auf den Lernerfolg detektiert werden. Dabei trat die Reduktion des Lernindex bereits im dritten Larvenstadien auf und setzte sich in der adulten Fliege fort. Der Einfluss des Fehlens des Synapsins auf Lernprozesse in Drosophila steht im Einklang mit Befunden aus Knock-out Mäusen für SynI + II. Im reduzierten Courtship Index der Syn97CS Männchen offenbart sich ein konkreter Hinweis auf eine verringerte Darwin’sche Fitness der Synapsin-Nullmutante. Die Gesamtheit der in der Synapsin-Nullmutante entdeckten Phänotypen könnte den hohen Konservierungsgrad des Proteins zwischen Vertebraten und Invertebraten erklären. In einem weiteren Teil-Projekt konnten Mutationen in die cDNA des Calciumsensor Cameleon 2.0 Proteins eingebracht werden, um so die verbesserte Version Cam 2.1 zu erhalten. Daraufhin wurden mehrere transgene UAS-Cam 2.1 Linien hergestellt, die bei der Kreuzung mit verfügbaren Gal4 Linien den Calciumsensor für eine Expression in definierten Neuronenpopulationen von Drosophila zugänglich machen. In weiterführenden Arbeiten konnte die Funktionalität des Fusionsproteins überprüft werden und somit die ersten Schritte hin zur Anwendung der in-vivo Calcium Imaging Methode am Lehrstuhl durchgeführt werden.
Netzhauterkrankungen, wie Retinitis pigmentosa, sind in der Bevölkerung weit verbreitet (1,5 Millionen weltweit). Gewöhnlich berichten die Betroffenen über Nachtblindheit und periphere Gesichtsfeldausfälle. Häufig führt diese Erkrankung, die durch eine fortschreitende Degeneration von Photorezeptoren verursacht wird, zur vollständigen Erblindung. Bisher beschrieb man den pathologischen Prozess vor allem an rd-Mäusen. Allerdings setzt bei diesen die Degeneration sehr früh ein. Somit ist die Übertragbarkeit auf den Menschen erschwert, da abgesehen von wenigen Ausnahmen, der Verlust von Photorezeptoren hier erst im zweiten Lebensabschnitt beginnt. Deshalb war es interessant, im Rahmen dieser Arbeit anhand der CNGA3-/-Rho-/- Maus ein Modell zu untersuchen, das ähnlich dem menschlichen System, zunächst eine intakte Morphologie zeigt. Dadurch war es möglich eine genaue zeitliche Abfolge der Degeneration zu dokumentieren. Dies kann medizinisch zur Entwicklung eines Therapieansatzes genutzt werden, der bereits zu Beginn der Degeneration greift, und damit den fortlaufenden Prozess zum Stillstand bringen kann. Die CNGA3-/-Rho-/- Maus repräsentiert ein System funktionsloser Photorezeptoren, bei dem der zyklische Nukleotid-Kanal (CNGA3) der Zapfenaußensegmente und das Rhodopsin (Rho) der Stäbchenaußensegmente ausgeschaltet wurde. Bestätigt wurde dies durch ein Elektroretinogramm mit einer negativen Photoantwort bezüglich Zapfen und Stäbchen. Die Degeneration führt zu einem vollständigen Verlust aller Photorezeptoren nach drei Monaten (Pm3). Zum Zeitpunkt Pw4 konnte, vergleichbar dem Wildtyp, eine intakte äußere Retina nachgewiesen werden, bei der lediglich die äußeren Stäbchensegmente fehlen. Die synaptischen Kontakte zwischen den Terminalien der Photorezeptoren, der Horizontalzellen und Bipolarzelldendriten waren normal entwickelt und Stäbchenendigungen als auch Zapfenendfüßchen bildeten funktionelle Triaden aus. Bei den Stäbchenendigungen konnte mit zunehmender Degeneration (Pw5, Pw6) eine Akkumulation synaptischer Bänder und postsynaptischer Elemente beobachtet werden. Im Zeitraum Pw4-7 zeigten sowohl die Zapfen, als auch die Horizontalzellen und Stäbchen-Bipolarzellen, eine bemerkenswerte strukturelle Plastizität. Obwohl durch die Photorezeptoren kein Lichtsignal vermittelt wurde, konnten präsynaptische Marker (bassoon) und postsynaptische Glutamatrezeptoren (GluR1, mGluR6) an den Photorezeptorterminalien nachgewiesen werden. Dies lässt die Vermutung zu, dass eine Transmitterfreisetzung theoretisch möglich wäre. Darüber hinaus konnte im Zeitraum von 12 Monaten keine nennenswerte Auswirkung auf die IPL beobachtet werden: Amakrin- und Zapfen-Bipolarzellen waren normal stratifiziert und die Expression der Transmitter-Rezeptoren zeigte ein charakteristisches Verteilungsmuster. Außerdem war die Ultrastruktur von konventionellen und Bandsynapsen der des Wildtyps vergleichbar. Darüber hinaus bildeten sowohl Amakrinzellen, als auch Bipolar- und Ganglienzellen, Fortsätze in die INL hinein. Allgemein zeigt die immunhistochemisch und ultrastrukturell untersuchte CNGA3-/-Rho-/- Maus, dass weder funktionell aktive Photorezeptoren noch Licht eine stimulierende Wirkung auf die Ausbildung synaptischer Strukturen und die Expression verschiedener Rezeptoren haben.